Vizsgálat az acteozid (a Cistanche Deserticola aktív összetevőjének) hatásáról a NAFLD -re az autofágia indukálásával

Absztrakt:

 

Célkitűzés:A hatóanyag-acteozid (ACT) autofágia-indukáló funkciójának feltárása a Cistanche sivaterticola-ban és annak hatása az alkoholmentes zsíros májbetegségre (NAFLD).

MódAz echinacoside szedéséhez és kutatási objektumokként való cselekedethez 1 0 0 μmol/L ACT és Echinacoside (ECH) kombináltuk az autofágia-lizoszóma-inhibitor Bleomycin A1-rel az intervenció kezelésére. A protein immunoblot -t használtuk az autofágia marker protein mikrotubulushoz kapcsolódó protein 1 könnyű láncának (LC 3- II) relatív expressziós szintjének kimutatására. A HEPG2 sejteket in vitro eltérő ACT -koncentrációval beavatkoztunk, és a sejtek életképességét a tetrazolium -só módszerrel detektáltuk. A HEPG2 sejtek in vitro beavatkozása, különböző ACT -koncentrációval, a Balofloxacin A1 -rel kombinálva, és az LC 3- ii protein expressziós szintek kimutatása protein immunoblot -technológiával. A Lipid cseppek festésére in vitro in vitro, amelyet in vitro építettek, olajvörös O festési módszer alkalmazásával és az intracelluláris triglicerid szintjének kimutatására. Vegye figyelembe az LC3 fehérje és a lipid cseppek lokalizációját immunfluoreszcencia technológián keresztül. Az eredmények szignifikánsan indukálhatják az autofágiát a Hepg2 sejtekben, és az LC 3- ii protein expressziós szintje szignifikánsan megnövekszik a kontrollcsoporthoz képest (önmagában kezelt ACT -vel kezelt) (1,36 ± {{19}. )), statisztikai szignifikanciával (P0.05). Az 50 μmol/L APT szignifikánsan indukálta az autofágiát a HEPG2 sejtekben, és az LC 3- II fehérje expressziós szintje szignifikánsan megnőtt (1,83 ± 0,53, 0,35 ± 0,18). A HEPG2 sejtek TG -szintje az ACT intervenciós csoportban (19,11 ± 1,68) szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a NAFLD in vitro sejtmodell csoportjában (34,15 ± 1,90), és a különbségek statisztikailag szignifikánsak voltak (P P (P P)<0.05). The number of positive lipid droplets in HepG2 cells in the ACT intervention group decreased significantly, and the number of autophagosomes inside the cells increased significantly, showing clear co localization with lipid droplets in space. Conclusion Cistanche deserticola ACT has significant autophagy induction ability, and it may have potential preventive and therapeutic effects on NAFLD.

 

Kulcsszavak:Nem alkoholos zsíros májbetegség;Cistanche sivatagola;Acteozid; Autofágia

 

A TCM Herb Cistanche az alkoholmentes zsíros májbetegség (NAFLD) kezelésére

Kattintson a képre, hogy további részleteket kapjon

 

Az elmúlt néhány évtizedben az alkoholmentes zsírmájbetegség(NAFLD) lett a leggyakoribbkrónikus májbetegség, a felnőtt populáció kb. 25% -ának globális prevalenciájával, és szorosan kapcsolódnak a metabolikus szindrómához [1]. Noha a NAFLD-betegekben a májhoz kapcsolódó szövődmények valószínűsége kevesebb, mint 10%, a NAFLD kockázati tényező a májhoz kapcsolódó betegségek, például a cirrhosis és az elsődleges májrák esetében, ami hatalmas gazdasági terhet jelent a betegek számára [2-5]. Annak ellenére, hogy a NAFLD egyre növekvő figyelmet fordít, a NAFLD, mint egy fontos krónikus betegség nem kapott elegendő figyelmet. Ezért a NAFLD patogenezisének és a hatékony kezelési stratégiák keresésének további mélyreható megértése sürgős problémákká vált, amelyeket meg kell oldani [6-7].

