Podocita sérülés a Tlr8 és endogén liganduma MiR-21 kölcsönhatása következtében az elzáródott vesében és a mellékvesében

Kapcsolatba lépni:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

cistanche merevedési zavar vesével kapcsolatos

Míg a krónikus vesebetegség elterjedt a felnőtteknél, obstruktív nephropathiáról (ON) számoltak be fiatal és idős betegeknél egyaránt. ON-ban a tubulointerstitialis léziókat (TIL-eket) széles körben vizsgálták, de a glomeruláris léziókat (GL-eket) nagyrészt figyelmen kívül hagyták. Itt egy új mechanizmust mutatunk be, amely a GL fejlődésének hátterében áll az ON-ban fiatal és idős egerekben. A TIL-ek korábban fejlődnek ki, mint a GL-k a tubulointerstitiumban lévő gyulladásos sejtek beszivárgása miatt, de a GL-ek a Toll-like receptor 8 (Tlr8) aktiválását követően alakulnak ki, annak ellenére, hogy nincsenek a glomerulusba beszűrődő gyulladásos sejtek. A TLR8 és az interleukin 1 béta (IL1b) fehérjék redukáló podocita funkció markerekkel (PFM) kolokalizálódnak, jelezve a TLR8 jelátvitel aktiválását a sérült podocitákban. Ezenkívül a Tlr8 endogén ligandja, a miR-21 glomeruláris és szérumszintje magasabb volt az ON egérmodellben, mint az álkontrollban. A Tlr8 glomeruláris expressziója pozitívan korrelál a miR-21 és az Il1b és Il6 downstream citokinekkel, és negatívan korrelál a PFM-ekkel (Nphs1 és Synpo). Bemutatjuk a TLR8 és IL1b fehérjék kolokalizációját a PFM-ek csökkentésével mind az akadályozott, mind az IL1b fehérjékben.járulékosvesefiatal és öreg egerek. Ezen túlmenően, az in vitro vizsgálati eredmények azt mutatták, hogy a Tlr8 és annak downstream citokinjei nagyobb mértékben expresszálódnak az elzáródott glomerulusokban.vesemiR{0}} utánzó kezelést követően, mint a kontrollban. Összefoglalva, a Tlr8 túlzott expressziója elfogadható mechanizmusként szolgálhat a GL fejlődésének hátterében az ON-ban a podocita sérülésen keresztül.

Kulcsszavak: krónikus vesebetegség,obstruktív nephropathia, podocita, TLR8, elzáródott és kollaterális vese

BEVEZETÉS

Krónikus vesebetegség (CKD), amely jelentős közegészségügyi probléma, a teljes népesség 8–13 százalékában fordul elő (1). Idős embereknél gyakori a társadalom elöregedése miatt. Az obstruktív nephropathia (ON) nagy érdeklődésre tart számot a klinikusok körében, mivel különböző korcsoportokba tartozó betegeknél jelentették. Az ON kezelhető és visszafordítható, ellentétben a többi CKD-vel (2, 3). Gyermekeknél 1500 fiatal egyénben fordul elő, és előfordulása 1–5 százalékos a fejlett országokban (4, 5). Felnőtteknél az ON prevalenciája 1000-ből 5-től 10000-ből 5-ig terjed. Ezenkívül a krónikus unilaterális ON prevalenciája körülbelül 0,5 százalék, míg az akut egyoldali és krónikus kétoldali ON prevalenciája körülbelül 0,1 százalék (4–7).

Az ON akut vesekárosodáshoz vagy CKD-hez vezethet, ami a vesefunkció progresszív csökkenésével és a veseszerkezetek több mint 3 hónapig tartó megváltozásával jár (8, 9). Az egyoldali ureterelzáródás (UUO) egy széles körben használt stratégia a krónikus ON tanulmányozására. Az UUO vesében az ON-t hypertrophia, hydronephrosis, gyulladásos sejtek felszaporodása az intersticiális területen, hipoxia okozta tubuláris sejthalál és a tubulointerstitiumban kollagén lerakódás jellemzi, amit a tubulointerstitialis fifibrosis (TF) kialakulása követ (10).

