Wen-Lan Li, Jing-Xin Ding, Jing Bai, Yang Hu, Hui Song, Xiang-Ming Sun, Yu-Bin Ji

További információért forduljon:Joanna.jia@wecistanche.com

Absztrakt

Az LC technológia világszerte elismert módszer a hagyományos kínai gyógyszerek (TCM) minőségének értékelésére. A TCM minősége közvetlen hatással van a hatékonyságára. Ezért ahhoz, hogy alaposan feltárjuk, hogyan fejti ki hatását a TCM, mindenekelőtt meg kell érteni hatékonyságának anyagi alapját, majd ellenőrizni kell a hatóanyagok minőségét. A spektrum-hatás összefüggés módszer alkalmazása döntő jelentőségű a farmakológiai anyagi alap meghatározásában. A cikk célja az volt, hogy megvizsgálja a mögöttes összefüggéseket a kémiai profilok és az ösztrogén aktivitás között.Cistanche, hogy felfedje a hatóanyagokat. A kémiai profilokCistancheHPLC/Q-TOF-MS/MS alkalmazásával rögzítettük, és az ösztrogén aktivitást a méhnövekedési teszttel és az MTT vizsgálattal határoztuk meg. Ezután a kétváltozós analízis, a főkomponens-analízis és a szürke korrelációs analízis eredményeit kombinálva tizenöt hatóanyagot azonosítottunk. Ezek a következők: 8-epilogánsav, szalidrozid, sziringalid A 3'- -l-ramnopiranozid, cisztanozid A, echinakozid, cisztanozid F, cisztanozid B, cisztanozid C, ozmantusid B, akteozid, izoakteozid, tubulozid B, 2 '-acetil-lakteozid és két ismeretlen vegyület. Ez a tanulmány megalapozza az in vivo vizsgálatokatCistanche, valamint klinikai alkalmazásának fejlesztésére.

Cistanchetubulosa

Kulcsszavak:Cistanchedeserticola; LC/Q-TOF-MS; ösztrogén aktivitás; főkomponens-elemzés (PCA); Méh növekedési teszt.

Rövidítések

TCM: Hagyományos Kínai Orvoslás

HPLC/Q-TOF-MS: Nagy teljesítményű folyadékkromatográfia/kvadrupólus repülési idő tömegspektrometria

BA: kétváltozós elemzés

PCA: főkomponens-elemzés

GCAM: szürke korrelációs elemzési módszer

MTT: Tripszin, 3-(4, 5-Dimetil-tiazol-2-il)-2, 5-difenil-tetrazoliumbromid

DMSO: dimetil-szulfoxid

RPMI1640 Roswell Park Memorial Institute 1640

1. Bemutatkozás

A közelmúltban a TCM egyre népszerűbb az ázsiai és nyugati országokban stabil terápiás hatásai és klinikailag alacsony toxicitása miatt. Ennek eredményeként új típusú TCM kifejlesztésére van szükség, és meg kell érteni a klinikai alkalmazásuk során használt hatékony készítményeket [1-6].

Először is a spektrum-hatás összefüggést tanulmányozzuk, hogy megállapítsuk a kromatográfiás ujjlenyomat és a farmakodinamikai hatékonyság közötti összefüggést. Ezután a kapcsolat segítségével hatékony komponenseket keresünk a TCM-ben, és szabályozási szabványokat fogalmazunk meg, amelyek tükrözik azok belső minőségét. A spektrum-hatás összefüggést a TCM-kutatás számos területén alkalmazták, mint például az egyszeri és összetett TCM anyagi alapjai, az összetevők kompatibilitása, a feldolgozási mechanizmus, a farmakológiai hatás előrejelzése és a technológia optimalizálás [7-12]. A spektrum-hatás összefüggést új ötletek és módszerek előterjesztésére használják a hatóanyagok feltárására, a formulák optimalizálására, az elkészítési folyamatok javítására, a célösszetevők nyomon követésére és elkülönítésére, valamint új TCM-gyógyszerek kifejlesztésére [13-17].

Cistancheszéles körben alkalmazzák szexuális zavarok, székrekedés, prosztatagyulladás és veseelégtelenség kezelésére. Bioaktivitások széles spektrumával rendelkezik, beleértve az ösztrogén hatást, az öregedésgátlót, az antioxidáns hatást és az immunrendszert [18-19]. Általában a fenil-etanoid glikozidokat (például a cisztanozid A, a tubulozid A), a lignánokat és az iridoid glikozidokat farmakológiai összetevőknek és kémiai markereknek tekintették a Cistanche és termékei minőségellenőrzéséhez [20-21]. A Cistanche különböző területekről származó kémiai spektrumait nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával (HPLC) [22-23] rögzítettük. Ebben a vizsgálatban a méhnövekedési tesztet és az MCF7 sejtproliferációs tesztet választjuk ki az ösztrogén aktivitásuk értékelésére. Az ösztrogénaktivitás és az egyes komponensek közötti korrelációhoz főkomponens-analízist, kétváltozós elemzést és szürke korrelációs analízist alkalmaztunk. Ennek a tanulmánynak az volt a célja, hogy azonosítsa a Cistanche bioaktív vegyületeit, amelyek felelősek az in vivo ösztrogén hatásokért. A tanulmány megalapozza a Cistanche mélyreható tanulmányait.

