Az előkondicionálás által aktivált AKT szabályozza a neuronális toleranciát az iszkémiával szemben az MDM2–p53 útvonalon keresztülⅠ

Absztrakt

Az előkondicionálás által közvetített neuroprotekció egyik legfontosabb mechanizmusa a sejt apoptózis csillapítása, amely az agyi toleranciát váltja ki a későbbi káros ischaemia után. Ebben az összefüggésben az antiapoptotikus PI3K/AKT jelátviteli útvonal kulcsszerepet játszik a sejtdifferenciálódás és a túlélés szabályozásában.

Kattintson a cistanche tubulosa porhozneuroprotekció

Az aktív AKT-ról ismert, hogy fokozza az egér double minute-2 (MDM2), egy E3-ubiquitin ligáz expresszióját, amely destabilizálja a p53-at, hogy elősegítse a rákos sejtek túlélését. Neuronokban nemrégiben kimutattuk, hogy az MDM2–p53 interakciót farmakológiai előkondicionálás fokozza, amely az NMDA glutamát receptor szubtoxikus stimulációján alapul, ami megakadályozza az ischaemia által kiváltott neuronális apoptózist.

Nem ismert azonban, hogy ez a mechanizmus hozzájárul-e a neuronok toleranciájához az ischaemiás előkondicionálás (IPC) során. Itt megmutatjuk, hogy az IPC az AKT PI3K-közvetítette foszforilációját indukálta a Ser473-on, ami viszont foszforilálta az MDM2-t a Ser166-on. Ez a foszforiláció váltotta ki az MDM2 nukleáris stabilizálódását, ami a p53 destabilizálódásához vezetett, így megakadályozta a neuronális apoptózist ischaemiás inzultus esetén. A PI3K/AKT útvonal wortmanninnal vagy AKT csendesítéssel történő gátlása a citoszolikus MDM2 felhalmozódását indukálta, megszüntetve az IPC által kiváltott neuroprotekciót.

Így az IPC fokozza a PI3K/AKT jelátviteli útvonal aktiválását, és elősegíti a neuronális toleranciát az MDM2–p53 kölcsönhatás szabályozásával. Eredményeink egy új mechanisztikus útvonalat kínálnak az IPC által kiváltott neuroprotekcióban az AKT jelátvitel modulációján keresztül, ami arra utal, hogy az AKT potenciális terápiás célpont az ischaemiás sérülés ellen. Kulcsszavak: AKT; MDM2; p53; PI3K; ischaemiás tolerancia; előkondicionálás

1. Bemutatkozás

Emberben a tranziens ischaemiás roham (TIA) létezését endogén prekondicionált állapotként tárták fel, amely a stroke-os betegek funkcionális kimenetelének előnyeit hordozza magában [1–3]. A rövid, szubtoxikus ischaemiás inger által kiváltott endogén neuroprotekció, az úgynevezett ischaemiás prekondicionálás (IPC), az ischaemiás sérülésekkel szembeni neuroprotekció feltörekvő területének stratégiájának tekinthető [4–6].

A bizonyítékok azt mutatják, hogy az IPC által támogatott neuroprotekció a transzkripciós, transzlációs és poszttranszlációs mechanizmusoktól függ, amelyek megváltoztatják a kulcsfontosságú fehérjék működését ischaemia után [6–11]. Az IPC által kiváltott ischaemiás tolerancia (IT) mechanizmusa azonban nem teljesen tisztázott az emberi agyban [12,13].

Az IPC által közvetített neuroprotekció megértésének új kísérleti megközelítései hatékony eszközt jelentenek az agy informatikai hátterében álló endogén mechanizmusok megfejtésére [6], amelyek új terápiás célpontok feltárására irányulnak, amelyek célja a stroke betegek agykárosodásának minimalizálása. Az elmúlt két évtizedben az apoptotikus neuronális sejthalál az agyi ischaemiás károsodásban szerepet játszó alapvető mechanizmusként pozícionálta magát [14–16]. Ebben az értelemben a protein-kináz B-t vagy AKT-t, egy szerin/treonin-kinázt, amelynek aktiválásához funkcionális foszfoinozitid-kináz (PI3K) szükséges, az ischaemia utáni neuroprotektív terápiák alapvető célpontjának tekintik [17,18].

Nemrég kimutattuk, hogy a PI3K/AKT jelátviteli útvonal gátlása növeli az idegsejtek excitotoxicitással szembeni érzékenységét [19]. Az AKT egy komplex anti-apoptotikus jelátviteli hálózatban vesz részt [20], amelynek komponensei a szövettípustól függően különböző szubcelluláris helyeken lehetnek jelen [21,22]. A szívben az AKT részt vett az előkondicionálás által elősegített kardioprotekcióban [23].

