Az elsődleges és metasztatikus emberi vastagbélráksejtek reaktív oxigénfajok által közvetített apoptózisa

BEVEZETÉS

A vastag- és végbélrák az egyik leggyakoribb rák világszerte (Brenneret al., 2014), előfordulása pedig folyamatosan növekszik, 2035-ben a becslések szerint 2,4 millió esetet regisztráltak a modern étrendnek és életmódnak, valamint a csökkent fizikai aktivitásnak köszönhetően. A jelenlegi erőfeszítések nem elegendőek a vastag- és végbélrák jelenlegi járványa elleni küzdelemhez, ezért új megközelítésekre van szükség a hatékony megelőzés és kezelés érdekében, beleértve az életmód megváltoztatását biztonságosabb alternatív beavatkozásokkal, például fitoterápiával kombinálva (Weidner).et al., 2015). A fitoterápia, a gyógynövények használata betegségek kezelésére, az ókori emberi történelem elkerülhetetlen része. A gyógynövényeket régóta használják a rák alternatív kezelési forrásaiként, és a hagyományos orvoslásban használt rákellenes szerek több mint hatvan százalékát teszik ki (Balunas és Kinghorn, 2005; Saibuet al., 2015). A legismertebb példák közé tartoznak kivonatok aCatharanthus roseusG. Don. (Apocynaceae), Taxus baccata L. (Taxaceae) és Camptotheca acuminate Decne (Nyssaceae) (Cragg és Newman, 2005; da Rochaet al., 2001). Számos növényi kivonatról és fitokemikáliáról kimutatták, hogy daganatellenes hatást fejt ki a vastag- és végbélrákban, ami a reaktív oxigénfajták (ROS) termelődésének és a rákos sejtek ezzel összefüggő apoptózisának indukciójának tulajdonítható, mint például a kivonatok esetében.Melissa officinalis(Weidneret al., 2015)

A fitoterápiás jelöltek közül pl.Cistanche tubulosa, az Orobanchaceae parazita sivatagi növény (Jiang et al., 2009), amely széles körben elterjedt Afrika, Ázsia és a Földközi-tenger száraz és félszáraz vidékein, értékes gyógyászati ​​tulajdonságokkal rendelkezik. A Cistanche tubulosa széles körben használatos a hagyományos orvoslásban, és azt feltételezik, hogy gyógyító hatása van veseelégtelenség, kóros leucorrhoea, metrorrhagia, női meddőség és időskori székrekedés esetén (Jiang et al., 2009). Hagyományos gyógyászati ​​felhasználása mellett fontos gyógyászati ​​​​felhasználás A Cistanche Tubulosa tulajdonságait intenzíven tanulmányozták az elmúlt évtizedben, beleértve az érrelaxánst (Yoshikawa et al., 2006), a májvédőt (Morikawa és mtsai, 2010), az antihiperglikémiás és hipolipidémiás hatásokat (Xiong et al., 2013). A Cistanche Tubulosa-t az immunrendszer erős erősítőjeként, a csontképződés serkentőjeként, valamint öregedés- és fáradtsággátló szerként is javasolták (Xu et al., 2014). Ezenkívül kimutatták, hogy a Cistanche tubulosa kivonat blokkolja az amiloid lerakódását az Alzheimer-kór modelljében (Wu et al., 2015). Különféle terápiás alkalmazásai ellenére a Cistanche Tubulosa potenciális rákellenes szer hatását még nem vizsgálták.

Jelen munkában a Cistanche Tubulosa rákellenes hatását vizsgáltuk két primer és két metasztatikus vastagbélrák sejtvonalon, valamint a hatás mögött meghúzódó lehetséges mechanizmusokat.

TERMÉSZETES CISTANCHE TUBULOSA A SZEXUÁLIS FUNKCIÓ JAVÍTÁSÁRA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

ANYAG ÉS MÓDSZER

Növényi kivonat gyűjtése és elkészítése

A Cistanche tubulosa mintáit 2014-ben gyűjtötték a katari sivatagi területekről, és a növény eredetiségét a herbatológus megerősítette. Az utalványmintákat az ADLQ Toxikológiai és Többcélú Osztályán archiválják. A napon szárított növényi mintákat Retsch Knife Mill Grindomix GM300-zal finom porrá őröltük. 20 gramm port extraháltunk 200 ml ultratiszta vízzel egy éjszakán át 37 °C-on forgó rázógépen 200 fordulat/perc sebességgel. A nyersCistanche tubulosa kivonatok (CTE)centrifugáltuk 3 0 percig 8000 fordulat/perc sebességgel, hogy a nem oldódó vegyületek üledékbe kerüljenek, a felülúszót összegyűjtjük és fagyasztva szárítjuk egy Labconco Freezone 6 plus Freeze dryer segítségével. A szárított kivonatot Dulbecco's Modified Eagle's Mediumban (DMEM, SIGMA, Németország) 20 mg/ml koncentrációra oldottuk fel, és sterilen szűrtük egy 0,{8}mikron membránszűrőn.

