Gyulladásos infiltrátumok mennyiségi értékelése vesetranszplantációs biopsziákban multiplex tiramid jelerősítés és mély tanulás segítségével

Kapcsolatfelvétel: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Meyke Hermsen¹Valerij Volk²Jan Hinrich Bräsen²et al

Absztrakt

A késleltetett graft funkció (DGF) erős kockázati tényező az intersticiális fibrózis és a tubuláris atrófia (IFTA) kialakulásában veseátültetések során. A gyulladásos infiltátumok kvantitatív értékelése DGF-betegek vesebiopsziáiban az IFTA kialakulásának prediktív markereit tárhatja fel. Ebben a vizsgálatban multiplex tiramid jelerősítést (mTSA) és konvolúciós neurális hálózatokat (CNN) kombináltunk, hogy felmérjük a gyulladásos mikrokörnyezetet DGF-betegek (n=22) vesebiopsziáiban, amelyeket a transzplantáció után 6 héttel vettek. A betegeket rétegezték az IFTA fejlődése szempontjából (<10% versus="" ≥10%)="" from="" 6="" weeks="" to="" 6="" months="" post-transplantation,="" based="" on="" a="" histopathological="" assessment="" by="" three="" kidney="" pathologists.="" one="" mtsa="" panel="" was="" developed="" for="" visualization="" of="" capillaries,="" t-="" and="" b-lymphocytes,="" and="" macrophages,="" and="" a="" second="" mtsa="" panel="" for="" t-helper="" cell="" and="" macrophage="" subsets.="" the="" slides="" were="" multi="" spectrally="" imaged="" and="" custom-made="" python="" scripts="" enabled="" conversion="" to="" artificial="" brightfield="" whole-slide="" images="" (wsi).="" we="" used="" an="" existing="" cnn="" for="" the="" detection="" of="" lymphocytes="" with="" cytoplasmatic="" staining="" patterns="" in="" immunohistochemistry="" and="" developed="" two="" new="" cnns="" for="" the="" detection="" of="" macrophages="" and="" nuclear-stained="" lymphocytes.="" f1="" scores="" were="" 0.77="" (nuclear-stained="" lymphocytes),="" 0.81="" (cytoplasmatic-stained="" lymphocytes),="" and="" 0.82="" (macrophages)="" on="" a="" test="" set="" of="" artificial="" brightfield="" wsi.="" the="" cnns="" were="" used="" to="" detect="" inflammatory="" cells,="" after="" which="" we="" assessed="" the="" peritubular="" capillary="" extent,="" cell="" density,="" cell="" ratios,="" and="" cell="" distance="" in="" the="" two="" patient="" groups.="" in="" this="" cohort,="" the="" distance="" of="" macrophages="" to="" other="" immune="" cells="" and="" peritubular="" capillary="" extent="" did="" not="" vary="" significantly="" at="" 6="" weeks="" post-transplantation="" between="" patient="" groups.="" cd163+="" cell="" density="" was="" higher="" in="" patients="" with="" ≥10%="" ifta="" development="" 6="" months="" post-transplantation="" (p="" <="" 0.05).="" cd3+cd8−/cd3+cd8+="" ratios="" were="" higher="" in="" patients="" with=""><10% ifta="" development="" (p="" <="" 0.05).="" we="" observed="" a="" high="" correlation="" between="" cd163+="" and="" cd4+gata3+="" cell="" density="" (r="0.74," p="" <="" 0.001).="" our="" study="" demonstrates="" that="" cnns="" can="" be="" used="" to="" leverage="" reliable,="" quantitative="" results="" from="" mtsa-="" stained,="" multi="" spectrally="" imaged="" slides="" of="" kidney="" transplant="">

A Cistanche deserticola megelőzi a vesebetegséget, kattintson ide a mintaért

Bevezetés

A vesetranszplantáció utáni késleltetett graft funkció (DGF) többtényezős, és főként a donor jellemzőihez és az ischaemia idejéhez kapcsolódik. A DGF-et általában úgy írják le, hogy a transzplantációt követő 7 napon belül dialízisre van szükség, és ez a krónikus vesetranszplantációs sérülés erős kockázati tényezője [1–3]. A krónikus vesekárosodás klasszikus összetevője az intersticiális fibrózis és tubuláris atrófia (IFTA). Azonban nem minden DGF-beteg halad előre az IFTA kialakulásáig, és a DGF és az IFTA közötti összetett kapcsolat még mindig kevéssé ismert. Ez egyrészt a potenciálisan kiváltó események és a funkcionális hanyatlás közötti késleltetési időnek köszönhető, másrészt a potenciális induktorok változó és összetett hatásainak, mint például a gyógyszeres kezelés kilökődésének és mellékhatásainak [1, 4]. A gyulladás és a specifikus makrofágok általános jelenlétét számos tanulmány leírja a graft elvesztésének előrejelzőjeként [5–8]. A mögöttes kóros folyamatok azonban nem teljesen ismertek, és a magas szintű gyulladás nem mindig vezet hosszú távú graftvesztéshez. A környezeti ingerek hatására a makrofágok speciális funkciókra tesznek szert, és különböző fenotípusokká polarizálódnak. Számos tanulmány azt sugallja, hogy specifikus makrofág-altípusok (alternatív módon aktivált makrofágok) részt vesznek a szöveti remodellingben azáltal, hogy szöveti javítást vagy fibrózist indukálnak. A szöveti remodelling (néha profibrotikus) fenotípus felé történő polarizációról ismert, hogy a környezeti ingerek széles skálájától függ, többek között a T-helper limfocita altípusoktól [9–11]. A DGF idején a graftban lévő T-helper sejtpopulációk felmérése egy elterjedt T-helper 1 altípust mutatott ki, de a graft kimenetelével vagy az IFTA-ba való progresszióval való összefüggést ez idáig nem vizsgálták [12]. A gyulladásos mikrokörnyezet átfogó értékelése, amely kifejezetten a makrofágokra és a T-helper sejt alcsoportokra összpontosított gondosan kiválasztott betegcsoportokban, betekintést nyújthat abba, hogy néhány, de nem minden DGF-beteg miért halad előre az IFTA kifejlesztése felé.

A gyulladásos infiltátumok átfogó vizsgálatát azonban számos (műszaki) korlát akadályozza. A hagyományos immunhisztokémiai (IHC) és immunfluoreszcens technikák csak korlátozott számú sejtmarker megjelenítését támogatják egy szövetmetszetben. Kis, értékes szövetfragmensek, például vesebiopsziák sorozatos metszete nem kívánatos, és a különböző metszetekben lévő sejtek közötti kapcsolatok értelmezése nehéz. Ezenkívül a gyulladásos infiltrátumok vizuális becsléssel történő kvantitatív értékelése a megfigyelők közötti variabilitás jelentős szintjét jelenti [13]. A hagyományos képfeldolgozási technikák, mint például a pixel küszöbérték, a vízválasztó és a morfológiai alapú szegmentálás, az összes morfológiai sejtreprezentáció és a szövetfoltok intenzitásának előzetes ismeretein alapulnak az adathalmazban [14–16]. Ezért ezek a módszerek gyakran nem robusztusak a biológiai és technikai képváltozatok tekintetében, és rosszul fordíthatók új vagy külső adatkészletekre. A digitális patológia térnyerése felgyorsította a teljes diaképek (WSI) értékelésére szolgáló alternatív módszerek kifejlesztését [17, 18]. A mély tanulási modellek, konkrétan a konvolúciós neurális hálózatok (CNN-ek) bebizonyították, hogy képesek szegmentálni és kimutatni a releváns biológiai struktúrákat a hisztopatológiai tárgylemezeken [19–23]. Ezek a technikák képesek elmozdulni a szubjektív vizuális becsléstől és a hagyományos képfeldolgozástól a pontos, objektív és reprodukálható sejtészlelés felé.

