Szinergikus immunitás és védelem egerekben a SARS-CoV tüskeproteinjét és egyéb strukturális fehérjéit kódoló DNS-oltóanyagokkal történő együttes immunizálással-2

Absztrakt:A súlyos akut légúti szindróma koronavírus 2 (SARS CoV-2) új változatainak megjelenése világszerte ismétlődő fertőzési kitöréseket generált. Ezek az erősen mutált változatok csökkentik a jelenlegi koronavírus-betegség 2019 (COVID-19) vakcinák hatékonyságát, amelyeket úgy terveztek, hogy csak az eredeti vírus tüske (S) fehérjét célozzák meg. A SARS-CoV-2 S-én kívül más szerkezeti fehérjék (nukleokapszid, N; burok, E; membrán, M) vakcina célantigénjeként még nem tisztázott, és vizsgálatra érdemes. Ebben a vizsgálatban négy SARS-CoV-2 szerkezeti fehérjét (pS, pN, pE és pM) kódoló szintetikus DNS-vakcinákat fejlesztettek ki, és az egereket három dózissal immunizáltuk intramuszkuláris injekcióval és elektroporációval. Figyelemre méltó, hogy az S- és N-fehérjét expresszáló két DNS-vakcinával történő együttes immunizálás magasabb neutralizáló antitesteket indukált, és hatékonyabban csökkentette a SARS-CoV{10}} vírusterhelést, mint az S-fehérje önmagában egerekben. Ezen túlmenően, a pS együttes immunizálás pN-nel vagy pE + pM-mel három immunizálás után magasabb S-fehérje-specifikus celluláris immunitást indukált, és enyhébb kórszövettani elváltozásokat okozott, mint a pS önmagában a fertőzés után. A SARS-CoV-2 konzervált szerkezeti fehérjéinek szerepét, ideértve az N/E/M fehérjéket is, tovább kell vizsgálni az oltóanyag-tervezésben, például mRNS-vakcinákban való alkalmazásuk szempontjából.

cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert

Kulcsszavak: COVID-19; SARS-CoV-2}}; társimmunizálás; DNS-vakcina; tüskefehérje; szerkezeti fehérje

1. Bemutatkozás

A súlyos akut légúti szindróma koronavírus 2 (SARS-CoV-2) a 2019-es koronavírus-betegség (COVID-19) okozója, amely fertőzések és halálozások millióit okozta világszerte, és veszélyeztette az emberi egészséget és a világgazdaságot. . Bár hatékony terápiás megközelítések még mindig nem állnak rendelkezésre, gyorsan fejlődtek, beleértve a CAR-T sejtterápia és a nanotechnológia alkalmazását [1,2]. A vakcinázás hatékony módja a járvány leküzdésének, és számos védőoltás használatát engedélyezték a különböző egészségügyi szabályozó testületek [3,4]. A koronavírus genomja négy fő szerkezeti fehérjét kódol, nevezetesen a tüske (S), a nukleokapszid (N), a membrán (M) és a burok (E) fehérjéket, amelyek felelősek a virionok összeállításáért és a gazdaszervezet immunválaszának elnyomásáért [5] ]. Az S fehérje 1273 aminosavból áll, amelyek két alegységet tartalmaznak, nevezetesen az S1-et és az S2-t. Közvetíti a vírus bejutását, és fő célpontja a koronavírus elleni vakcinák kifejlesztésének [6–11]. A SARS-CoV-2 S fehérje azonban magas mutációs gyakorisággal rendelkezik. Nem meglepő, hogy a SARS-CoV{19}}-ben, egy RNS-vírusban a mutáció folyamatos és elkerülhetetlen. Öt SARS-CoV{21}} aggodalomra okot adó variáns (VOC) jelent meg 2020 szeptembere óta, köztük a B.1.1.7 (UK, Alpha), B.1.351 (Dél-Afrika, Béta), P.1 (Brazília, Gamma), B.1.617.2 (India, Delta) és B.1.1.529 (Dél-Afrika, Omicron) (Andreano és Rappuoli, 2021; Gupta, 2021). Mindegyiküknek számos mutációja van a tüskefehérjében [12]. Ezek a változatok veszélyeztetik a jelenlegi COVID-19 vakcinák hatékonyságát, amelyeket úgy terveztek, hogy csak a tüskefehérjét célozzák meg.

A SARS-CoV-2 N-fehérje a magjukban található 140-aminosav-hosszú RNS-kötő doménen keresztül kötődik a virális RNS-hez, "gyöngy a húron" módon. A koronavírusok között erősen konzervált, körülbelül 90%-os szekvenciaazonosságot mutat a SARS-CoV-éval, és ez az egyetlen szerkezeti fehérje a virionon belül [13]. Ezenkívül fontos szerepet játszik a vírus RNS-nek a ribonukleokapszid komplexbe való becsomagolásában, és szükséges a vírus RNS replikációjához, a virionok összeállításához és a gazdasejtekből való felszabaduláshoz [14]. A koronavírusokban található N-fehérje nagy szekvenciahasonlósága alapján keresztvédő vakcina célpontként javasolható. Korábban azt találtuk, hogy az E- és M-fehérjéket expresszáló két DNS-vakcinával történő együttes immunizálás részleges védelmet nyújt a SARS-CoV-2 ellen, és ezt a módszert figyelembe kell venni a vakcina fejlesztése során [15]. A WHO tájékozódási dokumentumától függően általában hét stratégia létezik a SARS-CoV-2 vakcinajelöltekre, amelyek további három kategóriába sorolhatók: először is fehérjealapú vakcinák, beleértve az inaktivált vírusvakcinákat, vírusszerűek. részecskék és fehérje alegység vakcinák; másodszor, génalapú vakcinák, beleértve a vírusvektoros vakcinákat, DNS-vakcinákat és mRNS-oltásokat; harmadszor, fehérjealapú és génalapú megközelítések kombinációja, mint például az élő attenuált vírusvakcinák. A DNS-technológiák, mint új génalapú vakcina-stratégiák, gyorsan összehasonlíthatnak több vakcinajelöltet és stratégiát a preklinikai tesztelés során [16,17]. Elméletileg szinte minden vírusfehérje potenciális immunogén és vakcina célpont. Legjobb tudomásunk szerint azonban a szintetikus DNS-vakcinák immunogenitásáról és védőpotenciáljáról a SARS-CoV-2 S fehérjék és más szerkezeti fehérjék kódolásában szisztematikusan még nem számoltak be. Négy SARS-CoV-2 S-, N-, E- és Ml-fehérjét expresszáló DNS-vakcina immunogenitását és védőhatékonyságát egerekben értékelték, hogy feltárják az S immunológiai hatásait más szerkezeti fehérjékkel kombinálva.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Sejtek

