Abstrtörvény

Háttér: Egyre több tanulmány számolt be a mezenchimális őssejtből (MSC) származó exoszómák terápiás hatásáról, amelyekkel a fehérjét és a miRNS-t jellemzik. A humán embrionális őssejtekből (hESC-kből) és a humán indukált pluripotens őssejtekből (hiPSC-kből) származó exoszómák proteomikája és miRNS-profilja azonban továbbra is tisztázatlan.

A cisztanche glikozidja növelheti az SOD aktivitását a szív- és májszövetekben, és jelentősen csökkentheti az egyes szövetek lipofuscin- és MDA-tartalmát, hatékonyan megkötve a különböző reaktív oxigéngyököket (OH-, H2O₂ stb.) és megvédheti az okozott DNS-károsodást. OH-gyökök által. A Cistanche feniletanoid glikozidok erős szabad gyökfogó képességgel rendelkeznek, nagyobb redukáló képességgel rendelkeznek, mint a C-vitamin, javítják a SOD aktivitását a spermiumszuszpenzióban, csökkentik az MDA-tartalmat, és bizonyos védő hatást fejtenek ki a spermium membrán működésére. A cistanche poliszacharidok fokozhatják a SOD és a GSH-Px aktivitását a D-galaktóz által okozott kísérletileg öregedő egerek eritrocitáiban és tüdőszöveteiben, valamint csökkenthetik a tüdő és a plazma MDA- és kollagéntartalmát, valamint növelhetik az elasztintartalmat. jó eltávolító hatás a DPPH-ra, meghosszabbítja a hipoxia idejét öregedő egerekben, javítja a SOD aktivitását a szérumban, és késlelteti a tüdő fiziológiás degenerációját kísérletileg öregedő egerekben A sejtmorfológiai degenerációval a kísérletek kimutatták, hogy a Cistanche jó antioxidáns képességgel rendelkezik és potenciálisan gyógyszer lehet a bőröregedési betegségek megelőzésére és kezelésére. Ugyanakkor a Cistanche-ban található echinakozid jelentős mértékben képes megkötni a DPPH szabad gyököket, és képes megkötni a reaktív oxigénfajtákat, megakadályozza a szabad gyökök által kiváltott kollagén lebomlását, valamint jó javító hatással van a timin szabad gyökök anionjainak károsodására.

Kattintson az Öregedésgátló Cistanche Powder Bulk elemre

【További információ:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Mód: Ebben a vizsgálatban exoszómákat izoláltunk hESC-ből, hiPSC-ből és humán köldökzsinór-mezenchimális őssejtekből (hUC-MSC) klasszikus ultracentrifugálással és 0.22-μm-es szűrővel, majd konzervatív azonosítással. A tandem tömegcímkézés és a címkementes relatív peptid-kvantifikáció együttesen határozta meg proteomikáját. A miRNS profilok meghatározására nagy áteresztőképességű szekvenálást végeztünk. Ezután bioinformatikai elemzést végeztünk az exoszóma rakományok által modulált domináns biológiai folyamatok és útvonalak azonosítására. Végül Western blot és RT-qPCR vizsgálatot végeztünk a fehérjék és miRNS-ek tényleges terhelésének kimutatására háromféle exoszómában.

Eredmények: Vizsgálatunk alapján háromféle exoszómából származó rakomány hozzájárul a kifinomult biológiai folyamatokhoz. Összehasonlításképpen, a hESC exoszómák (hESC-Exos) jobbak voltak a fejlődés, az anyagcsere és az öregedésgátlás szabályozásában, a hiPSC exoszómák (hiPSC-Exos) pedig hasonló biológiai funkciókkal rendelkeznek, mint a hESC-Exosok, míg a hUC-MSC-exoszómák (hUC-MSC-Exos) jobban hozzájárult az immunrendszer szabályozásához.

Következtetések: A tanulmányunkban bemutatott adatok segítenek meghatározni három exoszóma fehérje- és miRNS-képeit, megjósolni biológiai funkcióikat szisztematikus és átfogó hálózati elemzéssel rendszerszinten, és feltárják a potenciális alkalmazásokat a különböző területeken az exoszóma szelekció optimalizálása érdekében preklinikai és klinikai területen. próbatételek.