Ennek a tanulmánynak a célja egy módszer kidolgozása több gyulladásos sejtmarker objektív, kvantitatív értékelésére, megkerülve a kiterjedt sorozatlemez-metszetek szükségességét. Ennek érdekében multiplex IHC-t, több spektrális képalkotást és mély tanulási modelleket kombinálunk. E technikák alkalmazhatóságának demonstrálására a gyulladásos mikrokörnyezet mély tanulási modellekkel számszerűsített összefüggéseit tanulmányozzuk az IFTA fejlődésével DGF-betegek felügyeleti graft biopsziájában.

vesebetegségek kezelésére szolgáló cistanche kivonat

Anyagok és metódusok

A DGF-betegek vesebiopsziájának gyulladásos mikrokörnyezetének felmérésére multiplex IHC-t végeztünk a transzplantáció után 6 héttel vett megfigyelő biopsziákon. A betegeket rétegezték az IFTA fejlődése szempontjából (<10% versus="" ≥10%)="" from="" 6="" weeks="" to="" 6="" months="" post-transplantation,="" based="" on="" a="" histopathological="" assessment="" by="" three="" kidney="" pathologists.="" multiplex="" ihc="" was="" performed="" using="" tyramide="" signal="" amplification="" (mtsa)="" panels.="" one="" mtsa="" panel="" was="" designed="" for="" the="" visualization="" of="" capillaries,="" macrophages,="" and="" t="" and="" b="" lymphocytes="" (panel="" i),="" and="" one="" mtsa="" panel="" for="" the="" visualization="" of="" polarized="" t-helper="" lymphocytes="" and="" macrophages="" (panel="" ii).="" second,="" the="" mtsa="" slides="" were="" multi="" spectrally="" imaged,="" and="" custom-made="" python="" scripts="" were="" used="" to="" convert="" the="" multispectral="" images="" to="" artificial="" brightfield="" ihc="" wsi.="" converting="" the="" slides="" to="" artificial="" ihc="" wsi="" allowed="" for="" the="" application="" of="" an="" existing="" cnn="" for="" the="" detection="" of="" lymphocytes="" in="" ihc="" [22].="" this="" existing="" cnn="" was="" designed="" for="" cytoplasmatic="" lymphocyte="" markers.="" hence,="" a="" second="" and="" third="" cnn="" was="" developed="" in="" this="" study="" for="" the="" quantification="" of="" macrophages="" and="" nuclear="" lymphocyte="" markers="" in="" ihc="" wsi.="" these="" three="" cnns="" were="" subsequently="" used="" to="" quantitatively="" assess="" the="" inflammatory="" infiltrates="" in="" the="" two="" patient="" groups="" and="" to="" study="" the="" correlations="" of="" the="" inflammatory="" microenvironment="" at="" 6="" weeks="" post-transplantation="" with="" the="" development="" of="" ifta="" 6="" months="" after="">

Szövetminták

A Hannoveri Orvostudományi Iskola (Hannover, Németország) vesetranszplantált recipienseitől származó megfigyelési biopsziákat használtunk, amelyeket egy leendő felügyeleti biopszia program keretében szereztünk be. A felvételi kritériumok a következők voltak: DGF előfordulása (meghatározása:<500 ml="" urine="" production="" within="" the="" first="" 24="" h="" after="" transplantation="" and/or="" the="" need="" for="" dialysis="" within="" 7="" days="" post-transplantation),="" absence="" of="" rejection="" in="" any="" of="" the="" surveillance="" biopsies="" or="" biopsies="" for="" cause="" within="" the="" first="" year="" post-transplantation,="" and="" absence="" of="" ifta="" in="" the="" surveillance="" biopsy="" taken="" at="" 6="" weeks="" after="" transplantation="" (based="" on="" the="" pathology="" report="" and="" graded="" according="" to="" the="" banff="" lesion="" grading="" system="" [24]).="" all="" patients="" were="" treated="" with="" dialysis="" because="" of="" no,="" or="" insufficient="" graft="" function,="" variably="" manifested="" by="" (combinations="" of)="" anuria,="" oliguria,="" metabolic="" de-arrangement="" with="" acidosis,="" or="" hyperkalemia.="" none="" of="" the="" patients="" had="" hyperkalemia="" or="" hypervolemia="" alone.="" formalin-fixed,="" paraffin-embedded="" tissue="" (ffpe)="" from="" biopsies="" taken="" 6="" weeks="" and="" 6="" months="" post-transplantation="" was="" collected.="" six="" patients="" did="" not="" undergo="" a="" surveillance="" biopsy="" procedure="" 6="" months="" after="" transplantation.="" instead,="" the="" surveillance="" biopsy="" was="" taken="" at="" 3="" months="" post-transplantation="" was="" included="" (n="3)" or="" the="" nearest="" cases="" with="" sufficient="" cortical="" tissue="" (here="" defined="" as="" ≥4="" glomeruli)="" in="" both="" the="" 6="" weeks="" and="" the="" 6="" months="" biopsy="" were="" included="" in="" the="" study="" (n="24)." one="" case="" was="" excluded="" because="" of="" interstitial="" nephritis="" of="" unknown="" cause="" and="" one="" more="" case="" due="" to="" fixation="" artifacts.="" a="" final="" number="" of="" 22="" patients="" were="" included="" in="" this="" study="" (table="">

IFTA értékelés

Az intersticiális fibrózis (ci) és a tubuláris atrófia (ct) (IFTA) mértéke 6 héten és 6 hónapon, a Banff-féle lézió-besorolási rendszerrel kifejezve [24] a patológiai jelentésből származott. A korai gyulladásos infiltrátumok és az IFTA fejlesztés közötti kapcsolat részletesebb felmérése érdekében minden PAS-festett tárgylemezt digitalizáltunk egy Pannoramic 25{9}} Flash II digitális diaszkennerrel (3DHistech, Magyarország) 20-as újbóli vizsgálat céljából. × objektív 0,24 μm/pixel felbontással. Mindkét időpont (6 hét és 6 hónap) PAS WSI-jét három vesepatológus értékelte az IFTA mértékére (a felület százaléka, 10 százalékos intervallumokkal). A patológusok átlagos IFTA pontszámait használták végső pontszámként az IFTA változásának kiszámításához a transzplantációt követő 6 hét és 6 hónap között. A betegeket az IFTA pontszám 10 százalékos vagy annál nagyobb abszolút növekedése alapján rétegezték (n=13), és nem, ill.<10% increase="" of="" ifta="" (n="9)" (table="" 1).="" recipient="" characteristics,="" donor="" characteristics,="" and="" banff="" ci,="" ct,="" ti,="" i,="" and="" i-ifta="" lesion="" scores="" (obtained="" from="" the="" pathology="" report)="" are="" listed="" in="" table="" 1="" for="" both="" patient="" groups.="" significant="" differences="" between="" patient="" groups="" were="" assessed="" using="" the="" independent="" samples="" mann–whitney="" u="" test="" or="" fisher's="" exact="" test="" and="" are="" displayed="" in="" table="">

Ezenkívül a Banff-lézió pontszámait Wilcoxon előjeles rangsor teszttel hasonlították össze az időpontok között. Ez jelentős különbségeket tárt fel a 6 hetes és 6 hónapos biopsziák között a Banff ti (p=0.017), ci (p=0.004) és ct (p=0.011) kategóriákban. .