A Huh7.5 sejteket és a humán embrionális vese 293T sejtjeit 37 ◦C-on, párásított atmoszférában, 5% CO2 mellett tenyésztettük a vizsgálat során. A sejteket DMEM tápközegben (HyClone, Logan, UT, USA) tenyésztettük, kiegészítve 10% FBS-sel (GEMINI Co., Shanghai, Kína) és 1% penicillin-sztreptomicinnel (Gibco, New York, NY, USA). Valamennyi sejtvonal negatívnak bizonyult mikoplazma-szennyeződés tekintetében.

2.2. SARS-CoV-2 S/N/E/M kódoló DNS-vakcinák felépítése

A SARS-CoV-2 S/N fehérjét kódoló gént, amely egy N-terminális Kozak szekvenciát (GCCACC), majd egy iniciációs kodont (ATG) tartalmaz, egy emlősökre optimalizált kodon (GenScript Co., Nanjing) segítségével szintetizáltuk. , Kína). Ezután EcoRI- és Xbal-emésztéssel a pcDNA3.1 (+) expressziós vektorba klónoztuk, és pS/pN-nek (DNS-vakcinák) nevezték el (1A. ábra). A pE/PM fehérjét a korábban leírtak szerint állítottuk elő és azonosítottuk [15]. A vakcinákat endotoxin-mentes Maxiprep készletekkel (Qiagen, Peking, Kína) állítottuk elő, és a szekvenciákat Sanger DNS-szekvenálással igazoltuk. Az S/N fehérje expresszióját Western blottal és 1:1000 arányban hígított anti-S (Sino Biological, Peking, Kína)/anti-N antitestekkel igazoltuk. Ezeket a kísérleteket a korábban leírtak szerint végeztük [15,18].

1. ábra. Rekombináns DNS-alapú SARS-CoV-2 S/N fehérje vakcina konstrukciók tervezése és expressziója. (A) A SARS-CoV-2 tüskét (PS), nukleokapszidot (pN), burkot (pE) és/vagy membránt (PM) kódoló rekombináns DNS-alapú vakcinák sematikus diagramja. (B) A DNS-vakcinákban a célfehérje expresszióját a pS/pN/pE/pM plazmidokkal transzfektált 293T sejtek Western blot analízisével validáltuk.

2.3. Védőoltás és kihívás

Nőstény BALB/c egereket (Charles River Laboratories, Franciaország) 6 hetes korukban az Országos Foglalkozás-egészségügyi és Méregellenőrzési Intézetben helyeztek el 21 ◦C-os és páratartalom-szabályozott környezetben, 12 órás világos/sötét ciklusokkal. Eközben élelmet és vizet ad libitum biztosítottak, és minden állatkísérletet jóváhagyott a Kínai Betegségellenőrzési és Megelőzési Központ (China CDC) Állatkísérletek Etikai Bizottsága. A kutatás megfelelt a vonatkozó etikai előírásoknak.

Az egereket véletlenszerűen öt csoportra osztottuk, és önmagában pS/pN-nel vagy pS + pN-nel vagy pS + pE + PM-mel együtt immunizáltuk a 0., 21. és 42. napon intramuszkuláris injekcióval plusz elektroporációval (35 mg/50). ml) (2. ábra) [19,20]. Röviden, DNS-vakcinákat injektáltunk a tibialis anterior (TA) izomba, és azonnal elektromos pulzálást végeztünk egy 5 mm-es távolságra lévő kéttűs elektróda (ECM830; BTX) tűkkel. Az egerek szérumát összegyűjtöttük a humorális immunválasz elemzéséhez, és az egér lépét feldolgoztuk a celluláris immunválasz mérésére (2. ábra).

2. ábra: Az immunizálás és a SARS-CoV-2 fertőzés vázlata. Az oltás, a kihívás és a vér/szövet mintavétel időbeli lefolyása. A BALB/C egereket véletlenszerűen csoportokra osztottuk.

A SARS-CoV-2 fertőzési kísérleteket a korábban leírtak szerint végeztük [15,21]. Röviden, az egereket elaltattuk, majd intranazálisan 2,5 × 108 PFU Ad5-hACE2-vel transzdukáltuk 45 µl össztérfogatban. Öt nappal a transzdukció után az egereket elaltattuk, majd intranazálisan fertőztük 1 × 105 TCID50 SARS-CoV-2 (Wuhan/IVDC HB-02/2019) 50 µl össztérfogatú sóoldattal. puffer. Az egérmodelleken végzett élő SARS-CoV{20}}-vel végzett összes munkát az Animal Biosafety Level 3 (ABSL-3) laboratóriumokban végezték.

2.4. Enzim-kapcsolt immunszorbens vizsgálat

Az enzimhez kötött immunszorbens vizsgálatokat (ELISA) a korábban leírtak szerint végezték [15]. Röviden: S (a Sino Biological-tól vásárolt)/N fehérjéket (a Song ajándéka) karbonát pufferrel (0,1 M, pH 9,6) hígítottuk fel 96-lyukú EIA/RIA lemezekre (Thermo). Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) egy éjszakán át 4 ◦C-on. A lemezeket 200 µl 10%-os kecskeszérummal blokkoltuk PBS-ben 37 °C-on 2 órán át, majd ötször mostuk PBST-vel. Ezután 2%-os kecskeszérummal PBS-ben sorozathígított szérummintákat adtunk hozzá, és 2 órán át 37 °C-on inkubáltuk, majd ötször mostuk PBST-vel. HRP-konjugált kecske anti-egér IgG Ab-ot (1:5000) adtunk hozzá 37 ◦C-on 1 órán át. Összesen 100 µl TMB szubsztrátot adtunk minden egyes lyukhoz, és 50 µl 2 M H2SO4-gyel leállítottuk. Az abszorbanciát 450 nm hullámhosszon olvastuk le SPECTR Ostar Nano (BIO-GENE, Hong Kong, Kína) segítségével.