A TF a végstádiumú vesebetegség fontos jellemzője, és a progresszív vesekárosodás fő meghatározója (11). A TF-et széles körben vizsgálták ON modellekben, de a glomeruláris sérülésekre, különösen a vér-vizelet gát (BUB) rendellenességeire vonatkozóan kevés adat áll rendelkezésre (8, 9, 12). Ezenkívül a tanulmányok a mellékvese tubulointerstitialis lézióit (TIL-eket) vizsgálták egyoldali ON esetén, de a glomeruláris elváltozásokat (GL-eket) nagyrészt figyelmen kívül hagyták (12). Számos jelentés feltárta a peritubuláris kapillárisok részvételét a TIL-ek progressziójában kísérleti ON-ban (13, 14). A glomerulus és a glomeruláris kapilláris azonban a nephron, illetve a peritubuláris kapillárisok tubuláris szegmenseibe folyik le. Ezért azt javasoljuk, hogy a glomerulonephritis a tubulointerstitiumot is érintheti. Korábbi tanulmányaink rávilágítottak a glomeruláris belső sejtek, elsősorban a podociták sérülésének hozzájárulására a GL-hez és az ezt követő TIL-fejlődéshez egy autoimmun betegség egérmodelljében a különböző Toll-szerű receptorok (TLR) túlzott expressziója miatt (15–18).

A glomeruláris kapilláris endotélium és a podociták fontos kapuőrök, amelyek BUB-okat tartalmaznak. E két epitélium között a podociták folyamatosan veszélyjelzéseknek vannak kitéve, beleértve a TLR ligandumokat, például a veszélyhez kapcsolódó molekuláris mintákat (DAMP) vagy a kórokozókhoz kapcsolódó molekuláris mintákat (PAMP), a glomerulusokban való egyedi lokalizációjuk miatt (15). Ezért úgy gondolják, hogy a podocitákban lévő TLR-ek és endogén ligandumaik közötti kölcsönhatás hozzájárul a podocita sérüléséhez nem fertőző körülmények között. Jelen tanulmányban a GL fejlődésére összpontosítottunk fiatal és idős egerek elzáródott és mellékveséjében egyaránt, mivel az ON gyakran megtalálható fiatal és idősebb emberekben is. Tisztáztuk, hogy a GL-t ON-ban fejlesztették ki a podocita sérülés következtében a Tlr8 túlzott expressziója révén fiatal és idős egerek elzáródott és kollaterális veséiben egyaránt.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Etikai nyilatkozat és kísérleti állatok elhelyezése Minden laboratóriumi állatokkal végzett kísérletet jóváhagyott a Hokkaido Egyetem Állatorvosi Karának Intézményi Állatgondozási és Felhasználási Bizottsága (jóváhagyási szám: 16- 0124). A szerzők követték a Hokkaido Egyetem Állatorvostudományi Karának laboratóriumi állatok gondozására és használatára vonatkozó jóváhagyott útmutatóját (amelyet a Laboratory Animal Care International Assessment and Accreditation Association jóváhagyott). A hathetes C57BL/6N egereket a Japan SLC Inc.-től (Hamamatsu, Japán) vásároltuk, és specifikus patogénmentes körülmények között tartottuk őket világos-sötét 1:1 arányú környezetben. A kísérleti állatokat ad libitum táplálékkal és ivóvízzel látták el.

Kísérleti tervezés Fiatal (9 hetes) és idős (12 hónapos) egereket egyaránt használtunk. Az egyes korcsoportokba tartozó egereket (n=4) vagy álműtétnek (kontrollcsoport) vagy UUO-nak (2, 7, 11 és 21 nap) vetették alá, hogy létrehozzák az ON-modell vesét, amint azt előző vizsgálatunkban leírtuk. (13).

Minta-előkészítés Az egereket mélyen érzéstelenítettük érzéstelenítő szerek keverékével a korábban leírtak szerint (16), és nyaki diszlokációval elaltattuk. Vérmintákat vettünk a femorális artérián keresztül a szérummarker elemzéshez. Mind az UUO-t, mind a mellékveséket összegyűjtöttük és vékony szeletekre vágtuk. A veseszeleteket 10 százalékos semleges puffer-formalinnal (NBF), 4 százalékos paraformaldehiddel (PFA) és 2,5 százalékos glutáraldehiddel (GTA) rögzítettük a kórszövettani, immunhisztokémiai és elektronmikroszkópos vizsgálatokhoz.

Immunhisztokémia és immunfluoreszcens NBF-fixált paraffin blokkokat 2 mm vastagságban vágtunk, és Schiff-hematoxilin (PAS-H) periodikus savval megfestettük a vese kórszövettani vizsgálata céljából. A sejtmarkerek immundetektálását a korábban leírtak szerint (16) végeztük el B-sejtek (B220), T-sejtek (CD3), kapilláris endotélium (CD31), IL1b, makrofágok (Iba1), podociták (podocin és szinaptopodin) és TLR8 esetében. A festési körülményeket az 1. táblázat tartalmazza.