Multiplex TSA festés

Multiplex IHC-t végeztünk mTSA segítségével, hogy több sejtmarkert is megjelenítsünk a 6 hetes biopsziák során. Primer és másodlagos antitesttel végzett inkubálás után a szövetet fluoreszcensen jelölt tiramiddal kezeltük. A másodlagos antitestből származó torma-peroxidáz katalizálja az aktív tiramid gyökök képződését. A tiramid gyökök kovalensen kötődnek az antigén tirozin maradékaihoz. Ez az állandó kötődés lehetővé tette az elsődleges-másodlagos antitestkomplex hő hatására történő eltávolítását, miközben megőrizte a fluoreszcens tiramid lerakódást [25]. Ez lehetővé tette a további, ugyanazon fajból származó további antitestekkel történő inkubálást a célantigének ellen.

Az mTSA-t két egymást követő tárgylemezen végeztük el a 6 hetes megfigyelő biopsziákból. Két mTSA panelt fejlesztettünk ki a gyulladásos infiltráció és a peritubuláris kapilláris kiterjedésének felmérésére betegcsoportjainkban. Az I. panel az anti-CD3, CD4, CD8, CD20, CD68 és CD34 antitesteket tartalmazza. A II. panelt a T-helper sejt és a makrofág polarizáció vizsgálatára használták anti-CD4, Tbet, GATA3, CD68 és CD163 antitestek alkalmazásával. Az antitestek specifikációit, hígításait és festési sorrendjét az 1. kiegészítő táblázat sorolja fel. Az összes tárgylemezt xilolban paraffinmentesítettük, 95 százalékos etanolban dehidratáltuk, csapvízben mostuk, és 10-szeres hígítású trisborát-EDTA-ban (T) megfőztük az epitóp-kinyeréshez. , 0658, VWR Life Sciences, USA) puffer. Lehűlés után a tárgylemezeket 3%-os hidrogén-peroxidáz-oldatban mostuk az endogén peroxidáz blokkolása érdekében, majd 0,05% Tween 20-at (822184, Merck KGaA, Németország) (TBS-T) tartalmazó trisz-pufferolt sóoldattal mostuk. A fehérjeblokkolást TBS-T alkalmazásával hajtottuk végre 1 százalék marhaszérum albuminnal (BSA) (mTSA 1. lépés). Az elsődleges antitesteket 1 órán át szobahőmérsékleten, vagy egy éjszakán át négy Celsius-fokon inkubáltuk (mTSA 2. lépés). TBS-T-ben történő mosás után a lemezeket HRP-vel konjugált másodlagos antitesttel (Poly-HRP-GAMs/Rb IgG, VWRKDPVO999HRP, Immunologic, Hollandia) inkubáltuk 30 percig szobahőmérsékleten (mTSA 3. lépés). Ezt követően a TSA-t az Opal 7-color Manual IHC Kitből (NEL811001KT, Akoya Biosciences, USA) származó Opal TSA fluoroforokkal végeztük (mTSA 4. lépés) (a fluoroforokat és a megfelelő antitesteket az 1. kiegészítő táblázat tartalmazza). Az antitest-TSA komplexet TBE-pufferben végzett forralással eltávolítottuk (mTSA 5. lépés). Az mTSA 1–5. lépéseit addig ismételtük, amíg a tárgylemezek meg nem festődnek az érintett panel összes antitestével. A tárgylemezeket fluoromount-G-vel fedtük le DAPI-val (00-4959-52, Thermo Fisher, USA).

herba cistanche

Multiplex TSA érvényesítés

Az ismételt forrási ciklusok befolyásolhatják a célepitóp affinitását. Egyes antitestek gyengébb festődést mutatnak a szövet többszöri forralása után, más antitesteknek több forralási ciklusra van szükségük az optimális festési intenzitás eléréséhez, míg más antitesteket ez egyáltalán nem érint. Ezt a hatást minden antitestre kromogén IHC-vel értékeltük az FFPE kontroll mandulaszöveten. Minden tesztelt antitesthez (n=9) hat metszetet vágtunk (4 μm vastagságban). Az összes tárgylemezt xilolban paraffinmentesítettük, 95 százalékos etanolban dehidratáltuk, csapvízben mostuk, és 10-szeres hígítású TBE-ben megfőztük az epitópok visszanyeréséhez (első forralási ciklus). Lehűlés után tesztelt antitestenként egy tárgylemezt foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS) tároltunk. A megmaradt tárgylemezeket ismét felfőzték. Ezt a ciklust ötször megismételték. Ezt követően az összes tárgylemezt 3%-os hidrogén-peroxidáz oldattal mostuk, majd PBS-ben öblítettük. Az elsődleges antitesteket (1. kiegészítő táblázat) 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk. Inkubálás után a lemezeket PBS-ben mostuk. Az anti-CD68, Tibet és GATA3 antitestekkel festett lemezeket további 15 perces antitestblokkolással (PAB) végzett inkubációra volt szükség (VWRKDPVB blokkolás, Immunologic, Hollandia). Inkubálás után a lemezeket PBS-ben mostuk, és HRP-vel konjugált másodlagos antitesttel inkubáltuk (a PAB VWRKDPVB110HRP, Immunologic, Hollandia nyomán, lásd a másodlagos antitest 1. kiegészítő táblázatát). A vizualizációt 3,3′-diaminobenzidin (DAB) (Bright-DAB, VWRKBS04, Immunologic, Hollandia) felhasználásával végeztük. Az eredményeket az 1. kiegészítő ábra szemlélteti. Ezen eredmények alapján meghatároztuk az optimális antitest-sorrendet az mTSA-kísérletekhez, az 1. kiegészítő táblázatban felsoroltak szerint.

Ha az érdeklődésre számot tartó epitópok egyidejűleg lokalizálódnak, a tiramid lerakódások zavarhatják egymást. Ennek a sztérikus gátlásnak a tesztelésére mandulakontroll szövetlemezeket használtunk, és ezeket mTSA paneleinkkel megfestettük. Az mTSA antitest-expresszióját összehasonlították az egyszeresen festett tárgylemezekkel, amelyek ugyanannyi forrási cikluson mentek keresztül. Nem figyeltünk meg különbségeket a festési mintákban az egyszeres és multiplex festett tárgylemezek között (példák az I. panelen, 2. és 3. kiegészítő ábra). Az mTSA-ban lévő összes elsődleges antitestet ugyanabban a hígításban használtuk, mint a kromogén IHC-hez. A fluoreszcens jel intenzitását a TSA oldat hígításainak beállításával optimalizáltuk.

Multiplex TSA képalkotás

A multispektrális képalkotást Vectra Polaris Imaging System (CLS143455, Akoya Biosciences, USA) segítségével végeztük 20x objektívvel, 0,49 μm/pixel felbontással, valamint DAPI, FITC, CY3, Texas Red és Cy5 spektrális kockák. A Vectra rendszer lehetővé teszi a régiók manuális kiválasztását a multispektrális felvételhez, amelyeket a rendszer ezt követően lapkákra oszt fel (1.1. ábra). Az autofluoreszcencia spektrumát és az összes Opal TSA fluorofort előre rögzítettük egy spektrális "könyvtárban" az Inform Advanced Image Analysis Software 2.4.6 szoftverrel. (Akoya Biosciences, USA). A spektrális könyvtár lehetővé tette a multiplex csempe felosztását több egyedi csempére, amely az egyes fluoroforok hozzájárulását képviseli ("feloldás"). Ez monokróm, többcsatornás lapokat eredményezett, amelyek mindegyike egyetlen fluorofornak és így antitestnek felel meg (1.2. ábra).

