Az 1. rész ERCC1 mutációi akadályozzák a DNS-károsodások helyreállítását, és máj- és veseműködési zavarokat okoznak a betegekben

Kapcsolatfelvétel: ali.ma@wecistanche.com

Katja Apelt et al

Kattintson ide a Cistanche kivonat előnyei a veseműködésre

Bevezetés

Az emberi genom hatmilliárd bázispárja folyamatosan ki van téve DNS-károsító ágenseknek, ami a genomi DNS-elváltozások széles skáláját okozza, beleértve az UV-fény által kiváltott fototermékeket, az intra- és szálak közötti keresztkötéseket (ICL) és a DNS-kettős. száltörések (DSB). A genomi integritás biztosítása érdekében ezeket a DNS-léziókat speciális és hatékony módon kell helyreállítani. Különböző DNS-javító mechanizmusok fejlődtek ki, amelyek mindegyike a DNS-léziók egy meghatározott részhalmazára hat. Míg számos DNS-javító fehérje egyetlen útvonalon vesz részt, a heterodimer endonukleázbanERCC1Az -XPF több mechanikailag elkülönülő DNS-javító útvonal között oszlik meg (Manandhar et al., 2015).

Az XPF instabil és gyorsan lebomlik, amit a vele való heterodimerizáció megakadályozERCC1(Biggerstaff et al., 1993). A két fehérje közötti kölcsönhatást a megfelelő C-terminálisukban található kettős hélix-hajtű-hélix (HhH)2 motívum, valamint a fehérje központi doménje közvetíti.ERCC1, valamint az XPF nukleáz doménje (de Laat és mtsai, 1998b; Jones és mtsai, 2020; Tripsianes és mtsai, 2005; Tsodikov és mtsai, 2005). A kettős szálú DNS-hez való kötődést az ERCC1 segíti elő, míg az XPF a (HhH)2 doménjén keresztül közvetíti az egyszálú DNS-sel (ssDNS) való asszociációt (Tsodikov et al., 2005). A pozicionálás után az XPF a katalitikus aktivitását nagymértékben konzervált nukleáz motívuma révén hasítja le a különböző DNS-szubsztrátokat a buborékok 59 csomópontjában és a DNS kettős hélixből kinyúló egyszálú 39 túlnyúlásnál (de Laat et al., 1998a; Enzlin és Sch¨). are, 2002; Matsunaga et al., 1996). Az ERCC1- XPF kulcsfontosságú szerepét először a nukleotid kivágási javításban (NER) mutatták ki, ahol a sérült DNS-t 59 hasítja a lézióhoz (Sijbers et al., 1996a).

A NER a szerkezetileg nem kapcsolódó DNS-elváltozások széles skáláját ismeri fel, beleértve az UV-indukált fototermékeket is, két alútvonalán keresztül: a globális genomjavításon (GGR) és a transzkripcióhoz kapcsolt javításon (TCR) keresztül. A NER-aktivitás nagy része a GGR-n alapul, ahol az XPC fehérje felismeri a fototermékeket az egész genomban, és felveszi a transzkripciós faktor IIH (TFIIH) komplexét (Sugasawa és mtsai, 1998; Volker és mtsai, 2001). Az RNS-polimeráz II (RNAPII) leállását okozó DNS-léziók a transzkripció során TCR-specifikus fehérjék, például CSB, CSA és UVSSA toborzását váltják ki, amelyek viszont a TFIIH komplexet toborozzák (Nakazawa et al., 2020; van der Weegen et al., 2020). A TFIIH DNS-lézióhoz való toborzását követően a GGR és a TCR egy közös molekuláris mechanizmussá alakul, amely magában foglalja az XPA és XPG asszociációját (Marteijn és mtsai, 2014), amelyek stimulálják a TFIIH helikáz aktivitását, és az RPA-val együtt stabil precíziós komplexet képeznek. Kokic és mtsai, 2019; Riedl és mtsai, 2003; Wakasugi és Sancar, 1998). AzERCC1- Az XPF heterodimert az XPA a NER komplexbe toborozza az XPA-kötő doménjén keresztül.ERCC1(Tsodikov et al., 2007; Volker et al., 2001). Az XPF (59 a lézióból) és XPG (39 a lézióból) endonukleázok összehangolt aktivitása által végzett kettős bemetszés során felszabadul a DNS-léziót tartalmazó ssDNS szakasz (Li és mtsai, 1995; Matsunaga és mtsai, 1995; O 'Donovan és mtsai, 1994; Staresincic és mtsai, 2009), amely után a keletkezett rést kitöltik és ligálják a teljes javításhoz.

A NER mellett megmutatták, hogyERCC1Az -XPF az ICL javításában is lényeges szerepet játszik (Klein Douwel et al., 2014). Ezt a javítási útvonalat az elakadt replikáció indítja el, és magában foglalja az ICL-elakadt replikációs villát a több fehérjemagból álló Fanconi anémia (FA) komplex által, amely E3 ubiquitin ligáz komplexként szolgál a FANCD2 számára. A FANCD2 mono-ubiquitilációja kiváltja az SLX4 toborzását, ami viszont aERCC1-XPF az ICL-ekhez (Abdullah et al., 2017; Klein Douwel és mtsai, 2014; Walden és Deans, 2014; Wood, 2010). A felvételt követően az ERCC{5}}XPF közvetíti az ICL kiakasztását azáltal, hogy bemetszi a szülői DNS-szálat a lézió mindkét oldalán, lehetővé téve a későbbi elváltozás elkerülését és helyreállítását (Kuraoka et al., 2000). Végül, az ERCC1-XPF a DSB homológ rekombináció révén történő javításában is szerepet kapott (Ahmad és mtsai, 2008), melynek során hatékonyan képes hasítani a különböző rekombinációs intermediereket (Wyatt et al., 2017). Alternatív megoldásként a sejtek a hibára hajlamos RAD{11}}függő egyszálú összekapcsolódási útvonalat használják, amely magában foglalja a mikrohomológiájú régiók összekapcsolását, majd a nem homológ 39 ssDNS-farok eltávolításátERCC1-XPF (Adair et al., 2000; Li et al., 2013, 2019). Azonban az ERCC1-XPF pontos szerepe ezekben a DSB javítási útvonalakban nem teljesen ismert.