cistanche növény-növelő immunrendszer

Kattintson ide a Cistanche Enhance Immunity termékek megtekintéséhez

【Kérjen többet】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.5. Pseudovírus fertőzési és semlegesítési kísérletek

A pszeudovírus neutralizációs vizsgálatot a korábban leírtak szerint végeztük [21,22]. Az ősi vírus S fehérjét expresszáló plazmidot korábban készítettek [22]. Az Omicron variáns SARS-CoV-2 tüskeprotein gént (GISAID: EPI_ISL_6590782.2) szintetizálták (a Vazyme Biotech Co., Ltd., Nanjing, Kína ajándéka) emlősre optimalizált kodont használva és a pcDNA3.1 vektorba klónozva, a korábban leírtak szerint [22]. Röviden, a luciferáz riportert expresszáló plazmidokat és az S fehérjét expresszáló plazmidokat együtt transzfektáltuk HEK 293T sejtekbe X-treme GENE HP DNS transzfekciós reagens alkalmazásával. A sejttenyészetet 6 órával a transzfekció után frissítettük, a pszeudovírus tartalmú felülúszót 48 óra elteltével gyűjtöttük össze, és -70 ◦C-on tároltuk. A pszeudovírus-neutralizációs vizsgálatban egy egyenlő szérum-vírus keveréket inkubáltunk 37 térfogatnyi pszeudovírust tartalmazó felülúszóval, majd hozzáadtuk a hígított szérumhoz. ◦C 1 órán át. A Huh7.5 sejttenyésztő tápközeget ezután 100 µl szérum-vírus keverékkel helyettesítettük, és 37 ◦C-on 12 órán át inkubáltuk. A csak SARS-CoV-2 pszeudovírusokkal tenyésztett sejteket párhuzamosan futtattuk. A tápközeget ezután DMEM-re (2% FBS) cseréltük, és az inkubálást 37 °C-on 48 órán át inkubáltuk. Ezután a luciferáz jelet a Bright-Glo szentjánosbogár luciferáz készlettel (Promega) mértük.

2.6. SARS-CoV-2 semlegesítési vizsgálat

Ebben a kísérletben a SARS-CoV-2 (Wuhan/IVDC-HB-02/2019) vegyületet használtuk. Röviden, a szérumokat kétszeresére hígítottuk 1:10-es kiindulási hígításból, összekevertük azonos térfogatú (10-15 pfu/lyuk) élő SARS-CoV-vel{10}}, és 1 órán át 37 ◦C-on inkubáltuk. ami után hozzáadták a kioltott Vero sejtekhez. 37 °C-on 48 órás inkubálás után citopátiás hatást (CPE) figyeltünk meg, és a tenyészet felülúszójából 100 µl-t gyűjtöttünk be nukleinsav-extrakcióhoz és valós idejű fluoreszcens reverz transzkripciós PCR-hez (RT-PCR). A medián neutralizációs dózist (ND50) Reed–Munch módszerrel számítottuk ki [15].

2.7. IFN-ELISpot Assay

A teljes S/N/E/M fehérjét lefedő peptidkészleteket, mint egymást követő 15-merek 10 aminosavval átlapolva, a Scilight Biotechnology, LLC szintetizálta. A peptidkészletben lévő egyes tisztított peptidekből körülbelül 2,5 mg volt jelen ampullánként. A kísérletet a korábban leírtak szerint végeztük [18]. Röviden: 96-lyuklemezeket (BD ELISPOT Set, USA) bevontunk anti-IFN-befogó Ab-val, és egy éjszakán át 4 ◦C-on inkubáltuk. A lemezeket háromszori mosás után a teljes tápközeggel blokkoltuk. A lépsejteket az egerek elaltatása után gyűjtöttük össze a 35. napon, és 120. Minden csoportból friss egysejtes szuszpenziót szélesztettünk 5 x 106 lyukanként, és peptideket adtunk hozzá. A lemezeket ezután 37 °C-on 5%-os CO2-ban 22 órán át inkubáltuk, és ELISpot lemezleolvasóval (Biosys, So. Pasadena, CA, USA) detektáltuk. A foltképző egység (SFU) egy T-sejt-szekretáló IFN-t képvisel.

2.8. Az egerek védelmének értékelése a SARS-CoV-2 utáni kihívás után

A kísérleteket a korábban leírtak szerint végeztük [15,21]. Röviden, a tüdőt az egerek elaltatása után gyűjtöttük be. A szövetek felét nukleinsav extrakcióra, valós idejű fluoreszcens RT-PCR-re és TCID50-re használták. A másik felét a Kínai Mezőgazdasági Egyetem Állatorvosi Főiskolájára küldték kóros kivizsgálásra.

2.9. Statisztikai analízis

A nem párosított t-teszteket, a kétirányú ANOVA-teszteket és a Dunnett-féle többszörös összehasonlítási tesztet a GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software LLC) segítségével végeztük. p-értékek < 0.05 statisztikailag szignifikánsnak számított (* p < 0.05; ** p < 0,01; * ** p < 0,001; **** p < 0,0001).

3. Eredmények

3.1. DNS-vakcinák jellemzése

Az E és M fehérjeszinteket Western blot segítségével határoztuk meg. Western blot analízissel mértük a SARS-CoV-2 kódolt S/N/E/M fehérjéinek expresszióját pS/pN/pE/pM plazmidokkal transzfektált HEK-293T-sejtekben, anti- -S/anti-N antitestek és egy anti-6 x His antitest a sejtlizátumokban. A sávok megközelítették az S (140–142 kDa), N (45 kDa), E (10 kDa) és M (22–25 kDa) fehérjék becsült molekulatömegét (1B. ábra).

