1. rész: Az Euphorbiae Ebracteolatae Radix összes diterpenoidjainak rosszindulatú ascitesz elleni hatása az aquaporinok megváltozásának tulajdonítható, mivel gátolja a PKC aktivitást a vesében

További információért. kapcsolatba lépnitina.xiang@wecistanche.com

Absztrakt: Ez a tanulmány az Euphorbiae ebracteolate Radix(TDEE)-ből kivont összes diterpenoidok hasvízkór elleni hatását értékelte rosszindulatú asciticus egereken, és feltárta a mögöttes mechanizmusát. A TDEE-t diklór-metánnal extraháltuk, és oszlopkromatográfiának vetették alá. A TDEE-ből izolált hat diterpenoid tisztaságát HPLC-vel 77,18%-nak határoztuk meg. A TDEE (3 és 0,6 g nyers gyógynövény/kg, po) csökkentette az ascitest és növelte a vizeletkibocsátást. Eközben a tumorsejtek életképességének, ciklusának és apoptózisának elemzése azt mutatta, hogy a TDEE nem rendelkezikdaganatellenestevékenység. Ezen túlmenően az akvaporinok (AQP) expressziós szintje, valamint a protein kináz C (PKC) és PKC membrán transzlokációs szintjeveseés sejteket mértek. A TDEE csökkentette az AQP1-4 szintjét és gátolta a PKC expresszióját a membránfrakcióban. A 2-es vegyület kivételével négy fő diterpenoid csökkentette az AQP1 szintjét az emberi vese-2 sejtekben. A 4. és 5. vegyület gátolta az AQP2-4 expresszióját egér belső velőcsatorna sejtekben. Az AQP1-4 expresszió diterpenoidok által kiváltott gátlását a forbol-12-mirisztát-13-acetát (PMA; PKC agonista) gátolta. A TDEE-ből származó diterpenoidok a fő ascites elleni komponensek. A diterpenoidok ascites elleni hatása összefüggésbe hozható a vese AOP-inak megváltozásával a diurézis elősegítése érdekében. Az AOP1-4 expressziójának TDEE általi gátlása összefügg a PKC aktiválásának gátlásával.

Kulcsszavak: Euphorbia ebracteolate Hayata; diurézis; bioaktív összetevők; terpenoidok; vesesejtek; PKC inhibitor

Kattintson ide, hogy megtudja a cisztancse gyógynövény előnyeit

1. Bemutatkozás

Az Euphorbia ebracteolate Hayata (EEH) az Euphorbia nemzetség tagja az Euphorbiaceae családban, és széles körben alkalmazzák hasi puffadás és ödéma, parazita fertőzések, tuberkulózis és egyéb betegségek kezelésére a hagyományos kínai orvoslásban (TCM)[1]. Az EEH (EER) gyökere különféle terpenoidokat tartalmaz, amelyeket hatékony komponensnek tartanak. A terpenoidokon a közelmúltban tanulmányokat végeztek annak meghatározásáragyulladáscsökkentő, vírusellenes,tuberkulózis elleni és egyéb in vitro hatások [2-5]. Mindazonáltal az EER hagyományos hatásaival kapcsolatos alapkutatások korlátozottak a hasi tágulás és ödéma kezelésében. A TCM elmélete szerint az EER a vizeletürítés és a hasmenés elősegítésével gyorsan megszünteti a hasi puffadást és az ödémát [6]. Korábbi tanulmányaink kimutatták, hogy az EER-ből (TDEE) származó összes diterpenoid hasmenést okozhat az akvaporin (AQP)-1 és AQP3 expressziójának szabályozásával [7]. A mai napig azonban nem tisztázott, hogy az EER-ben milyen hatásos anyagok az ascites elleni küzdelemben.

