Négy vegyület előkészítő izolálása és tisztítása Cistanches Deserticola YC Ma-ból nagy sebességű ellenáramú kromatográfiával

1. Bemutatkozás

Cistanches deserticolaYC Ma, egy fajIsztancsokami aOrobanchaceaecsalád, egy jól ismert hagyományos kínai orvoslás veseelégtelenség, női meddőség, kóros leukorrhea, neurapraxia és időskori székrekedés kezelésére [1]. Ez egy parazita növény, amely széles körben elterjedt Kína északnyugati részén. Eddig számos vegyület, köztükfenil-etanol-glikozidok (PhG-k), iridoidokat és lignánokat izoláltak ebből a fajból [2]. Néhány PhG-ről beszámoltak arról, hogy antioxidáns, hepatoprotektív és neuroprotektív hatásúak [3–6]. A PhG-k izolálása és tisztítása azonban nehéz és időigényes. Ezenkívül a klasszikus többszörös kromatográfiás eljárások nemcsak nagy mennyiségű szerves oldószert használnak, hanem alacsonyabb mintavisszanyerést is eredményeznek. A nagysebességű ellenáramú kromatográfia (HSCCC), egy hordozómentes folyadék-folyadék megoszlási kromatográfiás technika, kiváló mintakinyerést kínál néhány hagyományos módszerhez képest, és széles körben alkalmazzák különféle természetes termékek elválasztására és tisztítására [7–9] . Bár több PhG-t megtisztítottakIsztancsokgenus és mások a HSCCC [10–14] által, egyetlen dokumentum sem számolt be az akteozid, izoakteozid, sziringalid A 3'- tisztításáról. -L-ramnopiranozid és 2'-acetil-lakteozid egy kétfázisú rendszerben.

TERMÉSZETES CISTANCHE TUBULOSA A SZEXUÁLIS FUNKCIÓ JAVÍTÁSÁRA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Ebben a cikkben bemutatunk egy egyszerű módszert négy PhG elválasztására és tisztítására C. deserticolából. Végül 30,9 mg akteozidot, 13,0 mg izoakteozidot, 12,5 mg sziringalid A 3'- -L-ramnopiranozidot és 7,2 mg 2'-acetil-lakteozidot kaptunk egylépéses elválasztással. 297 mg frakcióból, amelynek tisztasága rendre 99%, 95%, 99%, illetve 98%. Szerkezetüket 1H- és 13C-NMR spektrum adatok és HR-MS spektrumok alapján jellemeztük. A vizsgálat során azonosított négy PhG szerkezetét az 1. ábra mutatja.

2. Eredmények és megbeszélés

2.1. A nyers kivonat HPLC analízise

A C. deserticolából származó n-butanollal kivont összetevőkkel dúsított frakciót HPLC-UV-vel elemeztük. Az alkalmazott oszlop Accurasil C18 (250 mm × 4,6 mm, átmérőjű 5 μm) (Thermo-Fisher Scientific Instruments, város, állam rövidítése, USA) volt, a mozgó fázis metanol-víz (30:70, v/v) volt. Az áramlási sebesség 1 ml/perc volt. A detektor hullámhosszát 254 nm-re állítottuk be. A HPLC kromatogram a 2. ábrán látható. Az 1–4. csúcsok az akteozidnak (1), az izoakteozidnak (2), a sziringalid A 3'- -L-ramnopiranozidnak (3) és a 2'-acetil-lakteozidnak (4) felelnek meg. .

2.2. Kétfázisú oldószerrendszer kiválasztása

A HSCCC-vel való sikeres elválasztás nagymértékben függ a megfelelő kétfázisú oldószerrendszer kiválasztásától, a kétfázisú oldószerrendszert az egyes célkomponensek megoszlási hányadosának (K) értékének megfelelően választottuk ki, és a K optimális tartományának {{ 2}}.5–2.