A legújabb tanulmányok kimutatták, hogy a sejtek autofágia fontos szerepet játszik a máj fiziológiájában és patológiájában [8]. Az autofágia diszfunkció vagy rendellenesség különféle májbetegségekkel jár, példáulalkoholfüggő májbetegség[9], NAFLD [10], alkoholmentes steatohepatitis [11] és hepatocellularis carcinoma [12]. A NAFLD patológiás tulajdonságai a trigliceridek (TG) és más semleges lipidcseppek (LD) túlzott lerakódása a májsejtek során az alkoholmentes stimuláció alatt. A máj esetében az LD -k katabolizmusát szabályozó két fő út a lipolízis és az autofágia.
A lipolízis útját citoplazmatikus semleges lipázok, például hormon-érzékeny lipáz és zsíros TG lipáz szabályozzák. A megfelelő lipoautofágia útvonalon az LD-k szelektíven vehetők fel az autofágia-val kapcsolatos fehérjék közvetlenül toborzásával autofagoszómák kialakításához, majd az autofagoszómák által beágyazott LDS-t tovább szállítják a lizoszómákba, és sav lipáz által bontják a lizoszómákban. Ezért a lipoautofágia aktiválása a májsejtekben hatékony stratégiává vált a NAFLD megelőzésére és kezelésére.
A Cistanche Deserticola egy értékes kínai gyógynövény, amelyet széles körben alkalmaztak a klinikai gyakorlatban a hagyományos kínai orvoslás képleteiben. Ugyanakkor már régóta használják egészségügyi élelmiszer -kiegészítőként. A CISTANCHE DESERTICOLA különféle bioaktív összetevőket tartalmaz, amelyek közül a legfontosabb a CISTANCHE DESERTICOLA feniletanol -glikozidok. A feniletanoid glikozidok, az echinakozid (ECH) és a verbaszkoszid (ACT) képviselőiént beszámoltak arról, hogy számos fontos biológiai aktivitással rendelkezik, mint például antioxidáns, neuroprotektív, immunmoduláló és májvédő [13]. A májvédelem szempontjából a vizsgálatok azt mutatták, hogy az ECH védi a májat azáltal, hogy csökkenti a gyulladásos mediátorokat, gátolja a transzformációs faktorot, és csökkenti a májfibrózissal kapcsolatos gének expressziós szintjét. Az ACT jelentős védőhatást gyakorol a kémiai és a gyógyszer által kiváltott májkárosodásra, például az alkohol, a szén-tetraklorid és a lipopoliszacharidra. Az ACT csökkenti a toxikus vegyi anyagok által okozott oxidatív stresszt, eltávolítja a májban felhalmozott reaktív oxigént, és csökkenti a malondialdehidkoncentrációt. Ugyanakkor szignifikánsan növeli a máj szuperoxid -diszmutáz aktivitását és csökkenti a glutationtartalmat, és jelentősen javítja a máj hisztopatológiai károsodását és apoptózisát. Nincs azonban releváns irodalmi jelentés arról, hogy a cistanche -sivatagola feniletanoid glikozidjai részt vesznek -e az autofágia folyamatában a májvédelem kialakításában. Ennek alapján ez a tanulmány a hagyományos sejtbiológiai módszereket és az in vitro sejtmodellt alkalmazta a CISTANCHE DESERTICOLA feniletanoid glikozidok autofágia-indukáló hatásainak előzetes feltárására, és feltárta annak lehetséges farmakológiai funkcióit, amelyek célja a jövőbeni gyógyszerfejlesztés tudományos alapjának biztosítása.