A haspuffadást és az ödémát a modern orvostudomány ascitesként írja le. Az ascites a peritoneális folyadék kóros felhalmozódása [8]. Az ascites kialakulásának számos oka van, például cirrhosis, daganat, szívelégtelenség és nephrosis szindróma [9]. Az ascites előfordulása portális hipertóniával függ össze, ami splanchnicus artériás értágulathoz, a hatékony keringési térfogat csökkenéséhez, az endogén érszűkítő rendszerek aktiválódásához és a vesékben való szenvedélyes vízvisszatartáshoz vezet [10]. Az AQP-k a víz gyors membrántranszporterei a hám- és endothelgátakon való átjutáshoz, és így alapvető szerepet játszanak a vízháztartás fenntartásában [11]. Számos tanulmány kimutatta, hogy az AQP-k kulcsszerepet játszanak az ascites kialakulásában és rendellenességeiben [12-15]. A vesékben sokféle AQP található, például AQP1, AQP2, AQP3 és AQP4[16]. Mivel a TDEE szabályozhatja az AQP-k expresszióját a bélben [7], azt javasoljuk, hogy a TDEE felhasználható legyen az ascites kezelésében az AQP-k vesében történő szabályozásával.

Az AQP-k kritikus szerepet játszanak a vizeletképzésben, azonban az AQP-k vesében történő expressziójának szabályozásának mechanizmusa nem tisztázott. Jelenleg csak korlátozott számú jelentés utal arra, hogy az AQP-ket a proteinkináz C(PKC) és a protein kináz A(PKA) útvonalak szabályozzák [17-20]. Egyes Euphorbiából izolált terpenoidok (pl. uphold és ingenol 3-angelát) szabályozó hatással vannak a PKC-re. A TDEE szabályozhatja az AQP-k expresszióját a vesékben a PKC útvonalon keresztül.

Ebben a vizsgálatban kivontuk a TDEE-t, és értékeltük aszcitesz elleni hatását, valamint az analitikus AQP-expressziót, a PKC- és a PKA-aktivitásokat ascitikus egerek veséjében. Ezután izoláltuk és megtisztítottuk a fő diterpenoidokat a TDEE-ből, hogy megvizsgáljuk annak hatását az AQPs fehérje és mRNS expressziós szintjére kétfélevesesejtek(humán vese-2 sejtek (HK-2) és egér belső velőcsatorna sejtjei (mIMCD3)). Végül egy diterpenoid vegyületet (eufebrakteolatin A) választunk, amely forbol-12-mirisztát-13--acetátot (PMA; a PKC agonistája) használva aktiválja a PKC útvonalat, hogy megállapítsa, szabályozott-e az AQP-k expressziója a vesében. PKC útvonalon keresztül. Ennek a tanulmánynak az volt a célja, hogy meghatározza a TDEE ascites elleni hatását EER-ben, és alapot biztosítson az EER klinikai alkalmazásához, valamint a vizelethajtó és asciticus hatású gyógyszerek jelöltek azonosításához.

2. Eredmények

2.1. A TDEE hatása az aszcitikus folyadék tömegére, a vizelet tömegére és a széklet víztartalmára

Az aszcitikus egerek teljes EER (TEER) és TDEE (3 és 0,6 g nyers gyógynövény/kg, po) és furoszemid (pozitív gyógyszer) kivonattal történő kezelése jelentősen csökkentette az asciticus folyadék tömegének növekedését a modellhez képest csoport (1A. ábra). Az 1C. ábra azt mutatja, hogy a vizelet súlya szignifikánsan (o<0.05, compared="" to="" the="" model="" group)increased="" in="" ascitic="" mice="" pretreated="" with="" teer,="" tdee,="" and="" furosemide.="" in="" addition,="" in="" the="" teer="" and="" tdee="" groups="" at="" a="" dose="" of="" 3="" g="" raw="" herbs/kg,="" a="" significant="" increase="" in="" fecal="" water="" content="" was="" observed="" compared="" with="" the="" model="" group="" (figure="" 1d).="" however,="" the="" non-diterpenoid="" fraction="" of="" eer(ntdee)="" groups="" showed="" no="" significant="" influence="" on="" ascites="" weight,="" urine="" weight,="" and="" fecal="" water="" content="" compared="" to="" the="" model="">

