Absztrakt

A bőr hiperpigmentációs rendellenességeit, mint például a melasma, a szeplők és a gyulladás utáni hiperpigmentáció (PIH), gyakran ultraibolya-B (UVB) sugárzás, bőrsérülés és helyi bőrgyulladás váltja ki. A melanin túlzott lerakódása rontja a bőr megjelenését és negatívan befolyásolja a páciens lelki jólétét. A hagyományos depigmentáló szerek, mint például a hidrokinon, elsősorban egymódusú tirozinázt céloznak meg, és jól dokumentált biztonsági kockázatokat hordoznak magukban. A többcélú természetes botanikai keverékek a modern funkcionális kozmetikai készítmény ígéretes alternatíváiként jelentek meg.

A feniletanoid-glikozidok (PhG-k) jellegzetes bioaktív összetevők, amelyekből izoláljákCistanche deserticola, egy jól ismert gyógynövény a száraz sivatagi vidékekről. Glabridin (Gla), egy prenilált izoflaván, amelyből kivontákGlycyrrhiza glabra, széles körben elismert nagy hatású bőrfényesítő természetes vegyület. Ez a kutatás szisztematikusan vizsgálta a glabridinnel kombinált PhG-k szinergikus antihiperpigmentációs teljesítményét. Az előzetes tömegarány-szűréshez in vitro biokémiai vizsgálatokat alkalmaztak, beleértve a tirozináz gátlást, a DPPH és az ABTS⁺ szabadgyök-fogó teszteket. Három sejtmodellt építettek tovább: UVB-besugárzott B16F10 egér melanoma sejtpigmentációs modell; lipopoliszacharid (LPS) által stimulált HaCaT keratinocita gyulladásos modell; AAPH-indukált HaCaT oxidatív-stressz modell. Számszerűsítettük az intracelluláris tirozináz aktivitást, a melanintartalmat, a gyulladást elősegítő citokin felszabadulást (IL-6, TNF-), a szuperoxid-diszmutázt (SOD) és a kataláz (CAT) enzimaktivitást lefedő mutatókat. Kombinációs index (CI) számítást hajtottak végre a két növényi kivonat közötti szinergikus kölcsönhatás kvantitatív azonosítására.

A tesztelt arányok közül az m(PhGs):m(Gla)=1:1, 5:1 és 10:1 tömegarányok kiemelkedő tirozináz-szuppresszív és antioxidáns szinergiát mutattak. 0,4 g/l összkoncentrációnál 6,8 pH-jú foszfátpufferes sóoldatban (PBS) a tirozináz gátlási aránya elérte a 94,37%-ot (1:1), 92,93%-ot (5:1) és 88,06%-ot (10:1). A megfelelő DPPH gyökfogó százalékos arány 89,44 %, 88,72 %, 88,10 % volt; Az ABTS⁺ kation gyökfogó kapacitása 100,13 %, 100,01 %, 99,87 %. 25 ug/ml munkakoncentrációnál mindhárom vegyületforma nem mutatott szignifikáns citotoxicitást B16F10 és HaCaT sejtvonalakkal szemben. Az 1:1 arányban kevert csoport kiemelkedő átfogó hatékonyságot produkált: a reziduális intracelluláris tirozináz aktivitás 23,80%-ra, a relatív melanintartalom 30,90%-ra csökkent. Ezen túlmenően a PhGs/Gla (1:1) a legerősebben gátolta az IL-6 és a TNF-szekréciót, és maximálisan helyreállította a SOD és CAT antioxidáns enzimaktivitást. A kísérleti eredmények megerősítették, hogy a glabridinnel párosított PhG-k szinergikus anti-hiperpigmentációs eredményeket érnek el hármas úton: gátolják a melanin bioszintézisét, enyhítik a bőrgyulladást és ellensúlyozzák az oxidatív stresszt. Az 1:1 tömegarány optimális integrált biológiai teljesítményt biztosít. Ez a tanulmány kísérleti bizonyítékokkal szolgál, amelyek alátámasztják aCistanchefeniletanoid glikozidok-glabridin kompozit anyagok a tiszta szépségű, növényi eredetű fehérítő bőrápoló alapanyagok fejlesztésében.

Kulcsszavak: Cistanche deserticolafeniletanoid-glikozidok; glabridin; szinergikus hatás; antihiperpigmentáció; antioxidáns; gyulladáscsökkentő; kozmetikai botanikai alapanyagok

1. Bevezetés

A melanin túlzott felhalmozódása az epidermális rétegekben heterogén bőrpigmentációs fenotípusokat eredményez, beleértve a melazmát, az ephelideket és a gyulladás utáni hiperpigmentációt (PIH) Google for.... Számos külső és belső hajtó tényező járul hozzá a kóros melanin túltermeléshez. Az UVB ultraibolya sugárzás az elsődleges környezeti kiváltó tényező; bőrsérülés és krónikus lokális gyulladásos reakciók tovább erősítik a pigmentzavarokat. Jól bebizonyosodott, hogy az epidermális keratinociták és a melanociták közötti áthallás uralja a pigment progresszióját. Külső stimuláció hatására az aktivált keratinociták reaktív oxigénfajtákat (ROS) és gyulladást elősegítő mediátorokat szabadítanak fel. Ezek a jelzőmolekulák diffundálnak és hatnak a szomszédos melanocitákra, fokozzák a tirozináz katalitikus aktivitását, felgyorsítják a melanin szintézist és elősegítik a melanoszóma keratinociták felé történő transzportját, végül látható pigmentált elváltozásokat hoznak létre a bőrfelületen. Ennek megfelelően a hiperpigmentáció hatékony beavatkozása nem korlátozódhat a tirozináz gátlására. A multimodális terápiás stratégiáknak egyidejűleg ki kell terjedniük a melanogenezis gátlására, a gyulladásgátló beavatkozásra és az oxidatív stressz semlegesítésére.