3.2. Robusztus és tartós anti-S és/vagy anti-N IgG termelés, amelyet pS és/vagy pN DNS indukál

Vakcinák A szérumot BALB/c egerekből gyűjtöttük 35, 56, 96 és 120 napon (2. ábra). Az anti-S/anti-N IgG-szinteket ELISA-val detektáltuk. A pS vagy pN által kiváltott S- vagy N-specifikus IgG válasz nagysága megnőtt a szérumban az első és a második boost után. Az anti-S és anti-N IgG titerek magasabbak voltak a pS + pN csoportban, mint a többi csoportban; a különbség azonban nem volt statisztikailag szignifikáns (3A, B ábra). Nem mutattak ki robusztus E/M fehérje-specifikus antitest választ, ami összhangban van egy korábbi vizsgálat eredményeivel (az adatokat nem mutatjuk be) [15].

3. ábra: B-sejtes válaszok SARS-CoV-2-re BALB/c egerekben. (A) A SARS-CoV-2 S (A) és N fehérjék (B) szérum IgG-kötési végpont titerei. (C) A neutralizációs titereket SARS-CoV-2 pszeudotipizált vírusrendszer alapján határoztuk meg. (D) Az anti-SARS-CoV-2 neutralizációs titereket SARS-CoV-2 vírus segítségével határoztuk meg. (E) SARS-CoV-2 Omicron pszeudotipizált vírusrendszeren alapuló neutralizációs vizsgálat. Az ál (kék), pS (piros), pS + pN (zöld), pS + pE + pM (rózsaszín) és pN (narancs) csoportból származó szérumok gátlási arányait mutatjuk be. A hibasávok a SEM-et képviselik, a p-értékeket pedig kétutas ANOVA és Sidak post hoc analízis segítségével számítottuk ki, ahol * p < 0.05

3.3. A pS és pN vakcinákkal történő együttes immunizálás által indukált semlegesítő antitest magas szintje

A sorozatban hígított szérumminták neutralizáló titereit a pszeudotipizált SARS-CoV-2 vírus segítségével határoztuk meg. A neutralizáló antitestek (nAbs) legmagasabb szintjét a pS + pN csoportban figyelték meg, a reciprok EC50 geometriai átlagtiterek elérték a 2988-at (a 35. napon) és a 3578-at (az 56. napon) (3C. ábra). Hasonló eredményeket figyeltek meg az élő vírus mikroneutralizációs (MN) teszttel, ahol a pS + pN csoportban az nAb-szintek magasabbak voltak, mint az S csoportban az 56. és 96. napon (p < 0,05; ábra). 3D). Ezenkívül az nAb-szintek a pS + pN csoportban az 56. napon (második erősítés) szignifikánsan magasabbak voltak, mint a 35. napon (p < 0,05; 3D. ábra).

Az egyes vakcinák SARS-CoV-2 Omicron variáns elleni semlegesítő hatását tovább határozták meg a pszeudotipizált platform és szérumminták segítségével. Az Omicron vírus elleni semlegesítési profil a 35. és 56. napon hasonló volt az ősi vírus elleni semlegesítési profilhoz (3E. ábra), ami arra utal, hogy a PS + pN kezelés keresztsemlegesítő hatású.

cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert

3.4. DNS-oltással kiváltott T-sejt-válaszok

Amint azt korábban leírtuk, a SARS-CoV-2 S/N/E/M antigének elleni T-sejt-válaszokat IFN-ELISpot segítségével becsültük meg, a korábban leírtak szerint [15]. Ahogy az várható volt, mind a PS + pN, mind a pS + pE + pM séma szignifikánsan magasabb S-fehérjére specifikus IFN + T-sejteket indukált a 12. napon0, mint a 35. napon (p < 0). 05; 4A. ábra). Ezenkívül az N-fehérjére specifikus IFN + T-sejtek száma a 120. napon (második erősítés) szignifikánsan magasabb volt, mint a 35. napon a pS + pN csoportban (p < 0,05; 4B. ábra). Végül az M fehérjére specifikus IFN + T sejtek száma a 120. napon (második erősítés) mindkét csoportban szignifikánsan magasabb volt, mint a 35. napon (p < 0,05; 4D ábra).

4. ábra: T-sejt válaszok SARS-CoV-2 egyedi szerkezeti fehérjékre BALB/c egerekben. (A) A T-sejt válaszokat IFN-ELISpot segítségével mértük 20 órán keresztül stimulált lépsejtekben, átfedő peptidkészletekkel, amelyek átívelték a SARS-CoV-2 S, (B) N, (C) E, és (D) M fehérjék. Az oszlopok az átlagot ± SD. A statisztikai elemzéseket kétutas ANOVA és Sidak post hoc teszttel végeztük, ahol * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,01 és **** p < 0,0001.

3.5. A pS/pN vagy pS/pE/pM együttes immunizálás által kiváltott szinergikus védelem

Ezt követően értékeltük a DNS-vakcinák védőhatékonyságát az ősi SARS-CoV-2 vírussal végzett fertőzés után immunizált hACE2 egerekkel. A kihívást követően az álcsoport egerei fokozatos súlycsökkenést mutattak. Ezzel szemben a pS-vel vagy pS+-szal immunizált egerek enyhe súlycsökkenést mutattak közvetlenül a fertőzés után, majd felépülést (5A. ábra). Nem volt kimutatható élő vírus a pS, pS + pN vagy pS + pE + pM vakcinával vakcinázott egerekben. Ezenkívül a pS + pN vakcináció szignifikánsan csökkentette a vírus RNS kópiaszámát a csak pS vakcinációval kapottakhoz képest (p=0.0228; 5B. ábra). Ezen túlmenően a tüdőszövettani vizsgálat kimutatta, hogy az egerek mind az ál-, mind a pN-csoportban fokális gyulladásfoltokat, pleurális invaginációt, alveoláris összeomlást, magas szintű gyulladásos sejt-infiltrációt és vérzéses területeket mutattak. Összehasonlításképpen, a pS + pN vagy pS + pE + pM-mel kezelt egerek enyhébb kórszövettani elváltozásokat és alacsonyabb INHAND pontszámot mutattak a fertőzés után, mint a másik csoportban (5C. ábra).