Hisztoplanimetriás PAS-H és immunfestett vesemetszeteket virtuális tárgylemezekké alakítottunk Nano Zoomer 2 segítségével.0 RS (Hamamatsu Photonics Co., Ltd.; Hamamatsu, Japán). A pozitív sejteket véletlenszerűen kiválasztott 20 glomerulusból vagy a tubulointerstitiumból származó 20 gócból számoltuk meg 400-szoros nagyítással NDP.view2 szoftverrel (Hamamatsu Photonics Co., Ltd.). A PAS-H-val festett metszetekből 20 glomerulus képét is rögzítettük 400-szor minden egérből egy All-in-One Fluorescence Microscope BZ-X710 (Keyence, Osaka, Japán) segítségével. A glomeruláris mezangiális területet és méretét a rögzített képekből BZ-X Analyzer (Keyence) segítségével mérték.

Glomerulus izolálása RNS extrakcióhoz és tenyésztéshez Álműtéttel és UUO vesékből származó glomerulusokat izoláltunk a korábban leírtak szerint (16). Röviden, az egereket mélyen érzéstelenítettük, és a bal kamrán keresztül perfundáltuk 40 ml Hank-féle kiegyensúlyozott sóoldattal (HBSS), amely Dynabeads-t (8 × 107; Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) tartalmazott. A vesét kivágták

és apró darabokra vágjuk. A sejteket ezután kollagenáz A-val (1 mg/ml; Roche, Basel, Svájc) és dezoxiribonukleáz I-gyel (100 U/ml; Life Technologies) emésztettük HBSS-ben 37 fokon 30 percig. Az emésztett szövetet tartalmazó szuszpenziót egy 100- mm-es sejtszűrőn (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ, USA) finoman átnyomtuk egy lapított mozsártörő segítségével. A kapott sejtszuszpenziót 200 x g-vel 5 percig centrifugáltuk, és a sejtüledéket 2 ml HBSS-ben újraszuszpendáltuk. A Dynabeads gyöngyöket tartalmazó glomerulusokat mágneses részecskekoncentrátorral (Life Technologies) gyűjtöttük össze, és RNS izolálására használtuk.

Reverz transzkripció és valós idejű PCRA teljes RNS-t a glomerulusokból RNeasy kit (Qiagen, Hilden, Németország) segítségével izoláltuk. A cDNS-t teljes RNS-ből reverz transzkripcióval szintetizáltuk a ReverTra Ace reverz transzkriptáz enzim (Toyobo, Osaka, Japán) és random dT primerek (Promega) segítségével. A cDNS-t valós idejű PCR-ben használták Brilliant III SYBR Green QPCR master keverékkel és Mx3000P-vel (Agilent Technologies, La Jolla, CA, USA). A glomeruláris génexpressziót az Actb expressziójára normalizáltuk. A használt primer párokat a 2. táblázat mutatja.

Reverz transzkripció és TaqMan-alapú valós idejű PCRA teljes RNS-t, beleértve a mikroRNS-t (miRNS) is az izolált glomerulusokban, miRNeasy kit (Qiagen) segítségével izoláltuk. miRNS-specifikus stem-loop RT primereket, reverz transzkriptázt, reverz transzkripciós puffert, dNTP-ket és RNáz inhibitort használtunk a teljes RNS reverz átírására a gyártó utasításai szerint (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). A kapott cDNS-sel valós idejű PCR-t hajtottunk végre miR-21- specifikus TaqMan primerek és specifikus próbák (Applied Biosystems), TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) és Mx3000P (Agilent Technologies) felhasználásával.

Izolált glomerulusok in vitro kezelése utánzókkalA glomerulusokat áloperált és UUO-ból izoláltukvese11 napos elzáródás után. Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) táptalajt (Fujifilm Wako, Japán), amely 300 glomerulust tartalmazott, egy 96-lyuktenyésztő lemez (TPP, Trasadingen, Svájc) minden lyukába elosztottuk. PBS-sel, negatív kontrollal és miR-21 mimikával (UAG CUU AUC AGA CUG AUG UUG A) (Bioneer, Daejeon, Dél-Korea) kezelték 1 pmol/µl koncentrációban 4 órán át 37 fokon 5 százalékos CO2-ban. A Tlr8 és downstream citokinek expresszióját az előző részben leírtak szerint mértük.

