AKIVONAT

Háttér:A Heliciopsis terminális törzsének (Proteaceae) fő alkotóelemeként bisz-rezorcinolt izoláltak. A közelmúltban a rezorcint aktív fehérítőszerként alkalmazzák különféle kozmetikai termékekben. A rezorcin szerkezeti mimikája miatt a bisz-rezorcin, mint öregedési enzim antagonista előnyeit igazolták ebben a vizsgálatban.

A vonatkozó tanulmányok szerint a cisztán egy közönséges gyógynövény, amelyet "az életet meghosszabbító csodanövényként" ismernek. Fő összetevője a cistanozid, amely különféle hatásokkal rendelkezik, mint például antioxidáns, gyulladáscsökkentő és immunfunkciót serkentő. A cistanche és a bőrfehérítés közötti mechanizmus a cistanche glikozidok antioxidáns hatásában rejlik. Az emberi bőrben a melanin a tirozin tirozináz által katalizált oxidációjával keletkezik, az oxidációs reakcióhoz pedig oxigén részvétele szükséges, így a szervezetben lévő oxigénmentes gyökök a melanintermelést befolyásoló fontos tényezővé válnak. A Cistanche cisztanozidot tartalmaz, amely antioxidáns, és csökkentheti a szabad gyökök képződését a szervezetben, így gátolja a melanintermelést.

Kattintson a Cistanche Tubulosa elemre a fehérítéshez

További információért:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Mód:A biszrezorcint a H. terminális törzsének nyers etanolos kivonatából oldószeres extrakcióval, illetve preparatív kromatográfiával tisztítottuk. A vegyület kollagenáz-, elasztáz- és tirozináz-gátló hatását eltérő spektroszkópiai technikával vizsgáltuk. Molekuláris dokkolást végeztünk az anyag lehetséges kölcsönhatásainak előrejelzésére az enzimaktív helyek körül.

Eredmények:A bisz-rezorcin és a kávésav kollagenáz IC50 értéke 156,7 ± 0,7 és 308,9 ± 1,6 µmol L-1 volt. Az elasztáz aktivitásra a bisz rezorcin és az urzolsav IC50 értéke 33,2 ± 0,5 és 34,3 ± 0,3 µmol L-1 volt. A bisz-rezorcin gátolta a tirozinázt, mivel az IC50 értéke 22,8 µmol L-1 volt, és 78,4 µmol L-1 volt az -arbutin esetében. A bisz-rezorcin a kollagenázhoz, elasztázhoz és tirozinázhoz kötődött, a megfelelő kötési energiákkal -5,89, -5,69 és -6,57 kcal mol-1. Ezek a kötési energiák a tesztelt inhibitorokéval azonos tartományban voltak. A szerkezetben található aromás fenolcsoportok felelősek az enzimekkel való kötési kölcsönhatások elvi és támogatásáért. A hidroxilcsoportok és az aromás gyűrű(k)ből származó π-vel kapcsolatos vonzó erők miatti hidrogénkötés sokoldalú kötődést biztosított a biszrezorcinhoz.

Következtetés:A H. terminálisokból tisztított bisz rezorcin hasznos lehet kozmetikai termékekbe való beépítésre, mint öregedési enzim antagonista.

Tantárgyak Biokémia, bioinformatika, sejtbiológia, bőrgyógyászat, adatbányászat és gépi tanulás

KulcsszavakHeliciopsis terminálok, Bisresorcinol, Kollagenáz, Elasztáz, Tirozináz, Öregedésgátló tulajdonság, Molekuláris dokkolás, Enzimgátlás

