Élő emberi glomerulus pásztázó ionvezetési mikroszkópja

További információ:ali.ma@wecistanche.com

Ruslan Bohovyk1,2|Mykhailo Fedoriuk1,2|Elena Isaeva1,2|Andrew Sevcsuk3|Oleg Palygin1|Alekszandr Staruschenko1,4

1 Élettani Tanszék, Wisconsini Medical College, Milwaukee, WI, USA2 Cellular Membranology Tanszék, Bogomoletz Institute of Physiology, Kijev, Ukrajna 3 Orvostudományi Tanszék, Imperial College London, London, UK4Clement J. Zablocki VA Medical Center, Milwaukee, USA

Levelezés Alexander Staruschenko és Ruslan Bohovyk, Physiology Department, Medical College of Wisconsin, 8701 Watertown Plank Road, Milwaukee, WI 53226, USA.E-mailek: staruschenko@mcw.edu; rbogovik@gmail.com

Finanszírozási információk Veteránügyi Osztály, Támogatás/díj száma: I01 BX004024; National Heart, Lung and Blood Institute, Grant/Award Number: P01 HL116264 and R35 HL135749; American Physiological Society, Grant/Award Number: Research Career Enhancement Award; Országos Diabétesz és Emésztési Intézet ésVeseBetegségek, Támogatás/díj száma: DK126720

Absztrakt

A podocita károsodás a glomeruláris betegségek, például a fokális szegmentális glomerulosclerosis jellemzője, amely jellemzően kifejezett albuminuriával és a vesepatológia progressziójával társul. A podocita szerkezeti rendellenességei és elvesztése szintén összefügg a minimális változási betegséggel, és gyakoribbakdiabéteszes vesebetegség. Itt alkalmaztuk az első alkalommal pásztázó ionvezetési mikroszkópos (SICM) technikát a frissen izolált ember felmérésére.glomerulusoktopológia. A SICM egyedülálló lehetőséget kínál az értékelésreglomeruluspodociták, valamint más nefron szerkezeti szegmensek elektronmikroszkópos felbontással, de élő mintákban. Itt látható a SICM módszer alkalmazása élő emberbenglomerulus, amely az élő sejtek membránmorfológiájának és különféle funkcionális paramétereinek jövőbeli dinamikus elemzéséhez nyújt elvi bizonyítékot.

Kattintson a cistanche mellékhatásaihoz és a Cistanche vesebetegséghez

1. BEMUTATKOZÁS

GlomerulusA nefron bemeneti részében elhelyezkedő kapilláriscsomót képviseli, ahol a vér szelektíven átszűrődik az endothelsejtekből, glomeruláris alapmembránból és podocitákból álló glomeruláris filtrációs gáton. A szomszédos podociták elsődleges és másodlagos folyamatai összefonódnak, és egy hasított membrán jön létre, amely szorosan befedi a glomerulusok kapillárisait. Ez a membrán összetett morfológiával rendelkezik, és a vér szűrésének végső gátját képezi, hozzájárulva a méretszelektivitáshoz, és lehetővé teszi az albuminnál kisebb molekulák permeabilitását. A podociták számának és a lábfolyamat kiürülésének csökkenéséről számoltak be fokális szegmentális glomerulosclerosisban, minimális elváltozásos betegségben és diabéteszes nephropathiában.{0}}Ezenfelül a podociták elvesztése és szerkezetük módosulása nyilvánvaló a betegség nagyon korai szakaszában.vesebetegségek, amelyek a progresszió hátterében/súlyosbbá válhatnak. A sejtmorfológia nagy felbontású képalkotása alapvető és hasznos eszközzé válik a sejtszerkezetek, valamint a sejtműködésben és a betegség progressziójában játszott szerepük tanulmányozásában.4 A pásztázó elektronmikroszkópia (SEM) széles körben alkalmazott módszer az ilyen vizsgálatok elvégzésére. Ennek ellenére több összetett eljárást igényel a minta-előkészítés, ami lehetetlenné teszi egy élő minta elemzését.5 Ezért kritikus igény van új eszközök kifejlesztésére a podocita morfológiai változásainak tanulmányozására élő mintákban. A Scanning Ion Conductance Microscopy (SICM) ugrálószondás módja egy olyan technika, amely lehetővé teszi az élő sejtfelszínek összetett morfológiájú, nagy felbontású, nem optikai képalkotását.6-8A módszer fő előnye a közel több nanométeres térbeli felbontás. hosszú Z (függőleges) tartomány, amely fiziológiailag releváns körülmények között kanyargós morfológiájú élő mintákra is alkalmazható. A SICM egy multimodális képalkotó technika, amely kombinálható más bevett technikákkal, a membrán morfológiájának egyidejű és dinamikus elemzésével és különféle funkcionális paraméterekkel, mint például a sejttérfogat, a membránpotenciálok, az egyetlen ioncsatornás áramok, és még a membránfehérje komplexek dinamikája is. élő sejtekben.{6}} Itt egy példát mutatunk be a SICM alkalmazására élő ember morfológiájának elemzésére.glomerulusszerkezet.