Pásztázó elektronmikroszkópRutin pásztázó elektronmikroszkópiához (SEM), kicsivese szeleteket2,5%-os GTA-val fixáltuk 4 órán át, majd utófixáltuk 1%-os ozmium-tetroxiddal 1 órán át, majd 1%-os csersavas kezeléssel 1 órán át. A mintákat ezután 1%-os ozmium-tetroxiddal fixáltuk 1 órán át, majd 0,5%-os, illetve 1%-os csersawal kezeltük 10 percig, illetve 1 órán keresztül.Veseszeleteketemelkedő minőségű alkohollal dehidratáltuk, 3-metil-butil-acetátba vitték át, végül HCP-2 kritikus pont szárítóval (Hitachi, Tokió, Japán) szárították. A mintákat ionporlasztásnak vetettük alá, majd S-4100 pásztázó elektronmikroszkóppal vizsgáltuk 12 kV-os gyorsított feszültség mellett.

Statisztikai analízisAz értékeket átlag ± standard hiba (se) formájában fejezzük ki. Az eredmények statisztikai elemzése nem paraméteres Mann–Whitney U-teszttel történt (P < 0.05).="" a="" kruskal-wallis="" tesztet="" három="" vagy="" több="" populáció="" összehasonlítására="" használták,="" és="" scheffe="" módszerével="" többszörös="" összehasonlítást="" végeztek,="" miután="" szignifikáns="" különbségeket="" észleltek="" (p="">< 0,05).="" a="" két="" paraméter="" közötti="" korrelációt="" spearman-féle="" rangkorrelációs="" együttható="" teszttel="" elemeztük="" (p=""><>

EREDMÉNYEK

TIL-ek és GL-ek fiatal egerek elzáródott veséjébenElőször vizsgáltuk a TIL-eket és a GL-eket olyan fiatal egerek áloperált és UUO veséiben, amelyek különböző időtartamokig obstrukciónak voltak kitéve. Míg az áloperált vesék normális tubulointerstitiumot mutattak (1A. ábra), addig az elzáródott vesék 2 napos UUO után TIL-eket mutattak, és a tubulusok kitágulása jellemezte őket; néhány tubulusban húgyhólyag is volt. Az ilyen elváltozások az elzáródás előrehaladtával növekedtek (1A. ábra). A GL-eket, főként glomerulosclerosis-t, a késői stádiumban, az UUO-t követő 21. napon figyelték meg, és periodikus sav-Schiff (PAS)-pozitív anyagok lerakódásával jellemezték. A glomeruláris szerkezet normális volt mind az ál-, mind a korai UUO-vesékben (2, 7 és 11 nap) (1B. ábra). A glomeruláris sejtek száma az elzáródást követő -11 napig nőtt, és a -21 napon csökkenni kezdett az UUO vesékben (1C. ábra). A glomeruláris mezangiális felhalmozódás az obstrukciót követő 7 naptól kezdve növekedett (1D. ábra).

hiányzott az UUO vesék glomerulusainak közepén az elzáródást követő 21. napon (1F ábra). A polimeráz láncreakció a PFM-ek (Nphs1 és Synpo) szignifikáns csökkenését mutatta ki UUO vesékben 21 nappal az elzáródás után (1G. ábra). Ezenkívül a SEM-analízis normál podocita lábfolyamatokat (PFP) tárt fel az áloperált vesékben; azonban PFP kiürülést és mikrobolyhos struktúrákat jelentettek UUO vesékben 21 nappal az elzáródás után (1H ábra). Ezek az eredmények együttesen azt sugallják, hogy az elzáródás után 21 nappal podocita sérülés fordul elő az elzáródott vesében.

Az infifiltráló immunsejtek hiányoznak az elzáródott vesében Korábban kimutattuk, hogy a podocita károsodás korrelál a glomerulusban lévő infifiltráló immunsejtekkel (13, 16, 18). Ezért megvizsgáltuk a B- és T-sejtek, valamint a makrofágok infifiltrációját áloperált és UUO vesék TIL-eiben és GL-eiben (2. ábra). Számos infifiltráló B-, T-sejt és makrofág volt megfigyelhető az UUO vesék TIL-jében az obstrukciót követő összes napon, de ezek szinte hiányoztak vagy alig voltak jelen mind az ál-, mind az UUO-vesék glomerulusaiban (2A–E. ábra). A B-, T-sejtek és makrofágok száma nagyon kevés volt a glomerulusban (az adatokat nem mutatjuk be), de szignifikánsan magasabb a glomerulusokban.

a 2-, 7-, 11- és 21-napos vesék tubulointerstitiumát az álvese tubulointerstitiumához képest (2F ábra). Ezért a beszűrődő immunsejtek hozzájárulhatnak a TIL-ek kialakulásához az elzáródott vesében. A GL fejlesztésével azonban más tényezők is összefügghetnek.