 

1 Anyagok és módszerek

1.1 Anyagok

1.1.1 Kutatási alanyokat és ACT -t használtak kutatási alanyként.

1.1.2 Anyagok A HEPG2 sejteket a Wuhan Punosai Life Science Co., Ltd. -től vásárolták, ECH (kötegszám: B21209) és ACT (Batch szám: B20715, HPLC tisztasággal, vagy 98%-nál nagyobb vagy egyenlő) Shanghai Yuanye Biological Company -tól, DMEM Buffer -tól és a tételszám: SH30243.01), PHORFATE -től, és a PHOFTATE -től, és a PHORFATE -től, és a PHORFATE -től, a pufferektől, és A tripszint a Hyclone Company -tól vásárolták, az USA -tól, a magzati szarvasmarha -szérumot (kötegelt szám: 04-002-1 a) a BI Company -tól, Izraelből, Penicillin/Streptomycin -től (SV30010.01) vásárolták a Hyclone Company -tól, az USA -tól, az MTT -től (Batch szám: M8180) Power -tól vásárolták a Soleaba -tól. (Batch szám: BC0625) Az érzékelő készletet a Solebao Company-tól, Pekingben, Kínából, olajvörös O-tól vásárolták (tételszám: o 0625-100 g), dimetil-szulfoxidot (tételszám: BCBZ1685) a Sigma-Aldrich-től vásároltuk; Az autofágia-lizoszóma inhibitor Bafilomycin A1 (BAFA1, tételszám: TLRL-BAF1) az Invitrogen-től, USA-tól vásároltuk; A Rapamycin autofágia aktivátorát (tételszám: S17098) a Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., Kína vásárolták; Mikrotubulus-asszociált protein 1 könnyű lánc 3 (LC3, tételszám: L7543, Faj: Nyúl, hígítási arány: 1: 1 000) és -tin (tételszám: ZRB1312, fajok: nyúl, hígítás arány: 1: 5 000}}}}}}}}}). torma-peroxidázzal jelölt másodlagos antitest (tételszám: 4010-05, Fajok: Kecske anti-nyúl, hígítási arány: 1: 1 000) a Southern Biotech, USA, az Alexa Fluorescent jelölt másodlagos ellenanyagoktól (tételszám: 43328, Wavelshthing: 546, 546, 1: 1: 1: 1: 1: 1: 1: 1: 1: 1: A Sigma-Aldrich Company, USA és a Bodipy 493/501 (tételszám: D3922) az Invitrogen Company-tól vásárolták meg.

 

1.2 Módszerek

1.2.1 sejttenyészet

A HEPG2 sejteket Dulbecco módosított sas magas glükózközegében tenyésztettük, amely 10% magzati szarvasmarha -szérumot, 100 U/ml penicillint és 100 ug/ml streptomycint tartalmazott 37 fokos, 5% szén -dioxid inkubátorban. Amikor a cellás összefolyás elérte a 85%-ot, szubkultúrát, bevonást, beavatkozást és egyéb műveleteket hajtottak végre.

 

1.2.2 fehérje immunoblot -kimutatás

1.2.2.1 ACT és ECH kezelés

Az LC 3- ⅱ fehérje expressziós szintje a Hepg2 sejtekben a bafa1 -ben, mint proton pump inhibitor, az LC 3- ⅱ fehérje nagy mennyiségben aggregálódhat a sejtekben, ezáltal amplifikálva az autofágia indukciós képességét. Ezért a BAFA1 együttes használata használható autofágia -megfigyelő rendszerként az autofágia indukciós képességének értékeléséhez. A logaritmikus növekedési fázisban lévő HepG2 sejteket 3,5 cm -es sejttenyésztési ételekbe vittük az éjszakai tenyésztés céljából. 100 μmol/L ACT -t, ECH -t és BAFA1 -et használtunk beavatkozáshoz 12 órán át. A sejteket előre hűtött foszfátpuffer oldattal (PBS) mossuk, és azonnal 10 percig lizáltuk RIPA protein lízispufferben. A felülúszót centrifugáltuk, és a teljes fehérjekoncentrációt egy bicinchonininsav fehérjekoncentráció -vizsgálati készlettel határoztuk meg. A nátrium -dodecil -szulfát -pufferrel történő mennyiségi meghatározás után a mintát 95 fokon melegítettük 10 percig, hogy denuáljuk a fehérjét. Ezután 30 μl mintát vettünk egy mikropipettal és elektroforézissel egy poliakrilamid gélen.
Az elektroforézis után a fehérjét a gélből egy nitrocellulóz membránba vittük, 1 0% tejjel blokkolva egy éjszakán át, egy specifikus primer antitesttel inkubáltuk szobahőmérsékleten 1 órán át, 0,5% tritont tartalmazó foszfát pufferrel mosva, és egy specifikus másodlagos antitesttel inkubáltuk szobahőmérsékleten 1 órán át. Az ECL módszert használták a színfejlesztéshez. Ezeket üres kontrollcsoportként, Rapamycin Group, ECH Group, ACT Group, Rapamicin+BAFA1 Group, Ech+BAFA1 Group és ACT+BAFA1 csoportként állították be.