Sejtvonalak és sejtkarbantartás

A CaCo2, SW620 és LoVo humán vastagbélkarcinóma sejtvonalakat a Cell Lines Service-től (CLS, Eppelheim, Németország) szereztük be, míg a HCT 116 sejtvonalat a Katari Egyetem Biológiai és Környezettudományi Tanszékének ajándéka kapta. A CaCo2 és a HCT11 a vastagbél karcinóma elsődleges helyéről, míg az SW620 és a LoVo a metasztatikus helyről származtak. Az SW620, HCT116 és LoVo sejteket DME tápközegben, míg a CaCo2 sejteket Eagle's Minimum Essential Mediumban (EMEM, SIGMA, Németország) tenyésztettük és tartottuk fenn. A sejteket egyrétegű tenyésztéssel tenyésztettük 37 fokon 10% borjúmagzati szérummal (FBS, SIGMA, Németország) és 1% Penicillin/Streptomycinnel (SIGMA, Németország) kiegészített tápközegben 5% szén-dioxidot tartalmazó, párásított atmoszférában.

Sejtéletképességi vizsgálat

A {{0}}[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazólium (MTT) tesztet használtuk a citotoxikus aktivitás értékelésére. CTE a korábban leírtakhoz hasonlóan (Jaganjac et al., 2010). A CaCo2, HCT116, SW620 és LoVo sejtek oltási sűrűsége 96-lyuklemezeken tenyésztett 104 sejt/lyuk volt. A sejteket 24 órával a kezelés előtt 10% FBS-sel kiegészített tápközegbe szélesztettük. 24 óra elteltével a tápközeget eltávolítottuk, és a sejteket 0, 0,25, 0,5, 1 és 2 mg/ml CTE-vel kezeltük 24, 48 és 72 órán keresztül 37 °C-on, 5% CO2-ot tartalmazó párásított atmoszférában. A CTE-kezelés után a tápközeget eltávolítottuk, és 40 µl MTT-oldatot (0,5 mg/ml) adtunk minden egyes lyukba.

3 órás inkubálás után az MTT oldatot eltávolítottuk, a formazán terméket dimetil-szulfoxidban (DMSO, SIGMA, Németország) oldottuk, és az abszorbanciát 590 nm-en mértük mikrolemez-leolvasóval (Infinite 200 PRO NanoQuant, Tecan Trading AG, Svájc). .

Apoptózis vizsgálat

A CaCo2, HCT116, SW620 és LoVo sejtekben az apoptózist PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I segítségével detektáltuk, 7-Amino-Actinomycin D-vel (7-AAD) létfontosságú festékként (Becton). Dickinson International, Belgium) a gyártó utasítása szerint. Röviden, a sejteket 24-lyukú lemezekre oltottuk 5×104 sejt/lyuk sűrűségben 10% FBS-sel kiegészített megfelelő táptalajban 24 órán keresztül a CTE hozzáadása előtt (0, 0,5). vagy 1 mg/ml). 24 CTE inkubációt követően a sejteket összegyűjtöttük, kétszer mostuk hideg foszfáttal pufferolt sóoldattal, és phycoerythrin (PE) Annexin V-vel és 7-AAD-vel festették 15 percig szobahőmérsékleten, sötétben. A megfestett sejteket 1 órán belül elemeztük áramlási citometriával FACS alkalmazásával. Aria III áramlási citométer és FACSDiva szoftver (Becton Dickinson) alacsony áramlási sebességgel, minimum 104 sejttel. A sejtek 4 órás kezelését 6 µM kamptotecinnel (SIGMA) alkalmaztuk pozitív kontrollként a vizsgálathoz.

