Tanulmány a Cistanche Deserticola összes glikozidjának védőmechanizmusáról az alkohol által kiváltott sérülésekkel szemben az elsődleges tenyésztett egérmájsejtekben
Jun 04, 2025
Célkitűzés:
A Cistanche deserticola összes glikozidjainak primer tenyésztett májsejtekre gyakorolt védő hatásának vizsgálata. Módszerek: A primer hepatocitákat in situ perfúziós módszerrel gyűjtöttük, és MTT módszerrel értékeltük a Cistanche deserticola összglikozidjainak hatását az alkohol által károsodott primer tenyésztett májsejtek túlélési arányára; Fluoreszcens mikroszkóppal értékeltük a Cistanche deserticola összglikozidjainak hatását a primer tenyésztett májsejtek és alkohol által sérült sejtmagok morfológiájára; Áramlási citometriával kimutattuk a Cistanche deserticola összglikozidjainak hatását az alkohol által károsodott primer tenyésztett hepatociták apoptózisára; Immuncitokémiai festést alkalmaztunk a Cistanche deserticola összglikozidjainak a bcl-2 és c-fos expressziójára gyakorolt hatásának kimutatására. Eredmények: Alkoholsérülés után a primer hepatociták túlélési aránya csökkent, az apoptózisban és a nekrózisban pedig nyilvánvaló változások következtek be. Az apoptózist gátló bcl-2 gén expressziója csökkent, a c-fos apoptózist elősegítő gén expressziója pedig nőtt. A Cistanche deserticola összglikozidjai jelentősen javíthatják a sejtek túlélési arányát, javíthatják az apoptózist és a nekrózist, fokozhatják a bcl-2 expresszióját és gátolhatják a c-fos expresszióját. A hatás dózisfüggő volt. Következtetés: A Cistanche deserticola glikozidok megvédhetik az elsődleges tenyésztett májsejteket azáltal, hogy növelik az apoptózist gátló gén bcl-2 expresszióját, csökkentik az apoptózist elősegítő gén c-fos expresszióját, csökkentik az apoptózist és a nekrózist, valamint növelik a sejtek túlélési arányát.
Kulcsszavak: a Cistanche deserticola összes glikozidja; Elsődleges kultúra; májsejtek; Alkoholos májkárosodás; Apoptózis
Cistanche kivonat por
Az elmúlt években az emberek életszínvonalának javulásával az alkoholfogyasztás rohamosan nőtt, amihez társult a különféle alkohollal összefüggő megbetegedések növekedése, és az alkoholos májkárosodás az egyik fontos probléma. Tanulmányok kimutatták, hogy a Cistanche deserticola védőhatása az immunrendszer működésének fokozása, az öregedésgátló, a sugárzás elleni, az antioxidáció, a lipid-peroxidáció és az alkohol okozta májkárosodás [1]. A glikozidok a Cistanche deserticola fő hatóanyagai.Korábbi kísérletekben állatkísérletekkel igazolták, hogy a Cistanche deserticola összes glikozidja csökkentheti a szabad gyökök képződését, fokozhatja a szabad gyökök és metabolitjaik megkötő képességét, ezáltal gátolja a lipidperoxidációt, és védő szerepet tölt be az alkohol okozta májkárosodásban.[2]. Ez a kísérlet a Cistanche deserticola összes glikozidjának sejtszintű alkoholos májkárosodásra gyakorolt védő hatását vizsgálja a májsejtek elsődleges tenyészetén keresztül.
1. Anyagok és módszerek
1.1 Reagens és műszer A Cistanche deserticola összes glikozidja, sötétbarna por, amelyet a Lanzhou Egyetem Gyógyszerészeti Iskolája biztosított, a fenil-etanol összes glikozidjának 88,6%-át tartalmazza. Oldjuk fel kétszer desztillált vízben, és hígítsuk fel a tenyészoldatot a kívánt koncentrációra. Enzimmarker (Beckman Coulter AD340), fluoreszcens mikroszkóp (Olympus, BX51), fordított fázisú kontrasztmikroszkóp (Leica DMI3000B), áramlási citometria (Beckman colter sejt, CellLabQuanta SC) stb.