A DNS-javítási útvonalak fontosságát hangsúlyozza az öröklött DNS-javító-hiányos rendellenességekkel küzdő egyének klinikai fenotípusa. A GGR inaktiválása Xeroderma pigmentosum (XP; MIM 278700, 610651, 278720, 278730, 278740, 278760 és 278780; DiGiovanna és Kraemer, 2012) Xeroderma pigmentosum kialakulását eredményezi, amelyet a fényérzékenység, a kétszeres kockázat és a}} jellemez. bőrrák. Cockayne-szindrómában (CS; MIM 216400 és 133540) neurodegenerációt, növekedési retardációt és többrendszerű betegséget figyeltek meg bőrrák nélkül. A CS-betegek szelektív genetikai hibája van a TCR-ben, amely megakadályozza a DNS-károsodás miatt elakadt RNAPII feldolgozását (Karikkineth és mtsai, 2017; Nakazawa és mtsai, 2020; Nakazawa et al., 2012; Ribeiro és mtsai, 2018; Tufegdˇzi´zi). c Vidakovi' c et al., 2020). Az alapvető ICL -javító gének mutációi FA -t okoznak (MIM 227650, 300514, 227645, 605724, 227646, 600901, 603467, 614082, 609053, 609054, 614083, 614087, 610832, 613390 és 613951), vagyis a Cractize, vagy a Cractize, vagy a Crapicate. , szervi rendellenességek és genomi instabilitás (Auerbach, 2009). A szerepeERCC1Az -XPF-et az ICL javításában alátámasztja az XPF-ben található mutációk, amelyek FA fenotípust eredményeznek (Bogliolo és mtsai, 2013; Ceccaldi és mtsai, 2016; Kashiyama és mtsai, 2013). A DSB-javítás öröklött hibái a sugárérzékenységgel, rákra való hajlammal, immunhiányos állapottal és neurodegenerációval kapcsolatos rendellenességek széles skáláját okozzák (Helfricht és mtsai, 2020; McKinnon és Caldecott, 2007).

A DNS-javítási-hiányos rendellenességek ritkák, és becslések szerint körülbelül 1/200,{2}} élveszületésnél fordulnak elő világszerte XP, CS és FA esetén. Azonban a mai napig csak két jelentést írtak le bi-allél ERCC1 (MIM 126380) mutációval rendelkező egyénekről (Jaspers et al., 2007; Kashiyama és mtsai, 2013). Mindkét személy CS-nek megfelelő tulajdonságokat mutatott, és 14 hónapos korában és 2,5 éves korában elhunyt. Az első és legsúlyosabban érintett egyed (165TOR) az egyik allélon korai stopkodont (Q158X), a másikon pedig F231L missense variánst hordozott (Jaspers et al., 2007). A második egyed (CS20LO) homozigóta volt az F231L missense variánsra (Kashiyama et al., 2013). Mindkét egyed sejtjei érzékenyek voltak az UV-indukált DNS-károsodásra, és különösen a 165TOR szintén enyhén érzékeny volt az ICL-t indukáló szerekre. Mindkét személy kora gyermekkorában halt meg (1–2 éves korban; Jaspers és mtsai, 2007; Kashiyama és mtsai, 2013). Egy harmadik, bi-allél ERCC1 mutációval rendelkező egyénre (XP202DC), aki 37 éves korában elhunyt, egy találkozó absztraktja hivatkozik (Imoto, K. et al. 2007. Patiens with defekts in the interacting nucleotid excision repair proteinsERCC1vagy XPF xeroderma pigmentosumot mutatnak későn jelentkező súlyos neurológiai degenerációval. [Absztrakt] J. Invest. Dermatol. 127:S92). Ez az egyed heterozigóta vegyület volt egy nonszensz mutációra (K226X) és egy splice mutációraERCC1. Részletes fenotípusos leírás nem áll rendelkezésre, és ezen ERCC1 mutációk hatása ismeretlen.

A két fent említett egyed fenotípusa súlyosabb, mint amit a NER-hiány önmagában várt, ami összhangban van az ERCC1-XPF több DNS-javítási folyamatban való részvételével. Ezzel összhangban akár az ERCC1, akár az XPF-KO egerek magas embrionális letalitást és csökkent élettartamot mutattak, és súlyos májelégtelenség következtében pusztultak el (McWhir és mtsai, 1993; Tian és mtsai, 2004; Weeda et al., 1997). amely nem figyelhető meg NER-hiányos XPA-KO egerekben (de Vries és mtsai, 1995; Nakane és mtsai, 1995).

A jelenlegi tanulmányban két bi-allél ERCC1 mutációval rendelkező testvért írunk le, akiknek egyedi fenotípusa alacsony termet, fényérzékenység, progresszív cholestaticus májbetegség és vesetubulopathia. Mindkét személynél progresszív májkárosodás alakult ki, és 10 éves koruk előtt májátültetésre volt szükség. Funkcionális vizsgálatok azt mutatják, hogy az ERCC1 és XPF egyensúlyi fehérjeszintje drámaian csökkent a betegekben talált missense variánst hordozó fekvőbeteg sejtekben és knock-in hámsejtekben. Ezenkívül a mutáns ERCC1 fehérje csak gyengén kölcsönhatásba lép más NER és ICL javító fehérjékkel. Az ERCC1 hiányának új esetéről számolunk be, amely erősen befolyásolja a NER-t, és jelentős hatással van az ICL helyreállítására, amelyek együttesen egyedülálló fenotípust eredményeznek, amely egyesíti az alacsony termetet, a fényérzékenységet, valamint a progresszív máj- és májkárosodást.veseműködési zavar.

