RNS-Seq alapú de Novo transzkriptom összeállítás és a Cistanche Deserticola húsos szár génfelfedezése-Ⅱ

Az összes kifejezett átirat funkcionális osztályozása génontológia és KEGG-adatbázisok alapján

A Gene Ontology (GO) annotációt az UniProt annotációs és identitástársítási fájlból szereztük be. Összesen 20 907 transzkriptumot, amelyek az összes kifejezett szekvencia 32,69%-át teszik ki, 1745 funkcionális kifejezéshez rendeltek. Az összes funkcionális GO kifejezés közül a biológiai folyamatokhoz való hozzárendelések adták a legtöbbet (1116, 63,95%), ezt követi a sejtkomponens (329, 18,85%) és a molekuláris funkció (300, 17,20%). Az expresszált átiratok hozzárendelt funkciói a GO kategóriák széles skáláját fedték le, és a 10 legjobb GO kifejezést a legtöbb megjegyzéssel ellátott átirattal a 3. táblázat tartalmazza. Az összes kifejezett transzkriptum megoszlását három génontológia kategóriában (Molekuláris funkció, Celluláris komponens és biológiai folyamat) a kiegészítő fájlban (S3 Dataset). A kötési funkciókkal és a transzferáz aktivitással kapcsolatos GO kifejezések túlnyomórészt a molekuláris funkció kategóriában voltak képviselve. A kötési funkciókat tekintve a kationkötés (4394 transzkriptum) volt a legelterjedtebb, ezt követte a nukleotid/nukleozid kötés (átlagosan 3404 transzkriptum) és a fehérjekötés (2422 transzkriptum). Míg a transzferáz aktivitású csoportban a legtöbben a transzfer foszfortartalmú csoportok vannak (2256 átirat, 65,77%). A celluláris komponensek kategóriája közül a transzkriptumok inkább intracellulárisan helyezkedtek el (átlagosan 10 581 transzkriptum), míg a biológiai folyamatok kategóriájában a transzkriptumok nagyobb mértékben vesznek részt a biopolimer anyagcsere folyamatában (átlagosan 6 683 transzkriptum), ezt követte a sejtfolyamat szabályozása (4 841 transzkriptum). ), génexpresszió (4678 átirat) és transzport (3512 transzkriptum).

TERMÉSZETES CISTANCHE TUBULOSA AZ ALZHEIMER-BETEGSÉG MEGELŐZÉSÉRE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

A lignin és a PhG bioszintézisében részt vevő gének bányászatához a KEGG adatbázisban 13 növényi szervezet génszekvenciájához 21 358 nem redundáns potenciális fehérje szekvenciát kerestek, melyeket 275 KEGG útvonalhoz rendeltek legalább 5 találattal. A 10 legjobb útvonalat a legtöbb egymáshoz igazodó szekvenciával a 4. táblázat sorolja fel. A legtöbb útvonal részt vett az elsődleges anyagcsere-folyamatokban, mint például az aminosav- vagy fehérje-anyagcsere (ko01230, ko04141 és ko04120), a szénhidrát-anyagcsere (ko01200 és ko00500), valamint a nukleotid- ill. nukleozid metabolizmus (ko03018, ko00230 és ko00240). Emellett 27 másodlagos anyagcserével kapcsolatos út létezik (2. ábra), mint például a terpenoid gerinc bioszintézis, fenilpropanoid bioszintézis, karotinoid bioszintézis, izokinolin alkaloid bioszintézis, valamint tropán, piperidin és piridin alkaloid bioszintézis. Ezek az eredmények további jelzést adnak arról, hogy a szervezetben aktív anyagcsere folyamatok zajlottakC. deserticolaszárszövet. A KEGG útvonalakhoz kapcsolódó összes expresszált átirat szerepel a kiegészítő fájlban (S4 Dataset). Bár vannak jelentősen megváltozott útvonalak a C. deserticola és más növények, például a rizs (S5 Dataset) között, a fő célunk ebben a tanulmányban a C. deserticola szár teljes transzkripciós profiljának feltárása és a PhGs bioszintézis kapcsolódó útvonalainak bemutatása. amelyek hasznosak lehetnek a termesztés irányításához.

