A nátrium-tioszulfáttal kiegészített UW-oldat megvédi a vesegraftokat a hosszan tartó hideg ischaemia-reperfúziós sérülésektől a szingén veseátültetés egérmodelljében

Kapcsolatfelvétel: ali.ma@wecistanche.com

Max Y. Zhang et al

A Cistanche tubulosa megakadályozzavesebetegség, kattintson ide atermékek és a Cistanche Nz

ABSZTRAKT

Bevezetés:A hideg ischaemia-reperfúziós sérülés (IRI) elkerülhetetlen esemény, amely növeli a transzplantáció utáni szövődményeket. Korábban kimutattuk, hogy a University of Wisconsin (UW) oldat kiegészítése nem FDA-jóváhagyott hidrogén-szulfid (H2S) donormolekulákkal minimalizálja a hideg IRI-t, és javítja a veseátültetés utáni graft működését. A jelen tanulmány azt vizsgálja, hogy az FDA által jóváhagyott H2S donormolekula, a nátrium-tioszulfát (STS) ugyanolyan vagy jobb hatást fejt-e ki egy klinikailag releváns szingén ortotopikus patkánymodellben.veseátültetés.

Módszer:Harminc Lewis patkányon esett át kétoldali nefrektómia, majd a bal oldali szingenikus ortotopikus transzplantációvese24-órás tartósítás után UW vagy UW plus STS oldatban 4 ◦C-on. A patkányokat a transzplantáció utáni 14. napig monitoroztuk, és leöltük a vesefunkció (vizeletkibocsátás, szérum kreatinin és vér karbamid-nitrogén) értékelése céljából.VeseA metszeteket H&E-vel, TUNEL-lel, CD68-cal és mieloperoxidázzal (MPO) festettük meg az akut tubuláris nekrózis (ATN), apoptózis, makrofág-infiltráció és neutrofil infiltráció kimutatására.

Eredmény:Az UW plusz STS graftok szignifikánsan javult a graft funkciója közvetlenül a transzplantáció után, a recipiens túlélése javult az UW graftokhoz képest (p < {0}},05).="" a="" hisztopatológiai="" vizsgálat="" szignifikánsan="" csökkent="" atn-,="" apoptózis-,="" makrofág-="" és="" neutrofil-infiltrációt,="" valamint="" a="" pro-inflammatorikus="" és="" pro-apoptotikus="" gének="" downregulációját="" mutatta="" ki="" uw="" plusz="" sts="" graftokban="" az="" uw="" graftokhoz="" képest="" (p=""><>

Következtetés:Első alkalommal mutatjuk be, hogy a vesegraftok megőrzése STS-kiegészített UW oldatban védelmet nyújt a hosszan tartó hideg IRI ellen azáltal, hogy elnyomja az apoptotikus és gyulladásos útvonalakat, és ezáltal javítja a graft működését és meghosszabbítja a recipiens túlélését. Ez egy új, klinikailag alkalmazható terápiás stratégia lehet az elhúzódó hideg IRI káros klinikai kimenetelének minimalizálására.veseátültetés.

Kulcsszavak:Nátrium-tioszulfát (STS) Ischaemia-reperfúziós sérülés (IRI) Statikus hidegtároló (SCS)Vesetranszplantáció A graft és a recipiens túlélése

1. Bemutatkozás

Vesea transzplantáció az optimális kezelés a végstádiumbanvesevese-betegség (ESRD). A dialízishez képestveseA transzplantáció jobb, mert jobb életminőséget biztosít, és jelentős túlélési előnyt biztosít költséghatékonysága mellett [1–3]. A donor veséjének beszerzése azonban eredendően összefügg az ischaemia-reperfúziós károsodással (IRI), amely elkerülhetetlen következménye a transzplantáció során a véráramlás leállásának és későbbi helyreállításának [4]. A transzplantáció által kiváltott IRI mérséklésének jelenlegi stratégiája a vesetranszplantátumok statikus hideg tárolása (SCS) standard tartósítóoldatokban, például a University of Wisconsin (UW) oldatban, jégen 4 ◦C-on a transzplantáció előtti időszakban [5]. Azonban kimutatták, hogy az elhúzódó SCS fokozott sejtpusztulással, gyulladással és más káros sejt- és molekuláris eseményekkel jár, amelyek végső soron a késleltetett graftfunkció (DGF), az akut tubuláris nekrózis (ATN) és a graft csökkenésének gyakoriságát eredményezik. túlélés [6–10]. Ezen túlmenően, hogy lépést tudjunk tartani az ESRD globálisan növekvő incidenciájával és a transzplantációs várólistán lévő betegek egyre növekvő számával, sok transzplantációs központ fogadja el a veseátültetéseket elhúzódó hideg ischaemiás periódusokkal, ami tovább hozzájárul az általános szövetkárosodáshoz. Az SCS-t követően reperfúzió következik, amikor a meleg oxigénnel dúsított vér visszakerül a hideg ischaemiás graftba. A reperfúziót, amely az ischaemiás sérülés effektor fázisa, fokozott szövetkárosodás jellemzi [11–13].

