Poli- és oligoszacharid Ulva Sp. Az enzimekkel segített extrakcióból származó frakciók modulálják az extracelluláris mátrix anyagcseréjét

Kérlek keress feloscar.xiao@wecistanche.comtovábbi információért

Absztrakt:Ulva sp. ismert, hogy bioaktív vegyületek, például furgonok forrása, de a humán dermális fibroblaszt extracelluláris mátrixra (ECM) gyakorolt ​​biológiai aktivitásukról keveset számoltak be. Ebben a munkában először vizsgálták az ECM szabályozását mind proteomikai, mind transzkriptomikus szinten normál humán bőr dermális fibroblasztokban, 48 órás inkubációt követően Ulva sp. enzimekkel segített extrakció és depolimerizáció után nyerik. A sejtproliferáció fokozódását (legfeljebb plusz 68%-kal), anélkül, hogy bármilyen citotoxikus hatást kifejtett volna a fibroblasztokra, mindkét frakciónál 50 és 1000 ug/ml koncentrációban mutatták ki. Proteomikus szinten az 1000 ug/ml koncentrációjú poliszacharid frakciók fokozták leginkább a glükózaminoglikánok (GAG-ok, akár plusz 57 százalék), az összkollagén szintézisét, különösen az I-es (plusz 217 százalékig) és a Ⅲ típusúak szintézisét, valamint a szintézist. és az MMP-1 (Matrix Metalloproteinase-1, akár plusz 309 százalék) aktivitása. Ezzel szemben az oligoszacharid-frakciók nem voltak hatással a GAG-szintézisre, de hasonlóságokat mutattak a kollagén és az MMP{12}} szabályozásában.puritánok c-vitaminTranszkriptomikus szinten a COL1A1 és COL1A2 expresszió csökkenése, valamint a COL3A1 és MMP{6}} expresszió növekedése megerősítette az ECM metabolizmusának mindkét frakció általi modulációját. Kutatásunk hangsúlyozza, hogy a poli- és oligoszacharid Ulva sp. frakciók érdekes biológiai aktivitást mutatnak, és támogatják potenciális alkalmazásukat a bőrmegújítás területén öregedésgátló dermokozmetikai alkalmazásokhoz.

kérjük kattintson ide további információkért

Kulcsszavak:kollagén; extracelluláris mátrix; humán dermális fibroblaszt; mátrix metalloproteináz; hínár; Ulva sp.