Konverzió mesterséges fényes mező IHC-vé

A tárolt koordináták alapján a csempéket összefűztük, hogy egy többcsatornás WSI-t hozzanak létre egy egyedi python szkript segítségével (1.3. ábra). A DAPI jelet reprezentáló csatornákat (IDAPI) és az egyik antitestet (IIHC) reprezentáló csatornákat mesterséges hematoxilin és DAB festéssé alakítottuk át (1.4. és 1.5. ábra). Az ismert kromatikus hematoxilin és a DAB Cx, a színárnyalat-telítettség-sűrűség (HSD) transzformáció utáni Cy koordináták alapján a foltvektorokat korábbi vizsgálatok során szereztük [26, 27]. Ezeket a foltvektorokat használtuk a mesterséges világosmező IHC vörös-zöld-kék értékeinek kiszámításához (1.5. ábra), a következőképpen:

CR-rel st a színezék fényelnyelése st a spektrum vörös részén. A B és G értékeket hasonló módon számítottuk ki.

Képelemzés

Érdekes régiók (ROI)

Az érdeklődésre számot tartó régiókat (ROI-k) a kohorszban minden esetben annotáltuk az automatizált diaelemző platform szoftverével (ASAP; 1.9-es verzió, nyílt forráskódú szoftverként elérhető a GitHubon). Ezek a ROI-k corticalis tubulointerstitiumból álltak, így kizárva a kapszulát, a glomerulusokat és az artériákat. Mivel a vese szubkapszuláris régióiban a gyulladás nem specifikus a transzplantációs patológiában, a biopsziákat ebben a vizsgálatban elsősorban a szubkapszuláris régió (a kapszula alatt 400 µm-rel meghatározott) kizárásával elemezték. Másodsorban megismételtük az elemzéseket, beleértve a szubkapszuláris régiót is. A ROI-k vizuális példáit a 4. kiegészítő ábra tartalmazza.

Limfocita kimutatás CNN I

A CD3, CD4, CD8 és CD20 festést reprezentáló mesterséges világosmezős IHC-képeket egy meglévő, U-Net architektúrájú CNN segítségével elemeztük [22, 28]. Ezt a hálózatot kifejezetten a citoplazmatikus limfocita markerek kimutatására tervezték IHC-ben. A CNN teljesítménye kifejezhető pontossággal, felidézéssel és F1- pontszámmal, ahol:

A CNN {{0}},76 pontosságot, 0,79 visszahívást és 0,78 F1-pontszámot ért el a tesztkészleten amelyet az eredeti papírban használtak, amely a hagyományos IHC WSI-t tartalmazza. Az egyes pozitív sejtek kimutatásához a CNN-kimenet küszöbértékére van szükség, amelyet utófeldolgozás követ. Mivel az mTSA panelen a CD3 festődés erősebb volt a CD4-hez, a CD8-hoz és a CD2-hez0 képest, az utóbbi három esetében alacsonyabb objektumészlelési küszöböt (0,4), a CD3 esetében pedig az eredeti tárgyészlelési küszöböt (0,7) alkalmaztunk. A CNN teljesítményének értékelésére a mesterséges világosmező IHC WSI-kon ebben a tanulmányban négy mesterséges világosmező IHC WSI-t (két beteg CD8 és CD20) használtunk tesztsorozatként. A pontjegyzeteket (n=1115) az ASAP szoftverrel hoztuk létre. A hálózat alkalmazása után kiszámították a pontosságot, a visszahívást és az F{19}} pontszámot a CNN teljesítményének értékeléséhez. Az észleléseket akkor tekintettük igazán pozitívnak, ha 4 µm-en (átlagos limfocitaátmérő) belül találhatóak az alapigazság-annotációhoz képest. Ha 4 µm-es tartományon belül két kimutatást találtak, csak a megjegyzéshez legközelebb eső észlelést tekintették igazán pozitívnak. Ezt követően a CNN I limfocita-detektálást alkalmaztuk az összes mesterséges világosmező IHC WSI elemzésére, amely citoplazmatikus limfocita markereket (CD3, CD4, CD8 és CD20) reprezentál.

Limfocita kimutatás CNN II

A mesterséges világosmezős IHC WSI elemzése nukleáris festődési mintákkal (amint azt a T-bet és a GATA3 bemutatja) a DAPI-t és a CD4-et képviselő csatornákat úgy választottuk ki, hogy egy WSI-ben egyesítsék (4). A korábbi vizsgálatok során szerzett foltvektorokkal mesterségesen színezték a DAPI jelet kékre (hematoxilin) ​​és a CD4 jelet barnára (DAB), ami egy mesterséges világosmező IHC WSI-t eredményezett (5).

szükséges egy új CNN képzése, validálása és tesztelése. Ebből a célból kilenc tárgylemezt vágtunk ki a vese, a mandula és a függelék FFPE kontrollszövetéből. Ezeket a tárgylemezeket IHC-vel festették anti-Tibet (4B1{{10}} klón, 14-5825-82, Thermo Fisher Scientific, USA) és anti-GATA3 (L50-823 klón, CM) -405B, Biocare Medical, Hollandia) antitestek. A diákat Pannoramic 250 Flash II digitális diaszkennerrel digitalizáltuk 0,12 μm/pixel felbontással. Két megfigyelő 5726 pont annotációt készített különböző régiókban az ASAP szoftver segítségével. Öt diáról származó annotációkat használtunk egy U-Net architektúra CNN betanítására, 256 × 256 pixeles foltokkal, amelyek pixelmérete 0,49 μm/pixel. Két WSI-t használtunk a CNN validálására és az objektumészlelési küszöb (0,4) meghatározására. A CNN teljesítményét a hagyományos IHC WSI-n egy két IHC WSI-ből álló visszatartott tesztsorozaton értékelték. A CNN teljesítményét a mesterséges világosmezős IHC WSI-n egy másodlagos tesztkészlettel értékelték, amely négy mesterséges világosmezős IHC WSI-t (Tibet és GATA3 két betegtől) tartalmazott, 1082 ponttal. A pontosságot, a felidézést és az F{22}}pontszámot kiszámítottuk a teljesítmény értékeléséhez mindkét tesztkészletben. Az észleléseket akkor tekintették igazán pozitívnak, ha az alapigazság-annotációtól számított 4 µm-en belül találhatók. Ha 4 µm-es tartományon belül két kimutatást találtak, csak a megjegyzéshez legközelebb eső észlelést tekintették igazán pozitívnak. Ezt követően a limfocita-detektáló CNN II-t használták az összes mesterséges brightfield IHC WSI elemzésére, amelyek nukleáris (limfocita) markereket (Tibet és GATA3) képviselnek.

