Ferulinsav-foszfolipid komplex előállítása az oldhatóság, az oldódás és a B16F10 sejtmelanogenezis-gátló aktivitás javítására

Absztrakt

Háttér

Ferulinsav(FA; 4-hidroxi-3-metoxi-fahéjsav) számos élelmiszerben megtalálható, beleértve a búzát, a rizst, az árpát, a zabban, a citrusféléket és a paradicsomot [1]. A FA-ról kimutatták, hogy jelentős bőrvédelmet nyújt az UV-sugárzás okozta oxidatív stresszel szemben [2]. Visszaállítja a krónikus UVB által kiváltott oxidatív károsodást egérbőrtumorokban azáltal, hogy modulálja a vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF), az indukálható nitrogén-monoxid-szintáz (iNOS), a tumor nekrózis faktor (TNF)- és az interleukin (IL) expresszióját{{7} } [3]. Ezenkívül modulálja a mutált p53, Bcl{10}} és Bax expresszióját UVB-indukált egérbőrtumorokban [4]. Számos tanulmány kimutatta, hogy az FA gátolja a citotoxikus és gyulladással összefüggő enzimek [5] és a mátrix metalloproteinázok (MMP-k) expresszióját, és gyengíti a kollagénrostok lebomlását [6].

A vonatkozó tanulmányok szerintcistancheegy közönséges gyógynövény, amelyet "az életet meghosszabbító csodanövényként" ismernek. Fő összetevője azcisztanozid, melynek különféle hatásai vannak, például antioxidáns, gyulladáscsökkentő és immunfunkciót serkentő. A mechanizmus közöttcistancheésbőrfehérítésa cisztanche-glikozidok antioxidáns hatásában rejlik. Az emberi bőrben a melanin a tirozin tirozináz által katalizált oxidációjával termelődik. Az oxidációs reakcióhoz oxigén részvétele szükséges, így a szervezetben lévő oxigénmentes gyökök a melanintermelést befolyásoló fontos tényezővé válnak.Cistanchecisztanozidot tartalmaz, amely antioxidáns, és csökkentheti a szabad gyökök képződését a szervezetben, így gátolja a melanintermelést.

Ezen túlmenően, a cisztanche elősegíti a kollagéntermelést, ami növelheti a bőr rugalmasságát és csillogását, és segít helyreállítani a sérült bőrsejteket. A Cistanche Phenylethanol Glykozidok jelentősen csökkentik a tirozináz aktivitást, a tirozinázra gyakorolt ​​​​hatás pedig kompetitív és reverzibilis gátlás, ami tudományos alapot nyújthat a Cistanche fehérítő összetevőinek fejlesztéséhez és hasznosításához. Ezért a cistanche kulcsszerepet játszik a bőr fehérítésében. Gátolhatja a melanintermelést, hogy csökkentse az elszíneződést és a tompaságot; és elősegíti a kollagéntermelést a bőr rugalmasságának és ragyogásának javítása érdekében. A cistanche ezen hatásainak széles körben elterjedt felismerése miatt számos bőrfehérítő termék elkezdett gyógynövényi összetevőket, például a Cistanche-t bejuttatni a fogyasztói igények kielégítésére, így növelve a Cistanche kereskedelmi értékétbőrfehérítő termékek. Összefoglalva, a cistanche szerepe abőrfehérítésdöntő fontosságú. Antioxidáns hatása és kollagéntermelő hatása csökkentheti az elszíneződést és a fakóságot, javítja a bőr rugalmasságát és csillogását, ezáltal fehérítő hatást érhet el. Ezenkívül a Cistanche széles körű alkalmazása a bőrfehérítő termékekben azt mutatja, hogy kereskedelmi értékben betöltött szerepét nem lehet alábecsülni.