Potenciális terápiás stratégia a hideg IRI korlátozására alattveseA transzplantáció során a standard tartósítóoldatot hidrogén-szulfiddal (H2S) egészítik ki, egy endogén eredetű gáztranszmitterrel, amelyről kimutatták, hogy fontos élettani szerepet játszik az értágításban és a sejtjelátvitelben [14–16]. Korábban kimutattuk, hogy az elhúzódó SCS H2S-vel kiegészített UW-oldatban csökkenti a transzplantáció által kiváltott hideg IRI-t és javítja a graft túlélést szingén és allogén vesetranszplantáció egérmodelljeiben [17–19, 41, 42]. Az ezekben a vizsgálatokban használt H2S donormolekulák azonban klinikailag nem életképesek. Ez oda vezetett, hogy fontolóra vették a nátrium-tioszulfát (STS), egy H2S-donor gyógyszer alkalmazását, amelyet az Élelmiszer- és Gyógyszerügyi Hatóság (FDA) hagyott jóvá ESRD-betegek kalcifilaxiájának kezelésére, a ciszplatin által kiváltott toxicitás kezelésére a rákterápiában, valamint a rák ellenszereként. ciánmérgezés [20–23]. A legújabb tanulmányok kimutatták, hogy az STS védő hatást fejt ki az IRI állatmodelljeiben [24–26]. A transzplantáció által kiváltott hideg vese IRI-re gyakorolt ​​hatása azonban nem ismert. Ezért jelen tanulmány az STS renoprotektív hatásait vizsgálja a vese IRI in vitro modelljében és a szingén ortotopikus vesetranszplantáció patkánymodelljében.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Kísérleti in vitro protokoll

A hideg hipoxia és a meleg reoxigenációs sérülés in vitro modelljét, amely utánozza a sejtes körülményeket az in vivo hideg IRI során, az STS védő hatásának felmérésére a vese IRI során. Az in vitro kísérletekben patkány vese hámsejteket (NRK{{0}}E sejtvonal; ATCC, USA) használtunk, mivel ezek a sejtek érzékenyek az ischaemiás károsodásra [27], és használatuk összhangban van a patkányokkal a tanulmány második céljához használt transzplantációs modell. A sejteket Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) táptalajban tenyésztettük, amely 1 0% magzati szarvasmarha szérumot (FBS) tartalmazott, hő hatására inaktivált 60 ◦C-on 20 percig, és 1% penicillin/sztreptomicint (P/S). A sejteket normál növekedési körülmények között, 37°C-on, 21% O2 és 5% CO2 mellett inkubáltuk. A kontrollsejtek a kísérlet előtti sejtekkel azonos körülmények között voltak. A kísérleti sejteket szérummentes tápközeggel (SF), SF plusz 200 nM AP39-cel, vagy változó koncentrációjú (50 µM, 150 µM, 500 µM, 1 mM) nátrium-tioszulfát-pentahidráttal (STS) kezeltük. az STS (Seacalphyx® [Seaford Pharmaceuticals Inc, Mississauga, ON, Kanada]) 250 mg/ml-es injektálható oldata. 200 nM AP39 koncentrációt alkalmaztunk, mert korábban kimutattuk, hogy az AP39 ilyen koncentrációban citoprotektív ugyanazzal a sejtvonallal szemben a hideg IRI hasonló modelljében [20]. A sejteket ezután 10 ◦C-on 24 órán át hipoxiás körülmények között (5% CO2, 0,5% O2, 95% N2) inkubáltuk HypOxystation H85 hipoxiás kamrában (HYPO2YGEN, USA), hogy hideg ischaemiás károsodást idézzenek elő. 10 ◦C-os hipotermiás hőmérsékletet alkalmaztunk, mivel ez volt a legalacsonyabb hőmérséklet, amely technológiailag elérhető volt, miközben a hipoxia 0,5 százalékos O2-szintjét fenntartotta. A hipoxiát követően a kísérleti sejteket tartalmazó tápközeget kontroll táptalajra cserélték, és a sejteket normál növekedési körülmények között (37 ◦C, 21% O2 és 5% CO2) 24 órán keresztül inkubálták, hogy szimulálják a reperfúziót és a kapcsolódó sérüléseket. 24 órás reoxigenizációt követően a sejtek életképességét a sejtek FITC-vel konjugált Annexin-V-vel (FITC-Annexin-V; BioLegend, USA) és 7-Aminoactinomycin D-vel (7-AAD; BioLegend, USA) történő festéssel értékeltük. ), amely a celluláris apoptózist és a nekrózist méri. A sejteket áramlási citometriával analizáltuk CytoFLEX S (Beckman Coulter, USA) alkalmazásával. A FlowJo 11-es verzióját (FlowJo LLC, USA) használták az adatok statisztikai elemzéshez szükséges megfelelő kapuzására.

2.2. Kísérleti állatok

Harminc, 275–300 g tömegű, Charles River-től (St. Constant, QC, Kanada) vásárolt hím Lewis patkányt a Western University (London, ON) Animal Care and Veterinary Services létesítményében helyeztek el standard körülmények között. Az állatkísérleteket a Western University Council on Animal Care and Animal Use 2018–155 protokollazonosítóval hagyta jóvá.