TERMÉSZETES CISTANCHE TUBULOSA AZ IMUNITÁS JAVÍTÁSÁRA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

A kísérletben több kétfázisú oldószerrendszer célkomponenseinek K értékeit az 1. táblázat mutatja (bár a 4. csúcs esetében valamivel magasabb, az eredmények elfogadhatónak bizonyultak). Ezek közül az etil-acetát-n-butanol-etanol-víz (40:6:6:50, v/v/v/v) a megfelelő megoszlási együtthatót adott a célvegyületekre. Végül az etil-acetát–n-butanol–etanol–víz (40:6:6:50, v/v/v/v) oldószerrendszert használták a C. deserticola négy vegyületének izolálására és tisztítására, amint az az ábrán látható. 3. ábra. A 2. ábrán látható módon az egyes HSCCC-frakciók HPLC-analízise azt mutatta, hogy négy tiszta PhG (akteozid, 99%; izoakteozid, 95%; sziringalid A 3′- -L-ramnopiranozid 99% és 2′- acetil-lakteozid 98%) nyerhető ki a nyers frakcióból.

3. Kísérleti

3.1. Berendezés A HSCCC

A jelen tanulmányban alkalmazott berendezés egy TBE{{0}}B nagy sebességű ellenáramú kromatográfiás rendszer (Shanghai Tauto Biotech Co., Sanghaj, Kína), három, sorba kapcsolt preparatív többrétegű tekercsleválasztó oszloppal (átmérője). cső=2,6 mm, teljes térfogata=300 ml) és egy 2{{10}} ml-es mintahurok. A forgási sugár vagy a tartó tengelye és a centrifuga központi tengelye közötti távolság (R) 5 cm volt, és az érték a belső kapocsnál 0,5-től a külső kivezetésnél 0,8-ig változott (=r/R, ahol r a tekercs és a tartótengely közötti távolság). A kísérletben egy HX 105 állandó hőmérsékletű keringető eszközt (Beijing Changliu Lab Instrument Company, Peking, Kína) használtunk a hőmérséklet szabályozására. A HSCCC rendszert egy TBP-5002 típusú közepes nyomású állandó áramlású szivattyúval, egy TBP-2000 típusú, 254 nm-en működő UV-detektorral és egy V4.0 típusú munkaállomással (Jinda Bio-chemistry Instrument) szerelték fel. Company, Shanghai, Kína).

A nagyteljesítményű folyadékkromatográfiás (HPLC) berendezés egy Agilent 1200 rendszer volt, amely egy G1312A bináris szivattyúból, egy G1329A automatikus mintavevőből, egy G1314A változó hullámhosszú detektorból (VWD), egy G1316A termosztált oszloptérből és egy G1379Bgilents LC37tt műhelyből áll. . A tisztaság kimutatására alltech 3300 ELSD-t használtunk. A vegyületek szerkezeti azonosítására Agilent 6520 Q-TOF és Bruker AVANCE III 500-NMR spektrométereket használtunk. Az1H- és 13C-NMR-spektrumokat (500 és 125 MHz-en) szobahőmérsékleten (22°/295,1 K) mértük.

3.2. Reagensek és anyagok

Az etil-acetát, n-butanol és etanol analitikai minőségű, a metanol pedig HPLC minőségű volt. Az összes oldószert a Tianjin Concord Technology Company-tól (Tianjin, Kína) vásároltuk. Minden oldathoz és hígításhoz Milli-Q vizet (18,2 MΩ) (Millipore, Bedford, MA, USA) használtunk. A C. deserticola rizómáját a Kínai Népköztársaság Belső-Mongólia tartományából gyűjtöttük 2009 júniusában. A növényt Prof. Lijuan Zhang azonosította, és egy utalványmintát (20091001. számú) letétbe helyeztünk laboratóriumunkban.