Kattintson a Cistanche fehérítéshez elemre

Kérdezz többet:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

A foszfolipid komplexeket széles körben használják a gyógyszeriparban. Jó áteresztőképességgel és biztonsággal rendelkeznek, és egyre nagyobb figyelmet kapnak a kozmetikai alkalmazásuk iránt. Mivel a foszfolipidek jó szolubilizáló tulajdonságokkal rendelkező biofunkcionális felületaktív anyagok, kevésbé oldódó gyógyszerek hordozórendszereként használhatók [7], javítva a transzdermális permeációt és a helyi gyógyszerek kumulatív behatolási sebességét [8]. A gyógyszerek transzdermális permeációja feloldódást, eloszlást és a bőrbe való diffúziót foglal magában. Fizikai és kémiai tulajdonságok, különösen a beadandó gyógyszer olaj-víz megoszlási hányadosa befolyásolják ezt a folyamatot [9].

Mód

Anyagok

Sejttenyésztés

FA–PC előállítása oldószer elpárologtatással

A ferulinsav és a foszfolipidek optimális arányának szűrése

A FA-t és a foszfolipideket 2:1, 1:1, 1:2, 1:3 és 1:4 mólarányban 100 ml-es gömblombikokba adtuk, és vízmentes etanolban (FA, 2,0 mg/ml). Az elegyeket 40 fokon 1 órán át folyamatosan keverjük, majd a vízmentes etanolt rotációs bepárlóval eltávolítjuk. A szárított FA-PC komplexeket exszikkátorba helyeztük 24 órára.

Szűrés az optimális reakcióhőmérséklet érdekében FA-PC előállításához

Szűrés az optimális reakcióidő megállapítására az FA–PC elkészítéséhez

Szűrés az optimális FA-koncentráció érdekében

Az FA–PC jellemzése

Differenciális pásztázó kalorimetria (DSC)

Oldhatóság és olaj-víz megoszlási hányados

Oldhatóság

A porított FA és FA–PC oldhatóságát úgy határoztuk meg, hogy feleslegben vett mintát adtunk 10.0 ml [10] vízhez vagy n-oktanolhoz, majd 3 órán át rázattuk lengőágyon. 37 fokon. Az elegyeket 15, 000 fordulat/perc mellett 10 percig centrifugáltuk az oldhatatlan FA eltávolítására. Ezután a felülúszót 0,45 µm-es membránon átszűrtük. Ezt követően a szűrleteket metanollal tízszeresére hígítottuk, és a FA-tartalmat UV-spektrofotométerrel (UV-3150; Shimadzu; Japán) határoztuk meg.

10 ml-es FA- és FA-PC-mintákat készítettünk vízzel telített n-oktanolban, és összeráztuk. Minden mintához n-oktanollal telített vizet (10 ml) adtunk, és az elegyedő folyadékot 24 órán át kevertük. Ezután a mintákat állni hagytuk rétegezéshez. Az FA koncentrációját minden fázisban UV spektrofotometriával határoztuk meg (UV-3150; Shimadzu; Japán). Az elemzéseket három példányban végeztük.

In vitro diffúzió

In vitro diffúziós vizsgálatokat Franz diffúziós sejtekkel (TK-20A; Shanghai Xie Kai Financial Information Service Co., Ltd.; Kína) végeztek. Ezenkívül Strat-M® membránokat használtunk, amelyek olyan diffúziós jellemzőkkel rendelkező szintetikus membránok, amelyek jobban korrelálnak az emberi bőrrel, mint az állati bőrmodellek [11]. A membránokat a függőleges diffúziós cellák donor- és fogadókamrái közé szorítottuk, a vevőkamrákat pedig foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS; pH 7,4) töltöttük meg az FA vagy FA-PC szolubilizálása és a nyelési feltételek biztosítása érdekében.

