A Cistanche Salsából származó teljes glikozid védő hatása kísérleti májsérülésre

Kapcsolatfelvétel: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964audrey.hu@wecistanche.com

Wang Yanfang, Zhao Jijun, Hai Pengli, Xue Peifeng, Li Hui, Li Minhui

Absztrakt

Ebben a kísérletben az alkoholos májkárosodás modelljét állítottuk fel egerekben, és a májfunkció biokémiai mutatóit és a máj hisztopatológiai változásait használtuk ellenőrzési indikátorként. Vizsgálja meg aa cistanche salsa teljes glikozidjának védő hatása a kísérleti alkoholos májkárosodásra. Adja meg összesena cistanche salsa glikozidjanagy dózisú (130 mg/kg) és közepes dózisú szondán keresztül (100 mg/kg), alacsony dózisú (65 mg/kg) és bidentát (150 mg/kg) pozitív kontrollként. Az eredmények azt mutatták, hogy a szérum ALT és AST szintje jelentősen megnőtt; Csökken az SOD aktivitás a májban, és nő az MDA-tartalom; megjelenik a májsejtek lipidózisa. A cistanche salsa nagy dózisú csoport teljes glikozidja hatékonyan javítja a májfunkciós indexeket és csökkenti a májsejtek lipiddegenerációját. Ennek alapján az előzetes meghatározásaechinakozidésakteozidA cistanche salsa teljes glikozidtartalma 29,1 százalék volt. A fenti kísérletek azt mutatják, hogy a cistanche salsa teljes glikozidja védő hatással van az alkoholos májkárosodásra egerekben, és azt is megerősítették, hogy a cistanche salsa teljes glikozidjának fő hatóanyagai az echinakozid és az akteozid.

Kulcsszavak: a cistanche salsa teljes glikozidja; nagy teljesítményű folyadékkromatográfia; akteozid; echinakozid; alkoholos májkárosodás

Citanche salsaaz Orobanchaceae (Orobanchaceae) családjába tartozó cistancse növény, más néven salina, évelő lágyszárú parazita növény, főként sivatagokban, sivatagokban és más száraz területeken elterjedt. A fő termelési területek Xinjiangban és Belső-Mongóliában találhatók. 1]. Mivel az azonos családba tartozó és azonos nemzetségbe tartozó Herba Cistanche nagy mennyiségben került feltárásra, illetve a parazita növények nehezen szaporíthatók, a gyógyászati ​​készletek napról napra fogynak, a piaci igények kielégítése nehézkes. Hazánkban a népi cistanche salsát a cistanche deserticola helyettesítésére használják, de kutatási jelentései kevések. Gyógyászati ​​értékének további tisztázása érdekében farmakológiailag tanulmányozták a cistanche salsa összes glikozidját (a Cistanche salsa összes glikozidja), amely a fenil-etanoid-glikozidokat tartalmazó anyagok osztálya.A cistanche salsa teljes glikozidja védő hatást fejt ki az idegekre[2] és megvédheti a DNS-t a hidroxil (OH·) által okozott oxidatív károsodástól [3]. A Cistanche salsa feniletanoid glikozidjai jelentősen növelhetik a szuperoxid-diszmutáz (SOD) aktivitást az egér szívében, májában és agyszöveteiben [4]. A fenti kutatások arra utalnak, hogy aa cistanche salsa teljes glikozidjaantioxidáns hatású.

Az alkoholos májbetegség (ALD) előfordulása országomban évről évre növekszik. Az alkohol a vírusos hepatitis után a második vezető májkárosodás okozója lett [5]. Az alkoholos májkárosodás kezelésére hiányoznak a biztonságos és hatékony gyógyszerek. A növényi erőforrások alkoholellenes és májvédő gyógyszerek és egészségügyi termékek kifejlesztésére való felhasználása széles körű figyelmet kapott a gyógyszer- és élelmiszeriparban. Kiterjedt irodalom után kiderült, hogy az alkoholos májkárosodás összefüggésben áll az oxidatív stresszel, és aA cistanche salsa teljes glikozidja hatással van az alkoholos májkárosodásray. A védőhatás kutatása még mindig üres. A kísérletben végzett kutatás tudományos alapot ad a cistanche salsa teljes glikozidjának kifejlesztéséhez és hasznosításához.