A lignin bioszintézisében részt vevő enzimeket kódoló gének jelöltjei

A lignin a második legnagyobb mennyiségben előforduló természetes szárazföldi polimer a növényvilágban, amely a növényi sejtfalban található anyag egyharmadát teszi ki. A sejtfal fontos alkotóelemeként a ligninek segítik a vízszállítást, mechanikai támasztást és szerkezeti integritást biztosítanak, valamint védekeznek a kórokozók és növényevők ellen. A ligninnek ezek a szerepei nagyon értékesek a C. deserticola sivatagi földalatti erekciós növekedésének támogatásában. Ebben a tanulmányban bemutattuk a teljes képet a C. deserticola lignin bioszintézis útjairól (3. ábra), amelyben a lignin monomerek bioszintetizálódnak fenilalaninból számos enzimatikus reakción keresztül, beleértve a hidroxilezést, metilezést, redukciót és oxidatív polimerizációs folyamatot. A lignin bioszintéziséhez kapcsolódó enzimeket három főként szintetizált formában érszövetben mutatták ki (p-hidroxil-fenil (H), guajacil (G) és sziringil (S) lignin) és 5-hidroxil-guajacil-lignin, amelyet csak azonosítottak. COMT (kávésav 3-O-metil-transzferáz, EC 2.1.1.68) hiányos (például knock-down) növényekben.

A fenilalanin ammónia-liáz (PAL, EC 4.3.1.24) az első kulcsenzim a lignin bioszintézis folyamatában (3. ábra), amely nem oxidatív dezaminációval alakítja át a fenilalanint fahéjsavvá. Összesen 6297 PAL-leolvasást szekvenáltunk, és 7 PAL-transzkriptumot állítottunk össze C. deserticolában (5. táblázat). A szekvenciahasonlóságok összehasonlításával azt találtuk, hogy közülük 4 (comp28550_c1_seq1/2/3/5) több mint 95%-ban hasonló a C. deserticola (gi|) ismert mRNS-szekvenciájához. 289595227|gb|ADD12041.1|), míg a comp3}c1_seq4 és a comp25940_c0_seq1 77%-os, illetve 82%-os hasonlóságot mutatott. Az ORF előrejelzése feltárta, hogy 5 transzkriptum tartalmazott fehérjéket kódoló potenciált, és aromás aminosav liáz domént hordozott (PF00221.14). Közülük csak a comp28550_c1_seq4 transzkriptum tudott 718 aminosavból álló teljes fehérjeszekvenciát kódolni. Beszámoltak arról, hogy a PAL-t a legtöbb növényfajban egy kis többgéncsalád kódolta, például 4 az Arabidopsis thaliana, 5 a Populus trichocarpa, 3 a Scutellaria baicalensis és 7 a Cucumis sativus stb. PAL-kódoló gének a C-ben.

deserticola, és CdPAL1-nek, CdPAL2-nek, CdPAL3-nak és CdPAL4-nek neveztük el őket (S2 ábra). A 4-kumarát-CoA ligáz (4CL, EC 6.2.1.12) és a transz-cinnamát 4-monooxigenáz (CYP73A, EC 1.14.13.11) két olyan enzim, amelyek felelősek a fahéjsav dikumarol-CoA-vá történő átalakulásáért két fordított módon. parancsokat. Ezek szintén a gerincben vannak, és kifejeződési FPKM értékeik 39,57 és 51,93.

A négyféle lignin bioszintetizálása különböző útvonalakon történt, amelyeket három kulcsenzim, a cinnamoil-CoA reduktáz (CCR, EC 1.2.1.44), a shikim o-hidroxicinnamoiltranszferáz (HCT, EC 2.3.1.133) és a ferulát szabályozott. {56}}}}hidroxiláz (F5H, EC 1,14.-.-). A CCR-t a lignin-útvonal kontrollpontjaként [50, 51] jelentették, amely az X-CoA-t (X beleértve a dikumarolt, a koffeoilt, a feruloilt, a 5-hidroxil-feruloilt és a szinapoilt) Y-aldehiddé (Y beleértve a p-t is) katalizálja. -puma, koffeoil, koniferil, 5-hidroxil-koniferil és snap), míg a HCT a p-kumaroil-CoA-t p-kumaroil-sikiminsavvá/p-kumaroil-kininsavvá katalizálta. A két enzim, akárcsak egy kapcsoló, szabályozta a P-hidroxil-fenil-ligninek vagy a másik három ligninek bioszintézisét. Az F5H egy másik elágazó kapcsoló volt, amely szabályozta a sziringil-lignint és a 5-hidroxil-guajacil-lignint. Egyéb fontos enzimek, köztük a kávésav-3-O-metil-transzferáz (COMT, EC 2.1.1.68), a koffeoil-CoA O-metil-transzferáz (CCoAOMT, EC 2.1.1.104) és a cinnamil-alkohol-dehidrogenáz (CAD, EC 1.1.1.1.68). ) is kifejezve észlelték. A részletes expressziós információkat a 6. táblázat sorolja fel. Ezek a tanulmányban azonosított enzimgének értékes forrást biztosítanak a funkcionális genomikai vizsgálatokhoz ebben a fontos gyógynövényben. A 6. táblázatban szereplő lignin bioszintézis útvonalhoz kapcsolódó 10 gént választottunk ki RT-qPCR ellenőrzésre, hogy megerősítsük RNAseq eredményeinket (4. ábra), és magas korrelációjuk (Pearson korrelációs koefficiens: 0,90343) a transzkriptomanalízisünk nagy pontosságára és reprodukálhatóságára utalt. Az S1 Dataset felsorolja az ebben az elemzésben használt primer szekvenciákat.

