A procianidinek védő hatásai és mechanizmusai a Parkinson-kórra in vivo és in vitro 2. rész

Kérlek keress feloscar.xiao@wecistanche.comtovábbi információért

2.7. A PC-k hatása az MPTP-vel kezelt zebrafish Larae oxidatív stresszére

A zebrahal lárvák PC-vel történő kezelése csökkentette az MPTP által kiváltott fokozott intracelluláris ROS képződést (7a, b ábra). Ezenkívül a lipid-peroxidációs vizsgálat eredményei azt mutatták, hogy a PC-expozíció (16 ug/ml) blokkolta az MPTP-indukált MDA-szinteket zebradán lárvákban (7c. ábra). Ezenkívül a GSH-Px aktivitás MPTP által kiváltott csökkenését a PC (16 ug/mL) kezelés (7d ábra) és a PC-k (4, 8 és 16 ug/mL) megfordította a CAT és SOD MPTP által kiváltott csökkenését. tevékenység (7e, f ábra).

Figure 7. Effects of PCs on oxidative stress of zebrafish larvae treated with MPTP. (a)ROS levels were measured by fluorescent microscopy and imaging analysis;(b)ROS levels were measured via imageJ software;(c) MDA levels;(d) GSH-Pxactivity;(e)CATactivity;(f) SOD activity. F and p values of the one-way analysis of variance are presented above each chart.The results of Tukey's post hoc test are presented for selected comparisons: ns, p>0.05;*,p<><0.01;***, p=""><0.001; the="" error="" bars="" are="">

További információért kattintson ide

2.8. PC-k hatása a Nr2/ARE Patlhroay-re MPTP-indukált zebrafish Laroa esetén

A zebrahal lárvák PC-vel történő kezelése aláhúzta azt a feltevést, hogy a Nr2/ARE útvonalak aktiválása szerepet játszik a PC által közvetített védő tulajdonságokban. A Nrf2, HO-1, NQO1, GCLC és GCLM markerek expresszióját a PC-kezelés fokozta, összehasonlítva az egyedüli MPTP-expozícióval (8a-e ábra).

Figure 8. Effects of PCs on Nrf2/ARE pathway in MPTP-induced zebrafish larvae. (a) Nrf2 levels;(b)HO-1 levels;(c)NQO1 levels;(d) GCLClevels;(e) GCLM levels. F and p values of the one-way analysis of variance are presented above each chart. The results of Tukey's post hoc test are presented for selected comparisons: ns,p>0.05;*,p<><><0.001:the error="" bars="" are="">

3. Megbeszélés

A PC-k erős gyökfogó képességgel és antioxidáns aktivitással rendelkeznek, és az oxidatív stressz, amelyet a ROS túlzott képződése és/vagy a károsodott antioxidáns védelmi rendszer okoz, kritikus szerepet játszik a PD-ben[37-39]. Továbbra sem világos azonban, hogy a PC-k neuroprotektív szerepet játszhatnak-e az antioxidáns hatások révén. A kutatás célja a PC-k molekuláris mechanizmusának vizsgálata volt MPP plusz /MPTP-indukálta PD modellekkel szemben.

A Cistanche javíthatja az immunitást

Ebben a vizsgálatban az MPP plusz /MPTP-alone csoporttal összehasonlítva a PC-k jelentősen megnövelték az antioxidáns enzimek (beleértve a GSH-Px-t, CAT-t és SOD-t) aktivitási szintjét, és csökkentették a ROS és az MDA szintjét. A jelenlegi eredmények összhangban vannak egy korábbi vizsgálattal, amely azt sugallja, hogy az alacsony PC-kiegészítés étrenden keresztül javítja a GSH-Px, CAT és SOD aktivitását elválasztott malacokban [40]. Egy másik tanulmány arra is utal, hogy a PC-k jelentősen növelik a CAT- és SOD-aktivitást, és csökkentik az MDA-tartalmat, ezáltal javítva a kecskesperma minőségét[41]. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a PC-k védő hatást fejtenek ki az idegsejtek oxidatív károsodása ellen. Ezenkívül a PC-k javították a sejtek életképességét az MPP plusz egyedüli csoporthoz képest az MPP plusz-indukált PC12 sejtekben, jelentősen megnövelték a teljes mozgási távolságot, és csökkentették a TH plusz sejtsűrűséget az MPTP csoporthoz képest MPTP-vel indukált zebradán lárvákban. Ezek az adatok azt mutatják, hogy a PC-k védő hatást fejtenek ki az idegsejtekre.