Cistanche por
Kattintson ide a Cistanche deserticola májvédő termékek megtekintéséhez
【Kérjen többet】 E-mail: xue122522@foxmail.com / WhatsApp: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
1.2 Az elsődleges hepatocitákat in situ perfúziós módszerrel izoláltuk és tenyésztettük [3].
Egy Kunming egeret 0,5%-os pentobarbitál 0,5 ml intraperitoneális injekcióval érzéstelenítettünk. A rutin bőrfertőtlenítés után nyissa ki a hasat, mozgassa a gyomor-bél traktust balra, tegye ki a portális vénát, óvatosan szúrja ki az infúziós eszköz infúziós tűjét a portális véna túlsó végéből, majd kösse le és rögzítse. Fordítsa az infúziós szerelék áramlását a maximumra (kb. 4 ml/perc), és engedje le a 37 fokra előmelegített kalciummentes előperfúziós oldatot. Amikor a máj megduzzad, gyorsan vágja le az inferior vena cava disztális végét, és szakaszosan nyomja össze az inferior vena cava proximális végét, hogy a máj felváltva visszahúzódjon és kitáguljon. Amikor a visszamaradt vér kimosódik, és a máj egyenletesen sárga és fehér, a meleg 0,05%-os kollagenáz (Sigma) perfúziós oldatot használják az emésztési perfúzióhoz. Az emésztés leáll, ha a máj puhává és rugalmatlanná válik, a májkapszula alatt apró vakuolák jelennek meg, vagy akár repedések jelennek meg a májszövetben. Óvatosan válassza le a májat, helyezze át egy steril lemezre, amely megfelelő mennyiségű DMEM magas cukortartalmú táptalajt (Sigma) tartalmaz, húzza le a májburkolatot és óvatosan rázza meg, majd szórja szét a májsejteket a táptalajban, gyűjtse össze egy kúpos csőben, rázza és tenyésztse 10 percig (rezgési frekvencia: 100 fok/perc). 1000 fordulat/perc), és dobja ki a felülúszót. A sejteket a tápközegben szuszpendáltuk, 200 mesh nejlonhálóval leszűrtük, és a szűrletet ismételten 3-szor centrifugáltuk (4 fok, 1000 fordulat/perc), hogy májparenchima sejteket kapjunk. Állítsa be a sejtkoncentrációt 5 × 106 sejt/ml értékre, oltsa be őket egy 25 ml-es patkányfark kollagénnel előkezelt tenyészlombikba, majd inkubálja őket 37 fokos, 5%-os CO2 inkubátorban. 24 óra elteltével cserélje ki az oldatot, dobja ki a nem tapadó sejteket, és folytassa a tenyésztést a következő kísérletekhez.
1.3. Primer tenyésztett egérhepatociták növekedési görbéjének meghatározása
Állítsa be a tisztított hepatociták számát 5 × 106 sejt/ml-re, oltsa be őket a 24 lyukú lemezre, és 1 ml sejtszuszpenziót oltunk be minden lyukba. Összesen 21 lyukat oltottunk be, és 10% magzati borjúszérumot (Sigma) tartalmazó DMEM magas cukortartalmú táptalajt tenyésztettünk 7 napig. Vegyünk 3 lyukat véletlenszerűen minden nap, emésztessük fel és fújjuk egyenletesen 0,25%-os tripszint, számoljunk a számlálótáblán, és rajzoljuk meg a növekedési görbét