Minden kísérleti eljárást felülvizsgált és jóváhagyott a Harbini Kereskedelmi Egyetem Állat-etikai Bizottsága.

CistancheA deserticolát (cd{0}}) a gyógyszerpiacról vásárolták, és Prof. Zhang Delian (Harbin University of Commerce) azonosította. A dietil-stilbesztrolt a HEFEI JIULIAN PHARMACEUTICAL CO., LTD-től vásároltuk. A fenolvörös nélküli RPMI1640-et és az RPMI1640-t a HyClone Company-tól (USA) vásároltuk. Az MTT-t és a DMSO-t a Sigma-Aldrich Co. LLC-től (St Louis, USA) vásároltuk. Az emberi emlőrák MCF7 sejtvonalat az Élettudományi és Környezettudományi Kutatóközpont (Harbin University of Commerce) biztosította. A használt szabványok a következők voltak: az akteozidot (111530- 200505), az echinakozidot (111670-200503) és a szalidrozidot (110736-200628) a Nemzeti Gyógyszerészeti és Biológiai Termékek Ellenőrzési Intézettől (Peking) szerezték be. , Kína). Az acetonitril, a metanol és a hangyasav MS-minőségű, míg a víz ultratiszta. Más reagensek analitikai minőségűek voltak, és kereskedelmi forgalomban voltak.

2 Kísérleti eljárás

2.1 Anyagok

Az Agilent 1290 HPLC rendszert, az Agilent 6530 Series Quadrupol Time-of-Flight LC/MS (Q-TOF) rendszert és a Chemical HPLC{5}}D munkaállomásokat használták az analitikai kémiai kísérletekhez és az adatfeldolgozáshoz. A minták és standardok elkészítéséhez Milli-Q ultratiszta vizet használtunk. A további műszerek közé tartozott az elektronikus Analytical Balance AR1140 (Ohaus International Ltd), a 680 Microplate Reader (Bio-Rad Corporation) és a 64R nagysebességű centrifuga (Beckman Coulter Allegra).

A Changchun National Biological Industry Base Laboratory Animal Centertől (Changchun, Kína) 12 ± 2 g súlyú, éretlen nőstény Kunming egereket (körülbelül 21 nap születési idővel, elválasztva) vásároltunk. Az egereket szabályozott hőmérsékletű helyiségben (22 ± 2 °C) tartottuk, ahol korlátlanul hozzáfértek az élelemhez és a vízhez. Az állatkísérleteket öt nap akklimatizáció után kezdtük meg. Az egereket egy éjszakán át éheztettük, és szabad hozzáférést kaptak a vízhez, mielőtt a tesztoldatokat beadtuk. Ezt a vizsgálatot szigorúan a National Institutes of Health Laboratóriumi Állatok gondozási és használati útmutatója ajánlásaival összhangban végezték.

2.2. A mintaoldat elkészítése

Cistanchemintákat tíz különböző élőhelyről gyűjtöttek, nevezetesen Neimeng, Xinjiang, Ningxia, Guizhou, Chaidamu, Xizang, Alashan, Qinghai, Sichuan és Hubei tartományból.

Az oldat (1.0 g/ml) aCistancheA mintát desztillált vízben készítettük orális adagolásra. A dietil-stilbösztrol koncentrációja 20 ug/ml volt, és pozitív kontrolloldatként használtuk. A Cistanche-minta oldatát (1.{5}} g/ml) 50 százalékos acetonitrilben készítettük. Akteozidot, echinakozidot és szalidrozidot (2,0 mg) 10 ml 50%-os acetonitril-oldatban oldunk. A mintát és a standard oldatot is 045-μm-es szűrővel szűrtük az elemzés előtt.

2.3 LC-MS körülmények

A minták elemzéséhez Waters Symmetry Shield RP18-at (3,9 mm × 15{5}} mm, 5 μm; Waters Corporation, Milford, MA, USA) használtunk. A mozgó fázis acetonitrilből (A) és 0,2%-os (v/v) vizes hangyasavoldatból (B) állt, és 0,5 ml/perc áramlási sebességgel szivattyúzzuk. Mindegyik minta befecskendezett térfogata 10 μl volt. A gradiens elúciós program a következő volt: Az A mozgófázis 5%-nál indult, és 35 perc után lineárisan 23%-ra nőtt. Az A oldat koncentrációját ezt követően 25%-ra növeltük (35-65 perc). Az A mozgó fázist ezután 5 százalékra csökkentettük a futás utolsó 5 percében (65-70 perc). Az oszlop hőmérsékletét 30 °C-on tartottuk. A kromatogramokat 254 nm-en követtük. A porlasztógáz nyomása 30 psi, a kapilláris feszültsége 3,5 kV. A száraz gáz áramlási sebességét 8 l/perc értékre állítottuk be 30 fokos hőmérsékleten. A tömegspektrumokat a 100- 3,000 Da pásztázási tartományon belül vették fel, és negatív ionos pásztázási módban voltak.