1 Anyag és felszerelés

1. 1 Gyógyszer és reagensek

Cistanche salsaa Baotou Medical College Mongolian Medicinal Material Identification and Standardization kulcslaboratóriuma biztosította; Bifendate csepegtető tabletták (Zhejiang Wanbang Pharmaceutical Co., Ltd., tételszám: A02121139); Alanin-aminotranszferáz (ALT) készlet, aszpartámsav-aminotranszferáz (AST) készlet, malondialdehid (MDA) tesztkészlet, szuperoxid-diszmutáz (SOD) készlet, Coomassie briliánskék fehérje-meghatározó készlet (Nanjing Jiancheng Institute of Bioengineering, tételszám: 20110422); 56 fokos likőr (Beijing Red Star Co., Ltd.); a többi reagens hazai tisztaságú.

1. 2 Állatok

72 hím, Kunming fajhoz tartozó egér, tömegük 17-22 g (Belső-Mongólia Egyetemi Laboratóriumi Állatközpont, Animal Qualification Certificate No.:6 (Mongólia 2002-0001)).

1. 3 Műszerek

Ultraibolya-látható spektrofotométer [Unico (Shanghai) Instrument Co., Ltd., UV modell-2000]; Mikrolemez olvasó (Beckman Coulter, USA, AD340 modell); Nagy sebességű centrifuga (Hangzhou Aipu Instrument Equipment Co., Ltd., TG18-WS modell); Nagy teljesítményű folyadékkromatográf (Thermo Fisher Scientific, Model Ultimate 3000); Analitikai mérleg (METTLER TOLEDO Instruments Co., Ltd. AR153O modell); Ultrahangos oszcillátor (Shanghai Branson, SB3200 modell); Fagymentesítő (Beijing Boyikang Experimental Instrument Co., Ltd., FD-1-50 modell).

2 Módszerek és eredmények

2. 1 Vizsgálat a cistanche salsa aktivitásának teljes glikozidjára vonatkozóan

2. 1. 1 Cisztanche salsa extrakció teljes glikozidja

2. 1. 1. 1 Nyerskivonat kinyerése

Mérjünk le 100 g cistanche salsa durva port, adjunk hozzá 600 ml 70 százalékos etanolt, és áztassuk 3 órán át, ultrahanggal extraháljuk 30 percig, szűrjük, és ismételjük meg a fenti lépéseket kétszer a szűrőmaradékon, egyesítsük a szűrletet és koncentráljuk az etanol kinyerésére. nincs alkohol íze, gyűjtsük össze a kivonatot és liofilizáljuk, hogy 19,46 g cistanche salsa nyers kivonatot kapjunk.

2. 1. 1. 2 Tisztítási folyamat

Tegyünk 10 g nyers cistanche salsa kivonatot egy főzőpohárba, adjunk hozzá 20 ml vizet, hogy ultrahangban feloldódjon, adjunk hozzá 80 ml abszolút etanolt, jól rázzuk össze és helyezzük 12 órára, majd szűrjük, a szűrletet bepároljuk, hogy visszanyerjük. etanolban, amíg az alkohol íze nem lesz, és liofilizálva 8,408 g teljes glikozidot kapunk a cistanche salsa kivonatból.