A TLR család különböző tagjainak és a downstream citokinek expressziója fiatal egerek áloperált és elzáródott veséiben Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a különböző TLR-ek nagyobb mértékben expresszálódnak a beteg vesék podocitáiban (15, 16, 19, 20). Érdekes módon adataink a Tlr8 és Tlr9 szignifikánsan magasabb expresszióját mutatták ki az UUO 21-napos csoportból izolált glomerulusokban, mint a hamis csoport glomerulusaiban (3A. ábra). Továbbá megvizsgáltuk a TLR családtagok downstream citokinek expresszióját az ál- és UUO 21-napos csoportok glomerulusaiban, és szignifikáns upregulációt találtunk az interleukin 1 bétát (Il1b) és az interleukin 6-ot kódoló gének expressziójában. (Il6) az UUO csoportban a színlelt csoporthoz képest (3B. ábra).

TLR8 kolokalizált PFM-mel Mivel a Tlr8 és Tlr9 expressziója magas volt az elzáródott veséből izolált glomerulusokban, lokalizációjukat immunfluoreszcens festéssel vizsgáltuk. A TLR8 fehérjét nem mutatták ki az áloperált vesékben (4A. ábra), de a PFM szinaptopodinnal kolokalizálták az UUO vesében (4B. ábra). Ezenkívül nem sikerült kimutatnunk a TLR9 fehérje expresszióját sem az áloperált, sem az UUO egerek vesében (az adatokat nem mutatjuk be).

IL1b termelés podocitákból fiatal egerek elzáródott veséjében Ahogy a 3B. ábrán látható, a glomeruláris Il1b (a TLR család egyik downstream citokinje) expressziója szignifikánsan magasabb volt az UUO vesében a 21. napon, mint az álvesében. Ezért immunfluoreszcens festéssel vizsgáltuk az IL1b forrását az UUO vesék glomerulusaiban. Az IL1b fehérje expresszióját nem mutatták ki az álvese glomerulusaiban, de az UUO vesék glomerulusaiban megfigyelték (4C, D ábra). Ezenkívül az IL1b PFM podocinnal kolokalizálódott (4D ábra).

az UUO-banvese21 napnál, mint az álságosnálvese.Ezért immunfluoreszcens festéssel vizsgáltuk az IL1b forrását az UUO vesék glomerulusaiban. Az IL1b fehérje expressziója nem volt kimutatható az ál glomerulusokbanvesede az UUO glomerulusaiban figyelték megvese(4C., D. ábra). Ezenkívül az IL1b PFM podocinnal kolokalizálódott (4D ábra).

A feltételezett endogén Tlr8 ligandum megnövekedett szintje ON modell egerekben Egy korábbi tanulmány kimutatta, hogy a miR-21 ligandumként szolgál a TLR8 számára (21). Ezért összehasonlítottuk a miR-21 glomeruláris és szérumszintjét az ál- és az UUO 21-napos csoportok között. Érdekes módon az UUO 21-napos csoport szignifikánsan magasabb glomeruláris miR-21 szintet mutatott, mint az ál-csoportban (P < 0,05),="" azonban="" a="" szérum="" mir{="" növekvő="" tendenciája="" az="" előbbi="" csoportban="" {10}}="" volt="" megfigyelhető,="" mint="" az="" utóbbiban="" (p="0,06)" (4e.="">

A Tlr8 kifejezés összefüggése a miR-21 ligandumával és a PFM-ekkel az akadályozott területenVeseAmint a 3. táblázatban látható, szignifikáns pozitív korrelációt figyeltünk meg a Tlr8 mRNS és endogén liganduma (miR-21), valamint a downstream citokinek Il1b és Il6 glomeruláris expressziója között. Másrészt negatív korreláció volt nyilvánvaló a Tlr8 mRNS és az Nphs1 és Synpo PFM-ek között.