Intracelluláris ROS termelés

Az intracelluláris ROS termelést 2,7- diklór-dihidrofluoreszcein-diacetáttal (DCFH-DA, SIGMA, Németország) vizsgáltuk. A DCFH-DA egy nem fluoreszcens próba, amelyet intracelluláris ROS-sel fluoreszcens 2,7- diklorofluoreszcein (DCF) vegyületté oxidálnak (Poljak-Blazi et al., 2011). A DCFH DA vizsgálatot a korábban leírtakhoz hasonlóan végeztük (Cindric és mtsai, 2013; Poljak-Blazi et al., 2011). Röviden, a CaCo2, HCT116, SW620 és LoVo sejtek oltási sűrűsége 96-lyuk fekete lemezeken 104 sejt/lyuk volt. A sejteket 10% FBS-sel kiegészített tápközegbe szélesztettük 24 órán át. A kezelés előtt a sejteket 10 µM DCFH-DA-val inkubáltuk 37 fokon 30 percig 5% CO2/95% levegőben. Ezután a sejteket mostuk, és 0, 0,5 és 1 mg/ml CTE-vel kezeltük fenolvörös nélküli tápközegben. Az intracelluláris ROS képződést 25 órán keresztül folyamatosan monitoroztuk 37 fokos hőmérsékleten és 5% CO2 mellett felső fluoreszcenciával és gázvezérlő modullal ellátott mikrolemez-leolvasóval (Infinite 200 PRO, Tecan Trading AG, Svájc). A fluoreszcencia intenzitását 500 nm-es gerjesztési hullámhosszon és 529 nm-es emissziós detektálással mértük. A tetszőleges egységek, a relatív fluoreszcencia egységek (RFU) közvetlenül a fluoreszcencia intenzitásán alapultak.

TERMÉSZETES CISTANCHE TUBULOSA A VESEMŰKÖDÉS JAVÍTÁSÁRA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Mitokondriális szuperoxid képződés

A CTE azon képességét, hogy a mitokondriumok szuperoxid képződését indukálják, sejtpermeábilis, mitokondriumokra célzott MitoSOX Red szondával (Life Technologies) és Hoechst 33342-vel nukleáris festéshez (Life Technologies) becsülték meg. CaCo2, HCT116, SW620 és LoVo sejteket 96-lyuklemezekre oltottunk 104 sejt/lyuk sűrűségben 10% FBS-sel kiegészített táptalajban 24 órán keresztül. . A sejteket ezután 4 µM MitoSOX-szal és 2 µM Hoechst 33342-vel töltöttük 20 percre, a felesleges festéket mostuk, és a lyukakat 0, 0,5 és 1 mg/ml CTE-vel kezeltük 24 órán át 37 °C-on és 5% CO2-on. A fluoreszcencia intenzitását 510 nm-es gerjesztési hullámhosszon és 580 nm-es emissziós detektálással mértük MitoSOX esetén, 350 nm-es gerjesztési hullámhosszon és 461 nm-es emissziós detektálással Hoechst 33342-vel, PROfinite fluoreszcenciás Tecan00 olvasóval. AG, Svájc)

Statisztikai elemzés

A leíró statisztikát az átlag +/− SD-ként mutattuk be. A csoportok közötti különbségek jelentőségét Student t-próbával és Chi-négyzet próbával értékeltük. Ha kettőnél több csoportot hasonlítottunk össze, egyoldalú ANOVA-t alkalmaztunk megfelelő post hoc teszteléssel. A Mircosoft Windows rendszerhez készült SPSS 11.{6}}1-et használták. A 0,05-nél kisebb P értéket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük.