Cistanche-vesebetegség tünetei

2. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK

A kísérlethez az eldobott transzplantált ember kérgi területének egy részét használtuk felvesefeldaraboljuk, és Wisconsin tartósítóoldatban tároljuk, majd oxigénnel dúsított fiziológiás sóoldatban (PSS) inkubáljuk.12 A vese glomerulusokat a korábban leírt vibrodiszociációs technikával izoláltuk.13 Ez a megközelítés lehetővé teszi a jól megőrzött vese glomerulusok gyors izolálását az emberi szervezetből.vese. SICM képalkotás elvégzésére, frissen izolált emberglomeruluspoli-L-lizin üvegfelületre erősítették, amelyeket a PSS oldattal töltött sejtkamrába helyeztek. A mintákat manuálisan helyeztük el xy irányban egy fordított optikai mikroszkóp alatt, Nikon TE2000-U (Nikon Instruments). Az ugráló szondához körülbelül 100 MΩ ellenállású SICM képalkotó boroszilikát üveg nanopipettákat használtak, ami a becsült 120 nm körüli csúcsátmérőnek felel meg. A nanopipettákat a vízszintes lángoló/barna típusú P-97 típusú lehúzóval (Sutter Instruments, Novato, CA) húztuk. A nanopipettákat a fürdőhöz használt PSS-oldattal töltöttük meg, és piezoelektromos aktuátorral z irányban helyeztük el. A nanopipettákon átfolyó ionáramot Axopatch 700B patch-clamp erősítővel (Axon Instruments) mértük feszültség-clamp módban, és az egyedileg módosított univerzális vezérlővel (ICAPPIC Ltd, UK) figyeltük, amely egyidejűleg szabályozta a minta és a pipetta pozicionálását. 6 Minden kísérletet szobahőmérsékleten (20-22 fok) végeztünk. Bonyolult csavart struktúrák, például podocyták lábfolyamatainak képalkotására aglomerulus, a backstep/hopping módú SICM-et használtuk, amely leginkább az élő sejtek topográfiájának nagy felbontású leképezésére alkalmas.6,14 Az ugrás elvének egyetlen lépése egy olyan eseményből áll, amikor a referenciaáramot úgy mérjük, hogy a nanopipetát jóval a minta. Ezután a nanopipetta a z tengely mentén közeledik a minta felületéhez, amíg a mért áramszint le nem esik az előre beállított alapértékre, amely a referenciaáram ~ 1.0 százalékának -1,2 százalékának felel meg. Ebben a pillanatban a megközelítés befejeződik, az XY és Z piezo aktuátorok XYZ koordinátáit rögzítjük mintafelületi koordinátaként az első képalkotási ponthoz, és a pipettát eltávolítjuk a felületről. Ez az eljárás ezután minden egyes képalkotási pontban megismétlődik az xy tengely mentén, amelyet az előre beállított felbontás és a szkennelési terület tartománya határoz meg. Az 1B. ábra esetében a beolvasási tartomány és a képfelbontás 30 µm × 30 µm és 512 px × 512 px, az 1C. ábra esetében pedig 5 µm × 5 µm és 480 px × 480 px. A nyers SICM topográfiai adatok és a kép utófeldolgozása SICM ImageViewer mikroszkópos elemző szoftverrel (ICAPPIC Ltd, Egyesült Királyság) történt.