A hagyományos szintetikus bőrvilágosító hatóanyagok, mint például a hidrokinon, elsősorban a direkt tirozináz-szuppresszió révén fejtik ki a depigmentációs hatást. Mindazonáltal az egycélú mechanizmusok korlátozzák a gyakorlati teljesítményt, és a hidrokinon hosszú távú helyi alkalmazása bőrirritációt, kontakt dermatitiszt és potenciális biztonsági kockázatokat válthat ki, korlátozva a kozmetikai minőségű felhasználást. A természetes növényi eredetű bio-összetevők enyhe profiljuk és többutas farmakológiai hatásuk miatt egyre nagyobb érdeklődést váltanak ki a kozmetikai készítők és a fogyasztók körében. A különböző növényi kivonatok összetett keverékei képesek szinergikus biológiai hatások kifejtésére, növelve az általános hatékonyságot, miközben csökkentik a hatékony adagolási követelményeket, ami új technikai irányokat nyit a pigmentáció elleni kozmetikai-alapanyag-kutatásbanGoogle

Cistanche deserticola, amelyet általában "sivatagi ginzengnek" neveznek, a hagyományos kínai orvoslás klasszikus tonizáló gyógynövénye. A modern fitokémiai vizsgálatok kimutatták, hogy a fenil-etanoid-glikozidok (PhG-k) alkotják a fő farmakológiailag aktív frakciót, amelyek jellemző vegyületei az echinakozid és az akteozid. A publikált farmakológiai kutatások azt mutatják, hogy a PhG-k erős antioxidáns kapacitással, gyulladásgátló bioaktivitással és mérsékelt tirozináz-gátló potenciállal rendelkeznek, ami várhatóan alkalmazható bőrgyógyászati ​​bőrápoló anyagokban. A glabridin egy jellegzetes izoflavonoid vegyület, amelyből izoláljákGlycyrrhiza glabragyökér, a kozmetikai iparban "fehérítő aranyként" ismert. Erőteljesen elnyomja a melanogenezist, és egyidejűleg modulálja a bőr gyulladásos kaszkádjait. A hagyományos orvoslás elméleti szemszögébőlCistanchetáplálja a veseesszenciát és tonizálja a jangot, míg az édesgyökér tonizálja a lépet és kitisztítja a hőmérget. A kombinált felhasználás megfelel a gyógynövényes bőrgyógyászati ​​terápiák összetett kompatibilitási elveinek.

A mechanisztikus hipotézis azt tartja, hogy a PhGs-glabridin kombináció szabályozhatja a bőr pigmentációját több célponton és több útvonalon keresztül: együttesen gátolja a tirozináz katalitikus funkcióját a melanin képződésének megszakítása érdekében; a reaktív-oxigén-fajok felhalmozódásának kioltása; gátolja a gyulladást elősegítő faktor túlzott felszabadulását, hogy megszakítsa a ROS és citokin által közvetített jelerősítést a melanociták aktiválásához. A mai napig kevés kutatási cikk számolt be szisztematikusan szinergikus antihiperpigmentáció-értékelésről erre a bináris keverékre.

Ez a cikk a kombinált biológiai hatások feltárását tűzi ki célulCistanchefeniletanoid glikozidok és glabridin. Először biokémiai in vitro enzimgátlási és gyökfogó szűrési kísérleteket hajtottak végre. Három reprezentatív sejtmodellt állítottak elő, amelyek utánozzák a pigmentlerakódást, a bőrgyulladást és az oxidatív károsodást a többdimenziós hatékonyságértékeléshez. A kombinációs index módszertant alkalmazták a szinergia vagy antagonizmus kölcsönhatásainak számszerűsítésére. Célunk az volt, hogy meghatározzuk az optimális vegyülettömeg-arányt, tisztázzuk a hármas üzemmódú funkcionális mechanizmusokat, és kísérleti adattámogatást nyújtsunk a természetes szinergikus bőrfényesítő kozmetikai alapanyagok kifejlesztéséhez.

2. Anyagok és módszerek

2.1 Reagensek, sejttörzsek és laboratóriumi műszerek

A B16F10 egér melanoma sejtvonalat (STCC20013G-1) a Saierbio Co., Ltd.-től vásároltuk. Az immortalizált humán epidermális keratinocita HaCaT-t (iCell-h066) az iCell Bioscience Inc.-től szereztük be.CistancheA fenil-etanol-glikozidokat (PhG-ket) és a glabridint (Gla) a Shaanxi Tianxingjian Biochemical Technology Co., Ltd. szállította kereskedelemben. Gomba tirozináz, arbutin, L-tirozin, L-DOPA, DPPH, ABTS diammónium só, L-aszkorbinsav, AAPH, LDM0 és egyéb trifluorsav (X-SO1-vitamin) az analitikai minőségű kémiai reagenseket a főbb biokémiai reagens-szállítóktól szerezték be. A sejtkultúra fogyóeszközök közé tartozott a magas glükóz tartalmú DMEM táptalaj, a magzati szarvasmarha szérum, a penicillin-sztreptomicin vegyes oldat. A humán IL-6, TNF-, CAT és total-SOD kimutatására szolgáló ELISA vizsgálati készleteket a megfelelő biotechnológiai gyártóktól szereztük be.