Kulcsszavak: Humán embrionális őssejtek, Ember által indukált pluripotens őssejtek, Emberi köldökzsinór-mezenchimális őssejtek, Exoszómák, Proteomika, miRNS

Bevezetés

Az extracelluláris vezikulák (EV-k) a sejtek által aktívan szekretált apró vezikulák, amelyek főleg exoszómákat, mikrovezikulákat (MV-ket) és apoptotikus testeket tartalmaznak [40, 56, 57]. Széles körben elterjedtek számos testnedvben, mint például a nyálban, az anyatejben, a vérben, a cerebrospinális folyadékban, az epében és a vizeletben [57]. Közülük az exoszómák 40–200 nm átmérőjű lipid kettős réteggel, szacharóz gradiensben 1,13–1,18 g/ml felhajtósűrűséggel rendelkeznek, elektronmikroszkóp alatt csésze alakúak [21, 53]. Különféle bioaktív vegyületek, köztük fehérjék, nukleinsavak és lipidek biztosítják az exoszómák sejtközi kommunikációs funkcióját a sejtek között [16, 17]. A lipid kettős réteg egy finom gát, amely megvédi az exoszómák tartalmát a testfolyadék enzimatikus degenerációjától [49]. A stabil exoszómák bonyolult fiziológiai és kóros folyamatokat közvetíthetnek a parakrin aktivitáson keresztül, beleértve a szervek és a szaporodási fejlődést, az antigén prezentációt, a neuronális kommunikációt, az immunválaszt, az öregedés szabályozását és a sejtproliferációt [57, 62].

Az exoszómák kialakulása és felszabadulása teljesen szabályozott folyamat, és az exoszómába zárt tartalom szétválogatása különböző fehérjék mobilizálásával történik [22, 47]. Több fehérje létfontosságú az exoszóma kialakulásában, amely tartalmazza a transzporthoz szükséges endoszomális szortírozó komplexet (ESCRT), tetraspaninokat (CD9, CD63 és CD81), apoptózishoz kötött génnel kölcsönható X-fehérjét (Alix) és a tumorérzékenységet. gén 101 (TSG101) [38, 55]. Az exoszómák intracelluláris kereskedelmét számos fehérje kollektív aktivitása mozgatja, beleértve a molekuláris kapcsoló RAB GTPázokat és a citoszkeletális fehérjéket, például az aktint és a tubulint [24]. Ezt követően az exoszóma szekréciót kiegészíti a SNARE komplex és a synaptotagmin család [22]. A kutatások megállapították, hogy az exoszómák bimbózása és leválása a kalciumaktivitáson és az ESCRT-felvételen múlik [15]. Hírvivőként az exoszóma felszabadulása részt vesz a sejtek áthallásában, válaszul a sejtfiziológiára és a kóros változásokra, mint például az aktivációra, a pH-változásra, a hipoxiára, a sugárkárosodásra vagy a sejtstresszre [61].

Az exoszómák összetevőinek és lehetséges fiziológiai és kóros funkcióiknak feltárására gyakran használnak proteomikai, transzkriptomikus és egyéb technikákat a különböző fajokból, szövetekből és sejtekből származó exoszóma RNS-ek és fehérjék tanulmányozására [44]. Az exoszóma proteomikai analízis jellemzően három lépésből áll: az exoszómák izolálása, tisztítása és jellemzése, a fehérje komponensek azonosítása tömegspektrometriával, valamint a nyers adatok elemzése [14]. A sejtállapot jelentősen befolyásolja a fehérje összetételét és az exoszómák mennyiségét. Jelenleg kvantitatív proteomikai technikákat alkalmaznak a fehérje jellemzésének és abundanciájának elemzésére az exoszómatermelés mögött meghúzódó mechanizmusok tisztázására, és elmélyítik az exoszómák sejtekben betöltött fiziológiai és patológiai szerepének megértését [39]. Közülük a tömegspektrometrián alapuló kvantitatív proteomikai technológiákat széles körben alkalmazzák, elsősorban jelölésmentes és stabil izotóppal jelölt módszereket [13, 42]. A miRNS-ek kis bioaktív molekulák, amelyek szorosan kapcsolódnak különféle élettevékenységekhez. A nagy áteresztőképességű szekvenálási technikát nagy érzékenység és pontosság jellemzi, és széles körben alkalmazható a miRNS szekvenálásban (18-30 nt) [6]. Tekintettel a jelenlegi technológia fejlődésére, nincs akadálya az exoszómák fehérje- és miRNS-profiljainak szétválasztásának.