Eredmények

Két testvér fényérzékeny, alacsony termetű, és progresszív máj- és veseelégtelenségben szenved

Az 1. testvér (PV50LD; 1. A ábra) 13 éves, a legidősebb a három egészséges, rokon szülők vegyes etnikumú testvérei közül, köztük őslakos ausztrál, máltai és angol-kelta örökséggel. A terhesség alatt édesanyjának átmeneti kardiomiopátiája volt, amely a szülés után megszűnt. A terhesség 39. hetében született, születési súlya 1,9 kg (Z=−3,8), hossza 44 cm (Z=−2,44), fejkörfogata 29,5 cm (Z {{ 17}} −3,8). Csecsemőkorában gyengén nőtt, és 18 hónapos korában májműködési zavara volt, túlnyomórészt kolesztatikus mintázattal. A máj ultrahang és a mágneses rezonancia cholangiopancreatográfia normális volt. A májfunkció fokozatosan csökkent, amint az a -glutamiltranszferáz (GGT), alanin-transzamináz (ALT) és bilirubinszint progresszív növekedéséből is látszik (S1 ábra, A-C). Egy májbiopsziánál (3,5 éves korban) a lebenyes parenchyma eltérést mutatott a hepatocita nukleáris morfológiájában, néhány sokkal nagyobb sejtmaggal és kettős maggal rendelkező sejtekkel (S1 D ábra) olyan területekre, ahol a sejtek kicsi, nem figyelemre méltó magokkal rendelkeznek. Volt enyhe portális fibrózis és enyhe rostos portál expanzió és enyhe fokális interfész gyulladás, ductopenia vagy periductalis fibrózis nélkül (S1 E ábra).

Számos visszatérő fertőzést tapasztalt, beleértve a mandulagyulladást, a bárányhimlőt, a kéz-láb- és körömfájást, a tüdőgyulladást, a hörghurutot, és visszatérő lázas epizódokat, hasi fájdalmat és sápadt székletet, ok nélkül. Az immunológiai vizsgálatok nem mutattak ki immunhiányt. Szem- és bőrfényérzékenységi epizódok alakultak ki nála. 6 éves korban veseműködési zavart észleltek, proximális tubuláris diszfunkcióra utaló jellemzőkkel, amelyeket albuminuria (szubnefrotikus tartomány) és hypercalciuria jellemez. Veseműködése ingadozott, időszakos epizódokkalakut vese sérülés, haladóvesekárosodásnövekvő kreatininszinttel (S1 F ábra), és minimális választ az acetilkolin-észteráz gátlására. A vese ultrahang kicsinek mutatkozottvesefokozott echogenitással és csökkent kortikomedulláris differenciálódással. A tüdőfunkciós tesztek enyhe vagy közepesen súlyos restriktív tüdőbetegséget mutattak ki.

A fejlődési mérföldkövek normálisak voltak, de bizonyos tanulási nehézségek nyilvánvalóak voltak iskolás korban, a regresszió jele nélkül. A látás és a hallás normális volt. A növekedés a kiegészítő takarmányozás ellenére is nagyon lassú maradt. Viszonylag stabil volt 9,5 éves koráig, amikor a májdekompenzáció jeleit mutatta, fokozatosan emelkedő bilirubinszinttel (S1 C ábra) és nemzetközi normalizált aránnyal. 9 éves, 10 hónapos korában ortotopikus májátültetésen esett át. Májátültetést követően tubulopathiája stabilizálódott, bár szérum kreatininszintje továbbra is lassabb ütemben emelkedik (S1 F ábra). Klinikailag stabil. 12 éves korában petefészek-elégtelenséget diagnosztizáltak. Az agyi mágneses rezonancia képalkotás (MRI) 12 éves korban enyhe agyi atrófiát mutatott, közepesen súlyos cerebelláris atrófiával és enyhe agytörzsi atrófiával. Az utolsó értékeléskor (13,5 évesen) a növekedés lassú volt (súly 22,4 kg [Z=−6,08] és magasság 134,7 cm [Z=−3,72]). Nagyon vékony testalkatú volt, gyenge izomtömeggel és kevés bőr alatti zsírral. A napfénynek kitett területeken szeplő alakult ki (1. ábra A). Enyhén mélyen ülő szemei ​​voltak, és a fejbőr haja vékony volt. Nem volt radiális sugárzási rendellenesség. A neurológiai vizsgálat enyhe gyengeséget, minimális ataxiát és depressziós reflexeket mutatott.

A 2. testvér (PV46LD; 1. A ábra) 11 éves, az 1. testvér húga. A terhességet a placenta previa és az átmeneti anyai kardiomiopátia bonyolította, a 2. testvér pedig a terhesség 35. hetében született, születési súllyal 1,79 kg (harmadik centilis), 45 cm hosszú (50. centile) és 29 cm-es körméret (kevesebb, mint a harmadik centile). Kevés volt a bőr alatti zsírrétege, és hasonló arcvonásokkal rendelkezett, mint idősebb testvérének. Az első életévben nem tudott boldogulni, és 2 éves kortól májkárosodást szenvedett, jelentősen megnövekedett GGT-, ALT- és bilirubinszinttel (S1 ábra, A-C). A 6 éves korban végzett májbiopszia az intrahepatikus epeutak károsodását mutatta, ami periductalis fibrózist eredményezett. Csakúgy, mint a nővére májbiopsziájánál, mérsékelt számú kettős magvú hepatocitát láttak, némelyikben nagy magokkal és nagy magvakkal.