A kulcsfontosságú laboratóriumi berendezések Multiskan FC teljes hullámhosszú mikrolemez-leolvasót, Heracell 371 CO₂ inkubátort (Thermo Fisher) tartalmaztak; KQ-200VDB ultrahangos tisztító; állandó hőmérsékletű vízfürdő; DHG-9246A fúvókaszárító sütő; KN4006B UVB ultraibolya besugárzású műszer 8 mW/cm² kimenő besugárzással.

2.2 Mintaoldat előkészítése

A PhG-k és a glabridin törzsoldatait pH 6,8 PBS pufferben vagy 50 % (v/v) etanol-víz oldószerben készítettük, sorozathígítással munkakoncentrációkra: 0,001 g/l, 0,005 g/L, 0,025 g/l, 0,1 g/l, 0,04 g/l, 0,04 g/l, 2,8 g/l. 1,6 g/l, 2,0 g/l. Kilenc összetett csoportot állítottunk be 0,4 g/l rögzített össztömeg-koncentráció mellett, változó tömegarányokkal m(PhGs):m(Gla)=40:1, 20:1, 10:1, 5:1, 1:1, 1:5, 1:10, 1:20, 1:40, Ph4/Gsla, Ph4/Gsla (PhGs/Gla) (1:40).

A celluláris kísérleti vizsgálatokhoz a pormintákat szérummentes DMEM tápközegben oldottuk fel, hogy munkakoncentrációs oldatok sorozatát készítsék.

2.3 Biokémiai in vitro vizsgálatok

2.3.1 Tirozináz gátlási vizsgálat

50 μL mintaoldatot, 50 μL pH 6,8 PBS-t és 50 μL 1 g/LL-tirozin szubsztrát oldatot adtunk egymás után a 96 lyukú mikrolemez minden üregébe. Az előinkubálás 37 fokos vízfürdőben 10 percig zajlott. Ezt követően 50 μl 0,4 g/l-es gomba tirozináz oldatot (200 U/ml) egészítettünk ki, és az inkubálást 37 fokon 10 percig folytattuk. Az arbutin pozitív kontrollanyagként működött, a vak kontroll 6,8 pH-jú PBS puffert választott. Az abszorbancia értéket 490 nm hullámhosszon mértük mikrolemez-leolvasón. A tirozináz-gátlási arány számítási képlete:

Tirozináz gátlási arány (%)={1 − [(A_reakció − A_reakció-kontroll) / (A_blank − A_blank-kontroll)]} × 100 %

Ahol: A_reakció: abszorbanciát tartalmazó minta, szubsztrát, PBS és tirozináz; A_reakciókontroll: a minta, a szubsztrát és a PBS abszorbanciája enzim nélkül; A_blank: szubsztrát, PBS és tirozináz abszorbanciája; A_blank-control: abszorbancia csak a szubsztrátum és a PBS puffer esetében.

2.3.2 DPPH szabadgyökfogó meghatározás

A DPPH port vízmentes etanolban feloldva 0,2 mmol/l DPPH munkafolyadékot állítunk elő. A PhG-ket, a glabridint és a C-vitamin referenciaanyagot 50%-os etanol-víz oldószerben oldották fel, hogy koncentrációgradiens törzsoldatokat kapjanak. A kilenc tömegarányú bináris keverékmintákat egyenletesen összekevertük. Mindegyik lyukba 100 μL mintafolyadékot és 100 μL DPPH munkaoldatot kapott. Alapos keverés után a mikrolemezt környezeti hőmérsékleten 30 percig fénytől távol tartottuk. Az abszorbancia leolvasást λ = 517 nm-en vettük fel. A C-vitamin pozitív kontrollként működött, minden kísérleti csoport megismételte 3 biológiai ismétlést. DPPH-tisztítási sebesség képlete:

DPPH tisztítási arány (%)={1 − [(A₁ − A₃) / A₂]} × 100 %

A1: minta abszorbanciája + DPPH munkafolyadék; A2: 50% etanol + DPPH munkafolyadék abszorbanciája; A3: az 50%-os etanol oldószerrel kevert mintaoldat abszorbanciája.

2.3.3 ABTS⁺ Kation gyökfogó vizsgálat

A 7,4 mmol/l ABTS törzsoldatot és a 2,6 mmol/l kálium-perszulfát oldatot egyenlő arányban kevertük össze, és sötét környezetben 12 órán át inkubáltuk, hogy stabil ABTS⁺ munkareagenst kapjunk. A mintaoldatokat a 2.3.2. 40 szakaszban leírt protokollok szerint konfiguráltuk. μL mintaoldatot és 160 μL ABTS⁺ munkafolyadékot pipettáztunk a mikrolemez lyukaiba. 6 perces, szobahőmérsékleten végzett, fényárnyékolt inkubálás után az abszorbanciát 734 nm-en mértük. ABTS⁺ gyökfogó sebességi képlet:

ABTS⁺ ürítési arány (%)={1 − [(A₁ − A₃) / A₂]} × 100 %

A1: a mintaoldat és az ABTS⁺ munkaoldat abszorbanciája; A2: ABTS⁺ munkareagenssel kevert ionmentesített víz abszorbanciája; A₃: tiszta ionmentesített vizes oldószerrel kevert mintaoldat abszorbancia értéke.

2.4 Sejttenyésztési eljárások

A B16F10 melanoma sejteket és a HaCaT keratinocitákat magas glükóz tartalmú DMEM táptalajban tenyésztettük, amelyet 10% magzati-marha szérummal és 1% penicillin-sztreptomicinnel egészítettek ki. Inkubátor paraméterei: 37 fok, 5 térfogat% CO₂, relatív páratartalom 70 %. A sejtek áthaladását és a tápközeg frissítését a fordított optikai mikroszkóp alatt megfigyelt sejtnövekedési sűrűség szerint végeztük. A logaritmikus növekedési fázisban lévő sejteket összegyűjtöttük, hogy később 96 lyukú tenyésztőlemezekre oltsák.