TERMÉSZETES CISTANCHE TUBULOSA A SZEXUÁLIS FUNKCIÓ JAVÍTÁSÁRA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

A PhG-k bioszintézisében részt vevő enzimeket kódoló gének jelöltjei

A fenil-etanoid-glikozidok (PhG-k) ismerten a C. deserticola elsődleges hatóanyagai, amelyek javítják a szexuális potenciált, megkötik a szabad gyököket és gátolják az öregedést. A PhG-k három kémiai komponense a szerves sav, a szacharid és a fenil-etanol-aglikon (3. ábra). A szerves savak, köztük a kávésav, a ferulasav és a kumalinsav, a fenilpropanoid bioszintézis út termékei. A szacharid komponensei, beleértve a glükózt és a ramnózt, a szénhidrát anyagcsere utak termékei, mint például a keményítő és szacharóz anyagcsere, aminocukor és nukleotid cukor anyagcsere, fruktóz és mannóz anyagcsere stb. A fenil-etanol rész bioszintézisének útja azonban még nem tisztázott. Itt két lehetséges fenil-etanol bioszintézis utat javasoltunk a szekvencia adataink alapján. Az egyik a bejelentett kávésav vagy ferulinsav útvonal, más néven fahéjsav útvonal, amely hasonló a lignin bioszintézis gerincútjához. Egy másik a fenilalanin metabolizmusán alapul (3. ábra), amelyben a fenilalanint feniletanollá egy ismert „Enrlich-útvonal” segítségével érik el, amelyet először egy évszázaddal ezelőtt találtak meg élesztőben, és amelyet petúnia virágokban, paradicsomban és rózsában validáltak. A C. deserticola szárában négy aszpartát/tirozin-aminotranszferázt, hisztidin-foszfát-aminotranszferázt és primer-amin-oxidázt kódoló enzimgént mutattunk ki, amelyek felelősek a fenilalanin fenil-etanollá történő átalakulásáért. A fenil-etanol termék tovább oxidálható monooxigenázzal, vagy metil-transzferázzal metilezhető származékaivá (fenil-etanol aglikon), amelyek részt vesznek a PhG bioszintézisben. Összefoglalva, a fenil-etanol-aglikon két feltételezett bioszintézis-útvonalát javasoltákC. deserticolade még további tanulmányozásra van szükség.

Megbeszélések

Az elmúlt években a növénygenomika a következő generációs szekvenálási technológia alkalmazásával gyorsan fejlődött, miközben kevés kutatás irányult a sivatagi gyógynövények genomikájára. Sürgősen szükség van genomikai vagy transzkriptomikai kutatásokra annak érdekében, hogy megértsük, hogyan alkalmazkodik a szárazsághoz és a sós környezethez, valamint a fő bioaktív komponensek bioszintézisútját. A de novo transzkriptom felfedezése egyes gyógynövények esetében,

Ilyen például a Panax ginseng, a Ginkgo biloba és a Glycyrrhiza uralensis, amelyet először a Roche 454 platform használatával használták ki hosszú olvasási hosszának köszönhetően. A rövid leolvasások hatékony összeszerelési képessége miatt, különösen az előnyös páros végű leolvasások révén, az Illumina-alapú transzkriptomszekvenálást és -összeállítást széles körben alkalmazzák modell- és nem-modell organizmusok esetében is. Ebben a tanulmányban körülbelül 8 g 101 bp-os páros végű leolvasást hoztunk létre, és hosszabb unigén szekvenciákat állítottunk elő 725 bp átlagos hosszúsággal. A nagyszabású szár-specifikus transzkriptomadatok hasznos referenciaadatokkal szolgálhatnak, és felhasználhatók a C. deserticola bioaktív komponenseinek másodlagos metabolizmusának bányászatára. Az összes nyers leolvasás 81,62%-a szigorú minőségi szűrőkön (beleértve az adaptervágást és az alacsony minőségű olvasások elvetését) ment át az összeszerelés előtt, ami arra utal, hogy szekvenálási adataink kiváló minőségűek, és a jó minőségű leolvasások 82,08%-a hasznos volt az összeszereléshez. Más leolvasások, amelyeket nem sikerült az összeállításhoz felhasználni, szekvenálási hibákból, összeállítási paraméterekből és másokból származhatnak. Ezek a fel nem használt kiváló minőségű leolvasások továbbra is hasznosak voltak a de novo összeállítás javításában, kombinálva a hosszabb olvasással egy másik platformról (például a Roche 454-ről) a jövőben.