5. ábra: Az immunizálás védőhatékonysága élő SARS-CoV-2 vírussal való fertőzés után. (A) Az egereket naponta lemértük (átlag ± átlag hibája (SEM), n=4) a fertőzés után három napig. (B) Fertőző SARS-CoV-2 titer tüdőhomogenizátumokban a fertőzés utáni harmadik napon, a TCID5{{10}} teszttel és az RNS-kópiaszámmal meghatározva. A csoportok közötti statisztikailag szignifikáns különbségeket egyutas ANOVA-val, majd Dunnett-féle többszörös összehasonlító korrekcióval határoztuk meg (* p < 0.05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, és **** p < 0,0001). (C) Tüdőszövettani elemzés H&E festéssel.

4. Megbeszélés

Ebben a vizsgálatban az S- és N-fehérjét expresszáló két DNS-vakcinával történő együttes immunizálás magas szintű nAb-t indukált, és rendkívül hatékony volt a SARS-CoV-2 vírusterhelés csökkentésében egerekben. Az S-fehérjét expresszáló DNS-vakcinák megnövekedett S-fehérje-specifikus celluláris immunitást indukáltak három immunizálás után, amikor az egereket N/E és M fehérjékkel együtt immunizálták, és enyhítették a fertőzés utáni kórszövettani változásokat. Legjobb tudomásunk szerint ez az első olyan jelentés, amely feltárja az immunitás és a védelem szinergikus fokozását egerekben az S-fehérjét kódoló DNS-vakcinával, amikor azokat a SARS-CoV más szerkezeti fehérjéit kódoló DNS-vakcinákkal együtt immunizálják{{8 }}.

cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert

Immundomináns B-sejt-epitópokat N antigén régiókban több vizsgálatban is megfigyeltek. Az N-alapú vakcinák általában nem képesek nAb-t indukálni, valószínűleg azért, mert az N-fehérje nem jelenik meg a vírus felszínén. Figyelemre méltó, hogy az S- és N-fehérjékkel történő együttes immunizálás magasabb szintű nAb-t indukált az ősi és az Omicron SARS-CoV-2 vírus ellen, mint a többi csoport. A megnövekedett nAb válaszok jobb víruskiürüléssel és védőhatékonysággal járnak együtt. Eredményeink azt mutatták, hogy a pS + pN kezelés hatékonyabban csökkentette a SARS-CoV-2 vírusterhelést a fertőzés után, mint a pS kezelés. Egy korábbi tanulmány arról számolt be, hogy az M- és N-fehérjéket együttesen expresszáló vakcinával immunizált hörcsögök védettek voltak a súlyos súlycsökkenés és a tüdőpatológiák ellen, és jelentősen csökkent a vírustiterük a szájgaratban és a tüdőben a SARS-CoV{12}} fertőzés után. ami összhangban van eredményenkkel [23]. Sajnos a vírustiterek csökkenése nem tulajdonítható specifikusan az M- vagy N-proteinnek, és az nAb-szinteket ebben a vizsgálatban nem értékelték. Egy SARS-CoV-2 mRNS vakcinával végzett vizsgálat arról számolt be, hogy az S + N együttes immunizálás fokozott S-specifikus CD8+ T-sejt választ és semlegesítő antitestaktivitást indukált, jobb védelmet biztosítva a tüdőben a Delta ellen. változatát önmagában S-vel összehasonlítva, ami összhangban van e tanulmány eredményeivel [24]. Egy másik tanulmány arról számolt be, hogy a fertőző gastroenteritisz koronavírus N-fehérje elősegítette a semlegesítő antitestek szintézisét, amikor sertés TGEV-IMMUNE sejteket S- és N-fehérjék kombinációjával in vitro stimuláltak, és ez a hatás a helper T-limfociták válaszával magyarázható. az N-fehérje [25].

Immundomináns CD{0}}/CD8+ T-sejt-epitópokat az N-antigén régiókban korábban azonosítottak. Számos tanulmány beszámolt arról, hogy a SARS-CoV-2 N fehérjére épülő vakcinák hatékonyan indukálják a sejtes immunválaszt. Az S + N csoport három immunizálás után megnövekedett S fehérje-specifikus celluláris immunitást mutatott. Egy SARS-CoV-2 mRNS-vakcinával végzett vizsgálat arról számolt be, hogy a kombinatorikus S+N fokozott S-specifikus CD8+ T-sejt-választ indukált, összehasonlítva az egyedüli S-sel, ami összhangban van eredményeinkkel [24]. Egy másik tanulmány arról számolt be, hogy az S- és N-antigénekre adott T-sejt-válasz a kettős antigén hAd5 S + N elsődleges vakcinázása után egyenértékű volt a korábban SARS-CoV-2--fertőzött betegek válaszaival, valamint a T-sejtek in silico előrejelzési modelljeivel. epitóp HLA kötődése azt sugallta, hogy a hAd5 S + N vakcinára adott T-sejt válaszok megőrzik hatékonyságukat a B.1.351 variánssal szemben. Ezenkívül a korábban SARS-CoV{28}}fertőzött betegek plazmája nagyobb kötődési affinitást mutatott a kettős antigén S-Fusion + N-ETSD konstrukciót expresszáló sejtekhez, mint a hAd5 S-Fusion önmagában, ami arra utal, hogy a Az S+N kettős antigénes vakcina jobb, mint az S egyantigénes vakcina [26].

Az élő vírus a tüdőben nem volt kimutatható, és a fertőzés utáni testsúlycsökkenés mérséklődött a pS, pS + pN és pS + pE + pM csoportokban, míg a pN kezelés nem csökkentette hatékonyan a vírustitert. Ezek az eredmények hangsúlyozzák az S fehérje, mint vakcina célpont nélkülözhetetlenségét és hatékonyságát. Nevezetesen, a pS-sel és pN-nel történő együttes immunizálás jobb hatással volt a vírus kiürülésére, mint akár a pS, akár a pN. A pS + pE + pM csoport kevesebb kórszövettani elváltozást mutatott a tüdőben, ami összhangban van korábbi vizsgálatunk eredményeivel [15]. Az S + N csoportban alacsony volt a vírus RNS kópiája a tüdőben, csökkent a súlyvesztés és gyors felépülési idő volt a SARS-CoV{11}} fertőzés után, összehasonlítva a csak S/N-nel immunizált csoporttal, ami összhangban volt a e tanulmány eredményeit. Azonban egyik csoport sem mutatta ki a neutralizáló antitest titereket, ami a vakcinafajták és a kísérleti állatok közötti különbségekkel magyarázható [26]. Egy SARS-CoV-2 adenovírus vektor vakcinával végzett vizsgálat arról számolt be, hogy az S vakcina csak akkor nyújtott akut agyvédelmet, ha N vakcinával együtt immunizálták [27]. Egy másik tanulmányban az S1/N/RdRp, N/RdRp és S1 fehérjéket expresszáló Tri: ChAd, Bi: ChAd és Mono: ChAd vakcinákat fejlesztettek ki, és tesztelték őket B.1.351 állatmodellben. Kiterjedt durva patológiát figyeltek meg a Mono: ChAdlungsban, míg a Bi: ChAd és Tri: ChAd tüdők szinte mentesnek tűntek ettől a patológiától [28].