A kromatográfiás elválasztást egy Agilent 1260LC sorozatú rendszerrel (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) végeztük, amely online vákuumgáztalanítóval, kvaterner szivattyúval, automatikus mintavevővel, termosztált oszloptérrel és diódasoros detektálóval (DAD) volt felszerelve. ). A folyadékkromatográfiához Agilent Technologies ChemStation szoftvert (LC; B.{14}}2.01) használtunk, és a HPLC elválasztást Eclipse plus-C18 oszlopon (4,6 × 250 mm, 5 μm) végeztük. A detektálási hullámhossz 0,05% ecetsav (A) és metanol (B) (40:60, v/v) volt. Az áramlási sebesség 1,0 ml/perc volt. Az oszlop hőmérsékletét 30 fokra állítottuk be. Az egyes időintervallumokban felszabaduló FA mennyiségének megállapítására kumulatív korrekciókat végeztünk. Minden mérést három párhuzamosban végeztünk, és a membránon átszivárgó kumulatív FA százalékát (Q százalék) az idő függvényében ábrázoltuk.

A melanogenezis gátlása

B16F10 sejt életképességi vizsgálat

A sejtek életképességét és sejtproliferációját {{0}}(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólium-bromid (MTT) alkalmazásával értékeltük. vizsgálat [2]. A B16F10 sejteket 0,25, 0.5, 1.0, 2,0 és 4,0 mg/ml koncentrációjú FA-val és FA-PC-vel előkezeltük. 48 órás inkubálás után MTT-oldatot (végkoncentráció: 5 mg/ml) adtunk hozzá, és a sejteket 3 órán át 37 °C-on inkubáltuk. Végül az egyes minták abszorbanciáját mikrolemez-leolvasóval mértük 570 nm-en, hogy meghatározzuk az életképes sejtek százalékos arányát.

Melanin tartalom mérése

A melanintartalmat a korábban leírtak szerint [6] mértük, némi módosítással. A B16F10 melanoma sejteket hatlyukú tenyésztőlemezekre oltottuk (2 × 105 sejt/lyuk 3 ml táptalajban), és egy éjszakán át inkubáltuk, hogy a sejtek megtapadjanak. A kezelés végén a sejteket PBS-sel mostuk, és 10% dimetil-szulfoxidot (DMSO) tartalmazó 1 M NaOH-oldattal lizáltuk 30 percig 80 °C-on. Az abszorbanciát (optikai sűrűség; OD) 475 nm-en mértük mikrolemez-leolvasóval. A melanintartalmat a következő képlettel számítottuk ki:

Adatelemzés

Az egyes kezelt csoportok és a kontrollcsoport átlagértékei közötti különbségek statisztikai szignifikanciáját Dunnett t-próbával határoztuk meg. P értékek<0.05 were considered statistically significant.

Eredmények és vita

Az FA–PC optimális előkészítése

Az FA–PC oldhatósága és olaj-víz megoszlási együtthatója

Az 1. táblázat mutatja a FA, PM és FA–PC oldhatóságát vízben és n-oktanolban. Az FA-PC jó oldhatóságot mutatott vízben és n-oktanolban (1,68 és 7,77 mg/ml), és az FA-PC oldhatósága n-oktanolban szignifikánsan nagyobb, mint a FA-é (1,34 mg/ml). .

A lipofilitást általában két nem elegyedő fázis közötti megoszlási együtthatóként (P) mérik. Jellemzően log P-ben fejezzük ki. Meghatároztuk az FA és FA–PC látszólagos megoszlási együtthatóit az n-oktanol/víz rendszerben. Az eredmények azt mutatták, hogy a log P magasabb volt az FA–PC-nél (1,21), mint az FA-nál (0,99), pH 5-nél mérve.0. Az enyhén megnövekedett log P a FA-PC szignifikánsan jobb n-oktanol oldhatóságával volt összefüggésben az FA-hoz képest. Az FA-PC megnövekedett oldhatósága n-oktanolban az FA-PC amorf tulajdonságaival magyarázható. Mivel a lipofilitás és a permeabilitás jól korrelál egymással, ezek az eredmények arra utalnak, hogy a FA transzdermális permeabilitása javítható foszfolipid komplexként történő alkalmazásával.

