A pinocembrin javítja az infarktus utáni szívelégtelenséget a Nrf2/HO-1 jelátviteli útvonal 1. rész aktiválásával

Kérlek keress feloscar.xiao@wecistanche.comtovábbi információért

Absztrakt

Háttér:Az oxidatív stressz fontos tényező a szívelégtelenség progressziójában. A jelenlegi vizsgálatot annak vizsgálatára végezték, hogy a pinocembrin képes-e javítani a posztinfarctus szívelégtelenséget (PIHF) és a mögöttes mechanizmusokat.

További információért kattintson ide

Mód:A patkányokat bal elülső leszálló artéria lekötéssel szívizominfarktus indukálására végeztük, majd 6 hétig neveltük, hogy krónikus szívelégtelenséget idézzenek elő. Ezután a pinocembrint minden második napon adták be 2 héten keresztül. A hatásokat echokardiográfiával, Western blottal, Masson-festéssel, biokémiai vizsgálatokkal, immunhisztokémiával és fluoreszcenciával értékelték. In vitro H9c2 kardiomiocitákat és szívizom-miofibroblasztokat is tenyésztettünk, hogy tovább bizonyítsuk a mechanizmusokat.

Eredmények:Megállapítottuk, hogy a PIHF által kiváltott szívműködési romlás szignifikánsan javult a pinocembrin adásával. Ezen túlmenően a pinocembrin kezelés gyengítette a kollagén lerakódást és növelte a vaszkuláris endoteliális növekedési faktor 2 receptor 2-t az infarktus határzónájában, valamint gyengítette az apoptózist, ami az oxidatív stressz enyhülésével függött össze, amit a szívszövetben a reaktív oxigénfajták (ROS) csökkenése bizonyít. és malondialdehid (MDA) a szérumban, valamint a szuperoxid-diszmutáz (SOD) növekedése. Ezt a nukleáris faktor eritroid 2-kapcsolódó 2-es faktor (Nrf2)/hem oxigenáz-1(HO-1) útvonalának felszabályozása kísérte. In vitro kísérletek során azt találtuk, hogy a specifikus Nrf2 inhibitor szignifikánsan megfordította a pinocembrin hatását, beleértve az antioxidánst, az apoptózist, az antifibrózist és a neovaszkularizációt, ami tovább jelezte, hogy a pinocembrin javítja a PIHF-et Nrf2/HO-ban-1 útvonalfüggő módon.

A Cistanche javíthatja az immunitást

Következtetés:A Pinocembrin javította a szívműködést és a PIHF-ből eredő remodellinget a ROS scavenging és a Nrf2/HO-1 útvonal aktiválásával, ami tovább gyengítette a kollagénrostok lerakódását és apoptózisát, és elősegítette az angiogenezist.

Kulcsszavak:Pinocembrin, szívelégtelenség, oxidatív stressz, Nrf2/HO-1

Bevezetés

A szívelégtelenség (HF), amelyet a szív strukturális és/vagy funkcionális károsodásából eredő terminális klinikai szindrómák sora jellemez, továbbra is globális egészségügyi teher marad, amelynek vezető oka a miokardiális infarktus (MI) (Ziaeian és Fonarow 2016; Galli és Lombardi 2016; Rengo et al. 2013). A szívelégtelenség kezelésében és az ellátás minőségében elért nagy előrelépés ellenére a becslések szerint évente 37,7 millió ember előfordulása világszerte 50 százalékos halálozással a szívelégtelenség diagnosztizálása után 5 évvel (Go et al. .2014). A jelenlegi dilemma részben annak tudható be, hogy az infarktus utáni szívelégtelenség (PIHF) számos olyan patofiziológiai mechanizmusból áll, amelyekre a jelenlegi terápiás módszerek nem képesek teljes mértékben hivatkozni.

