A Cistanche Tubulosa-ból származó szacharóz-szintáz génklónozása, funkcionális azonosítása, szerkezeti és expressziós elemzése Ⅲ

4 CtSus expressziós elemzése a Cistanche tubulosa és a sejttenyésztő rendszer különböző részein aszályos stressz alatt

4.1. A CtSus expressziós elemzése a Cistanche tubulosa különböző részein

In vitro, teljes sejt transzformációs kísérletek és enzimatikus katalitikus reakciók igazolták, hogy a CtSus gén által kódolt fehérje képes katalizálni az UDP-glükóz szintézisét. A gén és a glikozidvegyületek Cistanche tubulosa-ban történő bioszintézise közötti összefüggés további feltárása érdekében elemeztük ennek a génnek az expressziós szintjét a Cistanche tubulosa különböző részein.

KIVÁLÓ MINŐSÉGŰ CISTANCHE HERBA 10-98% ECHINACOSIDEVAL

Echinacoside is the most representative glycoside compound in Cistanche tubulosa, and its content can reach more than 30% of the dry weight of Cistanche tubulosa plants [23]. The research group previously measured the content of echinacoside in different parts of Cistanche tubulosa plants. Specifically, the content of echinacoside in different tissues is as follows: haustoria>underground part>>légi rész; közülük a haustoriákban a legmagasabb az echinakozid tartalma.

Valós idejű fluoreszcens kvantitatív PCR-t végeztünk a Cistanche tubulosa különböző részeiből származó cDNS-t templátként használva, és az eredményeket a 2–ΔΔCT módszerrel elemeztük és differenciálanalízist végeztünk. Az eredményeket a 4A. ábra mutatja. A CtSus gén expressziós szintje a haustoriában volt a legmagasabb, másfélszerese a légi részének, a föld alatti rész expressziós szintje pedig szignifikánsan magasabb, mint a légi részen, ami összhangban van a fenil-etanoid glikozidok felhalmozódási mintájával. az echinakozid képviseli a Cistanche tubulosa különböző részein.

4. ábra A CtSus relatív expressziós szintjei a C. tubulosa és a PEG6000-val kezelt szuszpenziós sejtek különböző részein. A: A CtSus relatív expressziós szintje a C. tubulosa különböző részein; B: A CtSus relatív expressziós szintje PEG6000-el kezelt C. tubulosa szuszpenziós sejtekben különböző időpontokban. n=3, 𝑥̅± s.*P ＜ 0,05,***P ＜ 0,001

4.2 CtSus expressziós elemzése Cistanche deserticola szuszpenziós sejtekben aszályos stressz körülmények között

A projekttel kapcsolatos előzetes kutatások kimutatták, hogy a PEG6000 által kiváltott szárazságstressz jelentősen növelheti a fenil-etanol-glikozidok felhalmozódását a Cistanche deserticola szuszpenziós sejtekben. Az indukció után 3-9 nappal az echinaceasid-tartalom jelentősen megnőtt. A 12. naptól a 15. napig az echinakozid tartalom növekedési üteme lelassult és a 15. napon érte el a maximális értéket. Majd a tenyésztési idő növekedésével az echinakozid tartalom jelentősen megnőtt. A fruktozid tartalma fokozatosan csökkent [24]. E kutatás alapján ez a cikk a kezeletlen Cistanche deserticola szuszpenziós sejtek cDNS-ét és a PEG6000-indukált Cistanche deserticola szuszpenziós sejteket használta templátként a valós idejű fluoreszcens kvantitatív PCR detektáláshoz, hogy megvizsgálja a CtSus gént Cistanche deserticola szuszpenziós sejtekben. aszályos stresszviszonyok. Az expressziós szintek változásai. Az eredményeket a 4B. ábra mutatja. A PEG6000 által indukált Cistanche deserticola szuszpenziós sejtekben a CtSus expressziója szignifikánsan megemelkedett az indukciót követő 6. napon, a legmagasabb értéket a 9. napon érte el, majd a kontrolléval megegyező szintre esett vissza. Azonos szintű csoportok. A fenti eredmények azt mutatják, hogy a szárazságstressz jelentősen növelheti a CtSus gén expresszióját a Cistanche deserticola szuszpenziós sejtvonalban, ami összhangban van az echinaceaside aszályos stressz alatti felhalmozódási mintájával. A CtSus gén expressziós csúcsa azonban korábban jelenik meg, mint az echinaceasid tartalom csúcsa, mivel a CtSus katalízissel szintetizált aktív glikozil donor fontos prekurzor, amely szükséges a többlépcsős glikozilációs reakcióhoz az echinaceaside későbbi bioszintetikus útjában. , azt feltételezik, hogy miután aszályos stressznek vannak kitéve, az organizmusok előszeretettel mobilizálják az elsődleges anyagcserével kapcsolatos géneket, hogy elérjék az aktív donorok felhalmozódását, majd az anyagcseretermékek fontos másodlagos metabolikus felhalmozódását.