Megfigyeltük továbbá, hogy a PC-k szignifikánsan megnövelték a nukleáris Nrf2 felhalmozódást az MPP plusz önmagában alkalmazotthoz képest PC12 sejtekben. Valójában a PC-k jelentősen megnövelték az NQO1, HO-1, GCLM és GCLC expressziós szintjét[42]. Továbbá az Nfr2gén-csendesítést Nrf2 siRNS-en keresztül használták a Nrf2/ARE aktiváció szerepének vizsgálatára az MPP plusz által kiváltott oxidatív károsodás elleni PC-k által közvetített neuroprotekcióban: Nrf2-siRNS-transzfektált sejtek az Nrf2 expressziójának jelentős csökkenését jelezték. Ez a jelenlegi tanulmány azt is megállapította, hogy az Nrf2 knockout megszüntette mind a PC-k által közvetített védelmet az MPP-vel és a sejtek életképességének károsodásával szemben, mind a PC-k antioxidáns hatásait. Ezek az eredmények összhangban vannak egy korábbi vizsgálattal, amely arra utal, hogy az Nrf2/ARE útvonal aktiválásának javítása hozzájárul a neuroprotekcióhoz [43].

A Nrf2/ARE útvonal jelentős antioxidáns útvonal [44-46]. Normális esetben az Nrf2 a citoplazmában található, ahol a gátló fehérjéhez, a Keapl-hez kötődik [47,48]. Amikor a sejtek oxidatív stresszen mennek keresztül, az Nrf2 disszociál a Keap1-ről, beindítja az endogén antioxidáns védelmi rendszert, majd ezt követően transzlokálódik a sejtmagba [46,49,50]. Ezután kölcsönhatásba lép az ARE-vel, hogy aktiváljon egy sor sejtvédő és antioxidáns gént, köztük a GCLC-t, a GCLM-et, az NQO1-et és a HO-1 [51-54]. Az oxidatív stressz hatására az Nrf2 disszociál a Keap1-ről a citoszolban, majd a sejtmagba transzlokálódik, és az ARE szekvenciához kötődve aktiválja a krioprotektív gének transzkripcióját [53-58]. A jelenlegi eredmények azt mutatják, hogy a PC-k képesek aktiválni az Nrf2/ARE útvonalat, átvinni az Nrf2-t a citoplazmából a sejtmagba, felhalmozódni a sejtmagban, felszabályozni a GCLC, GCLM, NOO1 és HO-1 expresszióját, és javítani a a sejteket, hogy ellenálljanak az oxidatív stressznek. Valójában a Nrf2/ARE útvonal a PC-k farmakológiai célpontja lehet a PD megelőzésében.

4. Anyagok és módszerek

4.1. Kémiai vegyületek és reagensek

Az MPP plus és MPTP ügynököket a Sigma cégtől (St. Louis, MO, USA), a Cell Counting Kit{0}} pedig a Beyotime-tól (Sanghaj, Kína) szereztük be. A PC-ket, 2',7/-diklórfluoreszcin-diacetátot, MDA-t, GSH-Px-t, SOD-t és CAT-t a Solarbio-tól (Peking, Kína) szereztük be. Az RNAiso Plus, PrimeScriptTMRT reagenskészlet gDNA radírral és SYBRPremix Ex TaqTMⅡI a Takarától (Shiga, Japán) vásároltuk; az Nrf2-siRNS-t, a kontroll-siRNS-t és a Lipofectamine 2000-et a GenePharma cégtől (Sanghaj, Kína) szereztük be. Végül az elsődleges antitesteket, Nrf2, HO-1, GCLC, GCLM, NAD(P)H: NQO1, Lamin B, GAPDH, antitirozin-hidroxiláz (TH) és a megfelelő másodlagos antitesteket a Proteintech-től (Wuhan, Kína) szereztük be. ).

4.2. Sejttenyésztés

A PC12 sejteket a National Collection of Authenticated Cell Cultures-től szereztük be. A sejteket 10% magzati szarvasmarha-szérummal és penicillin-sztreptomicinnel (100 U/ml; 100 ug/ml) kiegészített DMEM-ben tartottuk 37 fokos, 5 százalékos CO2-t tartalmazó, párásított atmoszférájú inkubátorban [59].

4.3. Sejtéletképességi vizsgálat

A PC12 sejteket (1 × 104 sejt/lyuk) 1,2 vagy 4 ug/ml PCsor deprenvl (30 μM) oldattal inkubáltuk 24 órán át, majd 1,5 mM MPP plusz 24 órán át inkubáltuk. Ezután 10 μL sejtszámláló készlet{12}} oldatot adtunk minden egyes lyukba, és 1 órán át inkubáltuk. Az abszorbanciát 450 nm-en mértük [60].