A felhalmozódó vizsgálatok kimutatták, hogy az oxidatív stressz (OS) túlnyomórészt szerepet játszik a PIHF kóros progressziójában (Dubois-Deruy és mtsai 2020; Ma és mtsai 2019; Bubb et al. 2017; Habtemariam 2019). a szabad gyökök/reaktív oxigénfajták (ROS) túlzott felhalmozódása, amelyek hidroxilgyököt, szuperoxidot, nitrogén-oxidot stb. tartalmaznak (Dubois-Deruy et al. 2020; Habtemariam 2019), igazolták, hogy képes kiváltani a lipid oxidatív módosulását vagy károsodását , fehérjék és DNS, organelluma rendellenességekkel, gyulladással, apoptózissal a miocitákban és intersticiális fibrózissal (Dubois-Deruy et al. 2020; Bubb et al. 2017; Hermida et al. 2018). A ROS többszörös káros hatása miatt az antioxidánsokat figyelembe vették a PIHF-terápiákban, amelyek mechanizmusa a közvetlen ROS-elszívás és/vagy az antioxidáns védelem stimulálása glutation, szuperoxid-diszmutáz (SOD), kataláz stb. Habtemar-iam 2019). Sajnálatos azonban, hogy egyes antioxidánsok, sem az E-vitamin (Lee et al.2005), sem a resveratrol (Made et al. 2015; Olesen és mtsai 2014) alkalmazása nem váltotta meg a szív- és érrendszeri betegségek terápiájában az elégedettséget. amit a szívműködés javításának kudarca bizonyít. Ezért a PIHF terápiában hatékonyabb antioxidánsokra van szükség.

A pinocembrin (Pino) ​​(kémiai szerkezete az 1A. ábrán látható) egy természetes flavonoid vegyület, amely mézből, propoliszból és számos más növényből extrahálható (Lan et al. 2015; Rasul et al. 2013) amellett, hogy mesterséges szintézis (Costa és Leitao 2011), amely gyulladáscsökkentő, antibakteriális, anti- és rákellenes hatást fejt ki (Rasul et al. 2013; Ye et al. 2019), valamint a hangsúlyos antioxidáns hatást (Kim et al. 2020; Sangweni et al. .2020). Amint azt korábban bemutattuk, a Pino fenolos szerkezete felelős a közvetlen ROS eliminációért, valamint az antioxidáns védekezést fokozó fenolos és nem fenolos szerkezetek (Habtemariam 2019) felelősek a Pino antioxidáns hatásáért, amellyel Pino-t széles körben tanulmányozták és alkalmazták. számos betegség, például neurodegeneratív betegségek, érelmeszesedés, doxorubicin által kiváltott kardiomiocita toxicitás (Sangweni és mtsai 2020; Sang és mtsai 2012; Liu és mtsai 2014). Tekintettel azonban arra, hogy a szívinfarktus és a szívelégtelenség számos antioxidánsa érvénytelen vagy nem elegendő ahhoz, hogy klinikai felhasználásra kerüljön, továbbra is kevéssé ismert, hogy a Pino antioxidáns hatása kiteljesedhet-e a PIHF terápiájában. Ezért ezt a kutatást annak vizsgálatára végezték el, hogy a Pino beadása képes-e üdvözítő hatást gyakorolni a PIHE-re, újszerűnek ígérkező, vagy ha nem is domináns, de legalább kiegészítő kezelésnek ígérkezik.

Módszerek és anyagok

Állatmodell és kísérleti protokoll

56 hím Sprague-Dawley patkány, amelyeket a China Three Gorges Egyetem állatkísérleti központjától vásároltak,

a Wuhan No.3 Kórház állatorvosi adminisztrációjában nevelkedtek. Minden kísérletet hivatalosan engedélyeztek és a Hubei Key Laboratory of Cardiology-ban végeztek, megfelelve az Egyesült Államok Nemzeti Egészségügyi Intézete által kiadott Útmutató a laboratóriumi állatok gondozásához és használatához (NIH Publikáció No.{1}}, felülvizsgálva 1996-ban).