2.4 Ujjlenyomat-értékelés

A 10 különböző tételből gyűjtött minták LC-ujjlenyomatait a TCM kromatográfiás ujjlenyomatainak hasonlóság-értékelő rendszere (2012-es verzió; Kínai Gyógyszerkönyvi Bizottság, Peking, Kína) segítségével automatikusan összeállítottuk és egyeztettük. Továbbá a referencia kromatogram térképet medián módszerrel állítottuk elő. Ezenkívül klaszteranalízist alkalmaztak a tíz különböző élőhelyről származó minták minőségének értékelésére.

2.5 Főkomponens-elemzés (PCA)

A PCA egy többváltozós statisztikai módszer. Az adatgyűjtésből elegendő információt tud megőrizni. Jelen tanulmányban az LC kromatogramok jellegzetes csúcsait tovább szűrtük PCA-val, és a spektrum-hatás összefüggés alapján kívántuk azonosítani a hatóanyagokat.

2.6 Méhnövekedési teszt

Az egereket 12 csoportra osztották (csoportonként 1 0). A Cistanche-ból készített mintaoldatokat tíz különböző élőhelyről gyűjtöttük össze, és naponta kétszer (reggel és este) adtuk be szondán keresztül, 30 g/ttkg dózisban négy napon keresztül. A vak és a pozitív kontrollcsoport azonos térfogatú desztillált vizet és dietil-stilboösztrol oldatot tartalmazott, és naponta kétszer adtuk be négy napon keresztül. Az ötödik napon a gyógyszert tartalmazó vérmintákat vettük az érzéstelenített egerekből. A mintákat centrifugáltuk (5, 000 rpm, 10 perc), és a felülúszókat (gyógyszertartalmú szérumminták) elválasztottuk. A gyógyszertartalmú szérummintákat 56 fokos vízfürdőben 30 percig történő melegítéssel inaktiváltuk, majd 022-μm-es szűrőn átszűrtük az MTT vizsgálat előtt. Ezzel egyidejűleg az egerek méhét azonnal kimetsszük és lemérjük, hogy kiszámítsuk a méhtömeg-indexeket. Az állatkísérleteket öt nap akklimatizáció után kezdtük meg. Az egerek egy éjszakán át éheztek, és szabadon hozzáfértek a vízhez a tesztoldatok beadása előtt. A jelen vizsgálatot szigorúan az Országos Egészségügyi Intézetek Laboratóriumi Állatok gondozási és használati útmutatója ajánlásaival összhangban végeztük. Minden kísérleti eljárást felülvizsgált és jóváhagyott a Harbini Kereskedelmi Egyetem Állat-etikai Bizottsága. Minden potenciálisan stresszes eljárást nátrium-pentobarbitál érzéstelenítésben végeztünk.

2.7 MTT vizsgálat

Az MCF7 sejteket RPMI 1640-nel együtt tenyésztettük fenolvörös nélkül (5% CDT-FBS-t tartalmazott) négy napon át. A sejteket 96-lyuklemezekre oltottuk 2,000 sejt/lyuk sűrűséggel. Tapadó tenyészetet értünk el, és 72 órás tenyésztést követően a sejteket együtt tenyésztettük RPMI 1640 táptalajban, amely Cistanche-kezelt egerekből származó szérummintákat tartalmazott. A kísérleteket hat ismétlésben végeztük. Ezt követően 20 μl MTT-oldatot (5 mg/ml PBS-ben) adtunk minden egyes lyukba, és a sejteket 4 órán át inkubáltuk. A táptalaj eltávolítása után 150 µl DMSO-t adtunk hozzá a formazán-termék előállításához, és a lemezeket sötétben rázattuk, hogy teljesen feloldódjanak. Az abszorbanciát 570 nm-en mértük Microplate Reader segítségével. A proliferációs sebességet úgy számítottuk ki, hogy a gyógyszert tartalmazó szérumcsoport átlagos abszorbancia értékét osztva a vak kontrollcsoport (szérum nélküli RPMI 1640-ben együtt tenyésztett sejtek) átlagos abszorbancia értékével.

2.8 Statisztikai elemzés

A páros mintás t-próbát (kétfarkú) használtuk a vak kontroll és kísérleti csoportok értékei közötti statisztikailag szignifikáns különbségek azonosítására. A különbségeket 95 százalékos konfidenciaszinten tekintettük szignifikánsnak (p <>

PCA-t használtunk a jellemző csúcsterületek értékelésére tíz különböző élőhelyről származó minták kromatogramjaiban. A csúcsterületek és azok ösztrogén aktivitásának korrelációjának felmérésére kétváltozós elemzést és Gray-korrelációs analízist alkalmaztunk. A korrelációt az SPSS statisztikai szoftver statisztikái (SPSS for Windows 21.0, SPSS Inc., USA) számították ki. A különbségeket 95 százalékos megbízhatósági szinten (kétirányú) tekintettük szignifikánsnak.

Etikai jóváhagyás: Az elvégzett kutatás nem kapcsolódik sem emberi, sem állati felhasználáshoz.