2.2. A TDEE hatása a szérum albuminszintre ascitikus egerekben

A szérum albumin a gerincesek plazmájában a legnagyobb mennyiségben előforduló fehérje, amely képes fenntartani a vér ozmotikus nyomását és szabályozni a vízszállítást. Az 1B. ábra azt mutatja, hogy az ascites termelése modellegerekben a szérum albumin jelentős csökkenését okozta a normál csoporthoz képest. Furoszemiddel, TEER-rel és TDEE-vel (3 és 0,6 g nyers gyógynövény/kg, po) végzett kezelés után a szérum albumin szintje hatékonyan helyreállt a modellcsoporthoz képest. Az NTDEE csoportokban nem tapasztaltak javulást ebben az indexben.

2.3. A TDEE hatása a tumorsejtek életképességére, ciklusára és apoptózisára ascitikus egerekben

Rosszindulatú ascitesben a daganatsejtek lebegnek az asciticus folyadékban. Megvizsgáltuk, hogy az ascites csökkenése összefüggésben van-e a TEER és a TDEE rákellenes aktivitásával. Az eredmények azt mutatták, hogy ezek a gyógyszerek nem gátolták a tumorsejtek életképességét (2A. ábra), és nem vezettek a sejtciklus leállásához (2B. ábra) és apoptózishoz (2C., D. ábra).

2.4. A TDEE hatása az AQP-k expressziójára aszcitikus egerek veséjében

A vese a víz-visszaszívás és a vizeletkoncentráció fontos szerve. Az AQP vízcsatornák közvetítik a víz gyors szállítását a vesékben. Így megvizsgáltuk az AQP-k expresszióját a vesékben. A 3. ábra azt mutatja, hogy az ascites fokozódása csekély hatással volt a vesék AQP-expressziójára a normál csoporthoz képest. TEER és TDEE kezelés esetén az AQP1, AQP2, AQP3 és AQP4 fehérjék expressziója a legtöbb dózisnál jelentősen alacsonyabb volt, mint a modellcsoportban. A TEER szignifikáns csökkenést eredményezett az AQP2, AQP3 és AQP4 expressziójában 3.0 és {{10}},6 g nyers gyógynövény/kg dózis mellett, míg az AQP1 expresszió csak egy alacsony dózis (0,6 g nyers gyógynövény/kg). Nevezetesen, a TDEE ugyanolyan gátló hatással volt az AQP3 és az AQP4 expressziójára, mint a TEER két dózisban. A TDEE és a TEER közötti különbség az, hogy a TDEE csak nagy dózisban (3 g nyers gyógynövény/kg) gátolta az AQP1 és az AQP2 expresszióját. Az NTDEE gyenge hatást gyakorolt ​​a vesék AQP-szintjére, és csak az AQP4 fehérje expresszióját szabályozta a vesékben. 3g nyers fűszernövény/kg.

2.5. A TDEE hatása a PKC és a PKA aktiválására ascitikus egerek veséjében

Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy az AQP expressziója szabályozható a PKC és a PKA aktiválásával. Megvizsgáltuk a TDEE hatását a PKC-a, PKC- és PKA aktivációra. A PKC aktivációját a citoszolból a sejtmembránba való transzlokációjával mérték. A 4A és B ábrákon látható, hogy a PKC- fehérje expressziós szintje a membránfrakcióban szignifikánsan csökkent a TDEE csoportokban, míg a PKC- membránfehérje expressziós szintjére nem volt szignifikáns hatás. A foszfolipáz C(PLC) egy fontos upstream jelátviteli molekula, amely közvetíti a PKC aktiválását. A TDEE kezelésnek nincs hatása a foszforilált és a teljes PLC szintjére (4D. ábra). A PKA egy heterotetramer, amely két katalitikus alegységből áll, amelyek két szabályozó alegységhez kapcsolódnak. A katalitikus alegységek felszabadulása a PKA aktiválásának egyik jellemzője. A 4C. ábrán a TDEE nem befolyásolta a PKA katalitikus alegységek expresszióját.