3.3. Nyersminta előkészítése

A C. deserticola porított, levegőn szárított, húsos szárát (1 kg) kétszer visszafolyató hűtő alatt forraljuk vizes etanollal (8 liter, 60 térfogatszázalék), minden alkalommal 2 órán át. Az extraktumot csökkentett nyomáson és 60 °C hőmérsékleten az etanol teljes elpárologtatásáig bepároljuk. A maradékot vízben szuszpendáltuk, és egymás után háromszor extraháltuk kloroformmal, etil-acetáttal és n-butanollal, így 5,16 g n-butanolos extraktumot kaptunk, miután csökkentett nyomáson szárazra pároltuk. Az n-butános kivonatot ezután szilikagél oszlopon (200-300 mesh) elválasztottuk progresszív gradiens elúcióval (CHCl3-MeOH, 10:1 → 1:1), így nyolc frakciót kaptunk. A 6. frakciót (297 mg) használtuk fel a további HSCCC izolálására és elválasztására.

TERMÉSZETES CISTANCHE TUBULOSA HAGYOMÁNYOS KÍNAI GYÓGYSZEREK PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.4. A kétfázisú oldószerrendszerek kiválasztása

A kétfázisú oldószerrendszereket a célkomponensek megoszlási hányadosa (K) alapján választottuk ki a C. deserticola frakciójában. A K értékeket LC analízissel határoztuk meg az alábbiak szerint: Megfelelő mennyiségű nyers extraktumport (6. frakció) feloldottunk az oldószerrendszer alsó fázisában, és HPLC-vel analizáltuk. A csúcsok területét A1-ként vettük fel. Ezután azonos térfogatú felső fázist adunk az oldathoz, és alaposan összekeverjük, hogy elérjük a megoszlási egyensúlyt. Az alsó fázist ezután ismét HPLC-vel elemezzük. Ez utóbbi csúcsterületeket A2-ként jegyeztük fel. A K-értékeket a következő egyenlet alapján számítottuk ki: K=(A1 − A2)/A2 [15,16].

3.5. Kétfázisú oldószerrendszer és mintaoldat elkészítése

Jelen vizsgálatunkban etil-acetát–n-butanol–etanol–víz (40:6:6:50, v/v/v/v) kétfázisú oldószerrendszert használtunk a HSCCC elválasztáshoz. Mindegyik oldószert egy választótölcsérbe adtuk, és szobahőmérsékleten alaposan kiegyensúlyoztuk. A felső és az alsó fázist elválasztottuk, és röviddel a felhasználás előtt 30 perces ultrahangos kezeléssel gáztalanítottuk. A mintaoldatot úgy készítettük el, hogy 297 mg 6. frakciót 15 ml etil-acetát–n-butanol–etanol–víz (40:6:6:50, v/v/v/v) alsó fázisban oldottunk fel.

3.6. HSCCC szétválasztási eljárás

A HSCCC-t az alábbiak szerint végeztük. A többrétegű tekercses oszlopot először a felső szerves állófázissal töltöttük meg. Az alsó vizes mobil fázist ezután 1,5 ml/perc áramlási sebességgel az oszlop fejrészébe pumpáltuk, és ezzel egyidejűleg a HSCCC-készüléket 900 rpm fordulatszámmal működtettük. Miután a hidrodinamikai egyensúly létrejött, amint azt a farok kimeneténél eluáló tiszta mozgófázis jelezte (körülbelül két órával később), 297 mg nyers kivonatot (6. frakció) tartalmazó 15 ml-es mintaoldatot injektáltunk az injekciós szelepen keresztül. Az oszlop kifolyását folyamatosan figyeltük 254 nm alatt. Négy csúcsfrakciót gyűjtöttünk össze a kromatogram szerint, majd csökkentett nyomáson bepároltuk. A készülék hőmérsékletét 25 fokra állítottuk be.