3. Eredmények és megbeszélés

3.1 Klaszterelemzés és hasonlóságértékelés

A retenciós idő és a jellemző csúcsok csúcsterületének relatív szórása {{0}},58 és 0,34 százalék volt a pontosságnál, 0,52 és {{8} },31 százalék a reprodukálhatóság, és {{10}},19 és 0,13 százalék a stabilitás. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy az ujjlenyomat megállapítására alkalmazott LC módszerünk ésszerű és megbízható. Tíz minta kromatogramjainak hasonlósága nagyobb volt, mint 0,9. Az összes minta közös csúcsai nem képviselték teljes mértékben a Cistanche jellemző összetevőit, mivel a csúcs elveszhetett volna. Ezért a mintaillesztési számot 26-ról 20-ra állítottuk, hogy pontosabb kromatogram-térképet kapjunk. Összesen 26 csúcsot kaptunk, és területük összege nagyobb volt, mint 0,8 a minta teljes csúcsterületéhez képest. Ezért arra a következtetésre jutottunk, hogy ezek a kromatográfiás csúcsok hatékonyan tükrözhetik a Cistanche fő kémiai összetevőit. A klaszteranalízis eredményeit az 1. ábra mutatja. Összesen tíz változatos élőhelyet osztottak három kategóriába az alábbiak szerint: (A) 2, Guizhou; 3, Qinghai; 4, Chaidamu; 10, Neimeng; 7, Xinjiang és 6, Sichuan. (B) 1, Xizang; 8, Ningxia és 5, Alashan. (C) 9, Hubei. A klaszteranalízis tendenciája azt mutatta, hogy a gyógynövények élőhelyei hasonlóak a küszöb alján. De a küszöb emelkedésével az élőhelyek éghajlati és növekedési feltételei közel vannak. Megmutatja, hogy a klaszteranalízis nemcsak jól megkülönbözteti a változatos élőhelyeket, hanem tükrözi a köztük lévő affinitásokat is.

3.2 A kémiai összetevők azonosítása

Based on the synergy between components, TCM exerted pharmacological effects. Certain studies have been conducted to identify the chemical compositions of C. deserticola [24-26]. The correlation of inherent constituents with their activities indicated that they could be identified based on the combination of LC with the corresponding indices of pharmacological activity. Q-TOF-MS is suitable for multi-constituent identification of TCM since it can provide the exact molecular mass because of its high resolution. A total of 26 compounds were identified by analyzing the primary and secondary MS data. PCA was used to assess whether these compounds concerning their oestrogenic activity. A contribution of the activity is indicated by an eigenvalue higher than 1 (> 1) and a cumulative contribution rate of variables higher than 0.8 (>0.8). Minél magasabb az Eigen terhelés abszolút értéke, annál nagyobb a vegyületek hatása az ösztrogén indexekre.

A Cistanche és a standard minták kromatogramjait összehasonlítottuk az egyes komponensek azonosítása érdekében azonos LC-MS körülmények között. Amint az 1. táblázatban látható, összesen 26 összetevőt azonosítottak a retenciós idő és az MS adatok alapján [24-26]. A hatóanyagokat orálisan keverékek formájában adják be monomerek helyett, mivel a hagyományos kínai orvoslás keverék formájában terápiás szerepet tölt be. Egyetlen vegyület egyéni elválasztása után nem játszott szerepet. Célunk olyan vegyületek feltárása, amelyek ösztrogén hatással rendelkeznek a Cistanche [23-30] ismert komponenseiben, és ezért nem választottak NMR-t és más technikai eszközöket azonosságuk igazolására. Az 1. csúcs egy domináns deprotonált iont jelez, m/z aránya 373 (C16H22O10), ami megegyezik a genipozidsav elemi összetételével. Ezt támasztotta alá egy glükózrész elvesztése, amely 211 m/z arányú fragmensiont eredményezett. A 2. csúcs egy túlnyomórészt deprotonált iont jelez, m/z aránya 461 (C20H30O12), ami megegyezett az elemi összetétellel. dekoffeoil-lakteozid, és ezt egy ramnozil-rész elvesztése támasztotta alá, 315 m/z arányú fragmentációt hozva létre. A 4. csúcs egy domináns deprotonált iont jelez, m/z aránya 375 (C16H24O10), ami megegyezett a az 8-epilogánsav elemi összetétele. A glükóz rész elvesztése, amely fragmentációt képezett 213 m/z aránnyal, tovább erősítette a következtetést. A 6. csúcs egy domináns deprotonált iont jelez, m/z aránya 607 (C29H36O14), ami megegyezik a sziringalid A3'- - l-ramnopiranozid elemi összetételével.