1.4 Alkoholos hepatocita sérülési modell felállítása.
A fenti módszerrel kapott logaritmikus hepatocitákat a patkányfarok kollagénnel előkezelt 96 lyukú lemezre oltottuk, és minden lyukba 100 sejtet oltottunk be 50 µl-rel. A 10% magzati szarvasmarha szérumot tartalmazó DMEM táptalajt 24 órán át tenyésztettük, majd további 24 órán át cseréltük. Egy üres csoportot állítottunk fel, és öt alkoholintervenciós csoportot (50, 75, 100, 125, 150 mmol/L) állítottunk fel, és mindegyik csoportot öt ismétléssel állítottuk fel. Miután a hepatocitákat 24 órán át különböző koncentrációjú alkohollal tenyésztettük, 0,5% MTT (Sigma) 20-at adtunk minden egyes lyukba μ 50 μl. Folytassa a tenyésztést 4 órán keresztül, dobja ki a felülúszót, és adjon DMSO 150-et minden lyukba μ 50. Tegye rázóasztalra, és keverje 15 percig, mérje meg az abszorbancia értéket 570 nm-en, és számítsa ki a sejtek túlélési arányát. A kezelt csoport/kontrollcsoport sejttúlélési aránya × 100%
1.5 A Cistanche deserticola összes glikozidjának hatása az elsődleges tenyésztett hepatociták túlélési arányára
Alkoholtól megsérült. Oltsuk be a fenti módszerekkel nyert hepatocitákat a patkányfark kollagénnel előkezelt 96 lyukú lemezre, és oltsunk be minden mérőhelyet 100 μL vagy 50 μL-rel. A 10% magzati szarvasmarha szérumot tartalmazó DMEM táptalajt 24 órán át tenyésztettük, majd kicseréltük. További 24 óra elteltével 0,2, 0,4 és 0,8 g/l végső koncentrációjú GC-ket adtunk a beadási csoporthoz. Az etanolos modellcsoport és a vakcsoport gyógyszer hozzáadása nélkül folytatta a tenyésztést, és mindegyik csoportot öt többszörös mérőhelyre helyeztük. 24 óra elteltével a modellcsoportot és a GC-s beavatkozási csoportot 100 mmol/l végső koncentrációjú alkohollal adtuk. 12 órás tenyésztés után a sejtek túlélési arányát MTT módszerrel mértük.
1.6 A Cistanche deserticola összes glikozidjainak hatása az elsődleges tenyésztett májsejtek és alkohol által sérült sejtmagok morfológiájára
Helyezze az elősterilizált fedőüveget egy 6-lyukú lemezre 5 × 106 sejt/ml sejtszuszpenzió beoltási koncentrációval, modellcsoporttal, Cistanche deserticola csoporttal (0,2, 0,4, 0,8 g/l) és vakcsoporttal. 24 órás tenyésztés után adjunk hozzá 100 mmol/l alkoholt a végső koncentrációig. 24 órás tenyésztés után vegye ki a 95%-os etanolt a tárgylemezről, és rögzítse 15 percig. A PBS-t kétszer mossuk, majd újra diszpergáljuk PBS-ben. Állítsa be a sejtkoncentrációt 5 × 104 sejt/ml értékre, adjon hozzá 10 μL akridinnarancs-etilidén-bromid keveréket (Sigma) (0,01 μ G/mL akridinnarancs oldat, 0,02 μ G/mL prometazin oldat, fluoreszcens 0 alatt figyelhető meg, vegyes térfogatarány: 1/1 aprításban) mikroszkóp.
1.7 A Cistanche deserticola összes glikozidjának hatása az alkohol által károsodott primer tenyésztett májsejtek apoptózisára
Állítsa be az emésztett sejtszuszpenzió sűrűségét 5 × 106 sejt/ml értékre, oltsa be egy hatlyukú lemezre, és tenyésztse 24 órán át. Állítsa be a modellcsoportot, a cistanche deserticola csoportot (0,2, 0,4, 0,8 g/l) és az üres csoportot. 24 órás tenyésztés után adjunk hozzá 100 mmol/l végső koncentrációjú alkoholt, inkubáljuk 24 órán át, emésztsük és gyűjtsük össze a sejteket, mossuk át kétszer PBS-sel, fixáljuk egy éjszakán át 4 fokon 70%-os előhűtött etanollal, mossuk át kétszer PBS-oldattal, adjunk hozzá RNS enzimet (Sigma), PI-t (100 μS) és öntsünk vízfürdőbe (itt G/7 m). 30 perc. Az apoptózis sebességét áramlási citometriával mértük.