3.7. HPLC analízis és a HSCCC csúcsfrakciók azonosítása

A HSCCC csúcsfrakcióit HPLC-ELSD-vel elemeztük. Az alkalmazott oszlop Accurasil C18 (250 mm × 4,6 mm, id 5 μm), a mozgófázis metanol-víz (30:70, v/v) volt. Az áramlási sebesség 1 ml/perc volt. Az ELSD a következő körülmények között működött: Hőmérséklet 45 fok, gáz 1,6 L/perc. A négy HSCCC csúcsfrakció szerkezeti azonosítását HR-ESI-MS, 1 H és 13C-NMR spektroszkópiával végeztük.

3.8. A strukturális azonosítás

I. frakció: HR-ESI-MS, megfigyelt m/z 623,2001 (M-H)-, C29H35O15-re számítva: 623,1981. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) 8 ppm: 1,09 (3H, d, J=6 Hz, ramnóz CH3), 2,79 (2H, t, J=7,5 Hz, Ar- CH2-), 4,37 (1H, d, glükóz J=8 Hz, H-1), 5,18 (1H, d, J=1 Hz, H{{34) ramnóz }}), 6,27 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 7,59 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 6,5-7,1 (6H, aromás H). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) 8 ppm: 131,5 (C{62}}), 117,2 (C{65}}), 146,2 (C{68}}), 144,7 (C{71}}). ), 116,4 (C-5), 121,3 (C-6), 72,4 (C- ), 36,6 (C- ), 127,7 (Caf-1), 115,3 (Caf{{89) }}), 146,9 (Caf-3), 149,8 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 168,3 (Caf-), 114,8 (Caf-), 148,1 (Caf-), 104,3 (G-1), 76,1 (Glc-2), 81,7 (Glc-3), 70,5 (Glc-4 ), 76,3 (Glc-5), 62,4 (Glc-6), 103,1 (Rha-1), 72,3 (Rha-2), 72,1 (Rha-3 ), 73,9 (Rha-4), 70,7 (Rha-5), 18,5 (Rha-6). A szakirodalmi adatokkal [17] összevetve az I. frakció az akteozidnak felelt meg.

II. frakció: HR-ESI-MS, mért m/z 623,1987 (M-H)-, C29H35O15-re számítva 623,1981. 'H-NMR (5{54}} MHz, CD3OD) 8 ppm: 1,25 (3H, d, J{16},5 Hz, ramnóz CH3), 2,78 (2H, t, J=7 Hz, Ar-CH2-), 4,33 (1H, d, glükóz J=8 Hz, H-1), 5,17 (1H, d, J { {33}} Hz, ramnóz H-1), 6,28 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 7,56 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 6,5-7,0 (6H, aromás H). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) 8 ppm: 131,5 (C{62}}), 117,2 (C{65}}), 146,2 (C{68}}), 144,7 (C{71}}). ), 116,5 (C-5), 121,3 (C-6), 72,4 (C- ), 36,7 (C- ), 127,8 (Caf-1), 115,2 (Caf{{89) }}), 146,8 (Caf-3), 149,7 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 169,2 (Caf-), 115,0 (Caf-), 147,3 (Caf-), 104,5 (G-1), 75,5 (Glc-2), 84,2 (Glc-3), 70,1 (Glc-4 ), 75,7 (Glc-5), 64,7 (Glc-6), 102,8 (Rha-1), 72,4 (Rha-2), 72,4 (Rha-3 ), 74,1 (Rha-4), 70,5 (Rha-5), 17,9 (Rha-6). Az 1H-NMR és 13C-NMR spektrum adatai megegyeztek az izoakteozid adataival, amint azt az irodalomban közölték [18].