Makrofág kimutatás CNN

A limfocita kimutatással ellentétben az egyes makrofágok azonosítása nem egyértelmű. Különösen a csoportosított jeleneteknél várható a megfigyelői variabilitás jelentős szintje. Ezért sokkal nagyobb számú esetet és humán annotációt használtak egy dedikált, harmadik CNN képzésére a CD68 plusz és CD163 plusz makrofágok kimutatására. Natív és transzplantált veseszövetből IHC-festett lemezeket (n=111) gyűjtöttünk. Az IHC festést anti-CD68 (PG-M1 klón, GA61361-2, Dako Omnis, Dánia vagy KP1 klón, M0876, Dako, Dánia) vagy anti-CD163 (MRQ klón) segítségével végeztük. -26 vagy 10D6, NCL-L-CD163, Leica Biosystems, Egyesült Királyság) antitest. Az IHC tárgylemezeket panoráma 250 Flash II digitális diaszkennerrel vagy Aperio AT2 diaszkennerrel (Leica Biosystems, Wetzlar, Németország) 0.24 vagy 0 felbontással digitalizáltuk. 0,25 μm/pixel. Négy megfigyelő 37 709 pont annotációt készített több ROI-n a WSI-ben, a makrofág annotáció protokollját használva, amelyről a kezdeti kísérleti kísérletek után állapodtak meg. A 101 diából származó annotációkat egy YoloV2 architektúra CNN képzésére használták [29]. A Yolo kifejezetten az észlelési feladatokra alkalmas. A hét konvolúciós rétegből álló hálózatot 0,98 μm/pixel felbontású 256 × 256 pixeles foltokon képezték ki, 21 μm-es határoló dobozokkal (az átlagos makrofág méret alapján). Tíz WSI-t használtunk a CNN validálására, valamint az objektumészlelési küszöb (0,45) és a nem maximális elnyomási paraméterek (0,05) meghatározására. A CNN teljesítményét a hagyományos IHC WSI-n egy tíz IHC WSI-ből álló visszatartott tesztsorozaton értékelték. A CNN teljesítményét a mesterséges világosmezős IHC WSI-n egy másodlagos tesztkészlettel értékelték, amely négy mesterséges világosmezős IHC WSI-t (CD68 és CD163 két betegtől) tartalmazott 1033 ponttal. Pontossági, felidézési és F1 pontszámokat számítottunk ki, hogy értékeljük a teljesítményt mindkét tesztsorozaton. A kimutatásokat akkor tekintettük igazán pozitívnak, ha 21 µm-en belül (átlagos makrofág-átmérő) találták meg az alapigazság-annotációhoz képest. Ha a 21 µm-es tartományon belül több észlelést találtak, csak a megjegyzéshez legközelebb eső észlelést tekintették igazán pozitívnak. Ezt követően a makrofág-detektáló CNN-t használták a makrofág markereket (CD68 és CD163) reprezentáló összes mesterséges világosmezős IHC WSI elemzésére.

cistanche tubolosa tesztoszteron

Kettős pozitivitás

A sejtek pozitivitását két markerre (kettős pozitivitás) úgy értékeltük, hogy meghatároztuk a pixelek számát a sejtdetektálások között a különböző csatornákban. Ha két limfocita kimutatás közötti távolság az volt<4 µm,="" the="" cell="" was="" considered="" double-positive.="" for="" macrophages,="" this="" was="" set="" to=""><21µm. this="" was="" used="" to="" assess="" cd3+cd4+,="" cd3+cd8+,="" cd4+tbet+,="" cd4+gata3+,="" and="" cd68+cd163+="">

A sejtszámot a ROI-kon belül számítottuk ki, és a sejtsűrűséget a sejtszám és a megjegyzésekkel ellátott ROI területe alapján határoztuk meg.

Térbeli kapcsolatok

A WSI automatizált sejtdetektálása lehetővé teszi a sejtek közötti térbeli kapcsolatok vizsgálatát. Az átlagos legrövidebb távolságot (a szubkapszuláris régió kivételével) a CD68 plusz sejtek és a CD3 plus , CD3 plus CD8 plus és CD20 plus sejtek esetében határoztuk meg az I. panel WSI-jében mindkét betegcsoportban, valamint a CD163 plusz sejtek és a CD4 között. plus , CD4 plus Tbet plus és CD4 plus GATA3 plus a WSI-ben mindkét betegcsoport esetében.

Peritubuláris kapilláris kiterjedés

A peritubuláris kapilláris kiterjedésének felmérése érdekében a CD34 csatornát képviselő nem kevert WSI-ket elemeztük Fidzsi-szigeteken (ImageJ 2-es verzió.0.0, USA, makrók és bővítmények: "Open and Duplicate", "ASAP" ROI Reader") [30]. A pozitív pixeleket automatikus küszöbértékkel határoztuk meg, majd a ROI-n belüli teljes pixelszám százalékában fejeztük ki.

Statisztikai analízis

A 6 hetes biopsziák során a következő sejtpopulációk sűrűségét számítottuk ki: T-limfociták (CD3 plusz ), citotoxikus T-limfociták (CD3 plusz CD8 plus ), B-limfociták (CD20 plusz ), makrofágok (CD68 plus , I. és I. panelek). II), polarizált makrofágok (CD68 plusz CD163 plus, CD163 plus), T-helper 1 limfociták (CD4 plusz Tbet plus) és T-helper 2 limfociták (CD4 plus GATA3 plus). Spearman-féle korrelációs együtthatókat számítottunk ki annak felmérésére, hogy van-e összefüggés a T-helper 1 és a T-helper 2 limfocita sűrűsége (CD4 plusz Tbet plus, CD4 plus GATA3 plus) és a polarizált makrofág sűrűség (CD68 plusz CD163 plus vagy CD163 plus ). Megfigyeltük a CD68 jelet (fluorofor 540 nm) az I. panel mesterséges CD4 (fluorofor 520 nm) IHC-jében. Ezért a CD3 plusz CD8− sejtek sejtsűrűségét is közöljük. Az eltérő IFTA kimenetelű betegcsoportok közötti különbségek felméréséhez csoportonként közöljük a medián, minimális és maximális sejtsűrűség értékeket. A sejtsűrűségben és a peritubuláris kapilláris kiterjedésében (amit a CD-pozitív pixelszázalékban határoztak meg) a csoportok között a Mann–Whitney-féle U-teszttel határozták meg a független mintákon. Független minták t-tesztjével értékeltük, hogy a különböző IFTA-kimenetelű betegeknél szignifikánsan eltérő a CD3 plusz CD8-/CD3 plusz CD8 plusz sejtarány. A betegcsoportok közötti különbségeket a CD68 plusz és CD163 plusz sejtek más immunsejtekkel való térbeli kapcsolataiban a független minták Mann–Whitney-féle U-tesztje segítségével értékelték szignifikancia szempontjából.

Eredmények

IHC pozitív sejtek CNN-alapú kimutatása

A meglévő CNN-ek alkalmazása érdekében, amelyeket eredetileg világosmezős mikroszkópiára fejlesztettek ki, az mTSA fluoreszcenciás képeket mesterséges világosmezős képekké alakították át. A 2. ábrán láthatók az mTSA-festett régiók példái a hozzájuk tartozó mesterséges világosmezős IHC-képekkel. Egy mesterséges világosmezős IHC WSI-re egy példát mutat be a 4. kiegészítő ábra. A többfelbontású WSI-k megnyithatók és megtekinthetők digitális dianézetben. olyan szoftverek, mint az ASAP és az Aperio ImageScope [v12.4.3.5008]. A 2. ábrán látható módon a mesterséges világosmezős IHC WSI alkalmas volt az eredetileg a hagyományos IHC WSI-hez kifejlesztett CNN-ek általi automatizált elemzésre.

Három CNN-t használtunk a gyulladásos sejtek kvantitatív értékelésére a 6 hetes mTSA-festett transzplantációs biopsziák során: limfocita kimutatására citoplazmatikus (CNN I) és nukleáris (CNN II) IHC festéssel, valamint makrofágok kimutatására. A 2. táblázat bemutatja a CNN teljesítményét (precíziós, visszahívási és F{3}}pontszámok) mind a DAB-festett IHC WSI-k, mind a mesterséges világosmezős IHC WSI-k kitartási készletei esetében. A CNN teljesítménye jellemzően olyan jó vagy jobb volt, mint a korábban leírt CNN alapérték ({1- 0,78-as F{6}}pontszámmal), amelyről kimutatták, hogy a tapasztalt kézi megfigyelők teljesítményéhez hasonlítható [22] . Míg a limfocita-detektáló CNN II némileg csökkent teljesítményt mutatott a virtuális világosmezős képeken a valódi DAB-képekhez képest (amelyeken a CNN-t betanították), a CNN-nél ennek ellenkezője volt megfigyelhető a makrofágok kimutatására.