1.8 A Cistanche deserticola teljes glikozidjai gátolhatják az alkohol, a bcl-2 és a pro-apoptotikus c-fos gén által károsított primer tenyésztett hepatociták apoptózisát
A fos expresszió hatását három hatlyukú tenyésztőlemezről vettük, amelyek mindegyike három lyukból álló csoport volt. Felállítottuk a modellcsoportot, a Cistanche deserticola csoportot (0,2, 0,4, 0,8 g/l) és az üres csoportot. Mindegyik lyukba egy steril tárgylemezt helyeztünk. A logaritmikus növekedési fázisú sejteket vettük, és a tripszin emésztést használtuk az egysejt-szuszpenzió elkészítéséhez, és a sejtsűrűséget 5 x 106/ml-re állítottuk be, és egy 6-lyukú lemezre oltottuk be, 2 ml/lyuk mennyiségben. 24 órás tenyésztés után adjunk hozzá 100 mmol/l végső koncentrációjú alkoholt, és folytassuk a tenyésztést 24 órán keresztül. Vegye ki a sejtekkel teli tárgylemezeket, mossa le kétszer PBS-sel, és fesse be a rutin immunhisztokémiai ABC módszerrel. A rövid lépések a következők: rögzítse őket 40%-os paraformaldehiddel 10 percig, zárja le normál bárányszérummal 30 percig, csepegtesse le és adjon hozzá bcl-2 poliklonális antitestet (Invitrogen) (1:75) vagy c-fos poliklonális antitestet (Invitrogen) (1:50), reagáljon komplexen szobahőmérsékleten, A1BC-n 5 órán át, szobahőmérsékleten A12 órán át. DAB, és zárja le őket zselatinnal. A Bcl-2 és a c-fos fehérje expresszióját fénymikroszkóppal és fényképezéssel hasonlítottuk össze.
1.9 Statisztikai feldolgozás A kísérleti adatok feldolgozása SPSS 13.5 szoftverrel történt. Ezt átlag ± szórásban (x ± s) fejezzük ki, és t-próbát használunk a csoportok összehasonlítására. P<0.05 indicates that the difference is statistically significant.
2 Eredmények
2.1 A primer tenyésztett egér hepatociták növekedési görbéjét az 1. ábra mutatja. Látható, hogy a hepatociták száma az inkubációs idővel nőtt, és a 4. napon logaritmikus növekedési fázisba lépett.
2.2 A különböző alkoholkoncentrációk hatása az elsődleges tenyésztett egér hepatociták túlélési arányára
Az 1. táblázatból látható, hogy az alkohol erős károsító hatással van a primer tenyésztett hepatocitákra, és a hatás dózisfüggő. A teszt igényeinek megfelelően a következő tesztben 100 mmol/l munkakoncentrációt használunk, és a sejttúlélési arány 43,40%.
2.3 A Cistanche deserticola összes glikozidjának hatása az alkohol által károsított primer tenyésztett májsejtek túlélési arányára
A 2. táblázatban látható. Alkoholsérülés után a hepatociták túlélési aránya jelentősen csökken. A Cistanche deserticola összes glikozidja jelentősen megnövelheti a hepatociták túlélési arányát (P<0.05), and the effect is dose-dependent (P<0.05).
sivatagi ginzeng
2.4 A Cistanche deserticola összes glikozidjainak hatása az elsődleges tenyésztett hepatociták és az alkohol által károsított sejtmagok morfológiájára.
Az azidin narancssárga zöld fluoreszcenciát mutat a sejtekbe jutva, míg a prometazin csak a hiányos sejtmembránnal képes megfesteni a nekrotikus sejteket. Megfigyeléssel (. 2. ábra) azt találtuk, hogy a vakcsoportban a hepatociták egyenletesen zöldek, és nem volt brómvörös festődés a nekrotikus sejteken (A); Alkoholos kezelés után a hepatociták kisebbek lettek, és nagyszámú brómvörösre festett nekrotikus sejt és a sejtmagban kromatinkoncentrációjú apoptotikus sejtek jelentek meg (a sejtmag élénkzöld volt) (B). Ezért úgy gondolják, hogy az alkohol sejtnekrózist is okozhat, miközben hepatocita apoptózist indukál. A GC-k jelentősen csökkenthetik a nekrózist és az apoptózist, és a hatás pozitívan korrelál a dózissal (C, D, E).