Szem- és bőrfényérzékenységi epizódjai voltak. Enyhe vesekárosodással járó vesetubulopathiát észleltek, fokozatosan emelkedő kreatininszinttel (S1 F ábra). A vese ultrahang kicsinek mutatkozottvesenefrokalcinózissal. A fejlődési mérföldkövek normálisak voltak, de iskolás korban enyhe értelmi fogyatékosságot (IQ 66) diagnosztizáltak. Lassú előrehaladás történt az idegrendszer fejlődésének mérföldköveivel, és nincs határozott regresszió. A látás és a hallás normális volt. A májkárosodás progresszív volt, és 8 éves korában májátültetésen esett át. Az agyi MRI 5 éves korban normális volt, de a 10 éves korban végzett ismételt MRI mérsékelt cerebelláris atrófiát és enyhe agyi sorvadást mutatott. 11 éves korban az ösztrogén, a tüszőstimuláló hormon és a luteinizáló hormon mérése petefészek-elégtelenségre utaló mintát mutatott. Az utolsó értékeléskor 11 évesen a növekedés lassú volt (súly 20 kg [Z=−3,89] és magasság 120,7 cm [Z=−3,17]). Nagyon vékony testalkatú, minimális bőr alatti zsírral és gyenge izomtömeggel, családi arcvonásokkal, enyhén mélyen ülő szemekkel és szeplős volt a napfénynek kitett területeken (1. ábra A). Nem volt radiális sugárzási rendellenessége. A neurológiai vizsgálat enyhe gyengeséget mutatott enyhe ataxiával és reflexek hiányával.

A molekuláris analízis új bi-allél ERCC1 mutációkat azonosít

Exome sequencing revealed that both siblings harbor a novel missense variant in exon 4 of the ERCC1 gene (p.R156W; c.466C>T) on the paternal allele (Fig. S2 A). The presence of the c.466C>A T missense variánst Sanger szekvenálás igazolta mindkét érintett testvérnél (1. B ábra). A teljes genom szekvenálása deléciót mutatott ki a 4. exonban az anyai allélon (hg19: chr19:45,922, 224- 45,924,375; S2B ábra), amelyet a 4. exon és az exon összehasonlító kvantitatív PCR-rel (qPCR) igazolt. Az ERCC1 5. ábrája mind a testvérekben, mind az anyában (1. ábra, C és D). A deléciót, amely várhatóan null allél, nem mutatták ki sem az apában, sem négy negatív kontrollmintában (1D. ábra).

While a previously described pathogenic ERCC1 missense variant (p.F231L; c.693C>G) a (HhH)2 doménben található (1. E ábra), a missense variáns (p.R156W) az ERCC1 központi doménjében található, és az XPA kötőzseb (110–154 aa) közvetlen közelében található. ERCC1 (1. E ábra). Az ERCC1 központi doménjének szerkezeti elemzése egy keskeny V-alakú hidrofób zsebet tárt fel, amely egy rövid motívumot (67–80 aminosav) köt meg az XPA-ban (1. ábra F; Tsodikov et al., 2007). Az ERCC1 XPA-kötő zsebét szegélyező aminosavak (1. F. ábra) fontosak a NER számára, de nélkülözhetetlenek más ERCC-függő javítási útvonalakban (Orelli et al., 2010). A betegekben szubsztituált R156 maradék közvetlenül az XPA-kötő zseb alatt helyezkedik el, és sóhidat képez az ellentétes D129 aminosavval (1. F ábra). Az R156W helyettesítés ezért valószínűleg befolyásolja az XPA-kötő zseb stabilitását. Lehetséges, hogy ez a szubsztitúció gyengíti az ERCC1 központi doménje és az XPF nukleáz doménje közötti kölcsönhatást is (Jones et al., 2020), és azt jósoljuk, hogy ez a heterodimer határfelület enyhe vagy közepes destabilizációjához vezethet. ami csökkenti a fehérje stabilitását.

A PV46LD és PV50LD fibroblasztok súlyos NER-hibát mutatnak A NER-hiány jellemzője az UV-C besugárzással szembeni erős érzékenység. Az ERCC1-hiány NER-funkcióra gyakorolt ​​hatásának kezelésére mindkét érintett testvér bőrbiopsziájából primer fibroblasztokat nyertünk. A klonogén túlélési vizsgálatok lehetővé tétele érdekében a PV50LD sejteket halhatatlanná tettük a hTERT bevezetésével (S3 A ábra). Kontrollként teljes ERCC1-KO sejteket generáltunk RPE1-hTERT sejtekben a CRISPR-Cas9 segítségével (2A. ábra). A klonogén UV-C túlélési vizsgálat azt mutatta, hogy a PV50LD-hTERT sejtek túlérzékenyek az UV-C besugárzásra, bár nem olyan mértékben, mint a teljes ERCC1-KO sejtek (2. B ábra), ami a NER súlyos hibájára utal.

A transzkripció során tapasztalt UV-indukált DNS-léziókat TCR javítja, amely az RNS-szintézis (RRS) helyreállítási vizsgálatával mérhető (Nakazawa et al., 2010). Megmértük az RRS-t 48BR fibroblasztokban (WT), betegek fibroblasztjain, és kontrollként XPA-hiányos (XP1PD) elsődleges fibroblasztokat vettünk fel. A születőben lévő transzkriptumok 5-etinil-uridin beépüléssel történő jelölése erős UV-indukált csökkenést mutatott a születőben lévő transzkriptumokban minden sejtvonalban 3 órával az UV-C után. Míg a 48BR teljesen helyreállította a transzkripciót az UV-C besugárzást követő 18 órán belül, mindkét beteg fibroblasztja még kevesebbet, mint a NER-hiányos XP-A betegsejtjei (2. ábra, C és D), ami arra utal, hogy ilyen körülmények között a TCR gyakorlatilag hiányzik.