2.3. Vesetranszplantációs modell

Syngeneic kidney transplantation in Lewis rats was performed to eliminate any confounding effects of immunosuppression. Rats were randomized into treatment groups of UW solution alone (UW) or UW+STS, anesthetized with ketamine (30 mg/kg) via intraperitoneal administration, and maintained under anesthesia with isoflurane during surgery. The left donor kidneys were procured under aseptic condition and flushed with 10 mL of either cold (4 ◦C) UW solution (UW group, n = 8) in a 28-G Angiocath Becton-Dickinson, or cold UW solution supplemented with sodium thiosulfate pentahydrate (150 µM Seacalphyx® [Seaford Pharmaceuticals Inc, Mississauga, ON, Canada]; UW+STS group, n = 6) until venous effluent was clear. Grafts were then subjected to SCS in UW solution at 4◦C with or without STS for 24 h to mimic prolonged cold ischemic time as previously described [13]. Following 24 h of SCS and bilateral nephrectomy in recipients, renal grafts were transplanted orthotopically into the left renal fossa of syngeneic recipient rats using 11–0 Prolene sutures as we previously described [22]. Sham-operated rats (mid-line incision only; n = 5), were used to establish a baseline for survival, histological analysis, BUN, and serum creatinine. Additionally, another subset of rats in the UW+STS group had grafts removed pre-emptively on a postoperative day (POD) 3 (n = 5) for histological comparison with UW grafts of recipients that were sacrificed at this time point. All surgeries were performed by the same microsurgeon with the length of surgery for the recipient being approximately 2–3 h for both UW and UW+STS groups. Graft failure was presumed in animals that required premature sacrifice (severe visible distress and/or >20 százalékos fogyás) vagy halál. A humánus végpontokat naponta kétszer ellenőrizték, és az összes patkányt CO2-expozícióval elaltatták egy kamrában 40 százalékos áramlási sebesség mellett. Az eutanázia idején nem volt olyan műtéti szövődmény, amely az eredmények eltéréseit eredményezhette volna.

2.4. A vesefunkció elemzése

A veseátültetést követően a patkányokat metabolikus ketrecekben figyelték 14 napig, majd leölték őket. Vér- és vizeletmintákat vettünk POD 3, 5, 7, 10 és 14-en a vesefunkció paramétereinek (szérum kreatinin, vér karbamid-nitrogén [BUN], vizelet ozmolalitása és vizeletkibocsátás) meghatározásához. A BUN és a szérum kreatinin vesetranszplantált recipiensektől származott, az áloperált patkányokat pedig IDEXX Catalyst One Chemistry Analyzer készülékkel (Markham, ON) mértük. A vizelet ozmolalitási szintjét fagyásponti ozmometriával határoztuk meg a 3320 Osmometer gép segítségével (Advanced Instruments, Norwood, MA), és összehasonlítottuk a vállalat által biztosított szabványokkal.

2.5. Hisztopatológiai és morfometriai elemzés

A paraffinba ágyazott veseszöveteket 4 µm vastag metszetekre vágtuk, és mikroszkópos tárgylemezekre rögzítettük szövettani vizsgálat céljából. A metszeteket hematoxilinnel és eozinnal (H&E), terminális dezoxinukleotidil-transzferáz dUTP nick end címkézéssel (TUNEL) festettük, hogy meghatározzuk az ATN és az apoptózis mértékét. A H&E szekciókhoz egy vak vesepatológus ATN-pontszámot adott a következő séma szerint: 1 =<11%, 2="11–24%," 3="25–45%," 4="46–75%," 5="">75 százalékos graft ATN. A vesemetszeteket a következő elsődleges antitestekkel is megfestették: vesekárosodás marker (KIM-1), makrofág felszíni marker CD68 és neutrofil-specifikus mieloperoxidáz enzim (MPO; Abcam®, Toronto, Kanada), majd másodlagos antitestekkel és DAB szubsztrát kromogén a Dako Envision System (Dako, Glostrup, Dánia) használatával a gyártó protokollja szerint, majd Eclipse 90i digitális fénymikroszkóppal (Nikon® Instruments, New York) 10-szeres nagyítással analizáltuk, és mennyiségi meghatározása ImageJ szoftver v. 1.8 (National) segítségével történt. Institutes of Health, Bethesda, MD).

2.6. Kvantitatív PCR elemzés

A teljes RNS-t a POD 3-on nyert vesegraft szövetekből RNeasy® Mini Kit (Qiagen, Toronto, Kanada) segítségével izoláltuk, majd a OneScript® Plus cDNS szintézis készlettel (ABM, Kanada) fordítottan átírtuk cDNS-re, az oligo(dT)12–12-vel együtt. 18 primer a gyártó protokollja szerint. Az izolált RNS-t és a cDNS-t nanodrop segítségével (DeNovix DS-11 Spectrophotometer, Kanada) elemeztük használat előtt, az A260/280 besorolások következetesen > 1,95, illetve > 1,8. Az egyes qPCR minták reakcióelegyének térfogata 20 µl volt, és a Blastaq® Green 2X qPCR Master Mix (ABM, Kanada) protokoll szerint készült, és CFX Connect Real-Time PCR Detection System géppel (Bio-Rad, Kanada) elemeztük. . A primer szekvenciákat Primer-BLAST szoftverrel (NCBI) terveztük béta-aktin, poli(ADP-ribóz) polimeráz (PARP), interferon-gamma (IFN-), tumor nekrózis faktor-alfa (TNF-), interleukin 6 (IL) ellen. -6), B-sejtes limfóma 2 (Bcl-2), Bcl-2- asszociált X-fehérje (BAX), kaszpáz 3, BH3 interacting-domain death agonista (BID), c-Jun N-terminális kináz 1/2 (JNK1/2), Pparg koaktivátor 1 alfa (PGC-1 ), mitokondrium komplex I (NDUFB8), mitokondrium komplex II (SDHB), mitogén által aktivált protein kináz 1/2 (ERK1) /2), a neutrofil zselatináz lipocalin (NGAL) és a vesekárosodás molekula-1 (KIM-1) gének. Minden érdeklődésre számot tartó gént normalizáltunk a béta-aktinnal szemben. A génexpresszió többszörös változásait áloperált patkányokkal hasonlítottuk össze, és a ΔΔCt módszerrel számítottuk ki.