EREDMÉNYEK

A CTE hatását a humán vastagbélrák sejtvonalak proliferációjára az 1. ábra mutatja be. Minden vizsgált CTE koncentráció erős gátló hatást mutatott a CaCo2 sejtvonalra koncentrációtól és időtől függő módon (1A. ábra). A hetvenkét órás CTE kezelés több mint 60%-kal gátolta a CaCo2 sejtek növekedését a kontrollhoz képest (p < 0.05 minden koncentrációra). A CTE-kezelésnek a HCT116 sejtek növekedésére gyakorolt ​​szignifikáns hatását minden időkben a két legmagasabb koncentrációnál (1 mg/ml és 2 mg/ml) is kimutatták, amely utóbbi koncentrációnál több mint 7{19}}%-os csökkenést ért el (ábra). 1B, p < 0,05). Bár a két alacsonyabb CTE-koncentráció (0,25 és 0,5 mg/ml) jelentősen csökkentette a sejtek HCT116 növekedését 24 óra elteltével (p<0.05), they had no significant effect following 72 hours of treatment compared to control (p>{{0}}.{{10}}5). A CTE proliferáció időtől és koncentrációtól függő gátlását a LoVo sejtekben a legmagasabb koncentrációnál több mint 60%-kal erősítették meg (p < 0.05) (1C. ábra), és mind a négy vizsgált CTE-koncentráció csökkentette az SW620 sejtek növekedését 48 óra elteltével (1D ábra, p < 0,05 az összesre). 72 órás kezelés után ugyanez a hatás csak a két legmagasabb koncentrációnál volt megfigyelhető (p < 0,05), míg a 0,25 és 0,5 mg/ml koncentrációk nem mutattak szignifikáns hatást a kontrollhoz képest (p > 0,05). A 0,5 és 1 mg/ml CTE-kezelés hatását az apoptózis indukálására tovább vizsgáltuk mind a négy sejtvonalon (2. ábra). A korai apoptózisban lévő sejtszám növekedését mutatták ki HCT116-ban és LoVo-ban 24-órás 0,5 mg/ml-es kezelést követően (p<0.05, Figure 2B and 2C) and in all cell lines at 1 mg/mL (p<0.05). A significant increase in necrotic or late apoptotic cell number was further observed in CaCo2 and SW620 cell lines (p<0.05, Figure 2A and 2D). The ability of CTE to induce intracellular ROS production is demonstrated in Figure 3. Three hours following CTE treatment there was a strong increase in intracellular ROS production in all cell lines (p<0.05). The intracellular ROS production increased progressively throughout the 25 hours of treatment in a time and concentration-dependent manner. Furthermore, the staining of cells with a mitochondria-targeted probe revealed a strong impact of CTE on mitochondrial superoxide production in a concentration-dependent manner (Figure 4). The highest increase in superoxide production by mitochondria was observed in HCT116 (69%, Figure 4B) and LoVo cells (82%, Figure 4C) following 24-hour treatment with 1 mg/mL of CTE.

1. ábra:HatásaCistanche tubulosaa vastagbélrák sejtvonalak életképességéről. A (A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo és (D) SW620 sejtek MTT-vizsgálatával mért sejtek életképességét a kontroll, kezeletlen vastagbélrák sejtvonal százalékában mutatjuk be. Az átlagértékek (±SD) a reprezentatív kísérlet 5 ismétlésére vonatkoznak: (*) szignifikancia p<0.05 in comparison to control untreated respective cells.

2. ábra: A Cistanche tubulosa vizes kivonat apoptózist indukál humán vastagbélrák sejtekben. Az (A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo és (D) SW620 sejtek Annexin-V-FITC áramlási citometriás analízisét a kontroll, kezeletlen vastagbélrák sejtvonal százalékában mutatjuk be. A reprezentatív kísérlet 3 ismétlésére vonatkozó átlagértékek (±SD) a következők: (*) szignifikancia p<0.05 in comparison to control untreated respective cells.

3. ábra: A Cistanche tubulosa vizes kivonat intracelluláris ROS termelést indukál idő- és dózisfüggően. Az (A) CaCo2-, (B) HCT116-, (C) LoVo- és (D) SW620-sejtekben DCFH-DA vizsgálattal mért ROS-termelés átlagos RFU-értékként (±SD) jelenik meg a megfelelő 5-replikátumokra. reprezentatív kísérlet. (*) Jelentőség p<0.05 in comparison to control untreated colon cancer cells. 

4. ábra: A Cistanche tubulosa vizes kivonat mitokondriális szuperoxid termelést indukál humán vastagbélrák sejtekben. Az A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo és (D) SW620 sejtekben a mitokondriumra célzott MitoSOX Red próba fluoreszcencia intenzitása a kontroll, kezeletlen vastagbélrák sejtvonal százalékában van megadva. Az átlagértékek (±SD) a reprezentatív kísérlet 5 ismétlésére vonatkoznak: (*) szignifikancia p<0.05 in comparison to control untreated colon cancer cells.

VITA

Bár a korábbi tanulmányok a Cistanche tubulosa számos gyógyászati ​​tulajdonságáról számoltak be, ez az első jelentés a rosszindulatú sejtekben lévő antiproliferatív hatásáról. A vízzel, egy erősen poláros oldószerrel extrahált Cistanche tubulosa bioaktív vegyületek erős rákellenes bioaktivitást mutattak. Korábban összehasonlítottuk a vízben oldott Cistanche tubulosa hatékonyságát más oldószerekkel, például metanollal és etil-acetáttal, de a vizes kivonatok mutatták a legígéretesebb rákellenes hatást (az adatokat nem mutatjuk be).