. 2 ábra A Cistanche deserticola összes glikozidjainak az elsődleges tenyésztett májmagok morfológiájára gyakorolt hatásának megfigyelése fluoreszcens mikroszkóp alatt (akridin narancs festés, 400)
V: Üres csoport; B: Modellcsoport; C:0.2g/L-GCs; D:0.4g/L-GCs; E:0.8g/L-GC
2.5 A cistanche deserticola összglikozidjainak hatása az alkohol által károsodott primer tenyésztett májsejtek apoptózisára
Cistanche kivonat por
A 3-B ábrán látható, hogy a májsejtek apoptózisi rátája alkoholsérülés után jelentősen megnőtt (34,7%), és a Cistanche deserticola összes glikozidja dózisfüggő módon jelentősen növelheti a hepatociták túlélési arányát, ami összhangban van a fluoreszcens mikroszkóp alatt megfigyelt eredményekkel.
ábra
V: Üres csoport; B: Modellcsoport; C:0.2g/L-GCs; D:0.4g/L-GCs; E:0.8g/L-GC
Immuncitokémiával azt találták, hogy az apoptózist gátló bcl-2 faktor expressziója csökkent (4-B), a c-fos expressziója pedig nőtt (5-B), miután a májsejteket alkohollal megsértették. A Cistanche deserticola összglikozidjai jelentősen fokozhatják a bcl-2 (4-C, D, E) expresszióját és gátolhatják a c-fos (5-C, D, E) expresszióját. Az eredményeket a következő ábra mutatja:. 4-5.
. 4 ábra: A Cistanche deserticola összes glikozidjának hatása a bcl-2 expressziójára az alkohol által sérült elsődleges tenyésztett májsejtekben (400)
V: Üres csoport; B: Modellcsoport; C:0.2g/L-GCs; D:0.4g/L-GCs; E:0.8g/L-GC
. 5 ábra: A Cistanche deserticola összes glikozidjának hatása a c-fos expressziójára az alkohol által károsított elsődleges tenyésztett hepatocitákban (400)
V: Üres csoport; B: Modellcsoport; C:0.2g/L-GCs; D:0.4g/L-GCs; E:0.8g/L-GC
3 Vita
Kínai gyógynövény-cistanche
Berry et al. először létrehozta az in situ perfúziós módszert, amelynek során kollagenázt használnak a máj perfundálására, hogy fiziológiás körülmények között hepatocitákat nyerjenek, majd később Seglen és munkatársai fejlesztették ki. [4], hogy ez a kollagenáz perfúziós technológia tökéletesebb legyen. Ennek a módszernek magas a sejthozama és magas a túlélési aránya. Ebben a kísérletben az elsődleges hepatocitákat egér hepatociták in situ perfúziójával nyertük és tenyésztettük. A módszer stabil volt, és a sejtaktivitás erős volt. A növekedési görbe teszttel azt találták, hogy a kapott primer hepatociták 4 nap után beléptek a logaritmikus növekedési fázisba.
Az MTT kolorimetriás mikroanalízis érzékeny módszer a sejtnövekedés és a túlélés jó ismételhetőségű kimutatására. Az élő sejtek mitokondriumában lévő szukcinát-dehidrogenáz képes a sárga MTT-t kékeslila kristályokká redukálni, míg az elhalt sejteknek nincs ilyen funkciója [5]. A sejtek aktivitását az optikai sűrűség mérésével lehet tükrözni. Ebben a kísérletben az MTT módszert alkalmaztuk annak kimutatására, hogy a májsejtek túlélési aránya alkoholsérülés után szignifikánsan csökkent, és a Cistanche deserticola összes glikozidjai jelentősen növelhetik a májsejtek túlélési arányát (P<0.05), and the effect was dose-dependent (P<0.05).
Az apoptózis a sejthalál egy speciális formája. Amikor a sejtek apoptózison mennek keresztül, különleges morfológiai és biokémiai változások következnek be [6-8]. A kísérlet igazolta, hogy az alkoholos kezelést követően a májsejtek többsége apoptotikus volt, a sejtek nyilvánvaló morfológiai elváltozásokat mutattak, amelyek a következők voltak: a sejtek kisebbek lettek, a sejtfelszínen lévő mikrobolyhok eltűntek, a sejtfelszín összezsugorodott, vakuolák, sejtmagkondenzáció, apoptotikus testek kialakulása; Nekrózis kíséri. A Cistanche deserticola teljes glikozidjaival történő kezelés után az apoptózis aránya jelentősen csökkent, és a nekrózis helyzete is enyhült.