2.5 Három sejtes funkcionális modell létrehozása

2.5.1 UVB-indukált B16F10 pigmentációs modell

A megfelelő mintaközeggel végzett 1 órás előkezelés után a sejtréteg felületét PBS pufferrel fedtük be. Az UVB besugárzás intenzitása 8 mW/cm², a besugárzási távolság 3 cm, a besugárzás időtartama 110 s. A normál csoport azonos tápközeget kapott UVB sugárzás beavatkozás nélkül. A modell kontrollcsoport PBS-előkezelést kapott, majd egyenlő dózisú UVB-expozíciót kapott minta-kiegészítés nélkül.

2.5.2 LPS-közvetített HaCaT gyulladásos aktivációs modell

A HaCaT sejteket 24 órán keresztül előinkubáltuk a tesztminta DMEM táptalajjal. Ezt követően lipopoliszacharid LPS-oldatot egészítettünk ki, hogy elérjük a 20 ug/ml végső koncentrációt, és az együtttenyésztés további 24 óráig tartott. A modellcsoport sejtjeit LPS-sel provokáltuk minta-előkezelés nélkül. A normál csoport a szokásos teljes táptalajt tartotta fenn.

2.5.3 AAPH által kiváltott HaCaT oxidatív stressz modell

A sejtek 24 órás minta-előinkubálást kaptak. AAPH-reagenst adtunk a táptalajhoz, végkoncentráció 25 mmol/L, 24 órás inkubációt folytatva. A modell-kontroll csoportot AAPH stimulálta mintabeavatkozás nélkül. A normál kontroll csoport normál közepes körülmények között nőtt.

Minden sejtmodell-csoport három technikai replikációs lyukat tartalmazott.

2.6 Citotoxicitási teszt (CCK-8 módszer)

A sejtszuszpenziót 1 × 104 sejt/ml sűrűségre állítottuk be, és 96 lyukú mikrolemezekre oltottuk be. A sejttapadás után gradiens-koncentrációs mintaközeget adtunk be, és az inkubációt 24, 48 és 72 órán keresztül folytattuk. CCK-8 detektáló reagens friss DMEM tápközeggel (térfogatfrakció 10%) keverve a régi táptalajt helyettesítette, az inkubálást 60 percig folytattuk. A mikrolemez-leolvasó abszorbanciát mért 450 nm hullámhosszon. A relatív sejtéletképesség százalékának számítási képlete:

A sejtek életképessége (%)=[(A_minta − A_blank) / (A_0 − A_blank)] × 100 %

A_sample: a mélyedést tartalmazó sejtek, a CCK-8 reagens és a mintaközeg abszorbanciája; A_blank: a tenyésztő tápközeg abszorbanciája plusz CCK-8 oltott sejtek nélkül; A_0: vak tápközeggel tenyésztett sejtek és CCK-8 reagens abszorbanciája (nincs tesztminta).

2.7 Az intracelluláris tirozináz aktivitás mennyiségi meghatározása

48 órás modell-alapítási feldolgozás után a sejtfelülúszót eldobtuk. Az egyrétegű sejteket kétszer mostuk pH 7,4-es PBS-sel. 50 µL 1%-os Triton X-100 lízisoldatot adtunk lyukonként. A mikrolemezt -80 fokos hűtőszekrényben 30 percig lefagyasztottuk, majd szobahőmérsékleten felengedtük a sejtmembrán teljes felszakadásához. Az előmelegítő kezelés 37 fokon 5 percig tartott. L-DOPA szubsztrátot (10 mmol/L, 10 μL) egészítettünk ki. A mikrolemezt 1 órán át inkubáltuk CO2 inkubátorban. Az abszorbanciát 475 nm-en detektáltuk a relatív intracelluláris tirozináz-aktivitás kiszámításához.

2.8 Intracelluláris melanintartalom mérése

NaOH hasítási módszert alkalmaztak a melanintartalom kimutatására. A 72 órás modellbeavatkozás után a tenyészet felülúszóját eltávolítottuk, a sejteket kétszer öblítettük PBS pufferrel . 100 μL 1 mol/l NaOH vizes oldat, amely 10% DMSO-t tartalmazott. A mikrolemezt 90 fokos sütőben 60 percig inkubáltuk a melanin teljes feloldódása érdekében. Az abszorbanciát 490 nm-en olvastuk le a relatív melanintartalom százalékos kiszámításához.

2.9 Gyulladásos faktor és antioxidáns-enzim indikátorok kimutatása

48 órás modellfeldolgozás után a HaCaT sejteket lekapartuk és összegyűjtöttük, centrifugáltuk a sejtfelülúszó begyűjtéséhez. Kereskedelmi ELISA készleteket használtak az IL-6 és a TNF-pro-inflammatorikus citokin koncentrációk kvantitatív meghatározására. Az antioxidáns-enzim teszteléséhez a sejtpelleteket ismételt fagyasztás-olvasztás ciklusnak vetettük alá, hogy elérjük a sejtfragmentációt. Centrifugálási körülmény: 12 000 fordulat/perc, 4 fok, 10 perc. A felülúszó frakciót összegyűjtöttük, hogy meghatározzuk a SOD vitalitást és a CAT enzimtartalmat a kit működési előírásai szerint.