Kimutattuk, hogy a CTE 1 mg/ml és 2 mg/ml koncentrációban képes gátolni mind az elsődleges, mind a metasztatikus vastagbélrák sejtvonalak növekedésének 60%-át, ami feltárja a CTE potenciálisan fontos szerepét.Cistanche tubulosavastagbélrák kezelésére. A normál sejtekhez képest a rákos sejteket általában a redox homeosztázis zavara jellemzi, és a jelenlegi rákellenes terápiák általános stratégiája a sejt oxidatív stresszének növelése (Yang et al, 2013). Bár a fiziológiásan alacsony ROS-szintek fontos szerepet játszanak jelzőmolekulákként, a túlzott ROS-termelés hozzájárulhat a rák instabilitásához és rosszindulatú daganataihoz (Liou és Storz, 2010). Paradox módon a sejt redox homeosztázisának ez az egyensúlyhiánya sebezhetőbbé teszi a rákos sejteket a ROS által kiváltott sejthalálra (Jaganjac et al., 2008; Nogueira és Hay, 2013). A CTE ebben a tanulmányban ismertetett antiproliferatív hatását a kivonatban lévő ismert és ismeretlen vegyületek különféle extracelluláris és intracelluláris mechanizmusai közvetíthetik, amelyek több útvonalat céloznak meg, amelyek alapvető szerepet játszanak az apoptózisban. A sejthalál különböző módjai közötti különbségtétel érdekében megvizsgáltuk a megfigyelt CTE által kiváltott citotoxicitásért felelős lehetséges mechanizmust.

CISTANCHE TUBULOSA KIVONAT Anti Alzhermer PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Adataink azt mutatják, hogy a CTE növeli az intracelluláris ROS termelést és ennek következtében a ROS által kiváltott sejthalált. A sejt redox állapota az apoptózis szabályozásában is döntő szerepet játszik, és a mitokondriális elektrontranszport lánc a sejtes ROS képződés egyik fő helye (Trachootham et al., 2008). Ezenkívül az intracelluláris ROS sejtes apoptózist okozhat mitokondrium-függő és független útvonalakon keresztül (Sinha et al., 2013). Valójában adataink azt is jelzik, hogy a CTE által kiváltott foszfatidilszerin-externalizáció gyakori hatás az apoptózisban, mind az elsődleges, mind a metasztatikus rákos sejtvonalakban, ami arra utal, hogy a CTE által kiváltott halál mechanizmusát apoptózis, nem pedig nekrózis közvetíti. Az apoptózis aktiválása a rákos sejtekben korrekciós stratégia, és számos rákellenes gyógyszer apoptotikus hatást fejthet ki a rákos sejtekben.

A rákos sejtekben pro-apoptotikus hatással rendelkező vegyületek vagy kivonatok ezért potenciálisan hasznosak lehetnek a rákellenes gyógyszerkutatásban (Wong, 2011). Annak megállapítására, hogy a CTE által kiváltott pro-apoptotikus hatást mitokondriumok által kiváltott ROS-mechanizmus közvetít-e, CTE-kezelt sejtekben mitokondrium-célzott fluoreszcens szondával mértük a szuperoxid termelést. Adataink egyértelműen azt mutatják, hogy a CTE stimulálja a mitokondriális szuperoxid termelést, ami arra utal, hogy a Cistanche tubulosa rákellenes aktivitását legalább részben a mitokondriumok által kiváltott ROS mechanizmus közvetíti.

KÖVETKEZTETÉSEK

Összefoglalva, adataink azt sugallják, hogy a sivatagi Cistanche tubulosa növény vizes kivonata ígéretes jelölt lehet a rákellenes megközelítéshez, más hagyományos terápiákkal kombinálva a vastagbélrák megelőzésére és kezelésére. Azt is kimutattuk, hogy a növényi kivonat rákos sejtekkel szembeni toxicitását a fokozott intracelluláris ROS termelés és legalább részben a mitokondriális függő apoptózis közvetíti. További vizsgálatok folynak a rákellenes hatásért felelős egyes biológiailag aktív összetevők izolálására és jellemzésére.

További kutatásokra van szükség ennek a kivonatnak mint hatékony kemopreventív szernek a lehetséges felhasználásának értékeléséhez, és a vastagbélráksejtekre kifejtett hatásmechanizmusok megértéséhez molekuláris szinten. További preklinikai és klinikai vizsgálatokra is szükség van a megfigyelt jótékony egészségügyi hatások megerősítéséhezCistanche tubulosa a rák megelőzésére.

 CISTANCHE TUBULOSA CISTANCHE KÁVÉ JAVÍTJA MEMÓRIÁT FÁRADTSÁG ELLENI PHGS75% ECH 30% ACT 12%