A glomerulusok in vitro stimulálása miR{{0}} utánzóval aktiválja a Tlr8 és downstream citokinek expresszióját A Tlr8 expressziója nőtt (P=0.06), de downstream citokinjei (Ifng és Il1b) szignifikánsan (P < 0,05 és 0,01) megemelkedtek az álegerek glomerulusaiban

miR{0}} mimikával, összehasonlítva a PBS-sel és a negatív kontrollutánzó egerek glomerulusaiban végzett kezeléssel (5A. ábra). Azonban nem figyeltek meg szignifikáns korrelációt a Tlr8 és a downstream citokinek expressziója között az ál egerek glomerulusaiban a mimikai kezelést követően (4. táblázat). A Tlr8 és downstream citokinek expressziója szignifikánsan magasabb volt az UUO glomerulusaibanvese, miR-21-kezelést követően, mint az UUO glomerulusaiban lévőkvesePBS-sel és negatív kontrollutánzóval kezeltük (5B. ábra). Szignifikáns korrelációt mutattak ki a Tlr8 expressziója és a downstream citokinek között az UUO vese glomerulusaiban mimikai kezelést követően, ami a Tlr8- által közvetített nukleáris faktor kappa B (NF-kB) útvonal magasabb aktiválódására utal. proinflammatorikus citokinek szekréciója az elzáródott vesében (4. táblázat).

TLR8 lokalizáció és podocita sérülés fiatal egerek mellékveséjébenAz áloperált vesék normális glomerulusokat mutattak, míg a kollaterális vesék glomeruláris hipertrófiát, megnövekedett glomeruláris sejtszámot és a glomeruláris kapillárisok tágulását mutatták (6A. ábra). Az áloperált vesékből származó glomerulusok pozitívak voltak a szinaptopodin expresszióra, és hiányzott a TLR8 expressziója (6B. ábra). Másrészt a mellékvesék elvesztették a szinaptopodin expressziót a glomerulusok közepén, de TLR8 expressziót mutattak a glomeruláris sebesség mentén (6C. ábra). Ezenkívül a TLR8 fehérjét a szinaptopodinnal együtt lokalizálták (6C. ábra). Az áloperált vesék a podocin normális expresszióját mutatták, de az IL1b nem expresszálódott a glomerulusokban (6D. ábra). A mellékvese glomerulusai azonban elvesztették a podocin expresszióját a központban, de az IL1b expressziója a glomeruláris sebesség mentén volt (6E ábra). Ezenkívül az IL1b fehérjét podocinnal kolokalizáltuk (6E. ábra). A SEM-analízis normál PFP-ket mutatott ki az áloperált egérvesékben, de PFP kifakadás és mikrobolyhos struktúrák voltak láthatók a mellékvesékben (6F ábra).

TLR8 lokalizáció és podocita sérülés idős egerek elzáródott és mellékveséjébenAz áloperált vesék a szinaptopodin normális expresszióját mutatták, de nem mutattak ki TLR8 fehérje festődést a glomerulusaikban (7A. ábra). Érdekes módon mind a kollaterális, mind az UUO vesék a szinaptopodin expressziójának elvesztését mutatták a glomerulusok központjában, de a TLR8 expressziója megmaradt a glomeruláris rete mentén (7B, C ábra). A TLR8 fehérjét szinaptopodinnal kolokalizáltuk a kollaterális és az UUO vesékben (7B, C ábra). Az áloperált vesék hasonlóan normális podocin-expressziót mutattak, de a glomerulusaikban nem volt IL1b-expresszió (7D. ábra). Másrészt mind a kollaterális, mind az UUO vesék elvesztették a podocin expressziót a glomerulusok közepén, de IL1b expressziót mutattak a glomeruláris rete mentén (7E, F ábra). A pozitív festődést podocinnal kolokalizálták a kollaterális és az UUO vesék glomerulusaiban (7E, F ábra). A SEM-vizsgálat normál PFP-ket tárt fel az áloperált egérvesékben, PFP kiürülést és mikrobolyhos struktúrákat az öreg egerek kollaterális és UUO veséjében (7G. ábra).