2.10 Kombinációs index (CI) elemzés

Chou-Talalay kombinációs index (CI) algoritmust alkalmaztak a PhG-k és a glabridin közötti szinergikus/additív/antagonista kölcsönhatás megítélésére a tirozináz-gátlási és antioxidáns vizsgálatokon belül:

CI=D₁/DX₁ + D2/DX₂

D₁ and D₂: individual mass‑concentration of PhGs and glabridin inside compound solution, when reaching fixed biological‑effect level X. DX₁ and DX₂: required mass‑concentration for single PhGs or glabridin to produce identical X‑level biological effect. CompuSyn software completed CI‑value computation. Evaluation criteria: CI >az 1. ábra antagonista kölcsönhatást jelöl; CI ≈ 1 additív hatást jelent; CI< 1 indicates significant synergistic‑enhancement effect.

2.11 Statisztikai elemzés

A kísérleti mérési eredményeket átlagérték ± standard deviáció (átlag ± SD) formában fejeztük ki. A GraphPad Prism 9.5.0 szoftver statisztikai számításokat végzett. Egytényezős varianciaanalízist (ANOVA) alkalmaztunk a többcsoportos összehasonlításhoz. P-érték< 0.05 was regarded as statistically significant difference; P < 0.01 marked significant difference; P < 0.001 stood for extremely significant statistical difference.
 

3. Eredmények és megbeszélés

3.1 PhG-k, glabridin- és bináris keverékminták in vitro tirozináz-gátló teljesítménye

Half‑inhibitory concentration IC₅₀ values for single‑component PhGs PBS solution, glabridin PBS solution and positive‑control arbutin were (2.192 ± 0.038) g/L, (1.376 ± 0.025) g/L and (0.101 ± 0.003) μg/mL respectively. In‑vitro tyrosinase‑suppressing potency sequence: arbutin > glabridin >PhGs.

A PBS-oldat 0,4 g/l összkoncentrációja esetén a PhGs/Gla (10:1), a PhGs/Gla (5:1), a PhGs/Gla (1:1) 88,06%-os, 92,93%-os, 94,37%-os tirozináz-gátlást eredményezett. Mind az 5:1, mind az 1:1 arányok meghaladták az egykomponensű PhG-k (36,92%) és az egykomponensű glabridin (92,71%) gátlási hatékonyságát, a megfelelő össztömeg-koncentráció mellett. Az 1:1 arányú csoport a pozitív kontroll arbutinhoz hasonló mértékű gátlást ért el. A CI-érték számítási eredményei szerint: m(PhGs):m(Gla) 40:1 és 1:1 között generált CI< 1, confirming obvious synergistic enhancement on tyrosinase‑suppression. Conversely, proportion series from 1:5 up to 1:40 gave CI >1, amely antagonista kölcsönhatást mutat.

A fenolos hidroxilcsoportok jelentik a tirozináz-gátló képesség központi funkcionális részét. A PhG-k orto-dihidroxifenil szerkezeti fragmentumokat tartalmaznak, amelyek képesek rézionok kelátképzésére a tirozináz katalitikusan aktív zsebében, kompetitív módon akadályozva a szubsztrát-enzim kötődését. A glabridin izoflaván váza 2-OH és 4-OH csoportokat hordoz a B-gyűrűjén, szerkezetileg analóg az L-tirozin/L-DOPA aromás hidroxilcsoporttal szubsztituált gyűrűvel, lehetővé téve az enzimaktív hely domén kompetitív elfoglalását. Összekeverés után a kumulatív fenol-hidroxil mennyiség növekszik; eközben két molekula kapcsolódhat a tirozináz fehérje különböző kötőhelyeihez, együttesen erősítve a gátló hatékonyságot.

3.2 A vizsgálati minták gyökfogó antioxidáns hatása

DPPH‑scavenging IC₅₀ data: PhGs (21.135 ± 1.164 μg/mL), glabridin (55.537 ± 5.230 μg/mL), Vitamin C positive reference (2.852 ± 0.252 μg/mL). DPPH radical‑quenching‑ability ranking: Vitamin C > PhGs >glabridin. A PhG-k bőségesek a koffeoil-csoportban és a 3,4-dihidroxi-fenil-etanol-részekben, a konjugált kettős kötésrendszerekkel pedig erősítik a szabadgyök-semlegesítő teljesítményt. A glabridin flavonoid keretrendszer hidroxilcsoportokat és kiterjesztett konjugált gyűrűs architektúrát is biztosít a reaktív oxigén fajokból származó páratlan elektronok stabilizálásához.

Három ígéretes PhGs/Gla (1:1), (5:1), (10:1) vegyületcsoport kiváló DPPH- és ABTS⁺-eltávolító teljesítményt nyújtott. Az ABTS⁺-megkötési arány majdnem elérte a 100%-ot, ami a kationok szabad gyökeinek csaknem teljes eliminációját jelzi. A különböző tömegarányok eltérő molekuláris kölcsönhatási állapotokat hoznak létre két molekula között, ami eltérésekhez vezet a hidroxilcsoport expozíciós állapotában, és az antioxidánsok szinergikus mértékének eltéréséhez vezet.

3.3. PhG-k, glabridin és kevert készítmények citotoxicitásának értékelése

A CCK-8 citotoxicitási vizsgálata kimutatta, hogy a 62,5-500 ug/ml koncentrációtartományban lévő PhG-k és a 6,25-25 ug/ml glabridin nem váltanak ki nyilvánvaló életképesség-csökkenést a B16F10 és HaCaT sejtvonalak esetében. 25 ug/ml össztömeg-koncentráció mellett három, PhGs/Gla (1:1, 5:1, 10:1) vegyületarány-csoport magas sejtéletképességet tartott fenn, és nem mutatott kimutatható citotoxikus hatást mindkét sejttörzzsel szemben. Következésképpen a 25 ug/ml-t választották biztonságos munkakoncentrációnak a sejtfunkció későbbi értékeléséhez. Az egyszeres csoportok esetében a PhG-k alacsony/közepes/magas dózisát 125 ug/ml, 250 ug/ml, 500 ug/ml értékben határozták meg; glabridin alacsony/közepes/nagy dózisú: 6,25 ug/ml, 12,5 ug/ml, 25 ug/ml.