DSC 

A DSC megbízható módszer a gyógyszer-segédanyag kompatibilitás szűrésére, és maximális információt nyújt a gyógyszerek és a segédanyagok közötti lehetséges kölcsönhatásokról [10]. A kölcsönhatás jelenlétére az endoterm csúcsok kiküszöböléséből, új csúcsok megjelenéséből, a csúcs alakjának és kezdetének, a csúcshőmérséklet/olvadáspont, valamint a relatív terület vagy entalpia változásából következtethetünk. Az 1. ábra az FA (1a. ábra), a PC (1b. ábra), a PM (1c. ábra) és az FA–PC (1d. ábra) DSC-termogramjait mutatja. A tiszta FA termikus görbéje tipikus éles endoterm olvadásponttal rendelkezik, körülbelül 172,7 fokon, ami annak vízmentes és kristályos állapotát jelzi, míg a foszfolipideké egy kisebb endoterm csúcsot mutat 231,7-248,6 fokon. A PM DSC görbéje, amely az FA és a foszfolipidek egymásra helyezett hőprofiljait tartalmazza, nem mutat szignifikáns értéketváltozik, kivéve egy kis eltolódást magasabb hőmérsékletre (175,9 fok), ami azt jelzi, hogy nincs kölcsönhatás a komponensek között. Az FA–PC-nek van egy fő csúcsa, 158,2 fok, amieltér az FA csúcstól, ami az FA és a PC közötti kölcsönhatást jelzi. Eredményeink arra utalnak, hogy a kölcsönhatás és/vagy amorfizáció különböző foka különbözőkeverékek vagy komplexek állíthatók elő az előállítási módjuktól függően, és ez az oldhatósági különbségekkel függ össze.

BECSÜLETES

Az FTIR spektroszkópia megerősítheti az FA-PC képződését, ha összehasonlítja az FA-PC spektrumot a tiszta FA spektrumával. A 2. ábra az FA, PC, PM és FA–PC FTIR spektrumát mutatja. Az FA-spektrum (2a. ábra) jellegzetes hidroxil-nyúlási sávot mutat 3436 cm-1-nél. Mindez széles szingulettté válik az FA–PC, PM és foszfolipid spektrumban (2b–d ábra). Az FA-spektrum (2a. ábra) jellemző csúcsokat mutat 1620 cm-1-nél (C=C nyújtás) és 1450 cm-1-nél (C=C aromás gyűrű nyújtás). Az FA-PC spektrumban (2b. ábra) ez a két csúcs nem látható, valószínűleg a foszfolipid molekula gyengülése, eltávolítása vagy árnyékolása miatt.

Az FA-spektrum (2a. ábra) jellegzetes telítetlen karboxil-csúcsokat mutat 1691 cm-1-nél (C=O-nyújtás) és 1664 cm-1-nél (C=C-nyújtás). Az FA-PC spektrumban (2b. ábra) ez a két csúcs nem látható, valószínűleg az FA negatív karboxil töltése és a foszfolipidek pozitív nitrogén töltése közötti vonzó erők miatt. A foszfolipid spektrum (2d. ábra) csúcsértéke 1733 cm-1 (C=O nyújtás), 1238 cm-1 (P=O nyújtás) és 1087 cm-1 (P-O). –C nyújtás). Aaz 1733 és 1087 cm-1 csúcsok megmaradnak a PM és FA-PC spektrumban, ami azt jelzi, hogy nem vesznek részt a komplex kialakulásában. Az 1283 cm-1-nél lévő foszfolipid csúcs nem figyelhető meg az FA-PC spektrumban, valószínűleg azért, mert az FA-ból származó jellegzetes hidroxilcsoport van der Waals erők révén kapcsolódik az 1283 cm-1-nél lévő P=O-hoz. Az eredmények azt mutatják, hogy a FA beágyazódott a foszfolipidek negatív foszfor oxigénkötéséből és pozitív nitrogéntöltéséből álló gyűrűszerkezetbe, amely a komplex FA-PC lett.