2. 1. 2 Az állatok csoportosítása és beadása

72 egeret tápláltunk adaptív módon 2 nappal a kísérlet előtt, és véletlenszerűen 6 csoportra osztották őket, mindegyikben 12 egér volt, nevezetesen egy üres kontrollcsoport, egy alkoholos májkárosodás modellcsoport és egy pozitív kontrollcsoport (150 mg). /kg bidentát), a cistanche salsa nagy dózisú csoport összes glikozidja (130 mg/kg), a cistanche salsa közepes dózisú csoport összes glikozidja (100 mg/kg) és a cistanche salsa összes glikozidja alacsony. dóziscsoport (65 mg/kg). Mindegyik csoportba tartozó állatoknak naponta kétszer intragasztrikus adagolást (ig) adtunk, és az ig térfogata 0,2 ml/20 g testtömeg volt. A vak kontrollcsoport és a modellcsoport azonos térfogatú sóoldatot kapott. Két órával minden egyes beadás után, kivéve a vak kontrollcsoportot, a többi csoport 56 fokos folyadékot kapott 0,4 ml/20 g testtömeg ig 10 egymást követő napon keresztül, hogy akut alkoholos májkárosodás modellt idézzen elő. A modellépítés 9. napján a böjt nem volt megengedett. A 10. napon 56 fokos fehérbort adtak 3 órán át. A szemgolyókból vért vettünk, és a szérumot elválasztjuk. A vérvétel után az egereket leöltük. Mérjük meg, vegyük ki a máj jobb lebenyét, és helyezzük 10 százalékos formaldehid fixáló oldatba, a máj többi részét pedig -20 fokos hűtőszekrénybe tesszük.

2. 1. 3 Statisztikai feldolgozás

Használja az SPSS 11.5 statisztikai szoftvert az adatok feldolgozásához, varianciaanalízishez, P<0.05 is="" statistically="">

2. 1. 4 A cistanche salsa teljes glikozidjának hatása a testtömegre, a májtömegre és az akut alkoholos májkárosodás májindexére egerekben

Amint az 1. táblázatban látható, a modellcsoportban lévő egerek májtömege és májindexe szignifikánsan magasabb volt, mint a vak kontrollcsoportban (P<0.05), indicating="" liver="" damage.="" compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" liver="" weight="" and="" liver="" index="" of="" mice="" in="" the="" total="" glycoside="" of="" the="" cistanche="" salsa="" high-dose="" group="" and="" the="" positive="" control="" group="" were="" significantly="" reduced="" (p=""><0.01). there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" the="" total="" glycoside="" of="" cistanche="" salsa="" medium="" and="" low-dose="" groups="" (="" p="">0.05).

2. 1. 5 A cistanche salsa teljes glikozidjának hatása a szérum AST és ALT szintjére

Az összegyűjtött vért 3,5 × 103 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk 10 percig a szérum előállításához. Lai módszerét használva UV-Vis spektrofotométer 505 nm-es leolvasásokat használtunk az ALT és AST aktivitásának meghatározására a szérumban. Amint a 2. táblázat mutatja, a szérum ALT és AST a modellcsoportban szignifikánsan magasabb volt, mint a vak kontrollcsoportban (P<0.05), indicating="" that="" the="" model="" group="" was="" successfully="" modeled.="" the="" serum="" alt="" and="" ast="" of="" mice="" in="" the="" positive="" control="" group="" were="" significantly="" lower="" than="" those="" in="" the="" model="" group=""><0.01). compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" serum="" alt="" and="" ast="" of="" mice="" in="" the="" total="" glycoside="" of="" the="" cistanche="" salsa="" high-dose="" group="" were="" significantly="" lower=""><0.01). there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" the="" total="" glycoside="" of="" the="" cistanche="" salsa="" middle="" and="" low="" dose="" group="" and="" the="" model="" group="" (p="">0.05).

2. 1. 6 A cistanche salsa összglikozidjának hatása a máj MDA-tartalmára és SOD-aktivitására

Vegyünk 0,3 g májszövetet a 10 százalékos és 1 százalékos homogenizátum elkészítéséhez. Centrifugálja az 1%-os májhomogenizátumot 3,5 × 103 fordulat/perc sebességgel 10 percig, és vegye ki a felülúszót. Az oldatot, a máj homogenizátumban lévő fehérjét Coomassie Brilliant Blue módszerrel határoztuk meg. Vegyünk 1 százalékos máj homogenizátum felülúszót, működtessük az SOD tesztdoboz szerint, és olvassuk le 450 nm-en a mikrolemez-leolvasón. Vegyünk 10 százalékos máj homogenizátum felülúszót, működtessük az MDA-meghatározó készlet szerint, és mérjük meg az abszorbanciát (A532) spektrofotométerrel 532 nm-en.