1. Bemutatkozás

Az Uloa sp. Bretagne-ban (Franciaország) a tengeri eutrofizáció miatt visszatértek. A zöld hínár partjainak mélyreható káros ökológiai hatásai vannak, beleértve az ökoszisztéma szerkezetének megváltozását, az őshonos biodiverzitás csökkenését és gazdasági veszteségeket [1,2]. Eltekintve a talajjavító hasznosítástól, az állati takarmányozástól, vagy az egyszerű bomlástól vagy égéstől, az Uloa sp. az emberi egészségben [1]. Azonban Ulloa sp. fontos forrása olyan vegyületeknek, mint az ulvánok. Az Evans, vízben oldható szulfatált sejtfalpoliszacharidok, amelyek főként ramnózból, uronsavból és xilózból állnak, az Ulloa száraz tömegének akár 36 százalékát is képviselhetik [3]. Az ulván két fő ismétlődő diszacharid egysége az aldobiuronsavak (ulvanobiuronsavak), A típus: -D-glükuronsav (1,4) -L-ramnóz 3-szulfáthoz kapcsolódik, és B típus: -L- iduronsav (1,4) -L-ramnóz 3-szulfáthoz kapcsolódik. Kisebb diszacharid aldózok, úgynevezett ulvanobiózisok (U típusú) is megtalálhatók az ulvanban[3.4]. Az Ulvan extrakció mennyiségi hozama és minősége jelentősen eltérhet a biomasszánál alkalmazott extrakciós és frakcionálási módszerektől függően. Az ulvánokat általában vizes oldatban extrahálják magas hőmérsékleten (80-90 fok), amelyet macerációs eljárásnak neveznek. Az Evans azonban kinyerhető egy újszerű zöld technológiával, az enzimaszisztált extrakcióval (EAE)[5]. Az EAE lehetővé teszi a kérdéses vegyületek extrakcióját denaturáló körülmények, például oldószerek vagy magas extrakciós hőmérséklet alkalmazása nélkül, és számos előnyt mutat, mint pl. nagy katalitikus hatékonyság, nagy specificitás, enyhe reakciókörülmények és a vegyületek biológiai aktivitásának megőrzése. Az EAE emellett javítja a hozamot, valamint csökkenti a költségeket és az energiafogyasztást a klasszikus macerációs eljáráshoz képest [6-9]. A macerálásból vagy egy új eljárásból, például az EAE-ből végzett vizes extrakciót követően az ulván-dúsítást gyakran etanolos kicsapási eljárással végzik [3]. Az Ulvans in vitro és in vivo számos biológiai aktivitást mutatott ki, például immunmoduláló, antioxidáns, rákellenes, véralvadásgátló, antihiperlipidémiás vagy vírusellenes [3,5,10-14].szistancheAz Evans szerkezeti jellemzői (szulfatációs fok, szulfatációs mintázat, monoszacharid összetétel, glikozidos kötések, elágazás mértéke, valamint molekulatömeg) befolyásolják biológiai aktivitását [3]

A bőr öregedése egy összetett folyamat két egymást kiegészítő folyamattal: belső (genetikai, sejtanyagcsere stb.) és külső (UV-expozíció, környezetszennyezés, dohányzás stb.)[15-17]

A Cistanche öregedésgátló hatású

Újonnan jelent meg a tengeri moszat bioaktív anyagok nagy hozzáadott értékű termékek forrásaként történő felhasználása a dermokozmetikai ipar számára. Ezen bioaktív vegyületek közül az ulvánok nagy potenciállal rendelkeznek. Valójában az elmúlt években nőtt a fogyasztói igény a természetes termékek iránt, ami a tengeri termékeket és különösen a tengeri moszatot a bőr szépségét és egészségét célzó természetes összetevők érdekes forrásává teszi [18-22]. A bőr, a kozmetikai termékek célpontja, három nagy, egymástól jól átfedő rétegből áll: epidermiszből, dermiszből és hypodermiszből.mi az a cistancheA dermis támogatja az epidermiszt, és fontos bőrsejteket tartalmaz, amelyeket fibroblasztoknak neveznek. A fibroblasztok, a papilláris dermisz fő sejtjei, amelyek közvetlenül az epidermisz alatt találhatók, lényegében az extracelluláris mátrixot (ECM) szintetizálják és szervezik. Az ECM különböző makromolekulákból áll, beleértve a kollagéneket (a száraz tömeg 70 százaléka), főleg az I. és III. típusú kollagéneket, az elasztint (2-4 százalék), a glikoproteineket (fibronektin, laminin stb.), a glikozaminoglikánokat (GAG-okat) vagy szulfatált (heparán) szulfát, dermatán-szulfát, keratán-szulfát, kondroitin-szulfát) és nem szulfatált (hialuronsav), proteoglikánok és lebontó komponensek, például MMP-k (mátrix-metalloproteinázok)[23,24]. Az I-es típusú kollagén az összes kollagén 80 százalékát teszi ki [25], és a bőr dermisz ECM egyik fő alkotóeleme; részt vesz a bőr rugalmasságában, rugalmasságában és feszességében. Az I-es típusú kollagén egy heterotrimer, tripla hélix fehérje, amely két cl láncból és egy c2 láncból áll, amelyeket COL1Al és COL1A2 gének kódolnak [26]. Az I-es és II-es típusú fibrilláris kollagének az összes kollagén több mint 90 százalékát teszik ki, és szorosan kapcsolódnak a bőrhöz [27,28]. A II-es típusú kollagén gyakoribb a fiatal bőrben, mint az idős bőrben, és különösen részt vesz a sebgyógyulásban [29,30]. Az ECM-összeállításhoz szükséges molekuláris hálózat létrehozása érdekében a GAG-ok fehérjékhez kapcsolódnak, és proteoglikánokat (pl. dekorint vagy versikánt) képeznek, amelyek kölcsönhatásba lépnek az I-es típusú kollagénnel [31] Az ECM-en belül az MMP-k, amelyek az ECM katabolikus útvonalának enzimei, látens vagy aktív formában kapcsolódnak az aktivitásukat szabályozó metalloproteinázok szöveti inhibitoraihoz, az úgynevezett TIMP-ekhez [32]. Az MMP-1(kollagenáz-1) az I. típusú kollagén lebontásáért felelős fő enzim, a TIMP-1 pedig ennek megfelelő inhibitora [334]. A fibroblasztok az ECM homeosztázis kulcsfontosságú szabályozói. Az anabolizmusban részt vevő bőr ECM-komponensei, például az I-es és II-es típusú kollagének, GAG-ok vagy TIMP-k, valamint a katabolizmusban, például az MMP-k közötti szintézis egyensúlya és összekapcsolása lehetővé teszi ennek az ECM-nek a megújulását és folyamatos átalakítását[25]. A bőr öregedésében. , a fő következmény az ECM szabályozás egyensúlyának felborulása a fibroblasztok proliferációjának csökkenésével, az ECM komponensek szintjének módosítása az I-es típusú kollagénszintézis, a GAG-szekréció és a TIMP{24}} szintézis jelentős csökkenésével, valamint a MMP-1 szint [24,35].