3.4 Befolyás az intracelluláris tirozináz-aktivitásra és a melanintartalomra az UVB-stimulált B16F10-sejtekben

UVB besugárzásos kezelés után a B16F10 modellcsoport statisztikailag szignifikánsan megemelkedett az intracelluláris tirozináz aktivitásban és a melanin felhalmozódásában (P< 0.001), verifying successful construction of cellular pigmentation‑model. Both single‑agent PhGs and glabridin reduced tyrosinase‑activity and melanin level following concentration‑dependent tendency.

25 ug/ml egységes összkoncentráció mellett a vegyületcsoportok jobb biológiai eredményeket mutattak, mint az egykomponensű társaik. Három arány közül a PhGs/Gla (1:1) optimális hatást fejtett ki: a maradék intracelluláris tirozináz-aktivitás csak 23,80%, a relatív melanintartalom 30,90%-ra csökkent. A statisztikai összehasonlítás szignifikáns különbséget mutatott az 5:1 és 10:1 vegyületcsoportokhoz képest. Az 1:1 arány kiemelkedő szinergikus amplifikációt mutatott a melanin bioszintézisének visszafogására a melanocita sejtekben.

Az UVB-sugárzás melanociták belső melanogén jelátviteli kaszkádját váltja ki, fokozza a MITF transzkripciós faktor expresszióját, és tovább indukálja a tirozináz fehérje túlzott expresszióját. Sejtkísérleti eredményeink igazolták, hogy a glabridinnel kombinált PhG-k hatékonyan visszafordíthatják az UVB által kiváltott tirozináz aktivációt és csökkenthetik a melanintermelést.

3.5 Gyulladáscsökkentő hatás az LPS-fertőzött HaCaT keratinocitákra

Az LPS-stimuláció erősen megnövelte az IL-6 és a TNF-pro-inflammatorikus citokin szekréciót a HaCaT modellcsoportban (P< 0.001), proving inflammatory‑model replication success. Individual PhGs and glabridin suppressed cytokine release in concentration‑dependent manner.

When comparing three compound ratios at 25 μg/mL, anti‑inflammatory potency sequence was PhGs/Gla (1:1) > PhGs/Gla (5:1) >PhGs/Gla (10:1). Az 1:1 arányú készítmény maximálisan csökkentette az IL-6 és a TNF-felszabadulást, meghaladva a PhG-k vagy glabridin külön alkalmazásával elért gátló hatást.

Molekuláris mechanizmus magyarázata: a PhGs fenol-hidroxil csoportja megköti a gyulladást kiváltó szabad gyököket; ezen túlmenően a PhG-k megzavarhatják az NF-κB és MAPK intracelluláris jelátviteli kaszkádokat, hogy visszafogják a gyulladást elősegítő gén transzkripciót. A glabridin gátolja a stressz által aktivált kináz JNK és p38 foszforilációját, blokkolva a downstream gyulladásos jelátvitelt. Egyetlen anyag csak részben képes elnyomni a gyulladásos jelút aktiválását. A bináris kombináció egyszerre több csomópontot is beavatkozik a gyulladásjelző hálózaton belül, így szinergikus gyulladásgátló teljesítményt ér el.

A bőrgyulladás a PIH előfordulásának kritikus upstream mozgatórugója. A keratinociták által kiválasztott gyulladásos citokinek parakrin jelátviteli hírvivőként működnek, stimulálva a szomszédos melanocitákat, hogy felgyorsítsák a melanintermelést és a melanoszóma transzfert. Az epidermális gyulladás hatékony enyhítése elengedhetetlen a hiperpigmentációs elváltozások megelőzéséhez és javításához. Ezért a PhGs-glabridin vegyület gyulladásgátló előnye további értéket biztosít a pigmentáció elleni kozmetikai anyagok alkalmazásában.

3.6 Antioxidáns-enzim-szabályozó képesség AAPH-indukált oxidatív-stressz körülmények között

Az AAPH oxidatív-stressz modellcsoport az intracelluláris SOD és a CAT antioxidáns-enzim vitalitásának nyilvánvaló csökkenését mutatta (P< 0.001). Treatment with PhGs or glabridin alone could partially restore SOD and CAT activity. Among compound‑ratio groups, PhGs/Gla (1:1) displayed most powerful capability to elevate SOD and CAT enzyme level inside HaCaT cells.

Az ultraibolya sugárzásnak kitett bőr nagy mennyiségű reaktív oxigén fajt termel. A felesleges ROS nemcsak közvetlenül oxidálja a melaninszintézishez kapcsolódó biomolekulákat, hanem több melanogén jelátviteli útvonalat is aktivál. Az endogén antioxidáns-enzim rendszer (SOD, CAT) jelenti a fő védekezési akadályt az intracelluláris ROS kiküszöbölésében. Amikor az oxidatív stressz túllépi a belső antioxidáns kapacitást, a ROS-felhalmozódás felgyorsítja a pigmentáció progresszióját. A PhGs-glabridin vegyület nemcsak közvetlenül megköti a szabad gyököket fenol-hidroxil kémiai reakción keresztül, hanem helyreállítja a sejtek antioxidáns-enzimrendszerének működését is, két dimenzióból enyhítve az oxidatív stressz okozta károsodást. A különböző tömegarányok megváltoztatják a két természetes molekula közötti molekuláris kölcsönhatás mintázatát, ami eltérést eredményez a végső antioxidáns-szabályozó hatékonyságban.