A bizonyítékok azt is mutatják, hogy a foszforilált AKT elősegíti a neuronok túlélését az agyi ischaemia kezdetén [24]. Bár az AKT aktiváció hozzájárulhat az IT indukciójához az agyban [25], az IPC által közvetített aktiváció pontos mechanizmusa továbbra is megfoghatatlan. Tumorsejtekben a PI3K/AKT jelátviteli útvonal aktiválása MDM2 foszforilációhoz vezet a Ser166/186-on, ami elősegíti az MDM2 nukleáris transzlokációját [26,27] és fokozza annak ubikvitinációs aktivitását [28].

A sejtmagban az MDM2 kötődik a p53-hoz, és elősegíti annak ubikvitinációját és ezt követő proteaszómális lebomlását, ami gátolja a p53 működését [29]. Stresszkörülmények között a p53 MDM2 túlzott expressziót is kiválthat, ami megfordítva elnyomja a p53 aktivációját egy negatív visszacsatolási hurokban [30]. A PI3K gátlása megakadályozza az AKT aktivációt [31] és az MDM2 foszforilációját az előkondicionált szívben [32].

Ezzel összefüggésben korábban azt találtuk, hogy az in vivo agyi előkondicionálás csökkentette az infarktus térfogatát tranziens középső agyi artéria elzáródás (tMCAO) után az MDM2 fehérjeszintű expresszió növelésével. Következésképpen az MDM2–p53 komplex gyengítette a p53/PUMA/kaszpáz-3 jelátviteli útvonal ischaemia által kiváltott aktiválódását az elsődleges kérgi neuronokban [33].

Itt megvizsgáljuk a PI3K/AKT jelátviteli útvonal szerepét az IPC által közvetített neuronális toleranciában egy későbbi ischaemiás sérüléssel szemben, valamint a mögöttes mechanizmust, és elsősorban az AKT aktiváció és az MDM2–p53 komplex közötti lehetséges kapcsolatra összpontosítunk. .

2. Eredmények

2.1. IPC által támogatott neuroprotection

Az AKT foszforilációja a Ser473-on, az MDM2 foszforilációja a Ser166-on és a p53 destabilizációja Korábban leírtuk az MDM2–p53 kölcsönhatás hatását az idegsejtek ischaemiára való érzékenységére [34] és IT [33]. Itt megvizsgáltuk az AKT potenciális szerepét az IPC által közvetített neuroprotekcióban, mint az MDM2–p53 útvonalban való részvételt.

Először is megerősítettük, hogy az ischaemia elősegítette az AKT aktivációt a neuronokban, amint azt a Ser473-on az AKT foszforilációja bizonyítja. Amint az 1A. ábrán látható, a rövid (20 perces) OGD szignifikánsan indukálta a p(Ser473)AKT és MDM2 expressziót, míg az AKT fehérje szintje változatlan maradt (S1A ábra). Az AKT-foszforilációt azonban nem figyelték meg, amikor a neuronokat hosszan tartó OGD-nek (90 perc) tették ki. Ezenkívül az MDM2 fehérjeszintek alacsonyabbak voltak, ami összhangban van a p53 fehérje magasabb expressziójával, amint azt az 1A. ábra mutatja.

Az Mdm2 expressziójának időfüggő felszabályozása OGD után (1B. ábra) megerősíti, hogy a szubakut ischaemia fontos lehet olyan mechanizmusok kiváltásában, amelyek megakadályozzák a p53 stabilizálódását OGD után, amint azt korábban leírtuk [33]. Az IPC modelljeként rövid OGD-t (20 perc), majd 2 órás újraoxigénezést használtunk (S1B ábra) [33]; így elemeztük az OGD (OGD/R) vagy az IPC protokoll (IPC plusz OGD/R) előtti OGD után 4 órás reoxigenizáció után gyűjtött neuronális kivonatokat. Ezzel párhuzamosan a neuronokat normoxia (Nx) vagy előkondicionálás (IPC) körülmények között inkubáltuk (S1B ábra).

Amint az 1C. és S1C. ábrákon látható, az IPC indukálta az AKT korai aktiválódását, amint azt a Ser473-on [35] végzett foszforiláció, majd a Ser166-nál az MDM2 fehérje stabilizálása és foszforilációja követte. Az IPC az OGD/R által indukált p53 stabilizációt is megakadályozta (1C. ábra). Érdekes módon az 1D. ábrán látható immunfluoreszcens képek felfedték, hogy az IPC elősegítette az AKT foszforilációját a Ser473-on a neuronokban, amelyek túlnyomórészt a sejtmagban halmozódtak fel, és csökkentette a p53 stabilizálódását OGD/R után (IPC plusz OGD/R), összehasonlítva a nem előfeltételezett neuronokkal (OGD). /R).