4.4. Halak karbantartása

Az állatok felhasználására vonatkozó etikai engedélyt a Zhejiang Egyetem kísérleti állatközpontjának állatvédelmi és felhasználási bizottsága (ZJU20200125) adta meg. A kifejlett zebrahalat (AB törzs) a Zhejiang Egyetem (Hang Zhou, Kína) laboratóriumi állatközpontjából szereztük be, és 28±1 fokon tartottuk 14 órás világos/10 órás sötét ciklusok alatt. A halakat naponta kétszer etették Artemia nauplii-val [61]. Az embriók előállításához kifejlett zebrahalakat tenyésztartályokba helyeztek éjszakára 1:1 hím: nőstény arányban. Az ívást azután indították el, hogy másnap reggel felkapcsolták a villanyt, és 2 óra alatt befejeződött. Az embriókat embrióvízben (13,7 mM NaCl, 540 µM KCl, 25 uM Na2HPOA44 uM KHPOA, 300 uM CaCl2, 100 µM MgSO ㉉, 420 µM NaHCO3, pH 36248, pH 7) neveltük fel.

4.5. ROS mérés

A ROS termelés mérésére a PC12 sejteket (2 × 104 sejt/lyuk) 1,2 vagy 4 ug/ml PC-vel vagy deprenil (30 μM) hatásának tettük ki 24 órán keresztül, majd 1,5 mM MPPt-vel inkubáltuk. 24 órán át 【64】. A sejteket 10 μM 2',7'-diklórfluoreszcin-diacetát oldattal kezeltük sötét körülmények között 30 percig; a festékoldatot ezután eltávolítottuk, és a sejteket foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS) háromszor mostuk. A sejtek képét Olympus lézer pásztázó konfokális mikroszkóppal (Olympus, Tokió fővárosa, Japán) figyeltük meg. A sejtek fluoreszcencia intenzitását az Image J szoftver v1.8.0 (Olympus, Tokió fővárosa, Japán) segítségével határoztuk meg. Az eredményeket a kontrollcsoportban lévő ROS régiók területének százalékában fejezzük ki.

A ROS termelés mérésére a zebrahal lárvákat a megtermékenyítés után 3 nappal (dpf) deprenyl (40 μM) vagy 4,8 vagy 16 ug/ml PC-k hatásának tették ki 400 μM MPTP-vel vagy anélkül 4 napon keresztül. A 7 dpf sebességű zebrahal lárvákat egy 24-lyukú lemezre helyeztük (csoportonként 10 lárva), 20 μM 2',7'-diklórfluoreszcin-diacetát oldattal kezeltük, és 60 percig sötétben, 28,5 fokon inkubáltuk [65 ]. A lárvákat ezután háromszor mostuk embrióközeggel, hogy eltávolítsuk a 2',7'-diklór-fluoreszcin-diacetát feleslegét. A megfestett lárvák képeit Olympus lézer pásztázó konfokális mikroszkóppal figyeltük meg. Az egyes lárvák fluoreszcencia intenzitását Image J szoftverrel határoztuk meg. Az eredményeket a kontrollcsoportban lévő ROS régiók területének százalékában fejezzük ki. 4.6. Az MDA, GSH-Px, SOD és CAT értékelése

A PC12 sejteket (2 × 104 sejt/lyuk) 1,2 vagy 4 ug/ml PC-vel vagy deprenil (30 μM) hatásának tettük ki 24 órán át, majd 24 órán át inkubáltuk 1,5 mM MPP plusz oldattal. Ezután 1 ml kivonatot adtunk 4×10 fokos sejtekhez, és a sejteket ultrahangos centrifugálással, 8000 fordulat/perc sebességgel, 4 fokon 10 percig feltörtük. A felülúszót ezután jégre tettük tesztelés céljából, és reagenseket adtunk hozzá az MDA, GSH-Px, SOD és CAT meghatározásához. Mindegyik indexet három példányban megismételtük.

A zebrahal lárvákat 3dpf mellett deprenyllel (40 μM) vagy 4,8 vagy 16 ug/mL PC-vel inkubáltuk 400 µM MPTP-vel vagy anélkül 4 napon keresztül. Ezután 0,05 g zebrahal lárva szövetet és 0,5 ml kivonatot jeges fürdőben homogenizáltunk, majd 4 fokon 10 percig centrifugáltuk. A felülúszót jégre tesszük tesztelés céljából. Ezt követően reagenseket adtunk hozzá az MDA, GSH-Px, SOD és CAT meghatározásához. Mindegyik indexet három példányban megismételtük.

4.7. Teljes sejtes, citoplazmatikus és nukleáris fehérje előállítása

A teljes sejt fehérje extrakciójához a sejteket összegyűjtöttük, és 1% PMSF-et és 1% proteáz inhibitor koktélt tartalmazó RIPA lízispufferrel inkubáltuk 30 percig jégen. A sejtlizátumokat centrifugáltuk, a felülúszót összegyűjtöttük és tároltuk. A szubcelluláris frakcionáláshoz a sejtmintákat a nukleáris és citoplazmatikus fehérje extrakciós kittel dolgoztuk fel. A fehérjetartalmat a BCA (Beyotime, Shanghai, Kína) assay segítségével határoztuk meg.