2.7. Statisztikai analízis

Minden statisztikai elemzés a GraphPad (La Jolla, CA) Prism statisztikai szoftvercsomag 9-es verziójával történt.{1}}. A túlélési adatokat Kaplan-Meier túlélési analízissel és log rank teszttel, míg a qPCR génexpressziós adatokat páratlan egyirányú t-teszttel elemeztük. Az összes többi adatot egyutas varianciaanalízissel (ANOVA) elemeztük, majd Tukey-féle post-hoc teszttel határoztuk meg a csoportok közötti statisztikai különbségeket. A statisztikai szignifikanciát p<0.05. values="" are="" presented="" as="" mean="" ±="" standard="" error="" of="" mean="">

3. Eredmények

3.1. Az STS-sel kiegészített szérummentes táptalaj javítja a vesetubuláris hámsejtek túlélését hideg hipoxia/reoxigenáció során

Az apoptózis és nekrózis kimutatása után végzett áramlási citometriai analízis azt mutatta, hogy az in vitro hideg IRI során SF-vel kezelt NRK{{0}}E-sejtek szignifikánsan csökkent sejtek életképességét a kontroll (normoxikus) sejtekhez képest (1A. ábra; p <). 0.05).="" míg="" az="" összes="" kísérleti="" minta="" szignifikánsan="" alacsonyabb="" vesetubuláris="" epiteliális="" sejtek="" életképességét="" mutatta,="" mint="" a="" normoxikus="" körülmények="" között="" növesztett="" sejtek="" (p="">< 0,05),="" a="" 150="" µm="" és="" 500="" µm="" sts-sel="" kiegészített="" sf-vel="" kezelt="" sejtek="" szignifikánsan="" magasabb="" életképességet="" mutattak,="" mint="" a="" kezeltek.="" csak="" sf="" tápközeggel="" (1a.="" ábra;="" p="">< 0,05),="" ami="" jelentősen="" csökkent="" apoptózisnak="" felelt="" meg="" a="" csak="" sf="" tápközeggel="" kezelt="" sejtekhez="" képest="" (1b.="" ábra;="" p="">< 0,05).="" ezenkívül="" úgy="" tűnik,="" hogy="" a="" sejtek="" életképességének="" növekedése="" és="" az="" apoptózis="" csökkenése="" eléri="" az="" optimális="" szintet="" 150="" µm="" és="" 500="" µm="" sts="" mellett,="" mivel="" a="" magasabb="" dózis="" megfordította="" ezeket="" a="" tendenciákat="" (1a="" és="" b="">

3.2. Az UW oldat STS-sel történő kiegészítése javítja a vesegraft korai túlélését és működését

A vesetranszplantátumok megőrzése STS-sel kiegészített UW-oldatban jelentősen javította a recipiens túlélést, 83%-os túlélést a POD 14-ig (az elpusztítás napja) az STS-kiegészítés nélküli kontrollcsoporthoz képest, amely 12,5%-os túlélést mutatott, különösen az első 3 napban. 2A; p < 0.05).="" ezenkívül="" az="" sts-kiegészítés="" jelentősen="" javította="" a="" graft="" funkcióját="" a="" korai="" poszttranszplantációs="" időszakban,="" összehasonlítva="" az="" uw-kezeléssel.="" a="" szérum="" kreatinin-="" és="" bun-szintje="" mind="" az="" uw,="" mind="" az="" uw="" plusz="" sts="" csoportban="" szignifikánsan="" megemelkedett="" a="" pod="" 3-on,="" ami="" összefüggést="" mutatott="" a="" vizelet="" ozmolalitásának="" csökkenésével="" a="" sham-hez="" képest="" (2b,="" c="" és="" 3a="" ábra;="" p="">< 0).{25="" }}5).="" azonban="" a="" szérum="" kreatinin="" és="" bun="" szintje="" az="" uw="" plusz="" sts="" csoportban="" szignifikánsan="" csökkent="" a="" pod="" 3-on,="" és="" ennek="" megfelelően="" nőtt="" a="" vizelet="" ozmolalitása="" az="" uw="" csoporthoz="" képest="" (2b,="" c="" és="" 3a="" ábra;="" p="">< 0,05).="" érdekes="" módon="" a="" szérum="" kreatinin="" és="" bun="" szintje="" az="" uw="" plusz="" sts="" csoportban="" folyamatosan="" csökkent="" pod="" 3-ról="" pod="" 14-re,="" a="" vizelet="" ozmolalitásának="" növekedésével,="" és="" összehasonlítható="" volt="" a="" sham-éval="" (2b,="" c="" és="" 3a="" ábra).="" ezenkívül="" a="" vizeletkibocsátás="" az="" uw="" plusz="" sts="" csoportban="" szignifikánsan="" magasabb="" volt="" az="" első="" négy="" posztoperatív="" napon="" az="" uw="" és="" sham="" csoportokhoz="" képest="" (3b.="" ábra;="" p="">< 0,05).="" ez="" azonban="" folyamatosan="" csökkent="" a="" kiindulási="" (sham)="" érték="" felé,="" és="" összehasonlítható="" volt="" a="" pod="" 14="" ál-értékével,="" míg="" a="" túlélő="" patkány="" vizeletkibocsátása="" az="" uw="" csoportban="" magasabb="" maradt,="" mint="" a="" pod="" 14="" kiindulási="" értéke="" (3b.="">