Következésképpen az IPC megakadályozta az OGD/R által okozott neuronális apoptózist és a kaszpáz-3 aktivációt, áramlási citometriával (S1D ábra) és fluorimetriás vizsgálattal (S1E ábra) mérve. A p53 IPC által közvetített neuroprotekcióban betöltött szerepének megerősítésére olyan neuronokat használtunk, amelyek expresszálnak (vad típusú; wt) vagy nem (knockout; ko) p53 fehérjét. Eredményeink azt mutatják, hogy a p53-at nem tartalmazó neuronok (S1F ábra) jobban ellenálltak az OGD által kiváltott apoptózisnak, mint a p53 wt neuronok.

Ezenkívül a p53KO neuronokban az apoptózis szintje hasonló volt az előkondicionált (IPC plusz OGD/R) wt neuronokban megfigyeltekhez (S1G ábra), ami megerősíti a p53 destabilizációjának kulcsszerepét az IPC által közvetített neuroprotekcióban [33]. Eredményeink azt mutatják, hogy az IPC neuroprotekciót indukált egy ischaemiás inzultus ellen egy olyan mechanizmuson keresztül, amely magában foglalja az AKT foszforilációját a Ser473-on, az MDM2 stabilizálását és foszforilációját a Ser166-on, valamint a p53 destabilizációját.

2.2. Az IPC kiváltja az MDM2 foszforilációt a Ser166-on a PI3K/AKT útvonalon keresztül

A PI3K/AKT jelátviteli útvonal mind in vitro [36], mind in vivo [37] részt vesz a neuronális IT-ben. A PI3K/AKT útvonal IPC által közvetített aktiválásának szerepe azonban az MDM2–p53 komplex szabályozásában továbbra is feltáratlan. Ennek tisztázása érdekében a neuronokat a PI3K/AKT útvonal irreverzibilis és specifikus inhibitorával, a wortmanninnal inkubáltuk [19].

Amint az a 2A. ábrán látható, a wortmannin megszüntette az IPC által fokozott (Ser473)AKT foszforilációt és a p53 destabilizációt, amint az 1D. ábrán látható. Ezek az eredmények közvetlen kapcsolatot sugallnak az AKT aktiváció és a p53-mediált neuronális apoptózis (S1D ábra) és az OGD/R után kiváltott kaszpáz-3 aktiváció (S1E ábra) gátlása között. A p53 stabilizálásának fő szabályozója, az MDM2 az AKT [26] célpontja, amely az MDM2-t Ser166-on és Ser186-on foszforilálja [26]. A wortmanninnal végzett PI3K gátlás megakadályozta mind a (Ser473)AKT, mind a (Ser166)MDM2 IPC által indukált foszforilációját (2B. ábra).

Az MDM2 specifikus Akt-mediált foszforilációját a Ser166-on, amelyet az IPC indukált, egy kis interferáló RNS (siRNS) felhasználásával igazolták, amelyet kifejezetten az AKT1 fehérje (siAkt) ellen terveztek, és amely nagymértékben expresszálódik a kérgi neuronokban, és amelynek aktivitása elengedhetetlen az iszkémia utáni neuronok túléléséhez. 38]. Amint a 3. ábrán látható, a siAkt csökkentette a teljes AKT és p(Ser473)AKT fehérje szintet a transzfekciót követő 3. napon, mind a HEK-293T-sejtekben (3A. ábra), mind a kérgi neuronokban (3B. ábra).

Ezenkívül az AKT knockdown (siAkt) megakadályozta a (Ser166) MDM2 foszforilációját (3B. ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az IPC által aktivált PI3K/AKT jelátviteli útvonal elősegíti az MDM2 foszforilációját a Ser166-on, ami felelős lehet az MDM2 stabilizálásáért és ennek következtében a p53 destabilizálásáért ischaemiás sérülés után.

2.3. Az IPC által aktivált AKT kiváltja a nukleáris MDM2 fehérje stabilizálását ischaemia után

Az AKT aktiválása szerepet játszik az MDM2 nukleáris transzlokációjában a tumorsejtekben [26]. Figyelembe véve a nukleáris MDM2 stabilizálás jelentőségét az ischaemia utáni neuronális túlélés szempontjából [34], pontosabban neuroprotektív szerepét az IPC-ben [33], úgy döntöttünk, hogy tovább vizsgáljuk a PI3K/AKT jelátviteli útvonal jelentőségét az MDM2 szubcelluláris lokalizációjának szabályozásában. fehérje.

Így a neuronokat vagy a HEK{0}}T-sejteket humán MDM2-címkézett fehérjével (MDM2-GFP) transzfektáltuk. A transzfektált HEK-293T-sejtek reprezentatív blotjait és a humán MDM2-fehérjét ektopikusan expresszáló neuronok képeit négy különböző kísérleti körülmény (Nx, IPC, OGD/R és IPC plusz OGD/R) után a 4A. és S1H. , ill.