A GGR-aktivitás vizsgálatához nem osztódó sejtekben ütemezett DNS-szintézist (UDS) mértünk (Nakazawa és mtsai, 2010). Ebből a célból a primer fibroblasztokat lokálisan UV-C fénnyel sugározták be, majd impulzusos jelölést végeztek timidin analóg 5-etinil-dezoxiuridinnel (EdU) a javulás mérésére. Tiszta EdU beépülést detektáltunk a 48BR sejtekben a helyi UV-indukált DNS-károsodás helyén. Azonban az EdU beépülésének csak nagyon alacsony szintje volt kimutatható a páciens fibroblasztjaiban, hasonló szinten, mint az XPA-hiányos fibroblasztokban (XP1PD; 2. ábra, E és F). A PV46LD és PV50LD sejtekben az UDS-szintek összehasonlíthatók vagy még alacsonyabbak voltak a korábban leírt ERCC-hiányos 165TOR-ban (Jaspers et al., 2007) és CS20LO-ban (Kashiyama és mtsai, 2013) mért szinteknél. cellákat, amelyeket párhuzamosan vettünk fel (2. G. ábra és S3. B. ábra). Fontos, hogy a menüvel jelölt ERCC1 reexpressziója mindkét fibroblasztban teljesen megmentette az EdU beépülését (2. ábra, E és F; és S3 C ábra), megerősítve, hogy az erős UDS-hiba az ERCC1 hiányának köszönhető. Primer fibroblasztokat is kaptunk a szülőktől, amelyek normális UDS-t mutattak a helyi UV-károsodás helyén (2. H ábra), ami arra utal, hogy a szülőkben a megfelelő heterozigóta ERCC1 defektust teljes mértékben kompenzálja a WT allél.

A PV46LD és PV50LD fibroblasztok ERCC1 és XPF fehérjeszintje nagyon alacsony

A NER magában foglalja a DNS-javító komplexek erősen koordinált és szekvenciális összeállítását, amelynek során az XPA toborzása a TFIIH után, de az ERCC{0}}XPF előtt történik (Volker et al., 2001). Annak megoldására, hogy a beteg fibroblasztjai milyen mértékben támogatják még mindig a NER-komplex összeállítását, lokálisan UV-C-vel besugároztuk a fibroblasztokat, és immunfluoreszcens jelöléssel nyomon követtük számos NER-mag fehérje felvételét (3. ábra A, kvantifikáció és S3 D ábra). A 48BR sejtekben a TFIIH, XPA és ERCC1 egyértelmű rekrutációját észlelték a lokális UV-indukált DNS-károsodás helyén, míg az XPA-hiányos XP1PD sejtek nem tudtak ERCC1-et toborozni a korábban leírtak szerint (3A és S3D ábra; Volker et al. al., 2001). Mind a PV46LD, mind a PV50LD sejtek normál TFIIH és XPA toborzást mutattak, míg az ERCC1 toborzása a helyi UV-indukált DNS-károsodás helyére nem volt kimutatható (3. ábra A és S3 D ábra).

Az ERCC1 lokalizáció elvesztése oka lehet az ERCC1 toborzás kudarca, az ERCC1 fehérjeszint általános csökkenése vagy a kettő kombinációja. A Western blot analízis valóban feltárta, hogy mind az ERCC1, mind az XPF steady-state szintje drámaian csökkent a PV46LD és PV50LD sejtekben (3B. ábra). A maradék ERCC1 expressziót azonban továbbra is kimutatták a teljes ERCC1-KO sejtekkel összehasonlítva (3B. ábra). Az ERCC1 és XPF fehérjeszintek csökkenése a PV46LD sejtekben nagymértékben hasonló volt a CS20LO vagy 165TOR sejtekben észlelt csökkent szintekhez (3C. ábra és S3, E és F ábra), ami arra utal, hogy a súlyosabb fenotípus az egyedben amelyekből ezek a sejtek származtak, nem a fehérje stabilitására gyakorolt ​​erősebb hatásnak köszönhető. UDS-eredményeinkkel összhangban normál ERCC1 és XPF expressziót észleltünk a szülők sejtjeiben, ami a WT allél általi kompenzációt jelzi (3D. ábra). Az immunfluoreszcens jelölés megerősítette, hogy az ERCC1 és XPF fehérjeszintek jelentősen csökkentek, míg a szülők sejtjei megkülönböztethetetlenek voltak a WT-sejtektől (3. E ábra). A Western blot adatok számszerűsítése azt mutatja, hogy az ERCC1 fehérjeszint a fekvőbeteg-fibroblasztok kb. 20 százalékára csökkent, ami az XPF-szintek hasonló csökkenését eredményezte (körülbelül 20 százalék; 3. F ábra).

Az R156W missense variáns beütése az ERCC1-XPFprotein instabilitásához és súlyos NER-hibához vezet

Csábító az a feltételezés, hogy az ERCC1-XPF alacsony egyensúlyi fehérjeszintjét és a páciens fibroblasztjaiban jelentkező erős NER-hiányt az ERCC1-ben található R156W aminosav szubsztitúció okozza. Figyelembe véve azonban, hogy az érintett egyedek testvérek, nem zárhatjuk ki, hogy más, köztük megosztott genetikai jellemzők is hozzájárulhatnak ehhez a fenotípushoz.

To directly assess this, we decided to generate knock-in lines (KIs) carrying the R156W amino acid substitution in RPE1- hTERT cells using CRISPR-Cas9 technology. We obtained homozygous KI clones carrying the patient mutation in ERCC1 (p.R156W; c.466C>T), amelyet Sanger-szekvenálással igazoltunk két egyedi klónban (4A. ábra). A missense mutáció az ERCC1 és XPF fehérjeszintek súlyos csökkenését okozta mindkét KI klónban (2–17. és 2–51. klón; 4. B ábra és S4, A és B ábra). A Western blot adatok számszerűsítése azt mutatta, hogy az ERCC1 és XPF fehérje szintek majdnem olyan alacsonyak voltak, mint az ERCC1-KO sejtekben (4C. ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az R156W aminosav szubsztitúciója erős hatással van az ERCC1 stabilitására.