5 A CtSus fehérje háromdimenziós szerkezetének tanulmányozása és a kulcsfontosságú aktív helyek elemzése

A CtSusnak a glikozil donor UDP-glükóz termelését katalizáló funkciója alapján a CtSus katalitikus aktivitásának szerkezeti alapjait tovább vizsgáltuk. A SOPMA online eszközt használták a fehérje másodlagos szerkezetének előrejelzésére. Az eredmények azt mutatták, hogy a CtSus másodlagos szerkezete 55,28% -hélixet, 25,47% véletlenszerű tekercset, 12,80% kiterjesztett szálat és 6,46% -fordulatot tartalmazott (5A ábra), ami azt jelzi, hogy a -hélixek a CtSus fehérje legfontosabb másodlagos szerkezeti egységei. ezt követik a véletlenszerű tekercsek, amelyek szintén a fehérje nagy részét teszik ki. A kiterjesztett szálak és -fordulatok eloszlanak a fehérjében. A meglévő tanulmányok szerint a szacharóz-szintáz általában tetramer formájában létezik, amelyet az aktív formájának tekintenek. Ezért ez a tanulmány tovább használta az AlphaFold2-t a CtSus fehérje szerkezetének előrejelzésére, és megkapta a fehérje tetramerek háromdimenziós szerkezetét. A PDB (Protein Data Bank) adatbázis-összehasonlítás azt találta, hogy az Arabidopsis thaliana szacharóz-szintáz AtSus1 (PDBID 3S28) és a CtSus szekvencia hasonlósága elérheti a 77,93%-ot. A megjósolt CtSus szerkezetet összehasonlították az AtSus1 háromdimenziós szerkezetével, és a fehérje szuperpozíció utáni négyzetes eltérés (RMSD) értéke 1,11 Å volt, ami azt jelzi, hogy a kettő térbeli struktúrája nagyon konzisztens (5B. ábra).

5. ábra A CtSus szerkezeti vizsgálata. V: A CtSus előrejelzett másodlagos szerkezete a SOPMA segítségével.Blue: helix; Lila: véletlenszerű tekercs; Piros: meghosszabbított szál; Zöld: lap. B: Az AtSus1 (kék színben) és a CtSus (zöld színben) háromdimenziós szerkezeti igazítása. Mindkettőt tetramerként mutatták be. C: Kulcsmaradékok az AtSus1 (kék színben) és a CtSus (zöld színben, jelölt maradékokkal) szubsztrátkötő zsebében; D: Az UDP és a fruktóz kötési konformációinak összehangolása AtSus1-ben (kék színben) és CtSus-ban (zöld színben); E: Az UDP és a CtSus közötti kölcsönhatások 2D diagramban, a Discovery Studio Client segítségével

Az Arabidopsis AtSus1 UDP-t és fruktózt tartalmazó fehérje-ligand kristály komplex szerkezetét (PDBID3S29) használták templátként [16] a CtSus UDP-vel és fruktózzal való kötődésének elemzésére. A molekuláris dokkolás eredményeit az 5C. ábra mutatja. Megfigyelhető, hogy az AtSus1 és a CtSus szubsztrátkötő zsebei nagyon hasonlóak aminosavtípust, térbeli eloszlást és konfigurációt tekintve, és nagy az átfedés, ami azt bizonyítja, hogy a szacharóz-szintáz szekvenciája erősen konzervált növényekben. A két ligandum, az UDP és a fruktóz konformációja a fehérjeszubsztrát-kötő zsebben az 5D. ábrán látható. Az UDP és a CtSus molekuláris dokkolás szempontjából legelőnyösebb konformációja jól átfedésben van az AtSus1-UDP kristálykomplexumban lévő UDP konformációjával, ami bizonyítja a molekuláris dokkolás eredményeinek pontosságát. Az UDP és a kulcsfontosságú aminosavak közötti kölcsönhatás a fehérjeszubsztrát-kötő zsebben az 5E. ábrán látható. Az UDP-t és a CtSus-t főleg hidrogénkötések és hidrofób kölcsönhatások kötik össze. A szubsztrátkötő zsebben található kulcsfontosságú aminosavak közé tartozik a Leu294, Gly301, Met576, Arg578, Lys583, Gln646, Asn652, Leu677, Thr678 és Glu681.