Egyelőre csak néhány tanulmány vizsgálta az Ulva sp. frakciók a fibroblaszt bőrsejtek metabolizmusán mind proteomikai, mind transzkriptomikus szinten[36-39], és mindeddig nem végeztek teljes vizsgálatot proteomikai és transzkriptomikus szinten az EAE folyamatból származó Ulua poli- és oligoszacharid frakciókon.Anti aging cistancheEbből a szempontból ez a tanulmány in vitro vizsgálja az Ulva sp. az EAE új zöld technológiájából származik az emberi dermális fibroblasztok metabolizmusán. Vizsgálták a fibroblasztok proliferációjára és életképességére, valamint az ECM anabolizmusára és katabolizmusára gyakorolt ​​hatásukat proteomikus és transzkriptomikus szinten, hogy rávilágítsanak a bőrápolásban (pl. öregedésgátlásban) rejlő lehetőségekre.

2. Eredmények

2.1. Az Ulva sp. poli- és oligoszacharid frakciói.

az EAE-től eltérő biokémiai összetételt és molekulatömeg-eloszlást mutat be

A poli- és oligoszacharid frakciók előállításának mechanizmusait az Anyagok és Módszerek című rész részletezi: "4.2 Poli- és oligoszacharid frakciók előállítása és jellemzése". Korábbi részletes biokémiai jellemzési elemzések (szénhidrátok, uronsavak, szulfátcsoportok és fehérjék) és molekuláris az Ulloa sp. EAE-ből származtatták [36]. Az adatokat az 1. táblázat tartalmazza.