VITATOVÁBB

előfordulása gyakori csecsemőknél és időseknél (4-7). Ezért a fiatal és idős egereket UUO-nak vetettük alá, hogy utánozzuk a különböző korcsoportok egyedeinek ON állapotát, és megvizsgáltuk a TIL-eket és a GL-eket. Az elzáródott vesében a TIL-ek progressziója nyilvánvaló volt az obstrukció egy korábbi szakaszában (2 nap); azonban a GL-ek progresszióját a podocita sérüléssel együtt egy későbbi szakaszban figyelték meg. A mellékvese egyidejűleg mutatott GL-t és podocita sérülést. Ez a megfigyelés azt jelzi, hogy a podocita sérülés mind az elzáródott, mind a mellékvesékben előfordul, bár a kezdeti inzultus változhat. Korábbi vizsgálataink rávilágítottak a podocita sérülés és a glomerulusban lévő immunsejtek infiltrációja közötti összefüggésre (13, 16, 18). A jelen vizsgálatban azonban nem figyeltek meg immunsejt-infiltrációt sem az ál-, sem az elzáródott vesék glomerulusaiba. Ezért figyelembe vettük más tényezők részvételét a podocita sérülésében az elzáródott vesében. Feltételeztük, hogy a keringési eredetű vagy a sérült tubuláris epitéliumból származó veszélyjelzések (DAMP-k vagy PAMP-ok) hozzájárulhatnak a podocita sérüléséhez ON-ban, a glomerulusban való egyedi elhelyezkedése miatt. Fontos, hogy a DAMP-ok és a TLR-ek közötti kölcsönhatásról kimutatták, hogy fontos szerepet játszik a nem fertőző betegségek patogenezisében (15). A TLR család különböző tagjai a sejtplazmamembránon vagy az intracelluláris vezikulákon (22) expresszálódnak, és veleszületett immunérzékelőkként jellemzik őket, amelyek hatékonyan ismerik fel a DAMP-okat vagy PAMP-okat. A megfelelő DAMP-okkal vagy PAMP-okkal történő aktiválás után a TLR-ek fokozták a downstream citokinek expresszióját az NF-kB útvonalon keresztül, és indukálták a gazdaszervezet védekező rendszerét (22). Ezenkívül a DAMP-ok a szöveti sérülés jelenlétét továbbítják az immunsejtekhez vagy a helyi belső sejtekhez, és ennek következtében súlyosbítják a szövetkárosodást (23–26). Fontos, hogy minden TLR aktiválja az NF-kB útvonalat, amely szabályozza egy sor gyulladásos citokin gének expresszióját (27). Ezenkívül a TLR-ek aktiválása jelzi az NF-kB aktiválását, amely a gyulladásért felelős és a sérült szövetek patogeneziséhez kapcsolódik (28). Shichita et al. feltárta az endogén ligandumok és a TLR2 vagy TLR4 közötti patológiás kölcsönhatásokat, amelyek hozzájárulnak az ischaemiás agysérüléshez (25). Korábbi vizsgálatok azt is kimutatták, hogy a TLR család tagjai képesek TIL-t (TLR2, 4, 5, 7 és 11) és GL-t (TLR1–6, 8 és 9) indukálni a vesében (17, 29–33). ). Jelen vizsgálatunkban podocita sérülést találtunk elzáródott és kollaterális vesékben, és tisztáztuk a

a TLR család különböző tagjainak szerepe, amelyek hozzájárulhatnak a podocita sérüléshez (15, 16, 19, 20). Amint azt feltételeztük, a Tlr8 és Tlr9 glomeruláris expressziója magasabb volt az UUO veséből izolált glomerulusokban, mint az áloperált egerekből származó glomerulusokban. Ezenkívül az NF-kB útvonalhoz kapcsolódó gyulladásos citokinek, köztük az Il1b és Il6 glomeruláris expressziója magasabb volt az UUO vesében az obstrukciót követő 21. napon. Ezért arra a következtetésre jutottunk, hogy a TLR által közvetített NF-kB útvonal fontos szerepet játszik a GL patogenezisében az obstruktív vesében. A TLR család többi tagjától eltérően a TLR8 és a TLR9 a sejtek endoszómáiban kimutatható. A TLR8 felismeri a mikroorganizmusokból származó egyszálú RNS-eket és rövid kétszálú RNS-eket, és aktiválja számos NF-kB által közvetített citokin termelését (22). Másrészt, a TLR9 felismeri a kétszálú DNS-eket, és aktiválja az NF-kB útvonalat, hogy downstream citokineket termeljen (16, 34). Ebben a vizsgálatban csak a TLR8 fehérje és a PFM szinaptopodin kolokalizációját ismertük fel a glomerulusokban. Korábbi tanulmányaink azt is kimutatták, hogy mind a TLR8, mind a TLR9 kolokalizálódik a PFM-ekkel, és aktiválja az NF-kB által közvetített gyulladásos citokintermelést, hogy podocita károsodást okozzon (15, 16). Ezenkívül más tanulmányok kimutatták a patológiás korrelációt a TLR által közvetített útvonalak és a podocita sérülések között in vitro (34, 35). Banas et al. feltárta a TLR4 kölcsönhatását podocitákban az immunrendszerrel a GL fejlődése során (35). Így a podociták a TLR által közvetített útvonalakon keresztül hozzájárulhatnak az immunrendszer felügyeletéhez. Ebben a vizsgálatban kimutattuk a TLR8 gén expresszióját és a fehérje lokalizációját az elzáródott vese podocitáiban, valamint a downstream citokinek magasabb expresszióját a glomerulusban. Ezért arra a következtetésre jutottunk, hogy a TLR{40}}közvetített útvonalak hozzájárulnak a GL fejlődéséhez az elzáródott vese podocita sérülése révén.