Amint a 3. táblázat mutatja, a modellcsoport májában az MDA-tartalom szignifikánsan magasabb volt, mint a vak kontrollcsoportban (P<0.05), and="" the="" sod="" activity="" was="" significantly="" reduced=""><0.05). compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" mda="" content="" in="" the="" liver="" of="" the="" positive="" control="" group="" was="" significantly="" lower=""><0.01), and="" the="" activity="" of="" sod="" was="" significantly="" increased=""><0.01). compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" mda="" content="" of="" the="" total="" glycoside="" of="" the="" cistanche="" salsa="" high-dose="" group="" was="" significantly="" lower=""><0.01), and="" the="" activity="" of="" sod="" was="" significantly="" increased=""><0.01). the="" total="" glycoside="" of="" cistanche="" salsa="" medium="" and="" low="" dose="" groups="" had="" no="" difference="" in="" mda="" and="" sod="" compared="" with="" the="" model="" group="" (p="">0.05).

2. 1. 7 A cistanche salsa teljes glikozidjának hatása a májszövet patológiás elváltozásaira egerekben

Patológiai vizsgálat: 10 százalékos formaldehiddel fixált májszövet, hagyományos paraffinba ágyazott metszet (5 μm szeletvastagság), HE festés, valamint a májszövettani elváltozások fénymikroszkópos megfigyelése.

Az üres kontrollcsoport mája sötétvörös színű és lágy textúrájú. A májszövet szerkezete normális, a májlebenyek szerkezete ép. Sokszögű, világos határokkal, a mag kerek és egyértelműen a sejt közepén helyezkedik el. A modellcsoportba tartozó egerek májtérfogata, valamint a cistanche salsa közepes és alacsony dózisú csoportjaiban a teljes glikozid mennyisége megnőtt, és a színe sárga lett. A mikroszkóp alatt látható kóros elváltozások főként a hepatociták zsíros degenerációját jelentették, a sejtekben diffúz lipidvakuolákkal és hepatocitákkal. Nagy, a citoplazma tele van apró lipidcseppekkel és vakuolákkal, és a sejtmag még mindig a központban van. A pozitív kontrollcsoportban és a cistanche salsa nagy dózisú teljes glikozid csoportjában az egerekben a májsejtek lipidózisa bizonyos mértékig, a lipidcseppek száma pedig bizonyos mértékben csökkent.

2. 2 A cistanche salsa teljes glikozidjának főkomponens-analízise

2. 2. 1 Kromatográfiás körülmények

A kromatográfiás körülmények a következők voltak: ZORBAX ODS kromatográfiás oszlop (250×4,6 mm, 5 μm); mozgófázis: metanol 0,2%-os hangyasavoldat (27,5∶72,5), gradiens elúció; oszlop hőmérséklete 30 fok; áramlási sebesség 1 ml/perc; detektálási hullámhossz 334 nm. A fenti kromatográfiás körülmények között az elválasztás azechinakozidésakteozidez jó.

2. 2. 2. Összehasonlító oldat készítése

Pontosan mérjen ki 1,3 mg-ot és 1,2 mg-otechinakozidésakteozidreferenciaanyag a {{0}},13 mg/ml echinakozid referenciaanyag oldat és 0,12 mg/ml akteozid referenciaoldat elkészítéséhez.

2. 2. 3 Vizsgálati oldat elkészítése

Pontosan mérjen ki 0,1082 g-ot a cistanche salsa kivonat teljes glikozidjából, és hígítsa fel 50 ml-re a mozgófázis-oldattal.