A 445 m/z arányú fragmensiont képező caff-rész elvesztése tovább erősítette a következtetést. A 8. csúcs egy túlnyomórészt deprotonált iont jelez, m/z aránya 799 (C36H48O20), ami megegyezik a cisztanozid A elemi összetételével. Egy caff-rész elvesztésével 637 m/z arányú fragmension keletkezett. tovább támasztotta a következtetést. A 11. csúcs egy domináns deprotonált iont jelez, m/z aránya 487 (C21H28O13 ), ami megegyezett a F cisztanozid elemi összetételével. Ezt támasztotta alá egy ramnozil rész elvesztése, amely m/z értékű fragmensiont eredményezett. aránya 341, és egy másik caff-rész elvesztése 179 m/z arányú fragmensiont képezett, ami tovább támasztotta a következtetést. A 12. csúcs egy domináns deprotonált iont jelez, m/z aránya 813 (C37H50O20), ami megegyezett a cisztanozid B elemi összetételével. Egy glükózrész elvesztésével 651 m/z arányú fragmension keletkezett, tovább támasztotta a következtetést. A 13. csúcs egy domináns deprotonált iont jelez, m/z aránya 827 (C37H48O21), ami megegyezett a tubulozid A elemi összetételével. A ramnozil rész elvesztése 681 m/z arányú fragmentációt eredményezett. alátámasztotta a következtetést. A 14. csúcs egy domináns deprotonált iont jelez, m/z aránya 637 (C30H38O15), ami megegyezett a cisztanozid C elemi összetételével. Egy ramnozil-rész elvesztésével 491 m/z arányú fragmension keletkezett. tovább támasztotta a következtetést.

A 15. csúcs egy túlnyomórészt deprotonált iont jelez, m/z aránya 591 (C29H36O13), ami megegyezett az ozmantusid B elemi összetételével. A ramnozil-rész elvesztésével 445 m/z arányú fragmension keletkezett. tovább támasztotta a következtetést. A 16. csúcs egy domináns deprotonált iont jelez, m/z aránya 623 (C29H36O15), ami megegyezett az akteozid elemi összetételével. A 461 m/z arányú fragmensiont képező caff-rész elvesztése tovább támasztotta a következtetést. A 18. csúcs egy domináns deprotonált iont jelez, m/z aránya 623 (C29H36O15), ami megegyezett az izoakteozid elemi összetételével. A caff-rész elvesztése, a 15. előcsúcs egy túlnyomórészt deprotonált iont jelez, m/z aránya 591 (C29H36O13), ami megegyezett az ozmantusid B elemi összetételével. A ramnozil-rész elvesztése egy fragmensiont képezett m/z aránya 445, tovább támasztotta a következtetést. A 16. csúcs egy domináns deprotonált iont jelez, m/z aránya 623 (C29H36O15), ami megegyezett az akteozid elemi összetételével. A 461 m/z arányú fragmensiont képező caff-rész elvesztése tovább támasztotta a következtetést. A 17. csúcs egy domináns deprotonált iont jelez, m/z aránya 623 (C29H36O15), ami megegyezik a cisz-akteozid elemi összetételével. A 461 m/z arányú fragmens jód és fragmension elvesztése tovább erősítette a következtetést. A 21. csúcs egy domináns deprotonált iont jelez, m/z aránya 653 (C30H38O16), ami megegyezik a campneozid Ⅰ elemi összetételével.

Egy caff-rész elvesztése 491 m/z arányú fragmensiont, egy másik ramnozil-rész elvesztése pedig 345-ös m/z-arányú fragmensiont képezett, ami tovább támasztja a következtetést. A 22. csúcs egy túlnyomórészt deprotonált iont jelez, m/z aránya 665 (C31H38O16), ami megegyezett a tubulozid B elemi összetételével. Egy CH3CO-rész elvesztése 623 m/z arányú fragmensiont eredményezett. és egy másik caff-rész elvesztése 461 m/z arányú fragmentiont képezett, ami tovább támasztja a következtetést. A 23. csúcs egy domináns deprotonált iont jelez, m/z aránya 639 (C29H36O16), ami megegyezik a campneozid elemi összetételével. A 493 m/z arányú fragmensiont képező ramnozil-rész elvesztése tovább erősítette a következtetést. A 24. csúcs egy domináns deprotonált iont jelez, m/z aránya 665 (C31H38O16), ami megegyezik a 2'-acetil-lakteozid elemi összetételével. Egy Ac-rész elvesztése 623 m/z arányú fragmensiont, egy másik caff-rész elvesztése pedig 461 m/z-arányú fragmensiont képezett, ami tovább támasztja a következtetést. A 25. csúcs egy domináns deprotonált iont jelez, m/z aránya 445 (C20H30O11), ami megegyezik a cisztanozid G elemi összetételével. Egy ramnozil-rész elvesztésével 299 m/z arányú fragmension keletkezett. tovább támasztotta a következtetést. A vegyületek szerkezetét a 2. ábra sorolja fel.

3.3 PCA

As shown in Table 2, the eigenvalues of the first eight principal components were higher than 1(> 1), and the cumulative contribution rate of the first six principal components was 93.417%. Therefore, the first six principal components were evaluated further. Table 2 indicates their eigenvalues and factor loadings. The first principal component exhibited a higher load based on the eigenvalues of the eight peaks (>0.9). Ezek a csúcsok a következők voltak: 9, 12, 14 és 15. Következésképpen az echinakozidot, a cisztanozid B-t, az ozmantusid B-t és az akteozidot, amelyek összesen 4 csúcsnak felelnek meg, az ösztrogén aktivitás reprezentatív változóiként választották ki (3. ábra).

.