III. frakció: HR-ESI-MS, megfigyelt m/z 6{{108}}7,2032 (M-H)-, C29H35O14-re számított: 607,2032. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) 8 ppm: 1,09 (3H, d, J=6 Hz, ramnóz CH3), 2,84 (2H, t, J=7,5 Hz, Ar- CH2-), 4,37 (1H, d, glükóz J=8 Hz, H-1), 5,19 (1H, d, J=1,5 Hz, H{ ramnóz {35}}), 6,27 (1H, d, J=16 Hz, Ar-CH=CH-), 7,59 (1H, d, J=16 Hz, Ar- CH=CH-), 6,6-7,1 (7H, aromás H). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) 8 ppm: 130,8 (C{61}}), 116,2 (C{64}}), 130,9 (C{67}}), 156,8 (C{70}}). ), 130,8 (C-5), 116,2 (C-6), 72,4 (C- ), 36,4 (C- ), 127,8 (Caf-1), 114,8 (Caf{{88) }}), 149,8 (Caf-3), 146,9 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 168,3 (Caf-), 115,4 (Caf-), 148,0 (Caf-), 104,3 (G-1), 76,3 (Glc-2), 81,7 (Glc-3), 70,4 (Glc-4 ), 76,1 (Glc-5), 62,5 (Glc-6), 103,0 (Rha-1), 72,3 (Rha-2), 72,2 (Rha-3 ), 73,9 (Rha-4), 70,7 (Rha-5), 18,4 (Rha-6). A szakirodalom szerint [18] a III. frakció a sziringalid A 3'- -L-ramnopiranozidnak felelt meg.

IV. frakció: HR-ESI-MS, megfigyelt m/z: 665,21{{20}} (M-H)-, C31H37O16-ra számítva: 665,2087. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) 8 ppm: 1,09 (3H, d, J=6,5 Hz, ramnóz CH3), 2,00 (3H, s, OAc), 2,72 (2H, t, J=7,5 Hz, Ar-CH2-), 4,55 (1H, d, glükóz J=8 Hz, H-1), 4,90 (1H, d, J=1 Hz, ramnóz H-1), 6,29 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 7,62 (1H, d , J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 6,5-7,0 (6H, aromás H). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) 8 ppm: 131,9 (C{66}}), 117,3 (C{69}}), 146,1 (C{72}}), 144,7 (C{75}}). ), 116,4 (C-5), 121,4 (C-6), 72,7 (C- ), 36,4 (C- ), 127,7 (Caf-1), 115,4 (Caf{{93) }}), 146,9 (Caf-3), 149,9 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 168,1 (Caf-), 114,7 (Caf-), 148,2 (Caf-), 101,8 (G-1), 75,3 (Glc-2), 80,3 (Glc-3), 70,8 (Glc-4 ), 76,2 (Glc-5), 62,3 (Glc-6), 103,3 (Rha-1), 72,0 (Rha-2), 71,8 (Rha-3 ), 73,7 (Rha-4), 70,8 (Rha-5), 18,5 (Rha-6), 171,5 (C=O), 20,9 (OAC). Az 1H-NMR és a 13C-NMR spektrum adatai megegyeztek a 2'-acetil-lakteozid adataival [17].

4. Konklúziók

Kidolgoztak egy HSCCC-módszert a Cistanches deserticola YC Ma-ból származó akteozid, izoakteozid, sziringalid A 3'- -L-ramnopiranozid és 2'-acetil-lakteozid preparatív elválasztására és tisztítására. A jelen tanulmány azt jelzi, hogy a HSCCC egy nagyon hatékony technika a bioaktív komponensek növényi anyagokból történő preparatív elválasztására és tisztítására. Ezenkívül a vegyületeket kellően nagy mennyiségben, nagy tisztasággal izolálhatjuk, majd referenciaanyagként használhatjuk kromatográfiás vagy bioaktivitási vizsgálatokhoz. A módszer megvalósítható, gazdaságos és hatékony technika bonyolult természetes termékek gyors preparatív izolálására.

TERMÉSZETES CISTANCHE TUBULOSA A SZEXUÁLIS FUNKCIÓ JAVÍTÁSÁRA PHGS75% ECH 30% ACT 12%