3.3. Az STS hozzáadása az UW oldathoz csökkenti a transzplantáció által kiváltott sejthalált veseátültetés után

A POD 3-on és 14-en kapott vesemetszeteket TUNEL-lel festettük meg az apoptotikus sejthalál mértékeként, és egy vak vesepatológus értékelte (4A. ábra). Az UW csoportból származó vesetranszplantátumok szignifikánsan magasabb apoptotikus sejthalált mutattak a POD 3-on, amit a magasabb TUNNEL pontszám jelez, mint az UW plusz STS és Sham csoportok veséi (5A és b ábra; p < 0).{11}="" }5).="" az="" uw="" plusz="" sts="" csoportból="" származó="" graftok="" nem="" különböztek="" szignifikánsan="" a="" sham-től="" ugyanabban="" az="" időpontban="" és="" pod="" 14-nél="" (4b.="" ábra).="" ezenkívül,="" míg="" az="" uw="" és="" az="" uw="" plusz="" sts="" csoportból="" származó="" graftok="" szignifikánsan="" megnövekedett="" atn="" pontszámot="" mutattak="" a="" pod="" 3-on="" az="" ál-csoporthoz="" képest="" (5.="" ábra;="" p="">< 0.05),="" az="" uw="" plusz="" sts="" graftok="" csökkent="" atn="" pontszámokat="" mutatott="" a="" pod="" 3-on="" az="" uw-hez="" képest="" (5.="" ábra;="" p="">< 0,05).="" továbbá,="" míg="" az="" uw="" graftok="" recipiensei="" nem="" élték="" túl="" a="" pod="" 14-et,="" és="" ezért="" atn="" pontszámukat="" nem="" lehetett="" meghatározni="" a="" pod="" 14-en,="" az="" uw="" plusz="" sts="" graftok="" túlélték="" a="" pod="" 14-et,="" de="" szignifikánsan="" megnövekedett="" atn-pontszámokat="" mutattak="" az="" ál-csoporthoz="" képest="" (3.="" 5,="" p=""><>

3.4. Az STS-sel kiegészített UW-oldatban megőrzött vesetranszplantátumok csökkent sérülési markereket és gyulladásos infiltrátumot mutattak vesetranszplantáció után

A POD 3-on és 14-en kapott vesemetszeteket KIM-1-val festették meg a proximális tubuláris sérülés, valamint a CD68 (makrofág marker) és MPO (neutrofil marker) kimutatására, és egy vak vesepatológus értékelte (6A., 7A. ábra, és C). A KIM{6}}, CD68 és MPO veseszöveti expressziója szignifikánsan magasabb volt az UW csoportban POD 3-on, mint az UW plusz STS és Sham csoportokban (6B, 7B és D ábra; p < {{11}="" }.05),="" míg="" ezeknek="" a="" markereknek="" az="" expressziója="" uw="" plusz="" sts="" graftokban="" nem="" különbözött="" szignifikánsan="" a="" pod="" 14-en="" lévő="" sham-hez="" képest="" (6b,="" 7b="" és="" d="" ábra;="" p=""> 0,05).

3.5. Az UW oldat STS-kiegészítése elnyomta a gyulladást elősegítő, pro-apoptotikus és mitokondriális gének vese expresszióját

A proinflammatorikus, pro-apoptotikus, mitokondrium-célzott és vesekárosodás markerek génexpresszióját qRT-PCR-rel határoztuk meg POD 3-on nyert transzplantált vesékben. Az IFN-, TNF- és IL{{8 }} jelentősen megnőtt az UW graftokban a POD 3 UW plusz STS graftokhoz képest (8A ábra; p < 0.05),="" és="" ugyanezt="" a="" mintát="" követték="" a="" parp,="" bax="" pro-apoptotikus="" génekkel="" ,="" kaszpázok-3,="" bid,="" jnk1="" és="" jnk2="" (8a="" ábra;="" p="">< 0.05),="" míg="" az="" anti-apoptotikus="" bcl-2="" expressziója="" enyhén="" megnövekedett="" uw-ben="" plusz="" sts="" csoport="" az="" uw="" csoporthoz="" képest,="" bár="" ez="" a="" növekedés="" nem="" érte="" el="" a="" statisztikai="" szignifikanciát="" (8a.="" ábra).="" ezenkívül="" a="" pgc-1,="" ndufb8="" (i.="" komplex)="" és="" sdhb="" (ii.="" komplexum)="" mitokondriális="" gének="" expressziója="" szignifikánsan="" csökkent="" az="" uw="" plusz="" sts="" graftokhoz="" képest="" (8b.="" ábra;="" p="">< 0="" .05),="" míg="" az="" erk1="" és="" erk2="" kifejezéseknél="" ennek="" fordítottja="" volt="" megfigyelhető="" (8b.="" ábra;="" p="">< 0,05).="" ezenkívül="" a="" kim-1="" génexpressziója="" az="" uw="" graftokban="" szignifikánsan="" megnövekedett="" az="" uw="" plusz="" sts="" graftokhoz="" képest="" (8c.="" ábra;="" p="">< 0,05),="" míg="" a="" csökkent="" ngal="" expresszió="" az="" uw="" plusz="" sts="" graftokban="" nem="" érte="" el="" a="" statisztikai="" szignifikanciát="" a="" uw="" graftok="" (8c.="" ábra;="" p=""> 0,05).

4. Megbeszélés

Ez a tanulmány létrehozza a standard tartósítóoldat kiegészítését STS-sel, egy klinikailag életképes, FDA által jóváhagyott H2S donorral, hogy enyhítse a transzplantáció által kiváltott hideg vese IRI-t, javítsa a graft minőségét és meghosszabbítsa a recipiens túlélését. A vese IRI in vitro modelljét és a szingenikus ortotopikus vesetranszplantáció patkánymodelljét használva először mutatjuk be, hogy az UW-oldat STS-sel történő kiegészítése hosszan tartó SCS során a test- és szervvédelmet nyújtja.