A hESC-k és hiPSC-k nagy differenciálódási potenciállal rendelkeznek [36]. Közvetlen alkalmazásuk a kezelésben azonban korlátozott a rosszindulatú daganatok kockázata és etikai problémák miatt [31]. Ezzel szemben a mesenchymális őssejtek (MSC) szélesebb körben alkalmazhatók több betegségben történő beavatkozásra klinikai körülmények között [8]. Közvetlen használatuknak azonban még mindig számos korlátja van, beleértve az alacsony túlélési arányt, az immunológiai kilökődést és a biztonsági problémákat [8, 43]. Jelenleg nagy figyelmet szentelnek az exoszómáknak biológiai biztonságuk, stabilitásuk, nem aneuploiditásuk és alacsony immunogenitásuk miatt [51]. Korábbi tanulmányok dokumentálták a különböző szövetekből származó MSC-k és azok proteomikus és miRNS-profilokat tartalmazó exoszómáinak komponenseinek összehasonlítását [59]. Gong et al. a hESC extracelluláris vezikulák (EV) szabályozó hálózatát is ábrázolta a proteom szempontjából, de csak az öregedéssel összefüggő útvonalakon, anélkül, hogy másokra összpontosítana [19]. Questa et al. összefonta a humán fityma fibroblasztokból (HFF) származó hiPSC-k EV proteomikus atlaszát [45]. Bár ezek a tanulmányok részben beszámoltak az EV-k fehérjekomponenseiről, nem kizárólag az exoszómákra összpontosítottak, és átfogó proteomikai elemzésük nincs egyértelműen megfogalmazva. Különösen a miRNS-profilokat még nem írták le. Ennek megoldására a jelen tanulmányban a hESC-kből, hiPSC-kből és hUC-MSC-kből izolált exoszómákat választottuk ki további vizsgálatokra, amelyek a proteom- és miRNS-profiljukat célozták meg, hogy új betekintést nyerhessenek kutatási és klinikai alkalmazásukba.

Mód

Exoszómák készítése és jellemzése

A hESC-ket és a hiPSC-ket ncTarget tápközegben (kat. sz. RP01020; Nuwacell. Ltd., Kína), míg a hUC-MSC 3. generációját szérummentes missziós hMSC táptalajban (kat. sz. RP02010; Nuwacell. Ltd, Kína). Ezután a logaritmikus növekedési fázisban lévő sejtek felülúszójából 350 ml-t (körülbelül 80 százalékos összefolyás) gyűjtöttünk össze exoszómatisztítás céljából. Az exoszómákat elismert centrifugálással és ultracentrifugálással extraháltuk, a korábban leírtak szerint [34, 52]. Röviden, a kondicionált tápközeget (CM) összegyűjtöttük, és gradiens centrifugálásnak vetettük alá (300 × g 10 percig, 2000 × g 15 percig, 10, 000 × g 30 percig), hogy elválasszuk. sejttörmelék. Az exoszómákat ülepítettük az összegyűjtött felülúszóból 100 °C-on, 000×g 70 percig Ti45 rotor segítségével (Beckman Coulter, USA). Ezután újraszuszpendáltuk PBS-ben a következő szűréshez 022- μm-es MF-Millipore™ membránszűrővel (Sigma, USA). A szűrletet 100 000 x g-vel 70 percig ultracentrifugáltuk. A végső exoszómapelletet PBS-ben újraszuszpendáltuk a következő elemzéshez. Az izolált exoszómák koncentrációjának és méretének mérésére dinamikus fényszórási (DLS) rendszert (Wyatt Technology, USA) használtunk.

Transzmissziós elektronmikroszkópia (TEM)

TEM-szkennelést végeztünk az izolált exoszómák morfológiájának leírására, a korábban leírtak szerint. Az újraszuszpendált exoszómákat (1 ug 10 ul PBS-ben) szénnel bevont rézrácsra (200- háló) ültettük, és hagytuk, hogy 2 percig adszorbeálódjanak rajta, majd kétszer mossuk kétszer desztillált vízzel. Ezután a rácsokat negatívan festjük 8 μl 2 százalékos uranil-acetát oldattal 1 percig. Természetes szárítás után a mintákat Tecnai Spirit rendszerrel (Thermo Fisher, USA) 120 kV-on vizsgáltuk.