4.8. Nrf2 siRNS transzfekció

A Nrf{0}}siRNS-t az Nrf2 leütésére használták. A PC12 sejteket Nrf2-siRNS-sel (80 nM) vagy kontroll-siRNS-sel transzfektáltuk Lipofectamine 2000 alkalmazásával, a kézikönyv szerint. 4.9. Western Blotting

A fehérjemintákat SDS-PAGE-val rezolváltuk, és polivinilidén-difluorid (PVDF) membránokra vittük át. A blotokat megfelelő primer antitesteknek tesszük ki: Nrf2, Keap1, HO-1, NQO1, GCLC, GCLM, Lamin B, GAPDH és peroxidázzal konjugált másodlagos antitestek. A fehérjesávokat ECL (Beyotime, Shanghai, Kína) és Western blotting detektáló reagensek segítségével tettük láthatóvá [36,43].

4.10. Mozgásszervi viselkedési teszt

A zebrahal lárvákat 3dpf mellett 4 napon keresztül deprenil (40 μM) vagy 4, 8 vagy 16 ug/ml PC-vel inkubáltuk 400 uM MPTP-vel vagy anélkül. A 7 dpf-es zebrahalat ezután 24-lyuklemezekre helyezték (1 hal lyukonként és 12 lárva csoportonként), és feljegyeztük az egyes halak 10 perc alatti úszásának teljes távolságát. A zebrahal viselkedését egy automatizált videokövető rendszerrel figyelték és elemezték (Any-maze 4.73, Stoelting, Wood Dale, IL, USA)[66].

4.11. Teljes RNS extrakció, reverz transzkripció és kvantitatív valós idejű polimeráz láncreakció

Az RNS-t RNAiso Plus-szal extraháltuk a gyártó utasításait követve. Az RNS-t egy PrimeScriptTMRT Reagent Kit és gDNA Eraser segítségével fordított átírással végeztük, követve a gyártó utasításait. A kvantitatív valós idejű PCR analízist Applied Biosystems ViATM 7 Real-Time PCR rendszeren végeztük SYBRPremix Ex TaqTM II (Takara, Shiga, Japán) segítségével. -aktint használtunk referenciagénként, és a relatív génexpressziót a 2-△Ct módszerrel számítottuk ki. A kutatás során felhasznált primer szekvenciákat az 1. táblázat tartalmazza.

4.12. Zebrafish antitirozin-hidroxiláz(TH) teljes körű immunfestés

A zebrahal lárvákat 1 dpf-nél deprenyllel (40 μM) vagy 4,8 vagy 16 ug/ml PC-vel inkubáltuk 400 uM MPTP-vel vagy anélkül 2 napig (10 hal/csoport tétel). A lárvákat 4 százalékos paraformaldehiddel fixáltuk PBS-ben 30 percig. Rögzítés után TH teljes immunfestéssel kezelték [67]. Szobahőmérsékleten 2% (v/o) bárányszérum és 0,1% (w/ø) szarvasmarha szérumalbumin (BSA) blokkolva volt foszfáttal pufferelt sóoldatban, Tween-20(PBST) 1 órán át. Ezután a blokkoló pufferben antitirozinhidroxiláz antitestet (1:200 hígítás, Proteintech) 2 órán át, majd 6-szor öblítettük PBST-vel. Az utolsó teljes immunfestési lépést 488 kecske antinyúl (1:500) festőpufferben hajtottuk végre 1 órán át, majd ismét mostuk PBST-vel. Kellő színfejlődés után a zebrahalakat 3,5 százalékkal laposra szereltükmetil-cellulózés egy Olympus lézer pásztázó konfokális mikroszkóp segítségével készült.

4.13. Statisztikai analízis

Egyutas varianciaanalízist (ANOVA), majd Tukey többszörös összehasonlító tesztjét alkalmaztuk a különböző csoportok átlagainak összehasonlítására. A statisztikai elemzéshez és a grafikonok ábrázolásához a Graphpad Prism v6.01-et (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) használtuk.

5. Következtetések

Összefoglalva, eredményeink azt mutatják, hogy a PC-k neuroprotektív hatást fejtenek ki az Nrf2/ARE útvonal aktiválása és annak downstream aktiválása révén.méregtelenítésésantioxidáns enzimek. Összességében ezek a betekintések arra utalnak, hogy a PC-k hasznosak lehetnek a PD kezelésében.

Ez a cikk a Molecules 2021, 26, 5558-ból származik. https://doi.org/10.3390/molecules26185558 https://www.mdpi.com/journal/molecules