BEVEZETÉS

Egy bisz-rezorcin, (8'Z)-3,5-dihidroxi-1-[16'-(3', 5″-dihidroxi-fenil)-8'-hexadecén{{ A 11}}′-il]-benzolt bőséges összetevőként izolálták a Heliciopsis terminális (Kurz) Sleumer törzséből, amely a Proteaceae családba tartozó növény, és Vietnamban élő népek májvédő hatásra használták. A mai napig ennek a vegyületnek a gyulladáscsökkentő, a malondialdehid (MDA) termelésének gátlása és a májvédő szer gyógyászati ​​előnyeit tisztázták in vitro és in vivo (Giang et al., 2019). Nyilvánvaló, hogy a bisz-rezorcin egy molekulája két rezorcinmolekulát (EC-szám 203-585-2) tartalmaz, amelyek meta-C7H14C=CC7H14 kötéssel kapcsolódnak egymáshoz (1A. ábra). A rezorcinolt a közelmúltban fehér terápia céljára koncentrált arcszérum formájában alkalmazzák. A Brüsszeli Fogyasztóvédelmi Tudományos Bizottság (SCCS 1270/09, Európai Bizottság, Fogyasztóvédelmi Tudományos Bizottság, 2010) alapján a rezorcint oxidálószerként szabályozzák a szempillafestésre szánt termékekben 1,25 százalékig terjedő koncentrációban. vagy hajápolókban és samponokban legfeljebb 0,5 százalékos koncentrációban. A rezorcin kozmetikai alkalmazásai tehát változatosak. A fehérítőszerek esetében feltételezték, hogy az epidermisz bazális sejtrétegében található melanociták gátolják a melaninszintézist. A tirozináz (EC 1.14.18.1) kulcsenzim a melanogenezis katalizálásában, amelyben az L-tirozint használják szubsztrátként. Bár a melanin segít megvédeni a bőrt az UV-sugárzás okozta károsodásoktól, a túlzott melanintermelés hiperpigmentációt, szeplőket és öregségi foltokat okozhat. A rezorcinon kívül különböző szintetikus és természetes vegyületekről is kimutatták, hogy eltérő kémiai szerkezettel rendelkeznek tirozináz-ellenes aktivitással (Dobos et al., 2015).

Az UV-sugárzás a bőr öregedését okozó fő külső tényező. Ehelyett a bőr idővel öregedhet reaktív oxigénfajták (ROS) és lipid-peroxidok hatására, amelyek az UV-sugárzás hatására belsőleg termelődnek. A lipid-peroxid metabolizmus másodlagos termékei károsíthatják az extracelluláris mátrixok (ECM) elasztin- és kollagénrostjait. Ezért az UV-sugárzásnak való kitettség a bőr kiszáradását, rugalmasságának elvesztését, valamint ráncosodást okozhat. Tudomásunk szerint az ECM-eket időszakonként átalakítják, hogy fenntartsák a normál szöveti struktúrákat, miközben a lejárt szöveti fehérjéket megfelelően lebontják a mátrix metalloproteinázok, például a kollagenázok és a szerin proteázok, például az elasztázok (Thring, Hili és Naughton, 2009). Ezenkívül az öregedő enzimek mennyiségét és aktivitását is megnövelte az oxidatív stressz, ami az ECM kiterjedt lebomlásához és progresszív öregedéshez vezetett (Sherratt et al., 2019). Ezért a fémionokkal komplexet képező vegyületek várhatóan gátolják a kollagenázokat, elasztázokat és tirozinázokat (Selvaraj et al., 2014). A projekt célja a bisz rezorcin tirozinázra, kollagenázra és elasztázra kifejtett biológiai hatásainak meghatározása in vitro, és dokkolási technikát is végeztek ezek molekuláris szintű kölcsönhatásainak tisztázására. Remélhetőleg a bisz rezorcinnal késlelteti az öregedési folyamatot és javítja a bőr megjelenését.

ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK

Vegyszerek és műszerek

Vegyületek tisztítása, azonosítása és megerősítése

A H. terminals törzsének etanolos nyers kivonatát nagylelkűen PM Giang professzortól szereztük be, a Vietnami Nemzeti Egyetem Kémiai Karán, Hanoiban, Vietnamban, a HNIP{0}} utalványminta számmal. Ezután metanol/n-hexán elegyben háromszor megosztjuk. A metanolos réteget majdnem szárazra pároljuk, majd etil-acetát/1-bután elegyben megosztjuk. Az etil-acetátos réteget addig párologtattuk, amíg térfogata 80%-kal nem csökkent. A kapott viszkózus folyadékot ezután szilikagél oszlopon tisztítottuk kloroform/metanol gradiens elúcióval a következőképpen: 100% kloroform, 30:1, 20:1, 10:1, 7:1, 5:1, 3:1, 3 :2, illetve 2:1 kloroform/metanol, illetve 100% metanol. Az 5:1 arányú oldószerkeverék eluensét összegyűjtjük és egynegyed térfogatra bepároljuk, majd az ODS oszlopon végzett elválasztást metanol és aceton gradiens eluálásával végezzük. A kívánt vegyületet, azaz a biszrezorcint (1. ábra) 70% acetont tartalmazó eluensekből nyertük, és MS, NMR és IR spektroszkópiával igazoltuk a műszerkönyvtár adatait illetően. Tisztaságának becslésére vékonyréteg-kromatográfiát használtunk.

Biológiai aktivitási vizsgálatok

Az in vitro kísérleteket, amelyek a kollagenáz, elasztáz és tirozináz enzim-inhibitor vizsgálatából álltak a bisz-rezorcin és az ismert inhibitorok kimutatására, a következők szerint történt.