 

1.2.2.2 Az ACT különböző koncentrációi beavatkoztak az LC expressziós szintjének 3- ⅱ fehérje Hepg2 sejtekben

A logaritmikus növekedési fázisú HEPG2 sejteket 3,5 cm -es sejttenyésztési ételekre vittük át az éjszakai tenyésztés céljából, és 25, 50 és 100 μmol/L ACT -t a BAFA1 -rel kombinálva 12 órás intervenciós kezeléshez használtunk, és az LC 3- ⅱ protein expressziós szintjét detektáltuk protein immunblotálással. A kontrollcsoportot (Con Group, Blank Control), az éhezési csoport (STA csoport, az éhezési kezelés Hepg2 sejtek), a 25, 50 és 100 μmol/L ACT -csoportot, valamint a BAFA1 -et 25, 50 és 100 μmol/L ACT -csoporttal kombinálva felállítottuk.

1.2.3.
A logaritmikus növekedési fázisban lévő Hepg2 sejteket 96- kútlemezben oltottuk be, közepes oltási sűrűséggel és inkubátorban 12 órán át tenyésztettük. 2 0, 40, 60, 80 és 100 μmol/L ACT -t adtunk hozzá 24 és 48 órán át. 0,5 mg/ml MTT -oldatot adtunk sötét környezetben, és inkubáltuk inkubátorban. 4 óra elteltével a felülúszót eldobtuk, mindegyik kúthoz 100 μl dimetil -szulfoxidot adtunk, és a sejteket állandó hőmérsékleten rázógépen ráztuk 37 fokos 10 percig. Az optikai sűrűség (OD) értékét 490 nm hullámhosszon egy enzim markerrel detektáltuk, és kiszámítottuk a sejtek túlélési sebességét.

 

1.2.4 A NAFLD sejtmodell in vitro felépítése

Egy bizonyos palmitinsav (PA) súlyát lemértük és teljesen feloldottuk egy bizonyos térfogatú izopropanolban, hogy elkészítsük egy 100 mmol/L PA készlet -oldatot, amelyet ezután felosztottunk és egy {1}} fokos hűtőszekrényben tároltunk későbbi felhasználáshoz. A PA törzsoldatot teljes tenyésztő tápközeggel hígítottuk 100 μmol/L-re, és 1% zsírsav-mentes szarvasmarha-szérum albumint adtunk hozzá. A sejteket 37 fokon inkubáltuk 3 órán át az indukciós oldat előkészítéséhez. A logaritmikus növekedési fázisban lévő HEPG2 sejteket egy 3,5 cm -es sejttenyésztő edénybe vittük az éjszakai tenyésztéshez megfelelő sűrűség mellett, majd az előkészített indukciós oldatot használtuk a beavatkozáshoz.