A sikeres automatikus kettős pozitivitásértékelés példáját a 3. ábra tartalmazza.

Különböző sejttípusok összefüggései

A legerősebb korrelációt a CD4 plusz GATA3 plusz sejtsűrűség és a CD163 plusz sejtsűrűség között figyelték meg (Spearman-féle együttható 0,75, p < 0.001)="" 6="" hetes="" biopszia="" (kiegészítő="" 5a.="" ábra).="" ez="" a="" korreláció="" gyengébb="" volt="" a="" cd4="" plusz="" tbet="" plusz="" sejtsűrűség="" és="" a="" cd163="" plusz="" sejtsűrűség="" között="" (spearman-féle="" együttható="" 0.61,="" p="">< 0.01)="" (kiegészítő="" 5b.="" ábra)="" .="" ha="" a="" sejtpopulációt="" kettős="" pozitív="" makrofágokra="" korlátoztuk="" (cd68="" plusz="" cd163="" plusz="" ),="" a="" spearman-féle="" korrelációs="" együttható="" 0,65="" (p="">< 0,01)="" volt="" cd4="" plusz="" gata3="" plusz="" sejtekkel="" és="" 0,66="" (p="">< 0,01)="" cd4="" esetén.="" plusz="" tbet="" plusz="" sejtek="" (kiegészítő="" 5c,="" d="" ábra).="" a="" szubkapszuláris="" régió="" bevonása="" az="" analízisbe="" nem="" változtatott="" az="">

A gyulladásos infiltrátumok összehasonlítása közöttaz IFTA-ra előrehaladó betegek a nem IFTA-val szemben

Azok a betegek, akik 6 hónapos korukban IFTA-ra fejlődtek, szignifikánsan magasabb CD163 plusz sejtsűrűséget mutattak a transzplantáció után 6 héttel vett biopsziákban (medián 505 sejt/mm2), mint azoknál a betegeknél, akiknél nem javult az IFTA (medián 370 sejt/mm2; p=0 .043) (3. táblázat). A szubkapszuláris régió bevonása ennek a hatásnak enyhe csökkenését eredményezte (p=0,051). Mindkét panelen CD68-at és CD4-et használtak. Az mTSA panel I-el festett tárgylemezek nagyobb CD68-pozitivitást mutattak, mint az mTSA panel II-vel festett lemezek. A CD4 sejtsűrűség magasabb az mTSA II panelben, mint az mTSA I panelben (3. táblázat).

A peritubuláris kapilláris kiterjedése hasonló volt DGF-betegek 6 hetes biopsziáján, különböző IFTA-eredményekkel (3. táblázat), mind a szubkapszuláris régió kizárásával (p=0.74), mind pedig (p=0.90). az elemzésből/ben.

A CD3 plusz CD8-/CD3 plusz CD8 plusz sejtarány értékelése szignifikánsan magasabb arányt mutatott azoknál a betegeknél,<10% ifta="" development="" 6="" months="" post-transplantation="" (ratio="" of="" 17.5)="" than="" in="" patients="" with="" ≥10%="" ifta="" development="" (ratio="" of="" 9.80;="" p="0.043)" (table="">

A CD68 plusz sejtektől a CD3 plusz , CD3 plusz CD8 plusz és CD20 plusz sejtekig (I. panel), valamint a CD163 plusz sejtektől a CD4 plusz, CD4 plusz Tbet plus és CD4 plusz GATA3 plusz sejtekig (II. panel) mért átlagos legrövidebb távolság nem különbözik szignifikánsan a betegcsoportok között. Az eredményeket a 4. ábra szemlélteti.

Cistanche kivonat: javítja a veseműködést és a fizikai erőt

Vita

Ebben a tanulmányban kifejlesztettünk egy módszert a gyulladásos sejt infiltátumok pontos és objektív számszerűsítésére DGF-es vesetranszplantált betegek graftbiopsziáiban, amely megkerüli a vesebiopsziás anyag kiterjedt sorozatvágását. Ebből a célból a multiplex IHC-t, a tiramid jelerősítést, a multispektrális képalkotást és a CNN-ek kvantifikálását kombináltuk. Mi voltunk az elsők, akik a csempézett multispektrális adatokat egyetlen mesterséges kromogén képpé alakítottuk át sejtmarkerenként, megkönnyítve a WSI-elemzést és a világosmezős IHC-hez tervezett CNN-ek alkalmazását. Két új CNN-t terveztünk a nukleáris festett limfociták és makrofágok kimutatására, és bemutattuk a hagyományos IHC WSI-n kifejlesztett CNN-ek általánosíthatóságát a mesterséges világosmezős IHC WSI-re. Módszerünk alkalmazhatóságát a CNN-k által nyert kvantitatív eredmények segítségével igazoltuk a DGF-betegek 6 hetes biopsziáiban a gyulladásos mikrokörnyezet és az IFTA 6 hónappal a transzplantáció utáni kifejlődés összefüggéseinek vizsgálatára.

Kereskedelmi forgalomban kapható kézi festőkészletet használtunk a multiplex IHC-hez, hogy megjelenítsük az immunsejteket és a peritubuláris kapillárisokat a 6 héttel a transzplantáció után kapott megfigyelési biopsziákban. A multiplex festési eljárás több mosásból, inkubálásból és szövetfőzésből állt, és több reagens oldatot is magában foglal. A módszerek kiterjedt validálása és minőség-ellenőrzése ezért nagy jelentőséggel bír, és konzisztens festési intenzitást biztosító specifikus antitestek használata javasolt. Az elvégzett validációs lépések ellenére makrofágszerű festődési mintázatok voltak láthatók az mTSA I. és II. panelek CD4 csatornáiban. A CD4 és CD68 festési ciklusokat nem végeztük el egymás után, így ezt a jelenséget nem okozhatta a CD68 antitest hiányos eltávolítása (1. kiegészítő táblázat). Bár a makrofág kettős pozitivitás ritka előfordulásait leírták CD4-gyel [31], ennek valószínűbb magyarázata a fluoroforok emissziós spektrumainak közelsége, amelyeket a CD4 (520 nm) és a CD68 (540 nm) vizualizálására használtak. a fluoreszcens mikroszkóp FITC szűrőkockájával. Ez az erős CD68 jel "kivérzését" okozhatja a CD4 csatornában. Ennek a jelnek a nagy részét kizártuk az I. panel elemzéséből, mivel csak a CD3-mal kétszeresen pozitív CD4 plusz sejteket használtuk az általános T-helper sejt analízishez. Ennek ellenére úgy döntöttünk, hogy közvetve értékeljük az általános T-helper sejteket is, CD3 plusz CD8− pótlással. A II. panelen a CD4-et kizárólag Tibettel és GATA3-mal kombinálva használták, csökkentve a hamis pozitív kimutatások használatának kockázatát.

Alacsonyabb CD68-pozitivitást figyeltek meg a II. panelen, mint az I. panelen. Feltételezzük, hogy ez a CD163-hoz tartozó tiramid-lerakódás által okozott sztérikus gátlás eredménye ("esernyőhatás") [32]. Szignifikánsan több CD163-pozitív sejtet figyeltünk meg a vizsgált kohorszban, mint a sztérikus gátlás ellenőrzésére használt mandulaszövetben, ami valószínűleg megmagyarázza, miért nem fedezték fel ezt a hatást a validálás során.