1. ÁBRA A pásztázó ionvezetési mikroszkópos képalkotás alkalmazása. A, Frissen izolált emberglomerulusa poli-Llysine üvegfelülethez rögzítve. A bal oldalon egy mikropipetta látható, amely megközelíti a glomerulus felszínét a SICM képalkotás végrehajtásához. B, Példa a glomerulus filtrációs gát összetevőire, beleértve a podocita és a lábfej folyamatokkal fedett ereket, a SICM által megjelenített. 45 perc a teljes terület szkenneléséhez (30 × 30 µm, felbontás 512 × 512 pixel; z tengely változása 15 µm). C, A nagy felbontású SICM által feltárt humán podocita másodlagos lábfolyamatok architektúrájának kiterjesztett nézete. 12 perc a teljes terület szkenneléséhez (felbontás 5 × 5 µm, felbontás 480 × 480 pixel; z-tengely változása 3 µm). Méretsávok jelennek meg

3. EREDMÉNYEK ÉS MEGBESZÉLÉS

A SICM képminőség hasonló a SEM-hez, és lehetővé teszi a pontos vizsgálatotglomerulusfelszíni szerkezete, beleértve a vérereket és a podocitákat, valamint a másodlagos lábfolyamatok felépítése.4 Korábbi vizsgálatunkban SICM képalkotást használtunk a 2-es típusú diabéteszes nephropathiás (T2DN) patkányok podocita lábfolyamatainak patológiás szerkezeti változásainak becslésére.15 összehasonlító elemzést végzett a podocita filtrációs gát háromdimenziós felépítéséről nem cukorbeteg és T2DN patkányokban. Adataink a podocita lábfolyamatok jelentős csökkenését mutatták ki a T2DN glomerulusokban, ami pontos értékelést ad a diabéteszes nephropathiában fellépő kórszövettani változásokról, amelyek ezekben a patkányokban a nephrinuria és albuminuria hátterében állnak. -frissen izolált, élő emberi glomerulus dimenziós felszíni szerkezete. Az emberi vese glomerulusai gömb alakú struktúrák, amelyek átmérője körülbelül 300 µm16; így a pipetta hegyének óvatosan kell megközelítenie a kívánt terület tetejét. SICM-beállításunk 25 µm-es z-tengelyes és 30 × 30 µm-es xy-tengelyes szkennerrel rendelkezik, amely lehetővé tette, hogy nagy felbontású képet kapjunk aglomerulusfelület. A felvételi idő erősen függ a szkennelési tartománytól, a felbontástól és az ugrálóelektróda hegyének méretétől. A komplex struktúrákban, például a frissen izolált glomerulusokban lévő élő sejtes képalkotásnál a szkennelési idő képkockánként 10 és 50 perc között változik (további részletekért lásd az ábra jelmagyarázatát). A nagy felbontás, a nagy szkennelési terület és az élő rendszerekben tapasztalható sztochasztikus ingadozások kumulatív hatása olyan képalkotási műtermékeket eredményezhet, amelyek vízszintes és függőleges eltolódásként jelennek meg a reménybeli pipetta-áthelyezési ciklusok között. Ne feledje, hogy összetett geometriák esetén a felületi helyzet hirtelen megváltozásával mind a felvételi idő, mind a képalkotási műtermékek, például a sötét vagy rossz pixelek megnövekedhetnek. A SICM topográfiai kép (1A ábra) jól látható primer és másodlagos podocita lábfolyamatokkal borított glomeruláris kapillárisokat szemléltet. A SICM lehetővé teszi a nanométeres skálán különböző pásztázási tartományú mintaképek beszerzését, megfelelő felbontási szintet tartva.17 Az 1B. ábra a humán podocita másodlagos lábfolyamat felépítését mutatja be, amelyet a nagy felbontású SICM tár fel. Az ilyen topográfiai képek további elemzése felhasználható a podocita lábfolyamatainak morfológiai változásainak tanulmányozására patológiás körülmények között és különféle gyógyszeres alkalmazások hatására.