Annak további megállapítása érdekében, hogy a betegek fibroblasztjaiban a NER-hibát az ERCC1 R156W aminosav-szubsztitúciója okozza, a TCR aktivitását a transzkripció UV-besugárzás utáni újraindulásának monitorozásával mértük. Míg a szülői RPE1-hTERT sejtek normál újraindulást mutattak az UV után 18 órával, mindkét R156W-KI klón erős TCR-hibát mutatott, amely összehasonlítható a teljes ERCC1-KO sejtekkel (4. ábra, D és E). Hasonlóképpen, az UDS-kísérletek normál GGR-aktivitást mutattak ki a szülői RPE1-hTERT-sejtekben, amely erősen, 10 százalék alá csökkent mind az R156W-KI klónokban, mind az ERCC1-KO sejtekben (4. ábra, F és G). . Végül megmértük egy R156W-KI klón (2–51) UV-érzékenységét a hTERT-vel immortalizált páciens PV50LD fibroblasztjával összehasonlítva. Az R156W-KI sejtek erős UV-érzékeny fenotípust mutattak, bár nem olyan érzékenyek, mint a teljes ERCC1-KO sejtek (4H. ábra). Érdekes módon az R156W-KI UV-érzékeny fenotípusa nagyon hasonló volt a PV50LD-hTERT betegek fibroblasztjaihoz. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az alacsony ERCC1-XPF fehérjeszint és az erős NER-hiba az ERCC1 R156W aminosav-szubsztitúciójának közvetlen következménye.

Az ERCC1R156W szubsztitúció részleges citoplazmatikus lokalizációt okoz

A páciens fibroblasztjai és a KI-sejtek drámaian csökkent fehérjeszintet és erősen csökkent NER-aktivitást mutatnak. Ezt követően azt kívántuk megvizsgálni, hogy a NER-hibát csak a csökkent ERCC1-XPF fehérjeszint okozza-e, vagy az ERCC1R156Wmutáns fehérje csökkent aktivitással rendelkezik-e endonukleázként vagy NER-ben.

Ennek megoldására ERCC{0}}KO cellákat generáltunk a CRISPR Cas9 segítségével Flp-In/T-Rex rendszerrel felszerelt U2OS cellákban. Flp-alapú hely-irányított rekombináció segítségével a GFP-vel jelölt ERCC1WT-t vagy ERCC1R156W-t kódoló cDNS-eket a genomiális Flp-felismerő célpont (FRT) helyére céloztuk meg, hogy lehetővé tegyük az erős víruspromoter által indukálható expressziót. A Western blot analízis azt mutatta, hogy az ERCC1WT és az ERCC1R156W hasonló szinten expresszálódott, és bármelyik fehérje expressziója megmentette az ERCC1-KO sejtekben megfigyelt csökkent XPF fehérjeszinteket (5A. ábra). Ezért ezek a sejtek kiváló modellrendszert jelentenek a WT szinten expresszálódó ERCC1R156W szubsztitúció specifikus hatásának és az alacsonyabb ERCC1 expressziónak a páciens fibroblasztjaiban és KI epiteliális sejtjeiben történő elválasztására.

Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy az XPF missense mutációi az ERCC{0}}XPF helytelen lokalizációját okozhatják a citoplazmában (Ahmad et al., 2010). Ezzel összhangban azt is kimutattuk, hogy az ERCC1R156W fehérjekészlet ~40 százaléka rosszul lokalizálódott a citoplazmában, ami az ERCC1WT-t expresszáló sejtekben csak ~15 százalék volt (5. ábra, B és C). Az ERCC1 téves lokalizációja szintén növelte a citoplazmatikus XPF frakcióját (5. ábra, B és C), jelezve, hogy az ERCC1R156W részben hibásan hajtogatható össze.

Ennek a lehetőségnek a tesztelésére immunprecipitációs kísérleteket végeztünk ERCC1WT-GFP és ERCC1R156W-GFP, majd kvantitatív címkementes tömegspektrometriával (MS) a két ERCC1 fehérje differenciális kölcsönhatásainak feltérképezésére. Fontos, hogy a kvantitatív MS megerősítette, hogy azonos mennyiségű ERCC1WT-GFP és ERCC1R156W-GFP fehérje húzódott le (5D. ábra). Meglepő módon az ERCC1R156W interaktómája hősokkfehérjékben (HSP), különösen a HSPA családban gazdagodott, míg az XPF-fel való kölcsönhatás mennyiségileg csökkent az ERCC1WT-hez képest (5D. ábra). A HSPA fehérjék fehérje-folding chaperonok, amelyek megakadályozzák a rosszul hajtogatott fehérjék aggregációját (Stetler et al., 2010). A koimmunprecipitációs (Co-IP) kísérletek valóban megerősítették, hogy az ERCC1R156W-GFP erős kölcsönhatásba lép a HSPA4-gyel az ERCC1WT-hez képest (5. E ábra), ami az ERCC1R156W részleges hibás hajtogatására utal.

Annak kezelésére, hogy milyen mértékben ERCC1R156W-XPF még mindig aktív, mint egy endonukleáz, megtisztítottuk a rekombináns komplexet Sf9 rovarsejtekből (ábra. S4 C). Korábban kialakított eljárásunk egy gélszűrési lépést tartalmaz, amely lehetővé teszi annak felmérését, hogy az ERCC1-XPF dimer vagy aggregált állapotban van-e (5. F. ábra, 2. és 1. frakció). A rekombináns ERCC1R156W XPF komplex hozama alacsonyabb volt, és magasabb aggregált fehérjeszintet mutatott. Ezenkívül azt is észleltük, hogy a heterodimer fehérje frakciója csökken az ERCC1WT-XPF-hez képest (5. F ábra). Mindazonáltal a 2. frakcióban lévő heterodimer rekombináns ERCC1R156W-XPF teljesen aktív volt, ha szárhurok-modell DNS-szubsztráttal inkubáltuk, míg a katalitikusan inaktív ERCC1-XPFD687A, amely negatív kontrollként szerepelt, mentes volt a bemetszési aktivitástól (4. . 5 G). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az ERCC1R156W-XPF részben hibásan hajtogatott és helytelenül lokalizálódott, de a megfelelően hajtogatott fehérjefrakció továbbra is aktív endonukleázként.