A multiplex IHC-t multispektrális képalkotással kombinálták a tumor mikrokörnyezetének vizsgálatára számos onkológiai tanulmányban, és az utóbbi időben a vese allograft kilökődésének elemzésére is [33–35]. Az mTSA tárgylemezeken lévő összes marker hozzájárulásának kinyeréséhez a metszeteket Vectra rendszerrel vagy hasonló, multispektrális elrendezésű fluoreszcens mikroszkóppal leképezzük. Az alacsony nagyítású áttekintő kép rögzítése után a Vectra rendszer a szövetet lapkákra osztja, és automatikusan multispektrálisan letapogatja a csempéket. Ez több közreműködő spektrummal rendelkező képcsempéket eredményez. Mivel az egyes fluoroforok spektruma ismert az előre felvett spektrális „könyvtárból”, lehetséges a multiplex lapkákat több egyedi csempére bontani, amelyek az egyes fluoroforok hozzájárulását reprezentálják ("feloldás"). A legtöbb tanulmányban az össze nem kevert képeket ezt követően kereskedelmi szoftverrel elemzik. Sok esetben ezek a programok nem támogatják a WSI-elemzést, nehézséget okoz a fürtözött sejtek elemzése, és gyakran nem ellenállóak a műtermékekkel és a festési eltérésekkel szemben. A nem kevert csempék átalakítása mesterséges világosmezős IHC WSI-kké lehetővé tette számunkra egy meglévő CNN alkalmazását, amelyet kifejezetten az IHC limfocita kimutatására terveztek [22] (a továbbiakban limfocita kimutatás CNN I). Ez a hálózat nagy pontossággal képes detektálni az egyedi és csoportosított limfocitákat, miközben ellenáll a háttérfestődésnek (2. ábra, CD3). Emellett két új CNN-t képeztünk ki nukleáris festődési mintázatú sejtek (Tibet, GATA3) (limfocita detektálás CNN II) és makrofágok kimutatására. A makrofágokat köztudottan nehéz észlelni a szórt festési mintázat miatt. A CNN makrofág-detektálását ezért négy különböző szakértő megjegyzései alapján képezték ki. A megjegyzések elkészítése előtt több találkozót terveztek, ahol megvitatták és értékelték a makrofágok annotációjának kritériumait. Ez egy olyan hálózatot eredményezett, amely reprodukálható módon képes detektálni a makrofágokat, miközben robusztus a nem specifikus festéshez (2. táblázat, 2. ábra és 6. kiegészítő ábra). Tudomásunk szerint ez az első algoritmus a makrofágok kimutatására szkennelt kórszövettani metszetekben. Mindhárom hálózat teljesítményét teszteltük egy hagyományos IHC WSI-ből álló tesztkészleten (hasonlóan az edzés során használtakhoz), valamint egy másodlagos tesztkészleten, amely mesterséges fényerejű IHC WSI-ből állt, amelyet a többszörös spektrálisan rögzített képekből generáltak. Minden CNN nagyon jó teljesítményt mutat az elsődleges tesztkészleteken, és hasonló F{11}}pontszámokat a másodlagos tesztkészleteken. A limfocita kimutatás CNN I teljesítménymutatóit normál szövetekre, műtermékekre és sejtklaszterekre számították. A második tesztkészlet mesterséges világosmezős IHC-je nem tartalmazott szöveti műtermékeket és kevesebb sejtklasztert. Ez megmagyarázhatja a hálózat általános jobb teljesítményét a második tesztkészleten. A makrofág-detektáló CNN-t négy különböző annotátor annotációin betanították és tesztelték. Míg az annotációs kritériumokat különösen megvitatták, az annotáció stílusában eltéréseket figyeltek meg. A CNN érzékenysége ezért valószínűleg valahol az annotációs stílus szélsőségeinek közepén van. A második tesztkészlethez tartozó megjegyzéseket egy annotátor generálta, látszólag megfelelve a CNN érzékenységének.

A leírt CNN-ek használata lehetővé tette számunkra, hogy példátlan pontossággal vizsgáljuk a gyulladásos infiltátumot DGF-es transzplantált betegek szigorúan kiválasztott korai felügyeleti biopsziáinak egyedülálló sorozatában.

Sajnos több mintát ki kellett zárni az elemzésből, főként azért, mert a diagnosztikai feldolgozás után nem volt elegendő maradék szövet. Még az adathalmaz korlátozott mérete ellenére is szignifikánsan magasabb CD163 plusz sejtsűrűséget találtunk olyan DGF-betegek biopsziáiban, akiknél az IFTA kialakulása előrehaladt, ami összhangban van e sejtek potenciálisan profibrotikus szerepével [11]. Bár a megfigyelt tendencia összhangban volt a publikált adatokkal, nem tudtuk megerősíteni a CD68 plusz makrofágok korai jelenlétének káros hatását, amelyet korábban más vesetranszplantált betegcsoportoknál jelentettek [7, 36, 37]. Pozitív korrelációt találtunk a CD4 plusz GATA3 plusz sejtek és a CD163 plusz sejtek sűrűsége között, ami megerősítheti a T-helper 2 limfociták hozzájárulását a profibrotikus mikrokörnyezethez. Bár ebben a vizsgálatban nem fedeztek fel új prediktív biomarkert az IFTA kialakulásához DGF-betegeknél, sikeresen kifejlesztettünk módszereket a gyér szövetekben előforduló gyulladásos infiltrátum pontos, reprodukálható és méretezhető értékelésére, például transzplantációs biopsziákra. Ezek a módszerek értékesek a hisztopatológiai szövet gyulladásának jövőbeni kvantitatív vizsgálataihoz.

A mellékvesekéreg fáradtságának enyhítésére a cistanche segítségével kattintson ide további részletekért

Az adatok elérhetősége

Az ebben a tanulmányban bemutatott adatok felhasználásával kapcsolatos együttműködési kérelmeket a megfelelő szerzőhöz (jeroen.vanderlaak@radboudumc.nl) vagy FF-hez (Feuerhake. Friedrich@mh-hannover.de) lehet intézni.

Köszönetnyilvánítás

Köszönetet mondunk Mark Gorrisnak és Kiek Verrijpnek az mTSA festéssel és képalkotással kapcsolatos tanácsaiért, Merijn van Erpnek a testreszabott ImageJ funkcionalitás kifejlesztéséért, valamint Sophie van den Broeknek, Milly van de Warenburgnak és Martijn Ottennek a makrofág-észlelési hálózat alapigazságának létrehozásáért. Továbbá köszönjük Irina Scheffnernek a klinikai adatgyűjtésben nyújtott segítségét.

Szerzői hozzájárulásokMH, VV, JS, WG, FF, BS, LBH és JAWML

tervezte a tanulmányt. A beteganyagot és a klinikai adatokat a JS, a WG és az FF gyűjtötte össze és biztosította. Az FF koordinálta az MHH-nál végzett erőfeszítéseket. JHB, EJS és JK pontozták az IFTA százalékos PAS-csúszását. Az MH elvégezte az mTSA festést, az I. és II. panel validálását, valamint az I. panel leképezését és keverésének feloldását. VV képzett és nem kevert panel II. A DJG kifejlesztette azokat a módszereket, amelyek segítségével az mTSA csempéket mesterséges világosmezős WSI-vé konvertálhat. Az MH végrehajtotta az átalakításokat. A ZS-C kifejlesztette a limfocita-detektáló CNN-eket, és megírta a szkripteket a limfocita mennyiségi meghatározásához. A JL kifejlesztette a makrofág-detektáló CNN-eket, és megírta a szkripteket a makrofágok mennyiségi meghatározásához. Az MH elvégezte a sejtek és a kapillárisok mennyiségi meghatározását. Az NSS kiszámította a cellatávolságokat. Az MH, a BS, az LBH és a JAWML elemezte az adatokat. Az MH elkészítette a számokat és elkészítette a papírt. A kézirat végső változatát minden szerző felülvizsgálta és jóváhagyta.