A bcl-2 gén egy proto-onkogén. Jelenleg öt bcl-2 géncsaládot (bcl-2, bcl-2 x, bax, mcl-1 és A1) találtak, amelyekben a bcl-2 képes gátolni a programozott sejthalált (PCD). A mechanizmus munkája a következőkre terjedhet ki: (1) a Ca2+. felszabadulás gátlása A Bcl-2 egy transzmembrán fehérje, amely főleg a sejtmag membránján található. A belső és a külső magmembránt az endoplazmatikus retikulum lumenje köti össze. Ez utóbbi az intracelluláris Ca2+ fő tárolóhelye, amely fontos szerepet játszik a sejtapoptózis folyamatában. Transzgenikus módszerekkel megállapították, hogy a bcl-2 magas expressziója gátolhatja a Ca2+ felszabadulását az endoplazmatikus retikulumból, ezért feltételezték, hogy a bcl-2 apoptózist gátló hatása összefüggésbe hozható az endoplazmatikus retikulumban lévő Ca2+-val [9]. (2) A Bcl-2 anti-apoptotikus szerepet játszik azáltal, hogy blokkolja a pro-apoptotikus gének jelátvitelét, vagy blokkolja ezeket az indukálható géntermékeket. Tanulmányok kimutatták, hogy a bcl-2 fehérje képes gátolni a P53 és a c-fos által kiváltott apoptózist [10]. (3) A Bcl-2 anti-apoptotikus szerepet játszhat a szabad gyökök gátlásával. A Bcl-2 antioxidáns szerepet tölt be, amely gátolja a szuperoxid képződését és hatását, így gátolja az apoptózis kialakulását [11].
A korai azonnali gének (IEG) olyan gének, amelyek korán megjelennek, és rövid ideig tartanak különféle káros ingerekre. A c-fos az egyik proto-onkogén, a 14q21-q31 kromoszómán található. Ez egy 9 kb méretű DNS, amely négy exonból és három intronból áll [12]. Az alapvető transzkripció alacsony, de különböző másodlagos hírvivő molekulákkal kiváltható a gyors és átmeneti expresszió érdekében. A c-fos fehérjeterméke a FOS, a c-Jun proto-onkogén által kódolt fehérje pedig a JUN. Az FOS leucin cipzárt (LZ) tartalmaz [13]. A FOS és a JUN az LZ szerkezeten keresztül heterodimert alkotnak a sejtmagban, az úgynevezett transzkripciós faktort AP-1, amely a célgén AP-1 helyével egyesül, és a sejtmag harmadik hírvivőjeként működik, lehetővé téve a célgén hosszú ideig történő expresszióját [14]. Morgan úgy véli, hogy a c-fos különböző kifejezései funkcióinak sokféleségét és összetettségét jelzik. Az átmeneti expresszió szerepet játszhat a sejtvédelemben, -javításban,-átalakításban és regenerációban, míg a tartós túlzott expresszió másodlagos károsodáshoz kapcsolódik. A kettő kifejeződési mechanizmusa eltérő. Ezért úgy tekinthetjük, hogy az olyan IEG-k, mint a c-fos, kettős szerepet játszanak. Amikor a javító védelmi rendszer teljesen gátolt, részt vesznek az apoptózisban; Ha nem gátolja, védő hatást fejt ki a lézió körüli sejtekre, és részt vesz a sejtjavítási és regenerációs folyamatokban [15]. A WebsterKR antiszensz nukleotidokat használ a c-fos transzkripciójának csökkentésére és az apoptózis előfordulásának megelőzésére, ami azt jelzi, hogy a c-fos túlzott expressziója elválaszthatatlanul összefügg különböző betegségek előfordulásával és kialakulásával [16].
Ebben a kísérletben, miután a májsejteket alkohollal károsították, az apoptózist gátló bcl-2 faktor expressziója szignifikánsan csökkent, a c-fos expressziója pedig megnőtt, ami arra utal, hogy a Cistanche deserticola összes glikozidja megvédheti a májsejteket a bcl-2 expressziójának fokozásával, a c-fos expressziójának gátlásával, csökkentve a májsejtkárosodást és az apoptózist.