Az ERCC1R156W mutáns fehérje nem lép hatékonyan kölcsönhatásba az alapvető NER-faktorokkal

Következő lépésként foglalkoztunk azzal, hogy az ERCC1R156W szubsztitúció hogyan befolyásolta a NER-t a rekonstruált ERCC1-KO sejtekkel. Mivel az R156W szubsztitúció közvetlenül az ERCC1 XPA-kötő zsebe alatt található (1. F ábra), megkérdeztük, hogy az ERCC1R156W továbbra is kölcsönhatásba léphet-e a NER fehérjékkel UV-sugárzás hatására. Ennek tesztelésére immunoprecipitáltuk az ERCC1WT-GFP, ERCC1R156W-GFP vagy GFP-t egy nukleáris lokalizációs jelhez (GFP-NLS) fuzionálva UV-sugárzással besugárzott sejtekből kontrollként, majd ezt követően címkementes MS-t végeztünk. Az ERCC1-GFP és a GPF-NLS összehasonlításával azonosítottuk az ERCC1 konstitutív, valamint UV-indukált interaktorait. Elemzésünk feltárta, hogy mind az ERCC1WT, mind az ERCC1R156W kölcsönhatásba lép az XPF-fel és az ICL javítás-specifikus SLX4 és SLX4IP scaffold proteinjeivel, bár mennyiségileg csökkent az ERCC1R156W-t expresszáló sejtekben (6. ábra, A és B). Meglepő módon az ERCC1WT sejtekben a TFIIH XPB alegységgel való UV-indukált kölcsönhatás teljesen elveszett az ERCC1R156W sejtekben (6. ábra, A és B). A ko-IP kísérletek megerősítették, hogy az ERCC1R156W sem a TFIIH-val, sem az XPA-val nem tudott kapcsolódni UV-sugárzás hatására, míg az ERCC1WT lehúzása után erőteljes kölcsönhatásokat észleltek (6. C. ábra és S4, D és E. ábra).

Az ERCC{0}}XPF NER-komplexekké való toborzása teljes mértékben az XPA-tól függ (Volker et al., 2001), ami felveti a kérdést, hogy az ERCC1R156W-t továbbra is felveszik-e az UV-indukált DNS-károsodás helyére. Ennek megoldására élősejtes képalkotás segítségével figyeltük az ERCC1-GFP toborzását UV-indukált DNS-léziókra. Ebből a célból a sejteket UV-C (266-nm) lézerrel sugározták be, ami az ERCC1WT-GFP gyors felszaporodását váltotta ki a besugárzást követő első 60 másodpercben, és 120 másodperc körüli platót ért el (6. D és E). Ezzel szemben az ERCC1R156W-GFP csak nagyon gyenge rekrutációja volt kimutatható UV-C besugárzással azonos körülmények között (6. ábra, D és E). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az ERCC1R156W képtelensége az XPA-val való kölcsönhatásra súlyosan korlátozza a NER-komplexszel való kapcsolatát.

A rekonstruált ERCC1-KO sejtekben szerzett eredményeink arra utalnak, hogy az ERCC1R156W továbbra is támogatja a maradék (körülbelül 40 százalékos) javítási aktivitást, ha az ERCC1WT-hez hasonló szinten fejeződik ki. Az ERCC1R156W mutáns fehérje súlyosan csökkent expresszióját mutató PV46LD és PV50LD primer fibroblasztok reziduális javításának mérésére UDS-kísérleteket végeztünk, amelyekben lehetővé tettük, hogy a sejteket hosszabb ideig (4 óráig) beépítsék az EdU-ba, hogy rögzítsük a maradék javítást. . Míg az XPA-hiányos XP1PD sejtekben az UDS még mindig ~10 százalék alatt volt, addig a PV46LD és PV50LD sejtekben az UDS ~10 százalékról kb. 20 százalékra nőtt ilyen körülmények között (6. ábra J és S5 A ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az ERCC1R156W mutáns fehérje, amely alacsony szinten expresszálódik a páciens sejtjeiben, támogatja a maradék NER aktivitást, ami valószínűleg megmagyarázza a mindkét testvérnél megfigyelhető enyhe XP-szerű klinikai tüneteket. Ilyen körülmények között a korábban leírt ERCC1--hiányos 165TOR (Jaspers és mtsai, 2007) és CS20LO (Kashiyama és mtsai, 2013) sejtekben is kimutattuk a maradék UDS-t a PV46LD és PV50LD sejtekben észleltnél is magasabb szinten. (6. ábra J és S5 A ábra).