Egy korábbi tanulmány kimutatta, hogy a miR-21, a TLR8 endogén liganduma, képes elérni és kötődni a TLR8-hoz a sejt endoszómáiban, ahol indukálhatja az NFkB útvonal TLR8-közvetített aktiválását és gyulladásos citokinek szekrécióját. (21). Jelen tanulmányban szignifikánsan magasabb glomeruláris miR-21-szintet, valamint emelkedett szérum miR-21-szintet találtunk az UUO vesében, mint az álkontrollokban, és kimutattuk, hogy ez összefüggésben áll a Tlr8 glomeruláris expressziójával. . Érdekes módon a miR-21-utánzással kezelt UUO vesék glomerulusai magasabb Tlr8-t és downstream citokinek expresszióját mutatták, mint a miR-21 mimikával kezelt ál egerek glomerulusaiban, ami az endogén miR fokozott elérhetőségét jelzi. -21 az elzáródott vese sérült szöveteiből és a Tlr8 túlzott expressziójának aktiválása az UUO vesékben, összehasonlítva a színlelt vesékkel. Együtt arra a következtetésre jutottunk, hogy az elzáródott vesében nagyobb mennyiségű miR-21 jut el a podociták endoszómáihoz, és indukálja az NF-kB útvonal Tlr8-közvetített aktiválását és proinflammatorikus citokinek szekrécióját. Ezek a citokinek pedig részt vesznek a GL fejlődésében podocita sérülésen keresztül.

Az IL1b az NF-kB-útvonal egyik fontos downstream citokinje, amelyet főként a glomerulusban lévő podociták termelnek betegség esetén. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy az IL1b podocita sérülést indukál a PFM-ek csökkentésével (36, 37). Jelen tanulmányban az Il1b magasabb glomeruláris expresszióját és PFM-ekkel való kolokalizációját mutattuk ki, ami csökkent expressziót mutatott. Ezenkívül az Il1b glomeruláris expressziója korrelált a Tlr8-cal, és hajlamos volt korrelálni a PFM-ek (Nphs1 és Synpo) expressziójával. Ezért ezek az eredmények azt mutatják, hogy a Tlr8-tól lefelé ható faktorok, beleértve az Il1b-t és az Il6-ot, podocita sérülést okozhatnak az elzáródott vesében a PFM expresszió csökkentésével.

A fiatal egerek mellékveséi szintén GL-t és PFM-veszteséget mutattak. Ezt az eredményt a SEM megerősítette, amely podocita sérülést mutatott ki a kollaterális vesében. Az ON egérmodellben a szérum miR{0}} magasabb szintjét is találtuk. Ezenkívül az IL1b fehérje a PFM-mel együtt lokalizálódott. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a szérum miR-21 kölcsönhatásba lép a TLR8-cal a kollaterális vese podocitáiban, és aktiválja a downstream citokinek termelődését, ami viszont csökkenti a podocita működését és a podocita sérülését. Podocita sérülést figyeltek meg öreg egerek elzáródott és mellékveséjében is, a fiatal egereknél megfigyelthez hasonló mechanizmus révén.

Összefoglalva (8. ábra), a glomeruláris miR-21 expressziója megemelkedett egyoldali ureterelzáródást követően, ahol kölcsönhatásba lép a podocitákban lévő TLR8-cal, és indukálja a downstream citokinek (Il1b és Il6) termelődését, ami az NF-kB útvonal aktiválására utal. A citokinek magasabb szintje csökkenti a PFM-eket, ami podocita sérülést és ezt követő GL-ek kialakulását eredményezi. A szérum miR-21 emelkedett szintje aktiválja a TLR8-at a mellékvese podocitáiban, és podocita sérülésen keresztül GL-t indukál. Ezért ez a tanulmány egyértelműen mutatja a GL fejlődését az elzáródott és mellékvesékben a Tlr8 túlzott expresszióját követő podocita sérülés következtében.