FinanszírozásEzt a munkát az ERACoSysMed kezdeményezés (SysMIFTA projekt) támogatta az Európai Unió Horizont 2020 keretprogramjának részeként, a ZonMw által (9003035004 sz. támogatás), a Német Kutatási és Oktatási Minisztérium (BMBF) társfinanszírozásával. . FKZ031L-0085A (SysMIFTA), FKZ01ZX1710A (MicMode-I2T) és FKZ01ZX1608A (SYSIMIT). A JAWML tanácsadói díjakat kapott a Philipstől (Hollandia), és támogatásokat a következőtől

ContextVision, Philips (Hollandia) és Sectra (Svédország), a beküldött munkán kívül. JK pénzügyi támogatást kapott a Holland Vese Alapítványtól (DEEPGRAFT projekt, 17OKG23 sz. támogatás).

Az etikai normáknak való megfelelés

ÉrdekellentétA szerzők nem nyilatkoznak egymással versengő érdekekről.

Etikai jóváhagyás és hozzájárulás a részvételhezAz adatgyűjtést és elemzést a páciens tájékozott beleegyezésével és a Hannover Medical School etikai bizottságának (2765. sz.) jóváhagyásával végeztük.

Kiadói megjegyzésA Springer Nature semleges marad a közzétett térképeken és az intézményi kapcsolatokban szereplő joghatósági igényekkel kapcsolatban.

Nyílt hozzáférésűEz a cikk a Creative Commons Nevezd meg 4.{1}} Nemzetközi Licenc, amely lehetővé teszi a felhasználást, megosztást, adaptálást, terjesztést és reprodukálást bármilyen médiában vagy formátumban, feltéve, hogy megfelelő elismerést ad az eredeti szerző(k)nek. ) és a forrás, adjon meg egy hivatkozást a Creative Commons licenchez, és jelezze, ha történtek módosítások. A cikkben szereplő képek vagy egyéb harmadik féltől származó anyagok a cikk Creative Commons licencébe tartoznak, hacsak az anyag hitelkeretében másként nem szerepel. Ha az anyag nem szerepel a cikk Creative Commons licencében, és az Ön tervezett felhasználását a törvényi szabályozás nem teszi lehetővé, vagy meghaladja a megengedett felhasználást, akkor közvetlenül a szerzői jog tulajdonosától kell engedélyt kérnie.

Hivatkozások

1. Siedlecki A, ír W, Brennan DC. Késleltetett graft funkció a veseátültetésben. Am J transzplantáció. 2011;11:2279–96.

2. Khalkhali HR, Ghafari A, Hajizadeh E, Kazemnejad A. A hosszú távú graft elvesztésének kockázati tényezői krónikus allograft diszfunkcióban szenvedő vesetranszplantált recipienseknél. Exp Clin transzplantáció. 2010;8:277–82.

3. Yarlagadda SG, Coca SG, Formica RN, Poggio ED, Parikh CR. A késleltetett graftfunkció és az allograft, valamint a beteg túlélése közötti kapcsolat: szisztematikus áttekintés és metaanalízis. Nephrol Dial Transplant. 2009;24:1039–47.

4. Schröppel B, Legendre C. Késleltetett vesegraft funkció: a mechanizmustól a transzlációig. Kidney Int. 2014;86:251–8.

5. Mengel M, Reeve J, Bunnag S, Einecke G, Jhangri GS, Sis B és társai. A teljes gyulladás pontozása jobb, mint a jelenlegi Banff-gyulladás pontszáma a kimenetel előrejelzésében és a vese-allograftok molekuláris zavarának mértékében. Am J transzplantáció. 2009;9:1859–67.

6. Cosio FG, Grande JP, Wadei H, Larson TS, Griffin MD, Stegall

MD. A vese allograft funkció későbbi hanyatlásának előrejelzése a korai megfigyelő biopsziákból. Am J transzplantáció. 2005;5:2464–72.

7. Toki D, Zhang W, Hor KLM, Liuwantara D, Alexander SI, Yi Z és mások. A makrofágok szerepe a humán vese allograft fibrózisának kialakulásában a transzplantációt követő első évben. Am J transzplantáció. 2014;14:2126–36.

8. Ikezumi Y, Suzuki T, Yamada T, Hasegawa H, Kaneko U, Hara M és mások. Alternatív módon aktivált makrofágok a krónikus vese allograft sérülés patogenezisében. Pediatr Nephrol. 2015;30:1007–17.

9. Biswas SK, Mantovani A. Makrofágok plaszticitása és kölcsönhatása limfocita alcsoportokkal: a rák mint paradigma. Nat Immunol. 2010;11:889–96.

10. Anders HJ, Ryu M. A vese mikrokörnyezetei és a makrofág fenotípusok meghatározzák a vesegyulladás és -fibrózis progresszióját vagy megszűnését. Kidney Int. 2011;80:915–25.

11. Ordikhani F, Pothula V, Sanchez-Tarjuelo R, Jordan S, Ochando J. Macrophages in szervtransplantation. Frontiers Immunol. 2020;11:582939.

12. Loverre A, Divella C, Castellano G, Tataranni T, Zaza G, Rossini M és mások. T helper 1, 2 és 17 sejt alcsoportok késleltetett graftfunkciójú vesetranszplantált betegekben. Transpl Int. 2011;24:233–42.

13. Klauschen F, Müller KR, Binder A, Bockmayr M, Hägele M, Seegerer P, et al. A daganatot beszűrődő limfociták pontozása: a vizuális becsléstől a gépi tanulásig. Szeminárium Cancer Biol. 2018;52:151–7.

14. Lauren J, Häyry P, Paavonen T. Képelemzésen alapuló módszer a krónikus allograft károsodási index paramétereinek kvantifikálására. AMPS. 2006;114:440–8.

15. Malpica N, Solórzano CO, de, Vaquero JJ, Santos A, Vallcorba I, García-Sagredo JM, et al. Vízválasztó algoritmusok alkalmazása klaszterezett magok szegmentálására. Citometria. 1997;28:289–97.

16. Lai YK, Rosin PL. Hatékony körkörös küszöbérték. IEEE Trans Med Imaging. 2014; 23:992–1001.

17. Litjens G, Kooi T, Ehteshami Bejnordi B, Setio AAA, Ciompi F, Ghafoorian M stb. Felmérés a mélytanulásról az orvosi képelemzésben. Med Image Anal. 2017;42:60–88.

18. Madabhushi A, Lee G. Képelemzés és gépi tanulás a digitális patológiában: kihívások és lehetőségek. Med Image Anal. 2016;33:170–5.

19. Ehteshami Bejnordi B, Veta M, Diest PJ, van, Ginneken B, van, Karssemeijer N, Litjens G, et al. Mély tanulási algoritmusok diagnosztikai értékelése emlőrákos nők nyirokcsomó-metasztázisainak kimutatására. JAMA. 2017;318:2199–210.

20. Hermsen M, Bel T, de, Boer M, den, Steenbergen EJ, Kers J, Florquin S et al. A veseszövet mély-tanuláson alapuló kórszövettani vizsgálata. J Am Soc Nephrol. 2019;30:1968–79.