3.7 Átfogó vita a szinergikus anti-hiperpigmentációról

A bőr hiperpigmentációs kóros folyamata összetett jelátviteli hálózatot alkot: az UVB-sugárzás mind a melanocitákra, mind a környező keratinocitákra hat. A keratinociták ROS-t és gyulladást elősegítő citokineket bocsátanak ki. Ezek a bioszignálok tovább aktiválják a melanocitákat, szabályozzák a tirozináz aktivitást, fokozzák a melanin bioszintézist, és megkönnyítik a melanoszóma transzportját az epidermális keratinociták felé, ami végül látható pigment lerakódáshoz vezet a bőr felszínén. Ennek megfelelően az egycélú tirozináz-gátlás nem tudja teljesen visszafordítani a patológiás pigmentációt. A többutas beavatkozási stratégiának integrálnia kell a melanogenezis-gátlást, a gyulladásgátlót és az antioxidáns védelmet.

Kísérleti eredményeink azt mutatták, hogy a PhG-k glabridinnel kombinálva multimodális beavatkozást valósítanak meg a hiperpigmentáció ellen:

Közvetlenül elnyomja a tirozináz katalitikus aktivitását a melanocitákon belül, hogy gátolja a melanin bioszintézis forrását;

Gátolja a gyulladást elősegítő citokin túlzott szekrécióját a keratinocitákból, levágja a melanociták felé irányuló parakrin gyulladásos stimulációs jelet;

Távolítsa el a felesleges reaktív oxigén fajokat, és állítsa vissza az endogén SOD/CAT antioxidáns-enzim aktivitást, csökkentve az oxidatív stressz által közvetített pigment-amplifikációt.

Az m(PhGs):m(Gla) = 1:1 arány optimális, átfogó szinergikus teljesítményt mutatott a biokémiai enzimgátlás, a gyökfogó, a melanocita pigment-modell, a keratinocita-gyulladás-modell és az oxidatív-stressz-modell tekintetében. Ez az arány szinte minden tesztelési mutatóban felülmúlta az 5:1 és 10:1 csoportokat. A szinergia származhat komplementer molekuláris szerkezeti jellemzőkből: a PhG-k és a glabridin különálló fenol-vázrendszerrel rendelkeznek, és különböző célfehérjékkel lépnek kölcsönhatásba (tirozináz, gyulladást jelző kinázok, antioxidáns-enzimekkel kapcsolatos útvonalak). A vegyületek összekeverése után a fenol-hidroxil expozíciós állapot optimalizálódik az intermolekuláris kölcsönhatás révén, javítva az általános biológiai aktivitást.

A kozmetikai ipar gyakorlati perspektívájából a szinergikus botanikai összetett nyersanyagok két fő előnnyel járnak. Először is, a szinergikus hatás lehetővé teszi az egyes hatóanyagok szükséges adagjának csökkentését, csökkentve a készítmény költségeit; Másodszor, a többutas funkcionális profil megfelel a klinikailag megfigyelt bőrhiperpigmentáció, például a PIH és a melasma összetett patológiás mechanizmusának, és elméleti alapot kínál a nagy hatékonyságú természetes bőrfényesítő kozmetikai formulák kifejlesztéséhez.

4. Következtetés

Ez a kutatás szisztematikusan értékelte a szinergikus hiperpigmentáció elleni bioaktivitástCistanche deserticola eredetűfeniletanoid-glikozidok (PhG-k) glabridinnel (Gla) kombinálva. Biokémiai in vitro szűrést és három reprezentatív sejtmodellt alkalmaztak a hatékonyság többdimenziós jellemzésére. A fő kísérleti következtetéseket a következőkben foglaljuk össze:

A tirozináz-gátlás és a szabadgyök-fogó in vitro biokémiai teszteken belül az m(PhGs):m(Gla) = 1:1, 5:1, 10:1 vegyületkészítmények kedvező gátló hatást és szinergikus kölcsönhatást mutattak. 0,4 g/l összkoncentráció mellett 6,8 pH-jú PBS-ben a tirozináz-gátlási arány elérte a 94,37%-ot (1:1), 92,93%-ot (5:1), 88,06%-ot (10:1). DPPH gyökfogó ráta: 89,44 %, 88,72 %, 88,10 %. ABTS⁺ gyökfogó ráta: 100,13 %, 100,01 %, 99,87 %.

25 ug/ml biztonságos munkakoncentráció mellett a PhGs/Gla (1:1), (5:1), (10:1) DMEM oldatok nem mutattak citotoxicitást a B16F10 melanomasejtekkel és a HaCaT humán keratinocitákkal szemben. Ezen csoportok közül a PhGs/Gla (1:1) érte el a legjobb integrált hatékonyságot: az intracelluláris tirozináz-aktivitás 23,80%-ra, a melanintartalom 30,90%-ra csökkent. Legerősebben gátolta az IL-6-ot, a TNF-gyulladásos citokin felszabadulását, és maximálisan helyreállította az SOD és a CAT antioxidáns-enzim vitalitását. Az 1:1 tömegarányú csoport nyilvánvalóan jobb szinergikus hatást fejtett ki, mint az egyszeres csoportok és más vegyületarányos csoportok.

A PhG-k és a glabridin bináris keveréke hármas úton fejt ki bőrhiperpigmentáció elleni hatást: elnyomja a melanin bioszintézist, enyhíti az epidermális gyulladást és ellensúlyozza az oxidatív stressz okozta károsodást. Az optimális szinergikus-tömeg-arány m(PhGs):m(Gla) = 1:1. Ez a tanulmány kísérleti bizonyítékokkal és műszaki támogatással szolgál a természetes növényi eredetű, többfunkciós kozmetikai alapanyagok kifejlesztéséhez bőrvilágosító és pigmentfoltosodás elleni alkalmazásokhoz.