3.4 Az ösztrogén aktivitás meghatározása

Kiszámoltuk a méh nedves tömegének és az egyes egerek testtömegének arányát (4. ábra). A Cistanche-nak kitett állatok kilenc élőhelyről jelentős ösztrogén aktivitást mutattak azáltal, hogy megnövelték a méh tömegét az üres kontrollcsoport egereihez képest. A 4. ábra bemutatja továbbá a Cistanche-kezelt egerek szérumával kezelt MCF7 sejtek proliferációs sebességét. Azok az egerek szérumával kezelt sejtek, amelyeknek tíz élőhelyről Cistanche-t adtak be, szignifikánsan nagyobb növekedést mutattak a kezeléstől mentes sejtekhez képest.

3.5 Kétváltozós elemzés

Jelen tanulmányban megfigyeltük, hogy az éretlen nőstény Kunming egerek méh súlya megnőtt, és elősegítette az MCF7 humán emlőráksejtek proliferációját. Ezek az eredmények igazolták a Cistanche ösztrogén aktivitását. Az 5. ábra ezen összetevők méhindexeit és MCF7 sejtproliferációs rátáját mutatja. A relatív csúcsterületek kiszámításához Pearson-féle korrelációs együtthatót használtunk, amely megfelelt a minták ösztrogén aktivitásának. A 0,3-nál magasabb korrelációs együtthatók szignifikánsnak (p < 0.05),="" míg="" a="" 0,5-nél="" magasabb="" korrelációs="" együtthatók="" nagyon="" szignifikánsnak="" (p)="">< 0,01).="" az="" eredmények="" alapján="" kimutatták,="" hogy="" a="" cistanche="" ösztrogén="" aktivitással="">

Összesen kilenc vegyület korrelált szignifikánsan a méh tömegének növekedésével (p < {0}},05),="" míg="" tíz="" vegyület="" szignifikánsan="" korrelált="" az="" mcf7="" sejtproliferációval="" (p="">< 0,05).="" azok="" a="" vegyületek,="" amelyek="" szignifikánsan="" korreláltak="" a="" méh="" tömegével="" és="" a="" sejtproliferációval:="" 8-epilogánsav,="" szalidrozid,="" sziringalid="" a3'-="" -="" l-ramnopiranozid,="" cisztanozid="" a,="" cisztanozid="" b,="" cisztanozid="" c,="" ozmantusid="" b,="" akteozid,="" izoakteozid,="" tubulozid="" b,="" 2'-acetil-lakteozid="" és="" két="" ismeretlen="" vegyület="" (5.="" ábra).="" ez="" a="" tizenhárom="" vegyület="" ösztrogén="" hatást="" fejtett="">

3.6 Szürke korrelációs elemzési módszer

A 6. ábra 26 vegyület jellemző csúcsainak relatív korrelációját mutatja a méhindexekkel, a 7. ábra pedig a 26 vegyület jellemző csúcsainak relatív korrelációját mutatja a sejtproliferációs sebességükkel. Összesen három vegyület mutatta a legmagasabb korrelációt a méhindexekkel, nevezetesen az 8-epilogánsav, a cisztanozid F és az akteozid (6. ábra, csökkenő sorrendben); mivel a hat vegyület, amely a legmagasabb korrelációt mutatta az MCF7 sejtproliferációval, az echinakozid, a cisztanozid F, a cisztanozid B, az ozmantusid B, az izoakteozid és a tubulozid B volt (7. ábra, csökkenő sorrendben). Az echinakozid, az ozmantusid B, az akteozid és az izoakteozid relatív korrelációi magasabbak voltak, mint 0,5.

3.7 LC-MS körülmények optimalizálása

A jobb kromatogramtérkép érdekében a metanolt és az acetonitrilt hasonlítottuk össze. Végül a vizes hangyasav (0,2% , v/v) és az acetonitril kombinációja volt a legjobb mobil fázis az elválasztáshoz. A 200-400nm teljes hullámhosszú letapogatás tartományában a 254 nm-t választottuk optimálisnak. Emellett az MS paramétereket is javították. A negatív ion szkennelési módot azért választottuk, mert ez javította a legtöbb összetevő válaszértékét a Cistanche-ban.

4 Következtetés

Az LC-Q-TOF-MS technológiát a Cistanche ösztrogén aktív összetevőinek azonosítására használták. A jelen tanulmány bemutatta, hogy az 8-epilogánsav, szalidrozid, sziringalidA3'- -l-ramnopiranozid, cisztanozid A, echinakozid, cisztanozid F, cisztanozid B, cisztanozid C, ozmantusid B, akteozid, izoakteozid, tubulozid B, A 2'-acetil-lakteozid és két ismeretlen vegyület volt a Cistanche fő aktív összetevője. Ezek az eredmények azonban további vizsgálatokat igényelnek az összetevők in vivo hatásainak és hatásmechanizmusának feltárásához.

Köszönetnyilvánítás:

Ezt a projektet a Kínai Nemzeti Természettudományi Alapítvány (81073015. sz.), a Heilongjiang tartomány Természettudományi Alapítványa (ZD2017014), valamint a Heilongjiang tartományi Főiskola Fiatal innovatív tehetségek képzési terve (UNPYSCT-2017209) támogatta. . A szerzők kijelentik, hogy nem áll fenn összeférhetetlenség a jelen dolgozat kiadásával kapcsolatban.