A patkányok kezdetben bal elülső leszálló koszorúér (LAD) lekötést vagy színlelt műtétet kaptak. Röviden, a patkányokat 3 százalékos pentobarbitállal (2 ml/kg; Sigma-Aldridge, St. Louis, USA, intraperitoneálisan) érzéstelenítettük, majd légcső intubációt és légzéstámogatást végeztünk (légzési térfogat: 5-10 ml, sebesség: 70 alkalom/perc). Ezt követően szívexpozíciót végeztünk, és a LAD-t 7-0 monofil nylon varratokkal lekötöttük. Az elektrokardiogram I elvezetésén az apexcordis sápadtsága vagy az ST-szakasz eleváció megjelenése MI indukcióját jelezte. Az álműtét azonos eljárásokon ment keresztül, kivéve a LAD-ligálást. Penicillint (200,000 NE) intramuszkulárisan injekcióztak naponta egyszer a műtét után egy hétig.

Afterward, the rats were carefully raised for 6 weeks to produce PIHF. Rats were then randomly split into 4 groups:(i) sham+saline (sham group);(i)sham+Pino group;(ii)LAD ligation+saline(HF group);(iv)LAD ligation+Pino(HF+Pino group). Pinocembrin(5 mg/kg, purity>98 százalék; Sigma-Aldridge) vagy azonos mennyiségű sóoldatot injektáltak intravénásan a farokvénán keresztül 2 héten keresztül minden második napon. Az adagolás egy korábbi tanulmányra hivatkozott (Lan et al. 2017). A protokollt az 1B. ábra szemlélteti.

A kontroll pozitív kontroll patkányok 3 csoportot tartalmaztak: hamis plusz sóoldat (álcsoport); LAD ligálás plusz sóoldat (HF csoport); LAD ligálás plusz enalapril (HF plusz ACEI csoport). A patkányokon a megfelelő műtéteket végeztük, kivéve, hogy a HF plusz ACEI csoportba tartozó patkányokat orálisan etettük 20 mg/kg enalaprillel.

Echokardiográfiás mérések

A szívműködést transzthoracalis echokardiográfiával értékeltük ultrahang képalkotó rendszerrel (Vevo 2100, Visual Sonics Inc., Toronto, Kanada), amint azt csoportunkban korábban közöltük (Fo et al.2020). A bal kamra belső dimenzióját a végdiasztolés stádiumban (LVIDd) és a végső szisztolés stádiumban (LVID), a bal kamra végszisztolés és végdiasztolés térfogatát (LVESV és LVEDV) kétdimenziós M-módú echokardiogrammal rögzítették legalább 3-ig. egymást követő ciklusokban minden patkánynál. Ezt követően kiszámítottuk a bal kamrai ejekciós frakciót (LVEF) és a frakcionált rövidülést (FS), amelyek a szisztolés funkciót tükrözték.

Minta előkészítés

Pino és echokardiográfiás tesztek beadása után a patkányokat ismét elaltattuk. A farokvénából több mint 2 ml vénás vért vettünk fel etilén-diamin-tetraecetsav (EDTA) tartalmú vákuum vérgyűjtő csövekbe, egymás utáni centrifugálással 3000 fordulat/perc sebességgel 15 percig és 4 °C hőmérsékleten, majd izoláltuk a szérum felülúszó és konzerválás -80 C-on. Ezután a szíveket gyorsan összegyűjtöttük. Mindegyik szív infarktus határzónájának egy részét levágtuk és folyékony nitrogénben lefagyasztottuk Western blot analízishez, a másik szívszövetet pedig 4-ben rögzítettük. százalékos paraformaldehidet 24 óránál tovább.

Masson festése

Masson festést végeztünk a kollagén lerakódás kimutatására az infarktus határzónában. A paraformaldehiddel rögzített kamrákat paraffinnal ágyaztuk be, majd 5-μm-es metszetekre vágtuk. A metszeteket ezt követően Masson trikrómmal festették meg, ahol a kollagént kékre, a szívizomot rózsaszínre, a sejtmagot pedig feketére festették. A kollagén lerakódását az Image J szoftverrel (NIH, Bethesda, MD) 200-szoros nagyítás mellett számítottuk ki.