2. 2. 4 Lineáris kapcsolat

Pontosan rajzolja meg a {{0}} referenciamegoldást! 06, 0. 12. 0. 18. {{10}}. 24. 0. 30, 0. 48. 0. 54. 0. 72. 1. 20 mg/ml koncentrációnál fecskendezzen be egymás után 5 μL-t a folyadékkromatográfiába, és számítsa ki a regressziós egyenletet úgy, hogy a két referenciaanyag injektált térfogata (ug) az abszcissza és a megfelelő csúcsterület az ordináta. echinakozid: Y=11.868 X-0.0785, R=0.9997; akteozid: Y=18.026X-0.1913, R=0.9997. Ennek eredményeként az echinakozid referenciaanyag jó lineáris kapcsolattal rendelkezik a 0,0635-0,4445 ug tartományban; az akteozid referenciaanyag 0,059-1,18 ug tartományban van. A belső lineáris kapcsolat jó.

2. 2. 5 Precíziós teszt

Pontosan vegyen fel 10 μL-t ugyanabból a tesztoldatból, és ismételje meg az injekciót ötször a fenti kromatográfiás körülmények között. Rögzítse a kromatogramot, és határozza meg a csúcsterületet. Az eredmény az echinakozid RSD 0,89 százaléka,RSD ofaz akteozid 1,87 százaléka, ami azt jelzi, hogy a műszer pontossága jó.

2. 2. 6 Stabilitási vizsgálat

Ugyanezt a vizsgálati oldatot rendre 0, 2, 4, 8, 16, 32, 40, 48 óra elteltével vegyünk pontosan 10 litert, fecskendezzük be a folyadékkromatográfba, rögzítsük a kromatogramot, és mérjük meg a csúcsterületét. . Az eredmény az echinacoside RSD 1, 58 százaléka, az RSD azakteozida 0. 49 százalék, ami azt jelzi, hogy a tesztoldat 48 órán belül van

A stabilitás jó.

2. 2. 7 Ismételhetőségi vizsgálat

Pontosan mérjen le körülbelül 0,2 mg-ot ugyanabból a tételből, összesen 5 részből, és készítsen elő 5 rész oldatot. A tartalom meghatározási módszer szerint pipettázzon pontosan 10 μL-t a folyadékkromatográfba, rögzítse a kromatogramot, és határozza meg a csúcsterületet. Az eredmény az echinacoside. Az 1,91 százalékos RSD és a verbascum glikozidok RSD értéke 2,08 százalék volt, ami azt jelzi, hogy a meghatározási módszer jó ismételhetőségű.

2. 2. 8 Helyreállítási arány teszt

Mérj le pontosan 0,2 g aa cistanche salsa teljes glikozidja, adjunk hozzá egy bizonyos mennyiségetechinakozid és akteozidreferenciaanyagokat, készítse el a vizsgálati oldatot a fenti 2.2.3. pontban leírt módszer szerint, és végezze el a meghatározást a tartalommeghatározási módszer szerint, meghatározott kromatográfiás körülmények között. Az eredmény Az echinakozid átlagos visszanyerési aránya 98,49 százalék, az RSD 1,06 százalék, az akteozid átlagos visszanyerési aránya 97,35 százalék, az RSD pedig 1,45 százalék.

2. 2. 9 Minták meghatározása

Vegyünk fel pontosan 10 μL-t a referenciaoldatból és a vizsgálati oldatból, fecskendezzük be a mintát, határozzuk meg a fenti kromatográfiás körülményeket, és számítsuk ki a minta tartalmát külső standard módszerrel. Az eredményeket a 4. táblázat tartalmazza. Az átlagos echinakozid-tartalom 24,5 százalék, az átlagos echinakozid-tartalom pedigakteozid4,6 százalék.