Hivatkozások

[1] Wang Z., Xia Q., Liu X., Liu W., Huang W., Mei X., Luo J., Shan M., Lin R., Zou D., Ma Z., Fitokémia, farmakológia , minőségellenőrzés és a Forsythia suspensa (Thunb.) jövőbeli kutatása Vahl: A review, J. Ethnopharmacol., 2018, 210, 318- 339.

[2] Shu Y., Liu Z., Zhao S., Song Z., He D., Wang M., Zeng H., Lu C., Lu A., Liu Y., Integrated and global pseudotargeted metabolomics strategy used a Citrus TCM-ek minőségellenőrzési markereinek szűrésére, Anal. Bioanal. Chem., 2017, 409(20), 4849-4865.

[3] Yang B., Wang Y., Shan L., Zou J., Wu Y., Yang F., Zhang Y., Li Y., Zhang Y., A Novel and Practical Chromatographic "Fingerprint-ROC-SVM " A hagyományos kínai orvoslás injekcióinak minőségi elemzésére alkalmazott stratégia: A KuDieZi injekció esettanulmányként, Molekulák., 2017, 22

(7). PII: E1237.[4] Zhuo L., Peng J., Zhao Y., Li D., Xie X., Tong L., Yu Z., A QiShenYiQi csepegtető tabletták bioaktív minőségellenőrző markereinek szűrése az ultra-nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás ujjlenyomat közötti kapcsolat alapján és érvédő aktivitás, J. Sep. Sci., 2017, 40(20), 4076-4084.

[5] Liu N., Li J., Li BG, Többváltozós statisztikai elemzés és gondolkodás alkalmazása a kínai orvoslás minőségellenőrzésében, Zhongguo. Zhong. Yao. Za. Zhi., 2014, 39

(21), 4268-4271.

[6] Wang DD, Liang J., Yang WZ, Hou JJ, Yang M., Da J., Wang Y., Jiang BH, Liu X., Wu WY, Guo DA, HPLC/qTOF-MS orientált jellemző komponensek adatai készlet és kemometriai elemzés komplex TCM-készítmények holisztikus minőségellenőrzéséhez: Niuhuang Shangqing tabletta példaként, J. Pharm. Biomed. Anal., 2014, 89, 130-141. [7] Hernaez R., Thrift AP, Magas negatív prediktív érték, alacsony prevalencia és spektrumhatás: Caution in the Interpretation, Clin. Gastroenterol. Hepatol., 2017, 15(9), 1355-1358.

[8] Liang J., Chen Y., Ren G., Dong W., Shi M., Xiong L., Li J., Dong J., Li F., Yuan J., Screening Hepatotox Components in Euodia rutaecarpa by UHPLC-QTOF/MS a spektrum-toxicitás összefüggés alapján, Molecules., 2017, 22(8). PII: E1264.

[9] Li W., Sun X., Liu B., Zhang L., Fan Z., Ji Y., Evodia rutaecarpa hepatotoxikus komponensének szűrése és azonosítása spektrum-hatás összefüggés és UPLC-Q-TOFMS alapján, Biomed . Chromatogr., 2016, 30(12), 1975-1983.

[10] Chopard G., Puyraveau M., Binetruy M., Meyer A., ​​Vandel P., Magnin E., Berger E., Galmiche J., Mauny F., Spectrum Effect and Spectrum Bias in the Screening Test Performance for Amnestic Enyhe kognitív károsodás: Mik a klinikai következményei?, J. Alzheimers. Dis., 2015, 48(2), 385-393.

[11] Xu GL, Xie M., Yang XY, Song Y., Yan C., Yang Y., Zhang X., Liu ZZ, Tian YX, Wang Y., Jiang R., Liu WR, Wang XH, She GM, Spectrum-effect relations as a systematic approach to hagyományos kínai orvoslás kutatás: jelenlegi állapot és jövőbeli perspektívák, Molecules., 2014, 19(11), 17897-17925.

[12] Zheng Q., Zhao Y., Wang J., Liu T., Zhang B., Gong M., Li J., Liu H., Han B., Zhang Y., Song X., Li Y. , Xiao X., Spektrum-effektus kapcsolatok az UPLC ujjlenyomatok és az Aconitum carmichaelii Debeaux (Fuzi) nyers másodlagos gyökereinek bioaktivitásai és három feldolgozott terméke között a mitokondriális növekedésen, valamint kanonikus korrelációs elemzéssel, J. Ethnopharmacol., 2014,153(3) , 615-623.

[13] Shi Z., Liu Z., Liu C., Wu M., Su H., Ma X., Zang Y., Wang J., Zhao Y., Xiao X., Spectrum-Effect Relationships Between Chemical Fingerprints és a Lonicerae Japonicae Flos és Lonicerae Flos bázis antibakteriális hatásai UPLC-n és mikrokalorimetrián, elöl. Pharmacol., 2016, 7, 12.

[14] Usher-Smith JA, Sharp SJ, Griffin SJ, A spektrumhatás kockázat-előrejelzési, szűrési és diagnosztikai tesztekben, BMJ, 2016, 353, i3139.