Az in vitro modellünkben az elsődleges megállapítás az, hogy a szérummentes tápközeg STS-kiegészítése megvédi a vese epiteliális sejtjeit a hideg hipoxiától és a meleg reoxigenáció által kiváltott apoptózistól, és növeli az életképességet, ami összhangban van korábbi vizsgálatunkkal, ahol kimutattuk a mitokondriumok védő hatását. - célzott H2S donor gyógyszer, AP39, a hideg vese IRI in vitro modelljében [20]. Érdekes módon az 1 mM-os magasabb STS-koncentráció megfordította a jótékony hatásokat, ami arra utal, hogy az STS kétfázisú dózis-válasz jelenséget mutat, amelyet hormézisnek neveznek, amelyben alacsonyabb koncentráció citoprotektív, míg magasabb koncentráció citotoxikus. A mitokondriális károsodás a vese IRI egyik fő következménye, mivel a mitokondriális permeabilitás gátolhatja az adenozin-trifoszfát (ATP) termelődését, és fokozhatja a reaktív oxigénfajták (ROS) képződését, amely a szövetkárosodás romboló mediátora [13]. A közelmúltban felmerült, hogy a mitokondriumok az STS-aktivitás elsődleges helyszínei. Nemcsak az STS-ről ismert, hogy H2S-t termel a mitokondriumokban a glutation-függő redukción keresztül, és fordítva, a szulfidoxidációs útvonalon keresztül, hanem megőrzi a mitokondriális ATP szintézist, csökkenti a ROS termelést és javítja az elektrontranszport láncban (ETC) a komplex enzimaktivitásokat [24]. ,28–30]. Ezenkívül a legújabb tanulmányok kimutatták, hogy az STS jelentősen megnövelte a PGC-1 expresszióját, amely a mitokondriális biogenezis és az ATP-termelés pozitív szabályozója [26], ami összhangban van in vivo megfigyelésünkkel. Ezek a molekuláris mechanizmusok magyarázhatják a mitokondriális I. és II. ETC komplexek (NDUFB8 és SDHB) szignifikánsan megnövekedett expresszióját vesetranszplantációs modellünkben, megnövekedett túlélés és funkció mellett, ahogy azt az STS-sel kiegészített UW oldatban megőrzött vesegraftokban is megfigyeltük.

In vitro eredményeink alapján úgy döntöttünk, hogy megvizsgáljuk, hogy az STS protektív hatása alkalmazható-e in vivo olyan transzplantációs modell segítségével, ahol a hideg IRI jelentős mértékben hozzájárul a graft diszfunkciójához és a megnövekedett poszttranszplantációs szövődményekhez. Eredményeink azt mutatják, hogy a vesegraftok elhúzódó (24 órás) SCS-je STS-kiegészített UW-oldatban jelentősen javítja a graft minőségét és működését, amelyet a csökkent szérum kreatinin- és BUN-szint, magasabb vizeletkibocsátás és a recipiens meghosszabbodott túlélése jellemez a csak UW-oldatban tartósított graftokhoz képest. . Fontos megjegyezni, hogy a vizelet azonnali kiürülése még klinikai vesetranszplantáció után is kritikus eredmény, amely meghatározza, hogy szükség van-e dialízisre a késleltetett graft funkció (DGF) kezelésére. Ezért ígéretes eredmény az a megfigyelésünk, hogy az STS közvetlenül a transzplantáció után növeli a vizelet mennyiségét, és összehasonlítható a POD 14-es Sham csoporttal. A vesefunkcióban megfigyelt javulás az STS-sel kiegészített UW oldatban megőrzött graftok átültetése után szintén jelentős túlélési előnyt jelentett. Mennyiségileg az STS-kiegészítés meghosszabbította a graft élettartamát oly módon, hogy az UW plusz STS graftot kapott patkányok 83 százaléka (5/6) túlélte a POD 14-ig (az elpusztítás napja), szemben a recipiens patkányok mindössze 12,5 százalékával (1/8). UW oldatban tartósított oltványok STS kiegészítés nélkül. A jelen tanulmány ezen megállapítása egybecseng korábbi vizsgálatunkkal is, amelyben a graftokat befogadó patkányok mindössze 14 százaléka (7-ből 1) maradt UW-oldatban 24 órán át H2S (GYY4137) kiegészítés nélkül, és túlélte a POD 14-ig [20]. .

Amellett, hogy a vesefunkciós paraméterek javulását mutatta, az STS-kiegészítés gátolta a vese graft apoptózisát és gyulladását is azáltal, hogy csökkentette a pro-apoptotikus és pro-inflammatorikus gének szöveti expresszióját, miközben egyidejűleg fokozta az antiapoptotikus gének szabályozását és csökkentette a CD68-pozitív makrofágok és MPO-pozitív neutrofilek, amelyek összességében csökkent KIM{5}} expressziót és ATN-t eredményeztek, és végül megőrizték a vese morfológiáját. Ezekről a gyulladásos citokinekről ismert, hogy a sejthalál közvetítői a hideg IRI során [31], és az UW plusz STS graftokban való csökkenésük valószínűleg az STS jól ismert tulajdonságainak köszönhető, hogy csökkentik az endothel permeabilitását vaszkuláris endoteliális monorétegben, gyengítik a citokintermelést. , és gyulladásgátló citokinek termelését váltják ki [32]. Ezen túlmenően az a megállapításunk, hogy az STS-kiegészítés UW-oldattal csökkenti a gyulladást elősegítő gének expresszióját, megegyezik egy korábbi, az STS gyulladáscsökkentő aktivitását vizsgáló tanulmány eredményeivel azáltal, hogy csökkenti a TNF- és IL{13}} szintjét neurológiai betegségekben [33] ,34]. Mechanikailag az STS inaktiválja a kaszpázt-3 azáltal, hogy erős hidrogénkötéseken keresztül kapcsolódik az aktív helyéhez, és ezáltal megakadályozza a természetes szubsztrát hozzáférését az aktív helyhez, végső soron megállítva az apoptózist [35]. Az STS emellett blokkolja a JNK aktiválását is, egy olyan fehérjét, amely kritikus szerepet játszik az apoptotikus jelátvitelben [35], ami alátámasztja az STS kaszpáz3-ra és JNK-ra gyakorolt ​​csökkentő hatására vonatkozó megállapításunkat. Azonban nem tudjuk megállapítani, hogy az ilyen mechanizmusok működőképesek-e jelen tanulmányban, mivel nem végeztünk további kísérleteket ezen molekuláris mechanizmusok feltárására.