Vita

A glikozilezés módosítása az egyik fontos eszköz a természetes termékek vagy gyógyszer-prekurzorok fizikai tulajdonságainak és biológiai aktivitásának javítására. A hagyományos kémiai módszerekkel összehasonlítva az enzimatikus glikozilezési módosítás előnye az enyhe reakciókörülmények, az erős szelektivitás és a környezetbarátság. A glikoziltranszferáz glikozilezési reakciójához azonban nagy mennyiségű UDP-cukor donorra van szükség, amelyek költsége és nehezen beszerezhető, ami azt eredményezi, hogy a glikoziltranszferázokat nem lehet széles körben alkalmazni az ipari termelésben. A szacharóz-szintáz katalizálhatja a reverzibilis reakciót: szacharóz + UDP ⇌ UDP-glükóz + fruktóz, és megújuló UDP-glükóz ciklust hozhat létre a glikozil-transzferázzal való kapcsolási reakció révén. A Cistanche tubulosa gazdag különféle szerkezeti típusú glikozidvegyületekben, amelyeket fenil-etanol-glikozid vegyületek képviselnek, ami arra utal, hogy a szervezetében az aktív glikozil-donor szintézis út, amely a szacharóz-szintázt is magában foglalja, erős metabolizmussal rendelkezik, de a Cistanche növényekből származó releváns szacharóz-szintáz nem. jelentették. Ebben a vizsgálatban először klónoztak CtSus szacharóz-szintáz gént Cistanche tubulosa-ból. Az e gén által kódolt fehérje a növényi szacharóz-szintáz konzervált doménjét tartalmazza. Más növényekből származó szacharóz-szintázok szekvenciájának összehasonlításával azt találták, hogy az aminosav-szekvenciák hasonlósága közöttük és az azonos rendű növényekből származó szacharóz-szintázok között több mint 90%, ami a növényekből származó szacharóz-szintázok szekvenciakonzerválódásának magas fokát jelzi. A molekuláris evolúciós elemzés kimutatta, hogy a CtSus a kétszikű növények szacharóz szintáz ágához tartozik, és a legszorosabb rokonságban áll az Orobanchaceae családba tartozó P. ramosa PrSus szacharóz szintázával.

A CtSus katalitikus aktivitásának feltárása érdekében ez a tanulmány az UGT71BD1 glikozil-transzferázt kombinálta, amelynek aktivitását a kutatócsoport korábban igazolta, hogy létrehozzon egy kettős plazmidos koexpressziós rendszert. Teljes sejtes katalitikus kísérletekkel a feltételeket további UDP-cukor donorok hozzáadása nélkül sikerült elérni. A kumarin vegyület, a fahéj és a sztilbén vegyület, a rezveratrol glikozilációs reakciója. A kontrollcsoporthoz képest a CtSus hozzáadása jelentősen megnövelte az UGT71BD1-katalizált glikozilációs reakciók konverziós sebességét. Ezen az alapon ez a tanulmány tovább állított egy CtSus rekombináns expressziós plazmidot, és elérte a rekombináns fehérje oldható expresszióját E. coliban. In vitro enzimatikus katalitikus reakciók azt mutatják, hogy szacharóz és UDP jelenlétében a CtSus képes katalizálni az UDP-glükóz képződését, majd miután a rekombináns fehérjében lévő trigger faktor affinitási jelzőt eltávolítják, a CtSus terméke katalizálja az UDP képződését. - glükózt kapunk. Az arány jelentősen javult. A teljes sejt transzformáció és az in vitro enzimatikus katalitikus reakciók eredményei megerősítették a CtSus szacharóz szintáz katalitikus aktív cukordonor UDP-glükóz aktivitását. A CtSus gén és a Cistanche tuberosum glikozidok bioszintézise közötti összefüggés további feltárása érdekében valós idejű fluoreszcencia kvantitatív PCR kísérletekkel elemeztük a CtSus expresszióját a Cistanche tuberosum különböző részein. Az eredmények azt mutatták, hogy a gén a Cistanche tuberosum haustoriájában expresszálódott. A legmagasabb kifejezési szint. A Cistanche deserticola egy parazita növény, és nem tudja beszerezni a növekedéshez és fejlődéshez szükséges tápanyagokat fotoszintézis útján. Ezért élősködőnek kell lennie a gazdanövény gyökerein, és a gazdanövényre kell támaszkodnia, hogy tápanyagokhoz jusson a növekedés fenntartásához. A növényekben a szacharóz többnyire energiát és szénforrást biztosít [12]. A szacharózt azonban a sejtek nem tudják közvetlenül felhasználni, ezért tovább kell bontani. A haustoria a Cistanche deserticola és a tápnövény között összekötő híd, és létfontosságú szerepet játszik annak növekedési folyamatában. kritikus