[15] Chen Y., Yu H., Wu H., Pan Y., Wang K., Liu L., Jin Y., Zhang C., Tracing novel hemostatic compounds from heat products of total flavonoids in Flos Sophorae by spectrum -effektus összefüggések és oszlopkromatográfia, J. Sep. Sci., 2015, 38(10), 1691-1699.

[16] Liu X., Wang XL, Wu L., Li H., Qin KM, Cai H., Pei K., Liu T., Cai BC, Investigation on the spektrum-effect relations of Da-Huang-Fu- Zi-Tang patkányokban UHPLC-ESI-Q-TOF-MS módszerrel, J. Ethnopharmacol., 2014, 154(3), 606-612.

[17] Xie RF, Zhou X., Shi ZN, Li YM, Li ZC, Rhizoma Rhei, cortex Magnoliae Officinalis, Fructus Aurantii Immaturus és képletük spektrumhatás kapcsolatának vizsgálata, J. Chromatogr. Sci., 2013, 51(6), 524-532. [18] Li F., Yang X., Yang Y., Guo C., Zhang C., Yang Z., Li P., Antiosteoporotic activity of echinacoside in ovariectomized rats, Phytomedicine., 2013, 20(6), { {9}}.

[19] Xiong WT, Gu L., Wang C., Sun HX, Liu X., A Cistanche tubulosa antihiperglikémiás és hipolipidémiás hatásai 2-es típusú diabéteszes DB/DB egerekben, J. Ethnopharmacol., 2013, 150(3) , 935- 945.

[20] Morikawa T., Ninomiya K., Imamura M., Akaki J., Fujikura S., Pan Y., Yuan D., Yoshikawa M., Jia X., Li Z., Muraoka O., Acilált feniletanoid glikozidok echinacoside és acteozid a Cistanche tubulosa-ból, javítja a glükóz toleranciát egerekben, J. Nat. Med., 2014, 68(3), 561-566.

[21] Nan ZD, Zeng KW, Shi SP, Zhao MB, Jiang Y., Tu PF, Fenylethanoid glikozidok gyulladásgátló hatással a Tarim sivatagban tenyésztett Cistanche deserticola szárából, Fitoterapia., 2013, 89, {{4 }}.

[22] Lu D., Zhang J., Yang Z., Liu H., Li S., Wu B., Ma Z., Cistanches Herba kvantitatív elemzése nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával, diódasoros detektálással és nagy kemometriai módszerekkel kombinált felbontású tömegspektrometria, J. Sep. Sci., 2013, 36(12), 1945-1952.

[23] Han L., Boakye-Yiadom M., Liu E., Zhang Y., Li W., Song X., Fu F., Gao X., Cistanches deserticola YC Ma feniletanoid-glikozidjainak szerkezeti jellemzése és azonosítása UHPLC/ESI-QTOF-MS/MS, Phytochem. Anal., 2012, 23(6), 668-676.

[24] Xiang Y., Jing Z., Haixia W., Ruitao Y., Huaixiu W., Zenggen L., Lijuan M., Yiping W., Yanduo T., Antiproliferative Activity of Phenylpropanoids Isolated from Lagotis brevituba Maxim, Phytother . Res., 2017, 31(10), 1509-1520.

[25] Yan Y., Song Q., Chen X., Li J., Li P., Wang Y., Liu T., Song Y., Tu P., Simultaneous determination of component with large polarity and content ranges in Cistanche tubulosa, soros csatolású fordított fázisú hidrofil kölcsönhatás kromatográfiás-tandem tömegspektrometriával, J. Chromatogr. A., 2017, 1501, 39-50.

[26] Zou P., Song Y., Lei W., Li J., Tu P., Jiang Y., 1H NMR-alapú metabolomika alkalmazása a különböző részek megkülönböztetésére és új feldolgozási munkafolyamat kidolgozása a Cistanche deserticola számára, Acta. Pharm. Bűn. B., 2017, 7(6), 647-656.

[27] Pan YN, Tanulmányok a friss Cistanche tubulosa összetevőiről és bioaktivitásáról, Ph.D. szakdolgozat, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang, Kína, 2011.

[28] Cui Q., ​​Pan Y., Xu X., Zhang W., Wu X., Qu S., Liu X., Az emberi vagy patkány bélbaktériumok vagy bélenzim által termelt akteozid metabolikus profilja in vitro UPLC-vel. Q-TOF–MS, Fitoterapia., 2016, 109, 67-74.

[29] Cui Q., ​​Pan Y., Bai X., Zhang W., Chen L., Liu X., A Cistanche tubulosa echinakozid és akteozid metabolitjainak szisztematikus jellemzése patkányplazmában, epében, vizeletben és székletben UPLC-ESI-Q-TOF-MS, Biomed. Chromatogr., 2016(9), 1406-1415.

[30] Cui Q., ​​Pan Y., Yan X., Qu B., Liu X., Xiao W., Metabolikus módszer az izoakteozid orális adagolásánál rossz biológiai hozzáférhetőséget okozó kapcsolódó akadályok vizsgálatára ultranagy teljesítményű folyadékkromatográfiát alkalmazó patkányokban/ kvadrupól repülési idő tandem tömegspektrometria, Rapid. Commun. Mass. Spectrom., 2017(4), 371-380.