Röviden, a nyers ulvánok (UE) és a dializált ulvánok (DS-UE) poliszacharid frakciói nagy molekulatömegű ulvánokból (nyers furgonokból) állnak, 23.5-37,4 százalék szénhidráttal,18.5-37. 0 százalék uronsav, 29.9-49,1 százalék szulfátcsoport és 10.5-12,8 százalék fehérje. A szénhidrátok összetétele főként ramnóz (50 százalék) és glükuronsav (11 százalék) volt. A DS-UE frakció lényegesen gazdagabb ulvánokban, mint az UE frakció. Az oligoszacharid frakciók, a HzO2-ből származó depolimerizált furgonok (DEP-HD PP-UE) és az Amberlite gyantából készült depolimerizált furgonok (DEP-AD PP-UE) alacsony molekulatömegű furgonokból állnak, 24.4-30,4 százalék szénhidráttal ( ramnóz 44.9-55.4 százalék és glükuronsav 7.5-11.0 százalék ), 21.6-30.8 százalék uronsav és 12.8-16.8 százalék fehérjék.

A depolimerizációs folyamat azonban a szulfátok részleges elvesztéséhez vezetett (a DEP-ADPP-ben nem, és csak 6,6 százalékban a DEP-HD PP-UE-ben). Az oligoszacharid frakciók molekulatömeg-eloszlása ​​(Mw) átlagosan alacsony Mw-ot, 8 kDa-t mutatott a DEP-HD PP-UE esetében, és alacsonyabbat a DEP-AD PP-U esetében (1,5 kDa).

2.2. Az Ulva sp. poli- és oligoszacharid frakciói. Stimulálja a metabolikus aktivitást, de ne befolyásolja a fibroblasztok életképességét

A normál humán dermális fibroblasztok (NHDF) metabolikus aktivitását 48 órán át poli- és oligoszacharid Ulloa-frakcióknak (50 és 100 ug/ml 48 órán át) exponálta WST-1 módszerrel (1. ábra). Ezekben a kísérletekben (n=9) ​​az EAE-ből származó Ullva-frakciók a kontrollhoz képest akár 68%-kal is növelték a fibroblasztok proliferációját.cistanche benefíciosAz anyagcsere-aktivitás jelentős növekedése (o<0.001)were observed="" for="" both="" ue="" and="" ds-ue="" at="" 50="" and="" 1000="" ug/ml.="" oligosaccharide="" fractions="" exhibited="" a="" higher="" and="" more="" significant="" rise="" of="" metabolic="" activity="" at="" 100="" ug/ml="" (p=""><0.001) than="" at="" 50="" ug/ml(no="" significance="" for="" dep-hd="" pp-ue="" and="" lower="" significance,=""><0.05, for="" dep-ad="">

Annak megállapítására, hogy ezek a hatások összefüggésbe hozhatók-e a sejttoxicitás hiányával, az Ulou-kivonattal kezelt sejtek életképességét az LDH (laktát-dehidrogenáz) felszabadulás mérésével, CytoTox96 fokos teszttel értékeltük 48 órás inkubáció után (n=3) (ábra). 2). A citotoxicitási vizsgálat azt mutatta, hogy egyik frakció sem mutatott szignifikáns citotoxicitást a kontrollhoz képest.

2.3. Az Ulva sp. poli- és oligoszacharid frakciói. Stimulálja az extracelluláris mátrix anyagcserét a fibroblasztokban

A poli- és oligoszacharid Ulloa frakciók hatását a fibroblaszt szulfatált és nem szulfatált glikozaminoglikánok (GAG) szintézisére Alcian blue festéssel értékeltük 48 órás inkubáció után (n=4) (3. ábra). Szignifikáns szintézisnövekedést csak az UE és a DS-UE esetében figyeltek meg 100 ug/ml-nél, figyelembe véve mindkét szulfátot (p<0.01,+39% and="" +51%,respectively)="" and="" non-sulfated="" gags=""><0.05,+44% and="" +57%="">

Érdekes megjegyezni, hogy a DS-UE, a leggazdagabb ulván-frakció fokozta leginkább a GAG-szintézist. 50 ug/ml-nél az UE és a DS-UE megnövelte a nem szulfatált GAG-szintézist, de nem jelentősen (plusz 14,2%, illetve plusz 22,7%). A DEP-AD PP-UE oligoszacharid frakciók 1000 ug/ml koncentrációban enyhén csökkentették a nem szulfatált GAG-szintézist, de nem szignifikánsan ({12}} százalék), a DEP-HD PP-UE pedig enyhén, de nem szignifikánsan növelte a GAG-szintézist 100 ug/ml koncentrációnál. ml (plusz 4,1% szulfatált és plusz 10,9% nem szulfatált).