Az MDM{0}} GFP méhen kívüli expressziója megerősítette, hogy az IPC elősegíti az MDM2 sejtmag felhalmozódását a nem prekondicionált ischaemiás (OGD/R) vagy normoxikus (Nx) neuronokhoz képest (4A, B ábra), amint azt a nukleáris/citoszolikus fluoreszcencia arány számszerűsítése mutatja. (S2B ábra) és az MDM2-GFP magfluoreszcencia intenzitása (S2C ábra).

2.4. Az IPC elősegíti a p(Ser473)AKT és MDM2 kölcsönhatást, ami fokozza az MDM2 stabilizációját a sejtmagban és csökkenti az indukált neuronális apoptózist ischaemia esetén

Miután bemutattuk a PI3K/AKT útvonal IPC-fokozott aktiválásának szerepét az MDM2 nukleáris stabilizálásában, tovább vizsgáltuk, hogy a p(Ser473)AKT és az MDM2 kölcsönhatásba lép-e a sejtmagban (6A. ábra). A nukleáris fehérje kivonatokból származó MDM2 immunprecipitáció, majd az MDM2 és a p(Ser473)AKT elleni immunoblot kimutatta, hogy az IPC elősegítette a p(Ser473)AKT és az MDM2 közötti kölcsönhatást OGD/R után, megakadályozva ezzel az OGD/R által kiváltott nukleáris p53 stabilizálódást. ahogy a magbemeneten látható (6A. ábra).

Végül megvizsgáltuk a PI3K/AKT útvonal megszakadásának káros hatását a neuronális apoptózisra (6B. ábra). Az AKT gátlás ellensúlyozta az IPC védő hatását az OGD előtt, ami megerősíti az AKT–MDM2 neuroprotektív szerepét az IT kontextusában. Eredményeink tehát azt mutatják, hogy az IPC indukálja az AKT foszforilációját és aktiválását, ami elősegíti az MDM2 foszforilációját a Ser166-on és a nukleáris transzlokációt, ahol kölcsönhatásba lép a p(Ser473)AKT-val. Ez a mechanizmus hozzájárulhat az MDM2 fokozott nukleáris stabilizálásához, amely alapvető szerepet játszik az IPC által kiváltott ischaemiás toleranciában.

Hogyan védi a Cistanche a neuronokat?

Néhány bizonyíték arra utal, hogy a Cistanche megvédheti a neuronokat az apoptózis (programozott sejthalál) csökkentésével és az idegsejtek túlélésének elősegítésével. Az apoptózis egy természetes folyamat, amely a szervezetben a sérült vagy nem kívánt sejtek eltávolítására megy végbe, de káros lehet, ha túlzottan vagy nem megfelelően történik. Laboratóriumi vizsgálatokban kimutatták, hogy a Cistanche gátolja az apoptózist, és ez a hatás segíthet megvédeni a neuronokat a károsodástól.

Ezenkívül a Cistanche számos bioaktív vegyületet tartalmaz, amelyekről kimutatták, hogy neuroprotektív hatással bírnak. Például echinakozidot tartalmaz, amelyről kimutatták, hogy megvédi a neuronokat az oxidatív stressztől és a gyulladástól. Akteozidot is tartalmaz, amelyről kimutatták, hogy gyulladáscsökkentő és antioxidáns tulajdonságokkal rendelkezik.

Folytatjuk...

Emilia Barrio 1,†, Rebeca Vecino 1,2,†, Irene Sánchez-Morán 1, Cristina Rodríguez 1,2,3, Alberto Suárez-Pindado 1, Juan P. Bolaños 1,2,3,4, Angeles Almeida 1, 2,3 és Maria Delgado-Esteban 1,2,3,*

1 Funkcionális Biológiai és Genomikai Intézet, Salamancai Egyetem, CSIC, 37007 Salamanca, Spanyolország; emibg7@gmail.com (EB); rebecavecino@usal.es (RV); irén_sm@usal.es (IS-M.); c.rodriguez@usal.es (CR); Alsuap77@gmail.com (AS-P.); jbolanos@usal.es (JPB); aaparra@usal.es (AA)

2 Salamancai Orvosbiológiai Kutatóintézet, Salamancai Egyetemi Kórház, Salamancai Egyetem, CSIC, 37007 Salamanca, Spanyolország

3 Biokémia és Molekuláris Biológia Tanszék, Salamancai Egyetem, 37007 Salamanca, Spanyolország 4 Centro de Investigación Biomédica en Red de Fragilidad y Envejecimiento Saludable (CIBERFES), Instituto de Salud Carlos III, 28029 Madrid, Spanyolország} * Corres {{5} ; Tel.: plusz 34-923-29-4908