Az ERCC1R156W hatása az ICL javításában

Az ICL javítása során az SLX4 scaffold protein ERCC1-XPF-et toboroz, hogy végrehajtsa a későbbi javítást lehetővé tévő leakasztásos bemetszéseket. MS elemzésünk feltárta, hogy az ERCC1R156W továbbra is kölcsönhatásba lép az SLX4-gyel, bár az ERCC1WT-hez képest alacsonyabb szinten (6. ábra, A és B). A ko-IP kísérletek valóban megerősítették az ERCC1WT és az SLX4 közötti erős kölcsönhatást, amelyet az UV-sugárzás nem befolyásolt, míg az ERCC1R156W-vel való kölcsönhatás erősen csökkent (7. ábra). Annak kiküszöbölésére, hogy ez a csökkent kölcsönhatás befolyásolta-e az ERCC1 ICL-ekbe való toborzását, lokálisan besugároztuk a sejteket UV-A lézerrel (365 nm) trioxsalen jelenlétében, amely egy psoralen származék, amely UV besugárzás hatására ICL-eket képez (Velimezi et al. , 2018). Az UV-A lézerrel végzett helyi besugárzás csak a trioxsalennel szenzitizált sejtekben váltotta ki az endogén FANCD2 felvételét, bizonyítva, hogy a mi körülményeink között ICL-eket indukáltak (S5 B ábra). Kimutattuk a GFP-ERCC1WT-GFP erős toborzását a helyi ICL-ekbe, míg az ERCC1R156W toborzása sokkal gyengébb volt (7. ábra, B és C), ami arra utal, hogy az SLX4-gyel való csökkent interakció szintén csökkenti az ERCC1R156W toborzási hatékonyságát. ICL-ek. Az ICL-t indukáló ágens, mitomicin C (MMC) után végzett klonogén túlélési vizsgálatok azonban azt mutatták, hogy az ERCC1R156W megmentette az ERCC1-KO sejtek MMC-vel szembeni túlérzékenységét, bár valamivel kisebb, mint az ERCC1WT (7D. ábra). Ezek a kísérletek azt mutatják, hogy az ERCC1R156W mutáns fehérje támogatja az ICL helyreállítását a WT szintek közelében, amikor a mutáns fehérje közel normális szinten expresszálódik.

Annak megállapítására, hogy a PV46LD és PV50LD betegek fibroblasztjai, amelyek az ERCC1R156W jelentősen csökkent expresszióját mutatták, továbbra is támogatják-e a hatékony ICL-javítást, MMC-indukált kromoszómatörési vizsgálatot végeztünk. Ez a módszer az MMC által kiváltott kromoszómatöréseket méri a metafázisos sejtekben, amelyeket az ICL javításának hiánya okoz. Míg a 48BR (WT) sejtek nagyon kevés törést halmoztak fel az MMC után, jelentős MMC-indukált kromoszómatörést mértünk Fanconi-beteg eredetű WK8103 sejtekben (Poll et al., 1984; 7. E ábra). Mind a PV46LD, mind a PV50LD köztes fenotípust mutatott fokozott törésképződéssel az MMC hatására, bár nem olyan mértékben, mint a Fanconi sejtek (7. E ábra). Ezzel összhangban a PV50LD-hTERT sejtek és az RPE1-hTERT R156W-KI sejtek érzékenyek voltak az MMC-re a klonogén túlélési tesztekben, míg a FANCF-hiányos VU121F-hTERT sejtek (Joenje et al., 1997) és különösen az ERCC{ {24}}A KO sejtek túlérzékenyek voltak az MMC-re (7. F ábra). Összefoglalva, az ERCC1R156W alacsonyabb expressziója és az SLX4-gyel való csökkent kölcsönhatás jelentős hatással van az ICL-rejavításra, bár a páciens sejtjei közel sem olyan érzékenyek, mint a Fanconi vagy a teljes ERCC1-KO sejtek. Valószínűleg ez magyarázza, hogy miért nem mutatkoznak FA-szerű tulajdonságok a két testvérben.

Az ERCC1R156W hatása a DSB javításban

Tekintettel az ERCC{0}}XPF szerepére a DSB-javításban, azt is megvizsgáltuk, hogy az ERCC1R156W milyen mértékben támogatja még mindig ezt a javítási folyamatot. Ennek érdekében a BrdU-val érzékenyített sejtekben UV-A lézeres besugárzást követően élő sejtes képalkotást végeztünk, hogy helyi DSB-ket hozzunk létre (Lukas et al., 2003). Toborzása endogén XRCC4 lehetett kimutatni helyeken a helyi UV-A lézeres besugárzás csak a BrdU szenzitizáció után (ábra. S5 C), ami azt mutatja, hogy a DSB-k indukáltak a mi körülményeink között. Egyértelműen észlelték az ERCC1WT-GFP toborzását a DSB-k helyére, míg ez sokkal gyengébb volt az ERCC1R156W esetében (8. ábra, A és B). Az ionizáló sugárzás (IR) után végzett klonogén túlélési vizsgálatok azonban nem mutattak ki különbséget az ERCC1WT-vel vagy ERCC1R156W-vel rekonstituált ERCC1-KO sejtek között (8C. ábra), ami arra utal, hogy a mutáns ERCC1 fehérje támogatja a DSB javítását.

Hogy ezt a betegsejtekben is kezeljük, klonogén túlélési vizsgálatokat végeztünk hTERT-vel immortalizált fibroblasztokban, növekvő dózisú IR expozíció után. Az XRCC4 hiányos fibroblasztok (CS16NG-hTERT; Guo et al., 2015) már a legalacsonyabb dózisnál (2 Gy) is egyértelműen érzékenyek voltak az IR-re. A PV50LD-hTERT sejtek azonban nem voltak túl érzékenyek 2 Gy mellett, és csak nagyobb dózisok mellett mutattak fokozott érzékenységet (8D. ábra). Valójában a teljes ERCC1-KO sejtek és az R156W-KI cellák csak marginális érzékenységet mutattak az infravörösre (S5D ábra), ami arra utal, hogy az ERCC1-XPF csekély mértékben járul hozzá a sejteknek az IR elleni védelméhez. Egy másik módszer a DSB javítási kapacitásának felmérésére az IR-indukált H2AX gócok felbontásának időbeni monitorozása. Mind a 48BR, mind a páciens fibroblasztjai a H2AX gócok normális clearance-ét mutatták 2 Gy fiziológiás dózisú besugárzás után 24 órán belül (8. ábra E és F; és S5 E ábra). A 48BR sejtek DNS-függő protein kináz (DNS-PK) inhibitorral történő kezelése azonban minden elemzett időpontban teljesen elnyomta a H2AX gócok felbontását (8. ábra, E és F). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a PV46LD és PV50LD sejtek teljes mértékben jártasak a DSB javításában alacsony károsodási terhelés mellett.