A teljes kollagénszintézist (4. ábra) Red Sirius teszttel értékelték ki, miután a fibroblasztokat 48 órás poli- és oligoszacharid Ulloa frakciókkal (n=7 100 ug/ml-nél és n{5}} 50 ug/ml-nél) kezelték. .

Minden frakció koncentrációfüggő növekedést mutatott a kollagénszintézisben. Marginális és nem szignifikáns kollagénszintézis-csökkenést figyeltek meg minden frakciónál 50 ug/ml-nél a kontrollhoz képest. Ezzel szemben 1000 ug/ml-nél az összes frakció növelte a teljes kollagénszintézist, és jelentős mértékben az UE esetében (plusz 22 százalék,p).<><0.01),and dep-hd=""><>

Poli- és oligoszacharid A származtatott EAE-frakciónak az I. típusú kollagénszintézisre (n=6) és az MMP-1 szintézisre (n=4) gyakorolt ​​hatását ELISA-vizsgálatokkal értékeltük (5. ábra).

Mindegyik frakció fokozta az I. típusú kollagénszintézist és az MP{0}} szintézist, de nem mindig jelentősen. Az I. típusú kollagén szintézis növekedése koncentrációfüggő volt. A poliszacharid frakciók, az UE és a DS-UE 1000 ug/ml koncentrációban szignifikánsan csökkentették (p)<05）increase type="" i="" collagen="" synthesis="" (+122%,="" and="" +217%="" respectively)="" and="" mmp-1="" synthesis="" (+309%="" and="" +169%="">

A poli- és oligoszacharid Ulloa frakciók 100 ug/ml koncentrációban, 48 órás fibroblaszt expozíció után, az I(n=5) és Ⅲ(n=4) típusú kollagének szintézisére, a az MMP-1(n=6) és a TIMP-1(n=5) ​​termelését Western blot (WB) analízissel, normalizálási módszerrel értékeltük a total lane protein módszerrel ( 6. ábra).

A 6a, e és WB ábrán az érett I-es típusú kollagén (≈130 kDa) és az érett III-as típusú kollagén (≈190 kDa) szintézisének növekedése látható minden frakció esetében. Az I-es típusú kollagén 6c. ábráján és a III-as típusú kollagén 6g. ábráján látható fehérje mennyiségi meghatározása NS (statisztikailag nem szignifikáns) növekedést mutatott ki szintézisükben mind poli-, mind oligoszacharidok jelenlétében Ulloa sp. törtek. Eközben a 6b,d ábrán látható WB lehetővé tette számunkra, hogy számszerűsítsünk egy jelentős （p<05）increase of="" mmp-1="" production="" （≈50kda）for="" polysaccharide="" fractions="" and="" not="" significant="" for="" oligosaccharide="" ulloa="" eae-derived="" fractions="" dep-ad="" pp.="" ue="" and="" dep-hd="" pp-ue.="" wb="" quantification="" of="" timp-1="" production="" （≈20kda）,="" available="" in="" figure="" 6f,h,="" showed="" only="" a="" significant="" increase="" in="" presence="" of="" the="" dep-hd="" pp-ue="" fraction=""><0.05), while="" other="" fractions="" had="" no="" significant="">

Az MMP-1 kollagenáz aktivitását zimográfiás vizsgálattal határoztuk meg poli- és oligoszacharid Ulloa-frakciók jelenlétében 100 ug/ml koncentrációnál (7a. ábra), számszerűsítettük, és összehasonlítottuk a kontrollal (7b. ábra), 48 órás fibroblaszt-expozíció után (n). =4).