Ezenkívül a nem vakcinázott állatok tüdővírus-terhelése magas volt, míg a Tri: ChAd kezelés jelentősen, 3,5 logal csökkentette a vírusterhelést. Összehasonlításképpen, mind a Bi: ChAd, mind a Mono: ChAd vakcina csak mérsékelten csökkentette a vírusterhelést. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az S/N kettős antigén vakcina variánsok elleni védőhatása jobb lehet, mint az S egyantigénes vakcináé, ami összhangban van eredményeinkkel [28]. Néhány tanulmány beszámolt arról, hogy az N-proteinnel immunizált egerekben súlyos tüdőgyulladás alakul ki a SARS-CoV fertőzés után [29–31]. Korábbi tanulmányok arról is beszámoltak, hogy a Mouse Hepatitis Virus N fehérjét expresszáló adenovírus vektor vakcinával történő immunizálás megvédi az egereket a halálos fertőzésektől, ami azt mutatja, hogy az N fehérje védőhatást válthat ki [32]. Ezenkívül a CRT/N DNS vakcinával immunizált csoportban szignifikánsan csökkent a vírustiter a fertőzés után, a SARS-CoV N fehérjét expresszáló vacciniavírussal [33].

cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert

Egy S-fehérjére vonatkozó vizsgálat kimutatta, hogy a kombinált DNS/fehérje vakcina jobban indukálta a humorális és celluláris immunitást, mint a DNS/fehérje vakcina önmagában [8]. A csak az S-fehérjét megcélzó vakcinák csökkent hatékonyságot mutattak a feltörekvő variánsok által okozott enyhe-közepes COVID{3}} elleni védelemben. A konzervált SARS-CoV-2 szerkezeti fehérjék szerepe, beleértve az N/E/M fehérjéket is, figyelmet érdemel a vakcina tervezésében és alkalmazásában, mivel a vakcina által kiváltott T-sejt-válaszokat a konzervált epitópok ellen általában nem befolyásolják a mutációk . Egy tanulmány arról számolt be, hogy a SARS-ből felépült betegek (n=23) még 17 évvel a 2003-as járvány után is rendelkeztek a SARS-CoV N fehérjére reaktív, hosszú távú memória T-sejtekkel, amelyek erőteljes keresztreaktivitást mutattak a SARS CoV-vel szemben. {15}} N-fehérje, amely tovább igazolja az N-fehérje keresztvédő vakcinacélpontként való alkalmazását [34]. Ez a tanulmány kimutatta, hogy a pS/pN koimmunizálás magasabb nAb-válaszokkal, jobb víruskiürüléssel és jobb sejtes immunválaszokkal járt együtt, és jobb védelmet nyújthat a SARS-CoV-2 fertőzés után, mint a pS önmagában. Ezenkívül kimutatták, hogy a SARS-CoV-2 variánsai számos állatfajt megfertőznek, és néhány vadon élő állatnál és háziállatnál emberről állatra terjedést figyeltek meg [7]. Tehát az állatgyógyászati ​​SARS-CoV-2 vakcina több figyelmet igényel. Ezen túlmenően a nanotechnológia hatékony eszköz lehet a vakcinák optimalizálására, és több figyelmet érdemel [2].

Ennek a tanulmánynak számos korlátja van. Először is, csak a DNS-vakcina stratégiáját figyeltük meg BALB/c egerekben, és a jövőbeni vizsgálatoknak fel kell mérniük ezen vakcina-sémák immunogén hatásait más állatmodellekben. Másodszor, további kutatásokra van szükség ahhoz, hogy teljes mértékben megértsük az S- és N-fehérjéket használó koimmunizáció által kiváltott megnövelt nAb- és S-specifikus CD8-T-sejt-válaszok mögött meghúzódó molekuláris mechanizmusokat, és hogy ezeket a tudást a COVID optimalizálása érdekében hasznosítsuk.{5}} vakcina tervezése. Végül az N-fehérje-specifikus antitestek funkciója további vizsgálatot érdemel.

cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert

Összefoglalva, ez a tanulmány értékelte a SARS-CoV-2 S-, N-, E- és M-fehérjékkel történő együttes immunizálás immunvédő potenciálját. Számos, csak az S fehérjét célzó vakcina csökkent védőhatással rendelkezik a feltörekvő variánstörzsekre. Eredményeink megalapozzák a keresztreaktív COVID{5}} vakcina kifejlesztését a SARS-CoV-2 jelenlegi és kialakulóban lévő változatainak ellenőrzésére és a lehetséges koronavírus-járvány megelőzésére.

Hivatkozások

1. Zmievskaya, E.; Valiullina, A.; Ganeeva, I.; Petukhov, A.; Rizvanov, A.; Bulatov, E. A CAR-T sejtterápia alkalmazása az onkológián túl: Autoimmune Diseases and Viral Infections. Biomedicines 2021, 9, 59. [CrossRef] [PubMed]

2. Rashidzadeh, H.; Danafar, H.; Rahimi, H.; Mozafari, F.; Salehiabar, M.; Rahmati, MA; Rahamooz-Haghighi, S.; Mousazadeh, N.; Mohammadi, A.; Ertas, YN; et al. Nanotechnológia az új koronavírus (súlyos akut légúti szindróma coronavirus 2) ellen: Diagnosztika, kezelés, terápia és jövőbeli kilátások. Nanomedicine 2021, 16, 497–516. [CrossRef]

3. Fontanet, A.; Cauchemez, S. COVID{1}} nyájimmunitás: hol vagyunk? Nat. Rev. Immunol. 2020, 20, 583–584. [CrossRef] [PubMed]