In vitro kísérletünk fő korlátja az a technikai kihívásunk, hogy a jelenlegi 4 ◦C-os standard tartósítási hőmérsékletet használjuk [36], mivel az általunk használt 10 ◦C volt a legalacsonyabb hőmérséklet, amely technológiailag elérhető a hipoxiás környezet veszélyeztetése nélkül. Ez igazi különbség a sejtfiziológiai folyamatok és a tartósítási technikák tekintetében is. Egy lehetséges megoldás a kémiailag kiváltott hipoxia használata műanyag zacskóban, és 4 ◦C-os hűtőszekrénybe helyezése, hogy tükrözze az SCS klinikai beállításait. Ezeket az anaerob atmoszférát generáló zsákokat azonban meleg hőmérsékleten (21–37 ◦C) történő használatra tervezték, mivel a hipoxiás környezetet kiváltó kémiai vegyületek ilyen körülmények között működnek. A jövőbeni vizsgálatok célja a hipoxiás kamra hőmérsékletének optimalizálása a klinikai SCS-beállítások utánzása érdekében. Az állandó 4 ◦C hőmérséklet elérése a hipoxiás környezet veszélyeztetése nélkül lehetővé teszi számunkra annak meghatározását, hogy a kísérleti in vitro hideg IRI modellben megfigyelt fenotípusok következetesen expresszálódnak-e. Az in vitro kísérleten kívül a patkánytranszplantációs modellünk sem mentes a hátrányoktól. Szingenikus vesetranszplantációt végeztünk (genetikailag azonos donorok és immunológiai kompatibilitású recipiensek), amely klinikai vesetranszplantációban csak egypetéjű ikreknél alkalmazható, míg a klinikai vesetranszplantációk többsége allogén (genetikailag különböző donorok és recipiensek). Az allogén transzplantáció arra kényszeríti a transzplantált recipienseket, hogy a transzplantáció előtt immunológiai vizsgálatokat végezzenek, hogy azonosítsák a donor humán leukocita antigénjeit (HLA; immunválaszt indukáló és szabályozó molekulák), meghatározzák a donorok és a recipiensek immunológiai kompatibilitását, és elkerüljék a szervkilökődést [37, 38]. Az STS-t használó jövőbeni vizsgálatoknak figyelembe kell venniük az allogén transzplantációt. Egy másik korlátot jelentő vesetranszplantációs modell az a tény, hogy az élő donorokra összpontosítottunk, a szívhalál utáni adományozásból származó, szuboptimális graftok (DCD) egyre gyakoribbak a donor veséjének forrásaként világszerte számos transzplantációs központban [39]. A DCD az SCS alatti hideg ischaemiás időszakok mellett a donor szerveket különböző meleg ischaemiás periódusoknak teszi ki, és az élő donorokhoz képest megnövekedett DGF-aránnyal és csökkent graft-túléléssel jár [40]. Ezért a jövőbeni tanulmányoknak figyelembe kell venniük a DCD veseátültetési modellt, hogy értékeljék az STS IRI elleni hatását ebben a modellben.

Összefoglalva, tanulmányunk azt mutatja, hogy a standard tartósító oldat kiegészítése klinikailag életképes H2S donor gyógyszerrel a vesegraftok hosszan tartó SCS-je során védelmet nyújt a transzplantáció által kiváltott hideg vese IRI ellen, javítja a graft általános minőségét és funkcióját, és meghosszabbítja a transzplantált recipiens túlélését. Figyelembe véve, hogy a klinikai vesetranszplantáció során a hideg ischaemiás idő elhúzódásával a DGF kockázata növekszik, ami komoly klinikai aggályt vet fel, az a megfigyelés, hogy az STS megvédi a vesegraftokat a hosszan tartó SCS során, és megakadályozza a DGF-et a transzplantáció után, nagy klinikai ígéret, amely csökkentheti vagy megelőzheti a veseátültetést. a DGF előfordulása klinikai vesetranszplantációban a közeljövőben. Így az STS megőrzési megoldásokhoz való hozzáadásának jövőbeli előnye potenciális megoldást jelenthet erre a folyamatban lévő problémára. Összességében ez a tanulmány kiegészíti az STS és más H2S donorok citoprotektív hatásait az IRI-vel szemben, különösen a transzplantáció által kiváltott hideg vese IRI-ben. Ezek a stratégiák megkönnyíthetik a hosszabb hideg ischaemiás időnek kitett graftok használatát, ami növelheti a transzplantálható szervek készletét.

CRediT szerzői hozzájárulási nyilatkozat

Minden szerző beleegyezett e kézirat benyújtásához. Nincs összeférhetetlenség.