Immunhisztokémiai elemzés

Immunhisztokémiai analízist végeztünk a vaszkuláris endoteliális növekedési faktor receptor 2 (VEGFR2) denzitásának értékelésére, amelynek felszabályozása elősegítette az angiogenezist, amely üdvös és fontos volt az átépülés csillapításában (Rengo et al. 2013). A kamrai metszeteket a Masson-festéssel végzettekhez hasonlóan készítettük el, majd paraffinmentesítettük és rehidratáltuk. Ezután a metszeteket hőközvetített antigén visszanyerésben részesítettük, és 3 százalékos H, O-val kezeltük, hogy blokkoljuk az endogén peroxidázt, 1 ug/ml VEGFR2 antitesttel (Abcam, ab9530) 12 órán keresztül 4 fokos teljesítés mellett. Ezt követően a metszeteket torma-peroxidázzal (HRP) jelölt másodlagos antitesttel (1:200, Service, G1213) inkubáltuk 50 percig 37 fokos hőmérsékleten. Ezenkívül 3,3'-diaminobenzidint használtunk a pozitív festődés kialakítására, amely barna színben látható. Végül a VEGFR2 átlagos optikai sűrűségét Image-Pro Plus 6.0 szoftverrel (Media Cybernetics, USA) elemeztük és kiszámítottuk.

Terminális dezoxinukleotidil-transzferáz által közvetített nick-end címkézési (TUNEL) vizsgálat

Az apoptózist ezt követően a TUNEL vizsgálattal detektáltuk. A korábban gyártott, kamrai szövetet beágyazó paraffinmasszákat más szeletekre vágtuk a TUNEL-vizsgálathoz, majd TUNEL-festést végeztünk a kereskedelmi tesztkészlet (Roche, Svájc; 11684817910) gyártójának utasításai szerint. Röviden, a kamrai metszeteket TUNEL reagensnek tettük ki, ahol a TdT-t és a dUTP-t 1:9 arányban kevertük össze 1 órán át szobahőmérsékleten, a proteináz K inkubálása és a sejtmembrán felszakadása után. Végül a fluoreszcens képeket 530 nm-es hullámhosszon figyeltük meg, amelyet 450 nm-es emissziós hullámhossz (×400-as nagyítás) váltott ki. A kamrai szövetek apoptotikus arányát az egyes csoportokban Image Software segítségével elemeztük és kiszámítottuk.

Western blot

Western blot-ot alkalmazunk, hogy tisztázzuk azokat a mögöttes mechanizmusokat, amelyek révén Pino javította a PIHF-et. A fehérjeminta extrakciós és előkészítési eljárásai hasonlítottak a tanulmányunkban korábban leírtakhoz (Chen et al. 2020a). A membránokat a nukleáris faktor eritroid 2-rokon 2-es faktor (Nrf2), hem oxigenáz{{{{) elleni antitestekkel vizsgáltuk. 4}}(HO-1;1:2000, Abcam, ab189491),p53(1:1000,sejtjeltechnika,2524S), BCL-2 (1:1000, sejtjelző technológia, 2870P) ,bax (1:1000, Abcam, ab32503), hasított kaszpáz-3(1:1000, sejtjelző technológia, 9664 T), kollagén I (1:1000, Affinity, AF7001), glicerinaldehid-3- foszfát-dehidrogenáz (GAPDH, Service, GB12002), majd HRP-vel jelölt másodlagos antitestekkel (Service, G1213 és G1214) és kemilumineszcenciás detektáló reagensekkel történő megjelenítéssel. A blot képeket végül Image J szoftverrel elemeztük és számszerűsítettük.