4. Jeyanathan, M.; Afkhami, S.; Smaill, F.; Miller, MS; Lichty, BD; Xing, Z. Immunológiai megfontolások a COVID{1}} elleni oltási stratégiákhoz. Nat. Rev. Immunol. 2020, 20, 615–632. [CrossRef] [PubMed]

5. Vandelli, A.; Monti, M.; Milanetti, E.; Armaos, A.; Rupert, J.; Zacco, E.; Bechara, E.; Delli Ponti, R.; Tartaglia, GG A SARS-CoV-2 genom szerkezeti elemzése és az emberi interaktóma előrejelzései. Nucleic Acids Res. 2020, 48, 11270–11283. [CrossRef] [PubMed]

6. Jackson, CB; Farzan, M.; Chen, B.; Choe, H. A SARS-CoV-2 sejtbe való bejutásának mechanizmusai. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2022, 23, 3–20. [CrossRef]

7. Conforti, A.; Sanchez, E.; Salvatori, E.; Lione, L.; Compagnone, M.; Pinto, E.; Palombo, F.; D'Acunto, E.; Muzi, A.; Roscilli, G.; et al. A SARS-CoV-2 receptorkötő domént kódoló lineáris DNS-vakcina potenciális immunválaszt és semlegesítő antitesteket vált ki házimacskákban. Mol. Ott. Methods Clin. Dev. 2023. [CrossRef]

8. Borgoyakova, MB; Karpenko, LI; Merkulyeva, IA; Scserbakov, DN; Rudometov, AP; Starostina, EV; Shanshin, DV; Isaeva, AA; Nesmeyanova, VS; Volkova, NV; et al. A COVID elleni DNS/fehérje kombinált vakcina immunogenitása-19. Bika. Exp. Biol. Med. 2023, 1–4. [CrossRef]

9. Qu, L.; Yi, Z.; Shen, Y.; Lin, L.; Chen, F.; Xu, Y.; Wu, Z.; Tang, H.; Zhang, X.; Tian, ​​F.; et al. Cirkuláris RNS vakcinák a SARS-CoV-2 és a kialakuló variánsok ellen. Cell 2022, 185, 1728–1744.e16. [CrossRef]

10. Corbett, KS; Edwards, DK; Leist, SR; Abiona, OM; Boyoglu-Barnum, S.; Gillespie, RA; Himansu, S.; Schäfer, A.; Ziwawo, CT; DiPiazza, AT; et al. A SARS-CoV-2 mRNS-vakcina tervezése a kórokozók prototípusának előkészítésével. Természet 2020, 586, 567–571. [CrossRef]

11. Tian, ​​JH; Patel, N.; Haupt, R.; Zhou, H.; Weston, S.; Hammond, H.; Logue, J.; Portnoff, A.; Norton, J.; Guebre-Xabier, M.; et al. SARS-CoV-2 spike glikoprotein vakcina jelölt NVX-CoV2373 immunogenitás páviánoknál és védelem egereknél. Nat. Commun. 2021, 12, 372. [CrossRef] [PubMed]

12. Andreano, E.; Paciello, I.; Piccini, G.; Manganaro, N.; Pileri, P.; Hyseni, I.; Leonardi, M.; Pantano, E.; Abdiento, V.; Benincasa, L.; et al. A hibrid immunitás javítja a B-sejteket és a SARS-CoV-2 variánsok elleni antitesteket. Természet 2021, 600, 530–535. [CrossRef]

13. Naqvi, AAT; Fatima, K.; Mohammad, T.; Fatima, U.; Singh, IK; Singh, A.; Atif, SM; Hariprasad, G.; Hasan, GM; Hassan, MI Betekintés a SARS-CoV-2 genomjába, szerkezetébe, evolúciójába, patogenezisébe és terápiáiba: Strukturális genomikai megközelítés. Biochim. Biophys. Acta Mol. Alap. Dis. 2020, 1866, 165878. [CrossRef] [PubMed]

14. Abbasi, J. India új COVID{1}} DNS-oltása serdülőknek és felnőtteknek az első. JAMA 2021, 326, 1365. [CrossRef] [PubMed]

15. Chen, J.; Deng, Y.; Huang, B.; Kéz.; Wang, W.; Huang, M.; Zhai, C.; Zhao, Z.; Yang, R.; Zhao, Y.; et al. A burkot expresszáló DNS-vakcinák és a membránfehérjék részleges védelmet nyújtanak a SARS-CoV-2 ellen egerekben. Elülső. Immunol. 2022, 13, 827605. [CrossRef]

16. Tebas, P.; Kraynyak, KA; Patel, A.; Maslow, JN; Morrow képviselő; Sylvester, AJ; Knoblock, D.; Gillespie, E.; Amante, D.; Racine, T.; et al. Az intradermális SynCon®Ebola GP DNS vakcina hőmérséklete stabil, és biztonságosan bizonyítja a sejtes és humorális immunogenitás előnyeit az egészséges önkénteseknél. J. Infect. Dis. 2019, 220, 400–410. [CrossRef]

17. Smith, TRF; Patel, A.; Ramos, S.; Elwood, D.; Zhu, X.; Yan, J.; Gary, EN; Walker, SN; Schultheis, K.; Purwar, M.; et al. A COVID-re jelölt DNS-vakcina immunogenitása-19. Nat. Commun. 2020, 11, 2601. [CrossRef]

18. Zhao, Z.; Deng, Y.; Niu, P.; Song, J.; Wang, W.; Du, Y.; Huang, B.; Wang, W.; Zhang, L.; Zhao, P.; et al. A CHIKV VLP-vel és DNS-vakcinákkal történő együttes immunizálás ígéretes humorális választ vált ki egerekben. Front Immunol. 2021, 12, 655743. [CrossRef]

19. Guan, J.; Deng, Y.; Chen, H.; Yin, X.; Yang, Y.; Tan, W. Két, hepatitis C vírus NS3 fehérjét expresszáló DNS-vakcinával történő beindítás, amely dendritikus sejteket céloz meg, kiváló heterológ védőpotenciálhoz vezet egerekben. Boltív. Virol. 2015, 160, 2517–2524. [CrossRef]