TERMÉSZETES CISTANCHE TUBULOSA A SZEXUÁLIS FUNKCIÓ JAVÍTÁSÁRA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Számos összeállított transzkriptum (30 098) nagy szekvenciájú hasonlóságot mutatott a nyilvános adatbázisokban lévő ismert génekkel, ami arra utal, hogy az Illumina-alapú páros végű adataink a C. deserticola transzkriptumainak jelentős részét fedték le. A BLAST találatok nélküli átiratok oka lehet a C. deserticola 3' vagy 5' nem transzlált régiói, nem kódoló RNS vagy új génszekvenciák. Az expresszált transzkriptumokat a GO kategóriák és KEGG útvonalak széles skálájához annotálták (3. és 4. táblázat), amelyekben sok átiratot másodlagos anyagcserével kapcsolatos útvonalakhoz rendeltek. Mint tudjuk, a fenilpropanoid indukálható antimikrobiális vegyületként funkcionálhat, amely nagy üdvösséggel bír a földalatti életmód számára [1], és gyógyászati ​​hasznossága mellett a növény-mikroba kölcsönhatásokban is jelmolekulaként működhet [68, 69]. A terpenoidot bioaktív komponensek (például 6- dezoxikatalpol) bioszintézisére használják [70]. Azt találtuk, hogy a fenilpropanoid és a terpenoid gerinc bioszintézisben részt vevő gének nagy mennyiségben fordulnak elő C. deserticolában. Ennél is fontosabb, hogy a lignin bioszintézisének jól reprezentált útvonalainak felfedezése (3. ábra) a lignin aktív metabolikus folyamatát jelezte a C. deserticola szárban. A lignin bioszintézisében részt vevő összes ismert enzimgén (3. ábra) kifejeződött, és négy kulcsenzim, köztük a PAL, a CCR, a HCT és az F5H, alacsonyabb expressziós bőséget mutatott (FPKM 26,47, 3,89, 3,4 és 3,83), összehasonlítva egyéb enzimgének (6. táblázat). További tanulmányozást érdemel, hogy e három gén expressziós változása befolyásolhatja-e a C. deserticola lignintermelését. A PAL kulcsenzim a lignin bioszintézisében, és részt vesz a fenilpropanoid, a rezveratrol, a flavonoid és a kumarin bioszintézisében is [71–74]. A C. deserticola genomjában (S2 ábra) négy különböző PAL gént detektáltunk, amely egybeesett azzal, hogy a PAL-t egy kis multigén család kódolja [39, 43, 45–49], és bebizonyítottuk, hogy fontos szerepet játszhat a metabolikus szénáramlásban. .

A PhG a C. deserticola elsődleges hatóanyaga. A fenil-etanol bioszintézisében részt vevő gének fontosak a C. deserticola minősége szempontjából. A C. deserticola szárban a fenil-etanol és a PhG bioszintézisben részt vevő 17 enzimgén két különböző bioszintézisútjára következtettünk. A lehetséges posztkávé/ferulinsav folyamatokat (3. ábra) szintén először vezettük le a köztitermékek és a megfelelő enzimek katalitikus tulajdonságainak szerkezeti képlete alapján, amelyben a kávé/ferulinsav először fenilpiruvát-származékká oxidálódik; ezután a karboxilcsoportot dekarboxilázok megfosztották; végül az aldehidcsoportot a dehidrogenáz visszaalakította alkoholcsoporttá. Ez az Illumina páros végű szekvenálási technológia első alkalmazása a C. deserticola teljes transzkriptumának vizsgálatára és RNS-seq leolvasások összeállítására referenciagenom nélkül. Ez a tanulmány hasznos forrásokat és génszekvenciákat biztosít a C. deserticola funkcionális genomikai és proteomikai kutatásához a jövőben.

Következtetések

Ebben a tanulmányban nagy áteresztőképességű szekvenálási adatok alapján profiloztuk a C. deserticola szár transzkriptumát, azonosítottuk a lignin bioszintézis-útvonalaiban részt vevő géneket, és első ízben következtettünk a PhG-k lehetséges bioszintézis-útvonalára is, ami minden bizonnyal felgyorsítja a megértést. a kétértelmű élettani folyamatok és a molekuláris szintű nagy gyógyászati ​​érték. Mostanáig ez az első kísérlet a C. deserticola szár teljes transzkriptumának de novo összeállítására és a gyógyászati ​​komponensek bioszintézisútjának kimutatására Illumina-alapú szekvenálási adatkészletek segítségével. Vizsgálatunk elősegítheti a természetes gyógymódok fejlesztését és a gyógyászati ​​tulajdonságokkal rendelkező fajták kiválasztását.

TERMÉSZETES CISTANCHE TUBULOSA A SZEXUÁLIS FUNKCIÓ JAVÍTÁSÁRA PHGS75% ECH 30% ACT 12%