A SICM technika alkalmazása a lágyszövetminták háromdimenziós felületi szerkezetének vizsgálatára, pl.glomerulusés podocita sejtek, kezdetben Nakajima és munkatársai vezették be4. A szerzők használtakveseszeleteket, hogy összehasonlítsa ezt a technikát a hagyományos SEM-mel. Itt ezeket a vizsgálatokat kiterjesztettük az élő emberi glomerulusokra. Ezzel a megközelítéssel feltártuk a SICM technikában rejlő nagy lehetőségeket a gyors és megbízható vizsgálatbanglomerulusszűrő gát. A SICM egyik nagy előnye (az élő minták használata mellett), hogy nem igényel többszörös minta-előkészítési eljárást, amely jellemzően az EM mikroszkópos képalkotáshoz szükséges, beleértve a dehidratálást és a fixáló oldatot. Ezért a SICM lehetővé teszi az EM-nél megfigyelt minták zsugorodásának elkerülését, ami félrevezető tényleges méretekhez vezethet. Fontos, hogy a frissen izolált glomerulusokon a valós idejű SICM lehetővé teszi a lábfolyamatok mozgásának dinamikájának tesztelését a kérdéses gyógyszerek akut expozíciójára válaszul. Végül a SICM pipettával egycsatornás áramok patch-clamp rögzítése is elvégezhető.18E célból a topográfiai térkép rekonstrukciója után az adatgyűjtő szoftver (ICAPPIC Ltd, UK) lehetővé tette a SICM üveg ellenőrzött fékezését. ugráló szonda a kamra felületén, csökkenti a mikroelektródák ellenállását a patch-clamp körülményekkel szemben (7-12 MΩ), és alkalmassá teszi egycsatornás rögzítésre ugyanabban a kísérletben. A SICM lehetővé teszi a patch-clamp elektróda pontos helyének kiválasztását a sejtfelszínen a topográfiai adatok alapján nanométeres pontossággal, jól szabályozott függőleges megközelítéssel, aminek eredményeként a Smart Patch nevű sejtmembránnal könnyen kialakulhat a kontaktgigaseal.19

Összefoglalva, az itt leírt módszer kiváló lehetőségeket rejt magában a glomerulusok és más frissen izolált nefronszegmensek vizsgálatára. Továbbá azt mutatja, hogy lehetséges embert használniveseminták bonyolult előkészítés nélkül, hogy értékeljék a morfológiai változásokat a patológiák vizsgálatában.

Cistanche vesebetegségre

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

A szerzők laboratóriumában végzett kutatásokat a Veterán Ügyek Osztálya I01 BX004024, az Országos Szív-, Tüdő- és Vérintézet R35 HL135749 és P01 HL116264, az Országos Diabétesz és Emésztési Intézet ésVeseBetegségek R01 DK126720, és az American Physiological Society Research Career Enhancement Award.

ÉRDEKÜLÉKENYSÉG

Dr. Andrew Shevchuk részvényes, és a tanácsadói díjakat az ICAPPIC Ltd.-től kapja. Az összes többi szerző nem nyilatkozott versengő érdekeltségről

A SZERZŐ HOZZÁJÁRULÁSAI

Ruslan Bohovyk: Konceptualizálás (egyenlő); Adatkezelés (lead); Formális elemzés (lead); Írás-eredeti piszkozat (egyenlő); Írás-ellenőrzés és szerkesztés (egyenlő). Mykhailo Fedoriuk: Adatkezelés (támogató); Formai elemzés (támogatás); Írás-ellenőrzés és szerkesztés (egyenlő). Elena Isaeva: Konceptualizálás (támogató); Adatkezelés (támogatás); Formai elemzés (támogatás); Eredeti piszkozat írása (támogatás); Írás-ellenőrzés és szerkesztés (egyenlő). Andrew Shevchuk: Konceptualizálás (támogatás); Szoftver (támogató); Eredeti tervezet megírása (támogató); Írás-ellenőrzés és szerkesztés (egyenlő). Oleg Palygin: Konceptualizálás (egyenlő); Formai elemzés (támogatás); Módszertan (támogató); Projekt adminisztráció (támogatás); Írás-eredeti tervezet (támogató); Írás-ellenőrzés és szerkesztés (egyenlő). Alekszandr Sztaruscsenko: Koncepció (vezető); Projekt adminisztráció (vezető); Erőforrások (ólom); Felügyelet (vezetés); Írás-eredeti piszkozat (egyenlő); Írás-ellenőrzés és szerkesztés (egyenlő).

AZ ADATOK ELÉRHETŐSÉGÉRE VONATKOZÓ NYILATKOZAT

A tanulmány megállapításait alátámasztó adatok ésszerű kérésre elérhetők a megfelelő szerzőtől.