 

1.2.5 ACT beavatkozás NAFLD in vitro sejtmodell TG detektálás és olajvörös o festés

 

1.2.5.1 TG detektálás

A logaritmikus növekedési fázisban lévő HEPG2 sejteket egy 3,5 cm -es sejttenyésztési ételbe vittük a tenyészethez, az üres kontrollcsoport, a modellcsoport és az ACT intervenciós csoport szerint. A modellcsoportot 100 μmol/L PA indukciós oldattal indukáltuk, és az ACT intervenciós csoportot 100 μmol/L PA indukciós oldattal indukáltuk, és egyszerre 50 μmol/L ACT -t adtunk hozzá. Az intervenciós idő 24 óra volt. Finoman távolítsa el a régi tenyésztő tápközeget, lassan mossa le a sejt felületét előre hűtött PBS-sel, adjon hozzá 100 μl/edényt előre hűtött Ripa lízis oldatot, teljes mértékben lyse a jégen 15 percig, centrifugáljon 4 fokon és 12 000 r/perc 10 percig, összegyűjtse a Supernatant-t, vegye be a TG-t, a TG-t, a TG-t, a TG-t, a TG-t, a TG-t, a TG-t, a TG-t, a TG-t, a TG-t, a TG-t, a TG-t, a TG-t, a TG-t, a TG-t, a TG-t, a TG-t, a TG-t, a TG-t, a TG-t, a TG-t, a TG-t. Kit utasítások, és végül javítsák a TG szintet mg fehérje.

1.2.5.2 Olajvörös O festés

A logaritmikus növekedési fázisban lévő HEPG2 sejteket egy 3,5 cm -es tenyésztő edénybe vittük át, amelyet steril borítóval borítottak az éjszakai tenyészethez. 100 μmol/L PA indukálta a sejteket, hogy lipidcseppeket képezzenek. Ugyanakkor 50 μmol/L ACT -t adtak hozzá 24 órán át beavatkozáshoz.
The cell slides were collected, washed 3 times with pre-cooled PBS, fixed with 4% formaldehyde at room temperature for 10 min, washed the cell surface with PBS, added the prepared Oil Red O staining working solution, stained at room temperature in the dark for 15 min, aspirated the Oil Red O staining solution, washed the excess staining solution with double distilled water, rinsed with 60% isopropanol, washed with double distilled water, and sealed, és mikroszkóp alatt fényképezték.

 

1.2.6 Az autofagoszómák és a lipidcseppek immunfluoreszcencia megfigyelése az ACT kezelés után

A logaritmikus növekedési fázisban lévő HEPG2 sejteket egy 3,5 cm -es tenyésztő edénybe vittük át, amelyet steril borítóval borítottak az éjszakai tenyészethez. 1 0 0 μmol/L PA -t használtunk a lipidcseppek képződésének indukálására a sejtekben. Ugyanakkor törvényt adtak hozzá 24 órás intervenciós kezeléshez. A sejtlemezeket összegyűjtöttük, háromszor mossuk előre hűtött PBS-sel, szobahőmérsékleten rögzítjük 10 percig 4% -os formaldehiddel, szobahőmérsékleten 15 percig permeabilizálva, permeabilizációs pufferrel, amely 0,1% szaponint tartalmaz, szobahőmérsékleten 1 órán át, kecske szérummal, a PBS-rel, a PBS-rel, a PBS-rel, a PBS-rel, a PBS-rel, a PBS-rel, a PBS-rel. egy specifikus fluoreszcens jelöléssel ellátott másodlagos antitesttel, szobahőmérsékleten inkubált és 1 órán át a fénytől távol. Az antitest inkubálása után a lemezeket háromszor mossuk PBS-sel, lipidcsepp-specifikus szonda bodypy 493/503-mal szemben foltosítottuk szobahőmérsékleten 10 percig, PBS-sel mossuk, és lezárták a halványsággátló tömítő tápközeggel, sötétben szárítva, lézerkonfokális mikroszkóppal megfigyelve és rögzítve. Megállapítottuk az üres kontrollcsoportot, a rapamicin kezelési csoportot és az ACT intervenciós csoportot.

 

1.3 Statisztikai elemzés

SPSS25. 0 Statisztikai szoftvert használtunk az adatok elemzéséhez. A kvantitatív adatokat x ± s -ként fejeztük ki. A variancia és az LSD-T teszt egyirányú elemzését alkalmaztuk. P<0.05 was considered statistically significant.