Hivatkozások

[1] RA Wolfe, VB Ashby, EL Milford és munkatársai, Összehasonlítás az összes dializált betegnél, a transzplantációra váró dialízisben részesülő betegeknél és az első holttest-transzplantációt átvevő recipienseknél, New Engl. J. Med. 341 (23) (1999) 1725–1730.

[2] M. Tonelli, N. Wiebe, G. Knoll és munkatársai, Szisztematikus áttekintés: veseátültetés összehasonlítása dialízissel klinikailag releváns eredményekben, Am. J. Transpl. 11 (10) (2011) 2093–2109.

[3] MC Cavallo, V. Sepe, F. Conte és munkatársai, Cost-effectiveness of vesetransplantation from DCD in Italy, Transplant. Proc. 46 (10) (2014) 3289–3296.

[4] B. Dorweiler, D. Pruefer, TB Andrasi, SM Maksan, W. Schmiedt, A. Neufang, CF Vahl, Ischaemia-reperfúziós sérülés, Eur. J. Trauma Emerg. Surg. 33. (6) (2007) 600–612.

[5] EE Guibert, AY Petrenko, CL Balaban, AY Somov, JV Rodriguez, BJ Fuller, Szervmegőrzés: jelenlegi koncepciók és új stratégiák a következő évtizedre, Transfus. Med. Hemother. 38. (2) (2011) 125–142.

[6] AK Salahudeen, N. Haider, W. May, Cold ischaemia és a cadaveric renális allograftok csökkent hosszú távú túlélése, Kidney Int. 65 (2) (2004) 713–718.

[7] I. Quiroga, P. McShane, DD Koo és munkatársai, Major effects of delayed graft function and cold ischaemia time on renalis allograft survival, Nephrol. Tárcsa. Transzplantáció. 21 (6) (2006) 1689–1696.

[8] LK Kayler, J. Magliocca, I. Zendejas, TR Srinivas, JD Schold, Impact of cold ischaemia time on graft survival among ECD transzplantált recipiensek: a paired vese analysis, Am. J. Transzplantáció. 11 (12) (2011) 2647–2656.

[9] MD Doshi, N. Garg, PP Reese, CR Parikh, Recipiens rizikófaktorok a késleltetett graftfunkcióval kapcsolatban: páros veseelemzés, Transplantation 91 (6) (2011) 666–671.

[10] A. Debout, Y. Foucher, K. Tr´ebern-Launay és munkatársai, Minden további órányi hideg ischaemia jelentősen megnöveli a graft elégtelenségének és a veseátültetést követő mortalitásnak a kockázatát, Kidney Int. 87 (2) (2015) 343–349.

[11] A. Kezic, I. Spasojevic, V. Lezaic, M. Bajcetic, Mitochondria-targeted antioxidants: future perspectives in vese ischaemia-reperfusion damage, Oxid. Med. Longev sejt. 2016 (2016) 2950503.

[12] TI ​​Peng, MJ Jou, Mitokondriális kalcium-túlterhelés által okozott oxidatív stressz, Ann. NY Acad. Sci. 1201 (2010) 183–188.

[13] W. Jassem, SV Fuggle, M. Rela, DD Koo, ND Heaton, The role of mitochondria in ischaemia/reperfusion damage, Transplantation 73 (4) (2002) 493–499.

[14] PM Snijder, E. van den Berg, M. Whiteman, SJ Bakker, HG Leuvenink, H. van Goor, Emerging role of gasotransmitters in renalis transplantation, Am. J. Transzplantáció. 13 (12) (2013) 3067–3075.

[15] JT Hancock, M. Whiteman, Hidrogén-szulfid és sejtjelzés: csapatjátékos vagy játékvezető? Plant Physiol. Biochem. 78 (2014) 37–42.

[16] W. Zhao, J. Zhang, Y. Lu, R. Wang, A H(2)S érrelaxáns hatása mint új endogén gáz alakú K(ATP) csatornanyitó, EMBO J. 20 (21) (2001) 6008–6016.

[17] I. Lobb, M. Davison, D. Carter és munkatársai, A hidrogén-szulfidos kezelés enyhíti a vese allograft ischaemia-reperfúziós sérülését a hideg tárolás során, és javítja a korai transzplantált veseműködést és az allogén vesetranszplantációt követő túlélést, J. Urol. 194 (6) (2015) 1806–1815.

[18] I. Lobb, A. Mok, Z. Lan, W. Liu, B. Garcia, A. Sener: A kiegészítő hidrogén-szulfid védi a transzplantált veseműködést, és meghosszabbítja a recipiens túlélését hosszan tartó hideg ischaemia-reperfúziós sérülés után a vesegraft apoptózis mérséklésével és gyulladás, BJU Int. 110 (11 Pt C) (2012) E1187–E1195.

[19] I. Lobb, J. Jiang, D. Lian és munkatársai, A hidrogén-szulfid specifikus mitokondriális hatások révén védi a vesegraftokat a hosszan tartó hideg ischaemia-reperfúziós sérülésektől, Am. J. Transzplantáció. 17. (2) (2017) 341–352.

[20] C. Renard, SW Borron, C. Renaudeau, FJ Baud, Nátrium-tioszulfát akut cianidmérgezésre: patkánymodellben végzett vizsgálat, Ann. Pharm. Fr. 63. (2) (2005) 154–161. [21] N. Laplace, V. Kepenekian, A. Friggeri és munkatársai, A nátrium-tioszulfát megvéd a vesekárosodástól a ciszplatinnal végzett hiperterm intraperitoneális kemoterápia (HIPEC) után, Int. J. Hyperth. 37. (1) (2020) 897–902.