20. Chen, H.; Wen, B.; Deng, Y.; Wang, W.; Yin, X.; Guan, J.; Ruan, L.; Tan, W. A DNS immunizálás és az in vivo elektroporáció fokozott hatása hepatitis B vírus mag-PreS1 és S-PreS1 plazmidjainak kombinációjával. Clin. Vaccine Immunol. 2011, 18, 1789–1795. [CrossRef]

21. Yang, R.; Deng, Y.; Huang, B.; Huang, L.; Lin, A.; Li, Y.; Wang, W.; Liu, J.; Lu, S.; Zhan, Z.; et al. Core-shell szerkezetű COVID-19 mRNS vakcina kedvező biológiai eloszlási mintával és ígéretes immunitással. Jelátvitel. Target Ther. 2021, 6, 213. [CrossRef] [PubMed]

22. Yang, R.; Huang, B.; A, R.; Li, W.; Wang, W.; Deng, Y.; Tan, W. A pszeudotipizált SARS-CoV-2 rendszer kifejlesztése és hatékonysága in vitro semlegesítési hatékonysági és belépési gátlási teszttel meghatározva. Biosaf. Egészségügy 2020, 2, 226–231. [CrossRef] [PubMed]

23. Jia, Q.; Bielefeldt-Ohmann, H.; Maison, RM; Masleša-Gali´c, S.; Cooper, SK; Bowen, RA; Horwitz, MRA A SARS-CoV-2 membrán- és nukleokapszid fehérjéket expresszáló, replikáló baktériumvektoros vakcina védelmet nyújt a hörcsögök súlyos COVID{5}}szerű betegségei ellen. NPJ Vaccines 2021, 6, 47. [CrossRef] [PubMed]

24. Hajnik, RL; Plante, JA; Liang, Y.; Alameh, M.-G.; Tang, J.; Zhong, C.; Ádám, A.; Scharton, D.; Rafael, GH; Liu, Y.; et al. A kombinatorikus mRNS-oltás fokozza a SARS-CoV-2 delta variáns elleni védelmet. bioRxiv 2021. [CrossRef]

25. Anton, IM; González, S.; Bullido, MJ; Corsín, M.; Risco, C.; Langeveld, JP; Enjuanes, L. Együttműködés a fertőző gastroenteritis coronavirus (TGEV) szerkezeti fehérjék között vírusspecifikus antitestek in vitro indukciójában. Virus Res. 1996, 46, 111–124. [CrossRef]

26. Deschambault, Y.; Lynch, J.; Warner, B.; Tierney, K.; Huynh, D.; Vendramelli, R.; Szabó, N.; Frost, K.; Booth, S.; Sajesh, B.; et al. A tüskét és a nukleokapszid fehérjéket expresszáló rekombináns ACAM2000 vaccinia vírusokkal végzett egyszeri immunizálás megvédi a hörcsögöket a SARS-CoV-2- okozta klinikai betegségtől. bioRxiv 2021. [CrossRef]

27. Penaloza-MacMaster, P.; osztály, J.; Dangi, T.; Richner, JM. A SARS CoV-2 nukleokapszid vakcina védelmet nyújt a vírus disztális terjedése ellen. bioRxiv 2021.

28. Afkhami, S.; D'Agostino, MR; Zhang, A.; Stacey, HD; Marzok, A.; Kang, A.; Singh, R.; Bavananthasivam, J.; Igen, G.; Luo, X.; et al. A következő generációs COVID-19 vakcina légúti nyálkahártyán történő bejuttatása erőteljes védelmet nyújt a SARS-CoV-2 ősi és változatos törzsei ellen egyaránt. Cell 2022, 185, 896–915.e19. [CrossRef]

29. Zheng, N.; Xia, R.; Yang, C.; Yin, B.; Li, Y.; Duan, C.; Liang, L.; Guo, H.; Xie, Q. A SARS-CoV nukleokapszid fehérje fokozott expressziója dohányban és immunogenitása egerekben. Vaccine 2009, 27, 5001–5007. [CrossRef]

30. Yasui, F.; Kai, C.; Kitabatake, M.; Inoue, S.; Yoneda, M.; Yokochi, S.; Kase, R.; Sekiguchi, S.; Morita, K.; Hishima, T.; et al. A súlyos akut légzőszervi szindrómával (SARS) összefüggő koronavírus (SARS-CoV) nukleokapszid fehérjével történő előzetes immunizálás súlyos tüdőgyulladást okoz SARS-CoV-vel fertőzött egerekben. J. Immunol. 2008, 181, 6337–6348. [CrossRef]

31. Deming, D.; Sheahan, T.; Heise, M.; Yount, B.; Davis, N.; Sims, A.; Suthar, M.; Harkema, J.; Whitmore, A.; Pickles, R.; et al. A vakcina hatékonysága a rekombináns SARS-CoV járványos és zoonózisos tüske variánsokkal fertőzött öregedő egerekben. PLoS Med. 2006, 3, e525. [CrossRef] [PubMed]

32. Wesseling, JG; Godeke, GJ; Schijns, VE; Prevec, L.; Graham, F.; Horzinek, MC; Rottier, PJ Az egér hepatitis vírus tüske és az adenovírus vektorok által expresszált nukleokapszid fehérjék megvédik az egereket a halálos fertőzéstől. J. Gen. Virol. 1993, 74, 2061–2069. [CrossRef] [PubMed]

33. Kim, TW; Lee, JH; Hung, CF; Peng, S.; Roden, R.; Wang, MC; Viscidi, R.; Tsai, YC; Ő én.; Chen, PJ; et al. A súlyos akut légúti szindróma koronavírus nukleokapszid fehérjét célzó DNS-vakcinák előállítása és jellemzése. J. Virol. 2004, 78, 4638–4645. [CrossRef] [PubMed]

34. Le Bert, N.; Tan, AT; Kunasegaran, K.; Tham, CYL; Hafezi, M.; Chia, A.; Chng, MHY; Lin, M.; Tan, N.; Linster, M.; et al. SARS-CoV-2-specifikus T-sejt-immunitás COVID-19 és SARS esetén, valamint nem fertőzött kontrollok. Természet 2020, 584, 457–462. [CrossRef]