[25], ezért indokolt a szacharóz-szintáz magas expressziója a Cistanche deserticola haustoriájában. A CtSus magas expressziója a haustoriában szintén összhangban van a fenil-etanoid-glikozidok nagy felhalmozódási mintájával a haustoriában. Ezenkívül a Cistanche deserticola szuszpenziós sejtekben a CtSus génexpressziós szintjének változásának fluoreszcencia kvantitatív PCR analízisével aszályos stressz alatt különböző időpontokban azt találták, hogy a szárazság stressz jelentősen növelheti a CtSus gének expresszióját a szuszpenziós sejtvonalban, ami összhangban van az echinaceasiddal. A szuszpenziós sejtvonalak aszályos stressz alatti felhalmozódási mintája következetes. A fenti eredmények arra utalnak, hogy a CtSus részt vesz az echinacea által képviselt fenil-etanol-glikozidok bioszintézisében a Cistanche tulipisban in vivo. Ez az egyik a sok bioszintetikus út közül. Az első lépéses glikozilációs reakció biztosítja az aktív glikozil donor UDP-glükózt. Röviden ez a tanulmány

A tanulmány új szacharóz-szintáz gént azonosított a Cistanche deserticolában, amely lehetővé tette az aktív glikozil-donorok in vitro enzimatikus szintézisét, és új genetikai elemeket biztosított a Cistanche deserticola glikozidok bioszintéziséhez szükséges mérnöki baktériumok felépítéséhez.

A szerző hozzászólásai: Tian Weisheng a bioinformatikai elemzésért, expressziós elemzésért, enzimaktivitás-elemzésért és a CtSus gén első vázlatának megírásáért volt felelős; Yan Yaru volt a felelős a génszűrésért és a klónozásért; Cui Xiaoxue és Huang Wenqian részt vett a bioinformatikai elemzésben és expressziós elemzésben; Wang Yingxia és Zhao Saijing részt vett a vektorépítésben és az enzimaktivitás-elemzésben; Li Jun és Shi Shepo főként az enzimaktivitás-analízist és az expressziós elemzést irányították; Tu Pengfei és Liu Xiao voltak felelősek a papírötlet megtervezéséért, a kísérletek irányításáért, valamint a papír megírásáért és átdolgozásáért. Minden szerző részt vett a dolgozat átdolgozásában.

Hivatkozások

[1] Dal ZH, Lei L, Tu PF. Előrelépések a CistancheHoffing növények farmakológiai aktivitásának kutatásában. et Link [J]. Chin Tradit Herb Drugs (中草药), 2003, 34: 113-115.

[2] Liu WJ, Liu Y, Song QQ és mások. A tenyésztett és a vadon élő Cistanchetubulosa kémiai összehasonlítása 1H-NMR spektroszkópiával [J]. China J Chin Mater Med (中国中药杂志), 2018, 43:3506-3512.

[3] Song Y, Zeng K, Jiang Y és mások. Cistanches Herba, egy veszélyeztetett fajtól a kínai orvoslás nagy márkájáig [J]. Med Res Rev, 2021, 41: 1539-1577.[4] Liu Y, Wang H, Yang M és mtsai. A Cistanche deserticola poliszacharidok megvédik a PC12 sejteket az OGD/RP által kiváltott sérülésektől [J]. Biomed Pharmacother, 2018, 99: 671-680.

[5] Yin Y, Huang J, Gu X et al. Növényi nukleotid-cukor interkonverziós enzimek evolúciója [J].PLoS One, 2011, 6: e27995.

[6] Bar-Peled M, O'Neill MA. Növényi nukleotid cukorképzés, interkonverzió és megmentés cukor újrahasznosítással [J]. Annu Rev Plant Biol, 2011, 62: 127-155.

[7] Guo H, Li L, Wang PG. Az Escherichia coli O86:B7 [J] UDP-GlcNAc/Glc4-epimeráz biokémiai jellemzése. Biochemistry, 2006, 45: 13760-13768.

[8] Dong S, Chesnokova ON, Turnbough CL Jr, et al. A Bacillus anthracis [J] exosporium fehérje glikozilációjában szerepet játszó UDP-N-acetil-glükózamin4-epimeráz azonosítása. J Bacteriol, 2009, 191: 7094-7101.

[9] Li LN, Kong JQ. A szacharóz szintáz gének transzkriptomra kiterjedő azonosítása az Ornithogalumcaudatumban [J]. RSC Adv, 2016, 6: 18778-18792.

[10]Schmölzer K, Gutmann A, Diricks M és társai. Szacharóz-szintáz: egyedülálló glikoziltranszferáz a biokatalitikus glikozilációs folyamat fejlesztéséhez [J]. Biotechnol Adv, 2016, 34: 88-111.[11]Cardini CE, Leloir LF, Chiriboga J. A szacharóz bioszintézise [J]. J Biol Chem, 1955, 214: 149-155.