Az eredmények azt mutatták, hogy mind a poli-, mind az oligoszacharid Ulva sp. frakciók nem növelték szignifikánsan a fibroblasztok MMP{1}} aktivitását.

2.4. Az Ulva sp. poli- és oligoszacharid frakciói. Differenciálisan modulálja a fibroblasztok ECM-génexpresszióját

A poli- és oligoszacharid Ulloa EAE-eredetű frakciók hatását több extracelluláris mátrix komponens (COL1A1, COL1A2, COL3A1, MMP-1 és TIMP-1) mRNS steady-state szintjére vizsgálták (n) =4)(8. ábra).

Észrevettük, hogy 1000 ug/ml-nél minden frakció jelentősen csökkent<0.01 and=""><05)col1a1 mrna="" steady-state="" levels="" (figure="" 8a).="" in="" contrast,="" we="" noted="" that="" all="" fractions="" increased="" mmp-1="" mrna="" level="" expression="" significantly="" (p="" <="" 0.05)="" for="" ue="" at="" both="" concentrations="" and="" ds-ue="" at="" 50="" ug/ml="" only="" (figure="" 8c).="" timp-1="" mrna="" steady-state="" level="" was="" not="" significantly="" changed,="" but="" dep-hd="" pp-ue="" and="" dep-ad="" pp-ue="" reduced="" it="" not="" significantly="" at="" 50="" ug/ml="" (figure="" 8e).="" the="" col1a2="" mrna="" steady-state="" level="" (figure="" 8b)="" is="" enhanced="" (ns)="" for="" both="" ue="" concentrations="" and="" ds-ue="" at="" 50="" ug/ml.="" however,="" it="" is="" lower="" at="" 1000="" ug/ml="" for="" ds-ue="" (ns),="" dep-hd="" pp-ue,="" and="" dep-ad="" pp-ue="" (only="" significant="" at="" 1000="" ug/ml="" for="" the=""><0.05). polysaccharide="" fractions,="" ue="" and="" ds-ue,="" raised="" col3a1="" mrna="" level="" expression="" significantly=""><0.05) at="" 1000="" ug/ml="" and="" at="" 50="" ug/ml="" for="" ue="" (ns="" for="" ds-ue)(figure="" 8d).="" oligosaccharide="" fractions,="" dep-hd="" pp-ue,="" and="" dep-ad="" pp-ue,="" at="" 1000="" ug/ml="" raised="" not="" significantly="" col3a1="" mrna="" level="" expression="" and="" reduced="" it="" at="" 50="" μg/ml（significant="" only="" for="" dep-ad=""><>

A 2. táblázat a gén-mRNS egyensúlyi állapotának összesített eredményeit mutatja, miután a fibroblasztokat 1000 ug/ml-es frakciókkal kezeltük.

A 2. táblázat azt mutatja, hogy az UE jelentősen csökkent<0.01)col1al and="" increased="" signifi-cantly=""><0.05) mmp-1="" and="" col3a1,="" and="" not="" significantly="" col1a2mrna="" steady-state="" levels.="" for="" ds-ue,="" dep-hd="" pp-ue,="" and="" dep-ad="" pp-ue,="" similar="" mrna="" steady-state="" levels="" with="" a="" decrease="" in="" col1a1=""><0.01), in="" col1a2(only="" significant=""><0.05 for="" dep-ad="" pp-ue),="" increase="" in="" col3a1="" (only="" significant=""><0.05 for="" ds-ue),="" increase="" in="" mmp-1(ns),="" and="" no="" significant="" change="" in="" timp-1="" mrna="" expression="" were="">

Ez a cikk: Mar. Drugs 2021, 19, 156. https://doi.org/10.3390/md19030156 https://www.mdpi.com/journal/marinedrugs