Kollagenáz gátlás

A legutóbbi anti-kollagenáz vizsgálatot módosították a korábban Widyowati és mtsai. (2016). Röviden, 50 mmol L-1 tricin puffert (pH 7,5), kiegészítve 400 mmol L-1 NaCl-dal és 10 mmol L-1 CaCl2-vel pufferoló hígítóként. A Clostridium histolyticumból (EC.3.4.24.3) származó kollagenázt feloldottuk a pufferben 1 mg L-1 koncentrációban. A MOCAc-PRO-Leu-Gly-Leu-A2pr (Dnp)-Ala-Arg-NH2 enzim-szubsztrátot előzetesen DMSO-ban oldottuk, majd a pufferben 1 mmol L-1 koncentrációra hígítottuk. A DMSO-ban oldott mintát a puffer segítségével különböző koncentrációkra hígítottuk. Egy 2-µl mintaoldatot 100 µl enzimoldattal inkubáltunk 37 ○C-on 10 percig. Ezután hozzáadtunk egy 50-µl szubsztrátot, és alaposan összekevertük. A fluoreszcencia emissziót (F) 405 nm-en azonnal feljegyeztük, és 30 percig folyamatosan figyeltük, 320 nm-es hullámhosszon gerjesztéshez. Kávésavat használtunk helyzetszabályozásként (1. ábra). A negatív kontrollt vízzel végeztük. A százalékos gátlást ( százalék ) az alábbi egyenletből számítottuk ki:

százalékos gátlás {{0}}{1 - (Fsam; 30 - Fsam; 0)÷(Fcont; 30 - Fcont; 0)} ×100.

Elasztáz gátlás

Az Abhijit & Manjushree (2010) szerinti vizsgálatot alkalmazták néhány módosítással. Röviden, a pufferrendszer 0,2 mM Tris-HCl puffer volt (pH 8,0). 1 µg ml-1 sertés hasnyálmirigy elasztáz (EC.3.4.21.36) oldatot készítettünk steril vízben. Az enzimszubsztrátot, az N-szukcinil-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilidet (SANA) feloldottuk a pufferben 80 mmol L-1 koncentrációban. A DMSO-ban oldott mintát különböző koncentrációkra hígítottuk a puffer segítségével. Egy 100-µl mintaoldatot összekevertünk 50 µl enzimoldattal, és 15 percig inkubáltuk. Ezután 50 µl enzim-szubsztrát oldatot adunk hozzá, és alaposan összekeverjük. Az OD410-et azonnal (0 perc) és egy éjszakán át (o/n) 37 fokon végzett inkubálás után mértük meg mikrolemez-leolvasóval. Pozitív kontrollként urzolsavat (1. ábra), negatív kontrollként vizet használtunk. A százalékos gátlást ( százalék ) a következő egyenlettel számítottuk ki:

százalékos gátlás {{0}} {1 - [(Asam; o/n - Asam; 0)÷(Acont; o/n - Acont; 0)]} × 100:

Tirozináz gátlás

Az alkalmazott tirozináz gátló vizsgálatot a korábban leírt módszerből adaptáltuk (Jiratchayamaethasakul et al., 2020). Röviden, a vizsgálatot 0,05 mol L-1 foszfátpufferben (pH 6,8) végezték. Gomba tirozinázt (EC.1.14.18.1) oldottunk fel a pufferben 100 egység ml-1 koncentrációban. Az L-tirozint, egy enzimszubsztrátot 0,25 mg ml-1 koncentrációban készítettünk a pufferben. Egy DMSO-ban oldott tesztvegyületet 0,625 és 10 mg ml-1 közötti koncentrációra hígítottunk. A 96-lyukú lemezek üregébe 10 µl mintát és 40 µl L-tirozin oldatot kevertünk, és 10 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk. Ezután 50 µl enzimoldatot oltottunk be, és alaposan összekevertük. A reakciót ezután jégen 1 percig tartó inkubálással leállítottuk. Az OD475-öt mikrolemez-leolvasóval mértük. - Arbutint és vizet használtunk pozitív kontrollként (1. ábra), illetve negatív megfelelőként. A százalékos gátlást ( százalék ) a következő egyenlettel számítottuk ki:

MOLEKULÁRIS DOKKOLÁSI TANULMÁNY

Ligandumok és receptorok előállítása

A biszrezorcin (CID 8917124) és referenciavegyületek háromdimenziós (3D) szerkezeteit, beleértve a szubsztrátokat és inhibitorokat, letöltötték a PubChem adatbázisból molekuláris dokkolási vizsgálat céljából. A ligandum szerkezetét Protein Data Bank (PDB) formátumú fájlban állítottuk elő az Online SMILES Translator és Structure File Generator segítségével. Az enzimek, például a kollagenáz (PDB ID 2Y6I), az elasztáz (PDB ID 1BRU) és a tirozináz (PDB ID 2Y9X) kristályszerkezetét az RCSB fehérje adatbázisából nyertük. A vizet és a hozzákapcsolt molekulákat az összes kiválasztott fehérjeszerkezetből kivágtuk. Eközben az AutoDockTools 1.5.6 segítségével poláris hidrogénatomokat adtunk a kristályosodott fehérjeszerkezetekhez. A célfehérjék és más felhasznált vegyületek fájljait PDBQT formátumban mentettük a molekuláris dokkolás végrehajtása előtt.

Az aktív hely maradékainak kiválasztása és molekuláris dokkolás

Az aktív hely előrejelzéseinek grid és dokkoló protokolljait az AutoDockTools 1.5.6 segítségével készítettük el. A rácshelyeket 0.375 Å távolsággal állítottuk be. Az xyz méreteket a következőkre állítottuk be: 126-135-160 Å3 a kollagenáznál, 130-120-126 Å3 az elasztáznál és 80-80-80 Å3 a tirozináznál. A rácsdoboz középpontjai (az AutoDockTools eltolási értékeivel) 31.869 (5.000), -19,41 (-25.{{20}}) és 17,815 a kollagenáz esetében , 30,048 (-0,972), 51,253 (-2,722), 17,6 az elasztázra és -8,407 (-1.000), -23,795 (-0,250), -36,019 (-3,500) ) tirozinázra, ill. A fehérje szerkezetét merev egységként, míg a ligandumvegyületet rugalmas molekulaként alkalmaztuk. A dokkolási vizsgálatot az AutoDock4 4.2-es verziója által megvalósított Lamarcki genetikai algoritmus (GA) segítségével végeztük. A GA futtatások száma 50 volt, népszerű méretük pedig 200. A kötési energiát (ΔGbind) ADT-vel elemeztük. Az interakció(ka)t a BIOVIA Discovery Studio (BIOVIA, 2020) segítségével vizualizáltuk. A vegyület és a fehérjereceptor közötti molekuláris kölcsönhatást a BIOVIA Discovery Studio szoftver (BIOVIA, 2020) segítségével elemeztük és vizualizáltuk. A fehérjekötőhely vegyület szerkezetét a Visual Molecular Dynamics (VMD) csomag segítségével tettük láthatóvá (Humphrey, Dalke és Schulten, 1996).

Statisztikai analízis

EREDMÉNYEK

Az egyik fő összetevőt sikeresen tisztítottuk a H. terminális törzséből oldószeres extrakciós, illetve fordított fázisú HPLC technikával. A kapott 1H-NMR és 13C-NMR spektrumot a SciFinder (https://scififinder.cas.org/) segítségével összehasonlítottuk a referenciaanyagokéval, és azt találtuk, hogy megfelelnek a (8′Z)-nek-1,{ {6}}dihidroxi-5- [16'-(3',5'-dihidroxi-fenil)-8'-hexadecén-1'-il]-benzol (Chaturvedula et al., 2{{ 23}}02). A bisresorcinolok közé sorolták. Ennek a legújabb bisz-rezorcinnak a molekulaképlete C28H40O4 volt, molekulatömege 463,2819 Dalton. Az extrakciós hozam 0,086 százalék volt a törzs szárított tömegére vonatkoztatva. Tisztasága több mint 98 százalék volt a kapott 1H és 13C-NMR spektrumokat tekintve (lásd az S1 és S2 ábrákat).

In vitro bioaktivitás-elemzés

A bisresorcinol öregedő enzimekre, így a kollagenázra, elasztázra és tirozinázra kifejtett antagonista hatását in vitro határoztuk meg, külön spektroszkópiai módszerrel. Az eredményeket az 1. táblázatban és a 2. ábrában foglaltuk össze. A kollagenáz gátlására 50-550 µmol L-1 tartományú tesztmintákat készítettünk MOCAc-PRO-Leu-Gly-Leu-A2pr (Dnp)-Ala Arg-NH2 felhasználásával. mint enzim-szubsztrát és a kávésav mint enzimgátló. Azt jelezték, hogy a biszrezorcin 156,7 µmol L-1 koncentrációban 50 százalékkal csökkentette az enzimaktivitást (IC50). Ehelyett a kávésav IC50 értéke 308,9 ± 13,7 µmol L-1 volt. Így a bisresorcinol anti-kollagenáz aktivitása szignifikánsan erősebb volt, mint a kávésav.

További információ: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501