2.6. Hat diterpenoid tartalmának meghatározása TDEE-ben nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával (HPLC)

Az állatkísérletek eredményei azt mutatták, hogy a TDEE az EER fő hatékony frakciója. Hat diterpenoidot izoláltunk (az 1–6. vegyületek szerkezetét az 5. ábra mutatja; a spektrális adatokat hozzáadtuk a kiegészítő anyaghoz) a TDEE-ből, és ezeket a vegyületeket standardként használtuk a TDEE diterpenoid tartalmának meghatározására. A TDEE és a hat diterpenoid standard HPLC kromatogramjait a 6. ábra mutatja be. Az 1-6 vegyület tartalma 1,07 % , 12 % , 12,69 % 9,15 % , 39,26 % és 3,02 % volt. a TDEE 77,18 százalékáért.

2.7. A TDEE-ből származó diterpenoidok hatása az AQP-k expressziójára a vesesejtekben

A TDEE az EER aktív frakciója volt, amely gátolta az ascitest az AQP1, AQP2, AQP3 és AQP4 expresszió csökkentésével a vesékben. Ugyanakkor a TDEE szignifikánsan csökkentette az AQP1, AQP2, AQP3 és AQP4 fehérje- és mRNS-expresszióját humán vese-2 sejtekben (HK-2) és rágcsáló belső medulláris gyűjtőcsatorna sejtjeiben (mIMCD3) (7. ábra). A TDEE fő összetevői a diterpenoidok. Összehasonlítottuk a TDEE és a diterpenoid keverék hatását (hat izolált diterpenoidot kevertünk össze a TDEE-ben lévő tartalmuk szerint). Az eredmények azt mutatták, hogy a diterpenoid keverék és a TDEE gátló hatása az AQP1, AQP2, AQP3 és AQP4 expresszióra hasonló volt (7. ábra). A TDEE-ből származó négy fő diterpenoid aktivitását in vitro értékeltük. A 8. és 9. ábra azt mutatja, hogy az AQP1 fehérje és mRNS expressziós szintjét a HK-2 sejtekben szignifikánsan csökkentette a 3, 4 és 5 vegyület. A 2. vegyülettel végzett kezelés nem idézte elő az AOP1 jelentős csökkenését a fehérjében és az mRNS-ben. szinteket. Ezeknél a vegyületeknél a 3. vegyület (egy ent-abietán típusú diterpenoid) aktívabb volt, mint a többi vegyület. Az mlMCD3 sejtekben négy diterpenoid vegyület indukálta az AQP2, AQP3 és AQP4 expressziójának különböző mértékű gátlását. A fehérje- és génexpresszió eredményeit a 8. és 9. ábrán mutatjuk be. A 4. és 5. vegyület erős AQP2, AQP3 és AQP4 gátló hatást fejt ki a kontrollcsoporthoz képest gén- és fehérjeszinten. A 2. és 3. vegyület csak az Aqp2, Aqp3 és Aqp4 mRNS expressziójára mutatott eltérő hatást.

2.8. A PKC aktivátorának hatása az AQP-k diterpenoidok által kiváltott gátlására

Az állatkísérletek eredményei azt mutatták, hogy a TDEE egyidejűleg gátolta a PKC aktivitást és az AQP-ek expresszióját a H22 tumorsejtet hordozó egerek veséjében. Annak további tisztázása érdekében, hogy a PKC szabályozta-e az AQP-k expresszióját a vesesejtekben, a PKC agonistát (PMA) előkezeltük HK-2 és mIMCD3 sejtekben 1,5 órával a diterpenoid (Euphebracteolatin A) stimuláció előtt. A membrán PKC , AOP1, AOP2, AOP3 és AOP4 expresszió változását detektáltuk. A Western Bolt eredményei azt mutatták, hogy az eufebrakteolatin A csökkentheti a membrán PKC , AOP1, AOP2, AOP3 és AOP4 fehérje expresszióját, és a hatásokat gyengítheti a PMA előkezelés (10. ábra).