SEM

Az FA, PC, PM és FA–PC felületi morfológiáit SEM segítségével vizsgáltuk (3. ábra). A 3c. ábrán az FA kristályosnak, majdnem téglalap alakúnak tűnik, míg az FA–PC részecskék (3a. ábra) szabálytalan alakúnak és sima felületűnek tűnnek. Az FA–PC alakja és felületi topográfiája jelentősen eltér az FA-tól és a PC-től (3b. ábra). Ez valószínűleg az FA teljes keverhetőségének köszönhető a PC-ben. A PM vizsgálatban (3d. ábra) mind az FA, mind a foszfolipidek könnyen megkülönböztethetők.

In vitro diffúziós vizsgálatok

A közelmúltban a szintetikus Strat-M® membránt az emberi bőrön végzett in vitro diffúziós vizsgálatok helyettesítőjeként vezették be [11]. A Strat-M® membrán két réteg poliéterszulfonból áll, amelyek ellenállnak a diffúziónak. A poliéterszulfon rétegek az egyik poliolefinrétegen helyezkednek el, amely nyitottabb és diffúzívabb. Ezt a szintetikus membránt alacsony tételenkénti variabilitás jellemzi, így konzisztensebb adatokat biztosít. Ezenkívül kimutatták, hogy a Strat-M® membránok diffúziós adatai jól korrelálnak az emberi bőr diffúziós adataival [11].

A PC hatásának értékelésére az FA in vitro diffúziós tulajdonságaira, az FA és az FA–PC százalékos Q értékét ábrázoltuk az idő függvényében. A jelen cikkben szereplő eredmények azt a tendenciát mutatták, hogy a foszfolipidek jelentősen megnövelték az FA bejutását a Strat-M® membránba. Ezenkívül az FA–PC hosszabb ideig tartózkodott a Strat-M® membránon, mint az FA (4. ábra). Ezért a foszfolipidek beépülése az FA-ba megnövelheti annak tartózkodási idejét a stratum corneumban, és alkalmasabbá teszi a bőr áthatolására. Ami az áteresztési időt illeti, bár a Strat-M® membrán jó korrelációt mutat az emberi bőrével [11], az emberi bőrhöz képest textúrális különbségek is vannak. A permeációs idők befolyásoló tényezői közé tartozik az oldószer, a vegyületek koncentrációja, a pH-érték stb. A jövőbeni elemzés során több kísérletet kell végezni.

A melanogenezis gátlása

Az FA-PC hatása a melaninszintézisre

Az irodalom szerint az FA a c-kit és az ERK1/2 sejtfehérjék leszabályozásán keresztül képes gátolni a celluláris tirozináz aktivitást és a melanogenezist a B16F10 melanoma sejtekben [12]. A jelen vizsgálatban az FA–PC a 0,25, 0,5 és 1,0 mg/ml tesztelt koncentrációknál nyilvánvalóbban csökkentette a melanintartalmat a B16F1{{10}} sejtekben, mint az FA (2. táblázat). Így megállapítottuk, hogy az FA-PC hatékonyabban gátolja a melaninszintézist a B16F10 sejtekben, mint az FA.

Következtetés

A szerzők hozzászólásai

Az LL és az LY jelentős mértékben hozzájárult az adatok kidolgozásához és tervezéséhez vagy beszerzéséhez, vagy az adatok elemzéséhez és értelmezéséhez; XY és WX részt vett a kézirat megszövegezésében vagy a fontos szellemi tartalom kritikus átdolgozásában; a ZJ és a DY pedig véglegesen jóváhagyta a közzétenni kívánt verziót. Minden szerző elolvasta és jóváhagyta a végső kéziratot.

Köszönetnyilvánítás

Ezt a munkát a Kínai Nemzeti Természettudományi Alapítvány (31501402) támogatta.

Versengő érdekek

A szerzők kijelentik, hogy nincsenek egymással versengő érdekeik.

Érkezett: 2016. december 27. Elfogadva: 2017. március 14

Online közzététel: 2017. március 22

Hivatkozások