Köszönetnyilvánítás

Ezt a munkát a Kínai Nemzeti Természettudományi Alapítvány (Grant No. 82160772) pénzügyileg támogatta. Köszönjük a Xinjiang Key Laboratory of Clinical Drug Research kísérleti platform támogatását.

Hivatkozások

[1] Nautiyal A, Wairkar S. A hiperpigmentáció kezelése: Jelenlegi kezelések és kialakulóban lévő terápiák [J]. Pigment Cell & Melanoma Research, 2021, 34(6):1000-1014.

[2] Yardman-Frank J M, Fisher D E. A bőr pigmentációja és szabályozása: az ultraibolya sugárzástól az őssejtekig [J]. Experimental Dermatology, 2021, 30(4):560-571.

[3] Neagu N, Conforti C, Agozzino M, et al. Melasma kezelés: szisztematikus áttekintés [J]. Journal of Dermatological Treatment, 2022, 33(4):1816-1837.

[4] Hossain M. R., Ansary T. M., Komine M. és mtsai. A változatos ingerek által kiváltott gyulladásos utak bőrpigmentációt okoznak [J]. International Journal of Molecular Sciences, 2021, 22(8):3970.

[5] Song X, Ni M T, Zhang Y és mások. Az epigallocatechin-3-gallát és gallocatechin-gallát tirozináz elleni gátló képességének és a kojsavval való kombinált hatásának összehasonlítása [J]. Food Chemistry, 2021, 349(1):129172.

[6] Zolghadri S, Beygi M, Mohammad T F, et al. A tirozináz megcélzása hiperpigmentációban: jelenlegi állapot, korlátok és jövőbeli ígéretek [J]. Biochemical Pharmacology, 2023, 212:115574.

[7] Cicero A. L., Delevoe C., Gilles-Marsens F, et al. A keratinociták által kibocsátott exoszómák modulálják a melanociták pigmentációját [J]. Nature Communications, 2015, 6:7506.

[8] Serre C, Busuttil V, Botto J M. Az emberi bőr melanogenezisének és pigmentációjának belső és külső szabályozása [J]. International Journal of Cosmetic Science, 2018, 40(4):328-347.

[9] Irfan M, Shafeeq A, Siddiqui U et al. A kozmetikai krémekben található nehézfémek, hidrokinon és mikroorganizmusok toxicitásának és kockázatának mechanikus megközelítése[J]. Journal of Hazardous Materials, 2022, 433:128806.

[10] Zheng Y, Du X S, Zhang L, et al. A hidrokinon által kiváltott bőrirritáló reakciót a hízósejtek aktiválásával lehet elérni a tömeghez kapcsolódó G-fehérjéhez kapcsolt X2[J] receptoron keresztül. Experimental Dermatology, 2023, 32(4):436-446.

[11] Meng H, Liu X K, Li J R et al. A ginzeng bőrre gyakorolt ​​hatásának bibliometriai elemzése[J]. Journal of Cosmetic Dermatology, 2022, 21(1):99–107.

[12] Liu F, Qu L K, Li H et al. A természetes fehérítő anyagok orvosbiológiai funkcióinak fejlődése a bőr pigmentációs betegségek kezelésében[J]. Gyógyszerészet, 2022, 14(11):2308.

[13] Wang T T, Zhang D, Wang Y J et al. Lonicera japonica polifenolok és a Vaccinium vitis-idaea L etanolos kivonata szinergikus bőrápolás.[J]. Fine Chemicals, 2023, 40(3):627-637.

[14] Wu Y, Liu Q, Tang W és mások. Salvia miltiorrhiza illóolaj és gyermekláncfű kivonat komplexeinek alkalmazása kozmetikában[J]. Fine Chemicals, 2022, 39(3):562-568.

[15] Chen J R, Zhu X Y, Cui H Y et al. Hszincsiang tartomány különböző fajtáiból és részeiből származó Cistanche deserticola hatóanyag-változatainak és antioxidáns aktivitásának elemzése[J]. Élelmiszeripari Tudomány és Technológia, 2024, 45(21):227-233.

[16] Xiao L Y, Yao J, Miao Y Y és társai. A Cistanche tubulosa-ból izolált tubulozid B ígéretes szer az M1 makrofágok aktivációja ellen a Mob1 és ERK1/2 [J] szinergikus célzása révén. Biomedicine & Pharmacotherapy, 2022, 153:113414.

[17] Xu H H. Tanulmány a Herba cistanches fenil-etanol-glikozidjairól a bőrön keresztül történő bejuttatásról és a melaninszintézis gátló hatásairól a B-indukált pigmentációban barna tengerimalacban[D]. Urumcsi: Hszincsiangi Orvostudományi Egyetem, 2020.

[18] Huang J, Xie C, Pan Z. A glabridin, a resveratrol és a poldatin komplex szinergikus fehérítő, antioxidáns és gyulladásgátló hatásai [J]. Flavor Fragrance Cosmetics, 2024(3):99–107,233.

[19] Wang S Q, Zhu Y Z, Zheng X B. A Chou-Talalay módszer tanulmányozása és alkalmazása daganatellenes gyógyszerkombinációra [J]. Chinese Journal of Modern Applied Pharmacy, 2013, 30(4):449-453.

[20] Pillaiyar T, Manickam M, Namasivayam V. Bőrfehérítő szerek: A tirozináz inhibitorok gyógyszerkémiai perspektívája [J]. Journal of Enzyme Inhibition & Medicinal Chemistry, 2017, 32(1):403-425