3 Vita

Az alkoholos májkárosodás májkárosodásra és kóros elváltozások sorozatára utal, amelyeket a hosszan tartó, erős alkoholfogyasztás okoz. A hosszú távú túlzott alkoholfogyasztás májsejtkárosodást, majd májfibrózist, sőt májcirrózist is okozhat [6]. A modellcsoporthoz képest ebben a kísérletben a cistanche salsa nagy dózisú csoport összes glikozidja szignifikánsan csökkentette az ALT és AST aktivitását az egérszérumban, szignifikánsan csökkentette a máj MDA-tartalmát és szignifikánsan növelte a SOD aktivitását. , amely bizonyos mértékig csökkentette a májsejtek lipidózisát. , Csökkentse a lipidcseppek számát. Nem volt szignifikáns különbség a közepes és alacsony dózisú csoport és a modellcsoport között. Ennek a kísérletnek az eredményei összhangban vannak a pA Cistanche teljes glikozidjainak rotektív hatása az alkoholos májkárosodásra egerekben [7].

A cistanche salsa teljes glikozidja védi a májsejtek károsodásáta sejtmembrán permeabilitásának csökkentésével és a vérbe kerülő ALT és AST tartalmának növelésével; növelheti az SOD aktivitását és nagyszámú szabad gyököt eltávolíthat az alkohol által a szervezet anyagcseréjében. ; Csökkentheti az MDA képződését, és megakadályozhatja, hogy károsítsa a szöveti sejtek membránszerkezetét [8-10]. A cistanche salsa teljes glikozidja védő hatást fejt ki az alkoholos májkárosodás ellen, és van egy mennyiségi hatás összefüggés. A szakirodalmat áttekintve nincs kvantitatív elemzés a cistanche salsa összglikozidjának hatóanyagairól. Ebben a cikkben a tartalomakteozidésechinakozid, a cistanche salsa teljes glikozidjának fő összetevőit, először kvantitatívan elemezték HPLC-vel, amely az összes glikozid 29,1 százalékát tette ki. Tudományos alapot nyújtani a cistanche salsa teljes glikozidjának fejlesztéséhez és felhasználásához. A modern farmakológiai vizsgálatok kimutatták, hogy az echinakozid védő hatást fejt ki a hidrogén-peroxid és az oxidatív stressz által károsított PC12 sejtekre vaszkuláris demenciában szenvedő patkányokban [11,12]. MindkétAz echinakozid és az akteozid gátló hatást fejt ki a hepatociták citotoxicitásáraD GalN és TNF- indukálta [13]. Továbbá a feltételezések szerint aA cistanche salsa teljes glikozidja megvédi az egereket az alkoholos májkárosodástóláltal fokozhatóechinakozid és akteozida sejtek antioxidáns enzimaktivitásának fokozására, a májsejtek antioxidáns kapacitásának javítására, ezáltal a májsejtek plazmamembránjának integritásának megőrzésére, hogy a májsejtek normálisan működhessenek Védekező és kompenzációs funkciók. A jövőbeni vizsgálatok során tovább fogjuk izolálni a vegyületeket, és molekuláris biológiai technikákat alkalmazunk a monomer vegyületek májsejtek apoptózisra gyakorolt ​​szabályozásának, valamint a kapcsolódó célgének szabályozásával való kapcsolatának tanulmányozására.

hivatkozások

1 Zhang HW. Vizsgálatok a kémiai összetevőkről és

a Cistanche salsa (CA Mey.) ujjlenyomata G. Beck. Hot: Inner Mongolia Medical College, MSc. 2008.

2 Tian XF, Pu XP. A Cistanches salsából származó feniletanoid glikozidok gátolják a metil-fenil-piridinium-ion által kiváltott apoptózist a neuronokban. J Ethnopharmacol, 2005, 97: 59-63.

3 Wang XW, Jiang XY, Wu LY. A Cistanche glikozidjainak szabad gyökök megkötő hatása és védelme az OH· által kiváltott DNS-károsodás ellen in vitro China Pharm J, 2001, 36: 29-32.

4 Wu HH. Cistanche salsából származó fenil-etanol-glikozidok előállítása és antioxidáns hatása. Nanjing: Nanjing Mezőgazdasági Egyetem, MSc. 2008.