H9c2 kardiomiociták tenyésztése és in vitro ártalmatlanítása A patkány szívkamrai eredetű H9c2 szívizomsejteket, amelyeket az American Type Culture Collection-től (CRL-1446) vásároltunk, tenyésztettük, hogy tovább igazoljuk a Pino in vitro hatását. A H9c2 kardiomiocitákat e Dulbecco módosított Eagle tápközegében (DMEM)/F12 tápközegben tenyésztettük, amely 10% magzati szarvasmarha szérumot (Sijiqing, Hangzhou, Kína) tartalmazott, 37 fokos hőmérsékleten, 95% levegőt és 5% CO-t tartalmazó atmoszférában. 90 százalékos növekedést követően 6-lyuklemezekre ültettük be, emellett 25 uM izoprenalint (ISO) tartalmazó szérum táptalajt cseréltünk normál táptalajra 3 mérőhelyben, hogy a sejteket 48 órán át inkubáljuk a HF-állapot utánzása érdekében. A szívelégtelenségre jellemző a szimpatikus tónus túlzott aktiválása és az -adrenerg receptor stimulációja, amely ROS-t generál (Velusamy et al. 2020). Ezután a sejteket 6 csoportra osztottuk: (i) kontrollcsoport; (ii) kontroll tápközeg 25 μM Pino-val 4 órán át (kontroll plusz Pino csoport); (i) 25 μM Pino-val és 5 μM ML385-tel együtt inkubált kontroll tápközeg 4 órán át (Nrf2 inhibitor); MCE, New Jersey, USA)(kontroll plusz Pino plusz ML385 csoport);(iv)ISO ​​csoport; v. ISO-médium 4-h inkubációval 25 μM Pino-val (ISO plusz Pino csoport); vi. ISO plusz 25 μM Pino plus 5 μM ML385 csoport. A gyógyszerek koncentrációja és inkubációs ideje korábbi tanulmányokra vagy utasításokra hivatkozott (Jin et al. 2015; Oliveira et al. 2017).

Újszülött patkány szívmiofibroblasztok tenyésztése és proliferációs vizsgálata

Újszülött patkány szívizom-miofibroblasztokat (CMF-eket) tenyésztettek, hogy megvizsgálják a Pino kollagénszekrécióra gyakorolt ​​hatását. A CMF-eket 3 napos újszülött patkányok segítségével különítettük el, hivatkozva korábban bemutatott módszerekre (Cui et al. 2021). Az izolált és darált szíveket 0,125 százalék tripszinnel emésztettük, majd egy koktélt, amely 0.25 százalék tripszint és 0,08 százalék kollagenázt tartalmazott többször, majd centrifugálást és Petri-csészébe történő átültetést végeztünk a sejteket a felülúszóból. Ezután a tápközeget a H9c2 kardiomiociták tenyésztéséhez használthoz hasonló szérum táptalajra cseréltük 90 perces adhézió után. A CMF-ek ugyanolyan ártalmatlanításban részesültek, mint a H9c2 kardiomiocitákon. Bevezettünk egy sejtszámláló készlet-8(CCK-8) tesztet (Dojindo, Japán) is a CMF-ek proliferációjának kimutatására, amikor mindegyik lyukban elérik az 1,5 × 10 fokos sűrűséget, egy mikrolemez-leolvasó segítségével 450 nm hullámhossz, ahol a magasabb érték fokozott proliferációs aktivitást jelez.

ROS észlelés

A Pino ROS-megkötő képességét dihidroetidium fluoreszcens szondával (DHE; Beyotime, Shanghai, Kína) mérték. A DMSO-ban oldott DHL-t 5 μM-ra hígítottuk a fagyasztott metszetekhez, vagy hozzáadtuk a hígítandó szérum táptalajhoz az utasításoknak megfelelően. A paraformaldehiddel rögzített szíveket lefagyasztottuk, majd felszeleteltük 4-μm-es metszetekre. A metszeteket vagy H9c2 kardiomiocitákat DHE oldattal együtt inkubáltuk 30 percig 37 °C hőmérsékleten, majd ezt követően fordított fluoreszcens mikroszkóppal (IX70; Olympus, Tokió, Japán) leképeztük. Röviden, a DNS-sel és RNS-sel töltött sejtmag kifejezetten vörösre festődött a nukleinsav és a DHE közötti affinitás miatt. Ezenkívül az erősebb fluoreszcencia intenzitás a ROS nagyobb felhalmozódását jelezte.

Biokémiai vizsgálatok

Biokémiai vizsgálatokat végeztünk a szérum BNP, SOD és malondialdehid(MDA) szérumban és sejtfelülúszójában a HF fenotípusra, illetve az oxidáns védekezésre utaló változásaira. A koncentrációt megfelelő biokémiai vizsgálati készlettel mértük a gyártó utasításai szerint (Jiancheng, Nanjing, Kína).

Ez a cikk Chen et al. Mol Med (2021) 27:100 https://doi.org/10.1186/s10020-021-00363-7