Dinamikus fényszórás

Az exoszómák méreteloszlását nanorészecske-követő analízissel írták le dinamikus fényszórási mérővel (Wyatt Technology, USA) a gyártó utasításai szerint (271-DPN), amint azt korábban közöltük[23]. Röviden, az exoszóma pelletet 100 μl PBS-ben újraszuszpendáltuk. A fenti exoszómákból tíz, 50 μl-t adtunk 1450 µl PBS-hez, és 30 másodpercig vortexeltük. Az exoszómákat (1,5 ml) egy eldobható küvettába vittük át, hogy egyensúlyba kerüljenek 25 fokon 30 másodpercig. A diszpergálószer törésmutatója 1,37 volt, és mind a Z-átlag, mind a polidiszperzitás (PDI) meghatározta az exoszóma részecskék méretét. Minden mintánál fától független méréseket végeztünk.

Tandem tömegcímkés (TMT) jelölés és címkementes relatív peptid mennyiségi meghatározás (LFQ) elemzés

Total protein was extracted from exosomes, and the concentration was quantified using the Bradford method.  The samples were separated by 12.5% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).  The protein suspensions were digested with trypsin (cat.   no. 9002-07-7; Sigma, USA) in 40 μL of tetraethylammonium bromide (TEAB) buffer for 12  h at 37  °C and then labeled with TMTsixplex™ isobaric label reagent set (cat. no. 90061; Thermo Fisher, USA). TMT-labeled peptides were fractionated by reversed-phase chromatography using an Agilent 1260 Infinity II HPLC system  (Agilent Technology, USA). LC-MSC/MS analysis was performed by LC-Bio Technology Co., Ltd. (Hangzhou,  China). Briefly, the analysis was completed using the combination of a Q Exactive Plus mass spectrometer and Easy nLC (Thermo Fisher, USA). Survey scans were acquired at a resolution of 70,000 at m/z 200. MS/MS   spectra were captured by the MASCOT engine using the built-in software Proteome Discoverer 2.4. Label-free relative peptide quantification analysis was also performed by LC-Bio Technology Co., Ltd. as previously reported  [27]. Briefly, the digested proteins of exosomes were separated by HPLC and detected by mass spectrometry.  Raw files from technical and biological replicates were filtered, de novo sequenced, and assigned with protein ID   using PEAKS 8.0 by searching against the human SwissProt database. Tree-independent exosome samples were subjected to TMT or label-free assay. The final protein profiles of exosomes were determined by overlapping the data of TMT (mascot score>60, abundance>100 és P<0.05) and label-free (at least two tests results>0 és P<0.05).

Differentially expressed proteins (DEPs) were considered valid after the data were normalized by protein loading and differential p-value false discovery rates (FDR) corrected [30]. In particular, the proteins with log2|fold change|>1 (|log2FC|>1), valamint a statisztikai szignifikancia (P<0.05), were classified as enriched in exosomes.

miRNS profil elemzés

A teljes RNS-t az izolált exoszómákból a mirVana™ miRNA Isolation Kit (kat. sz. AM1560; Thermo Fisher, USA) segítségével extraháltuk. Az RNS-mintákat az LC-Bio Technology Co., Ltd. által végzett miRNS microarray vizsgálathoz minőségellenőrzésnek vetettük alá. A nyers adatok elemzését a korábban közölt módon végeztük [9]. A differenciálisan expresszált miRNS-eket p-értéken választottuk ki miRNS-jelöltként<0.05 and |log2FC|>2. Data were omitted if they corresponded to questionable miRNAs, according to previous reports or in-house validated miRNAs [12]. The miRNA target genes were determined by the overlap of prediction of Targetscan and miRanda databases under the restriction of threshold value>90 (Targetscan) és maximális szabad energia<−10 (miRanda).

Bioinformatikai elemzés

A nyers adatokat a Maxquant szoftvercsomaggal (v1.6.{2}}) elemeztük, és referenciaként a Swiss-Prot_Emberi adatokat állítottuk be (20 600 fehérje) (Proteome ID: UP000005640) . Az azonosított fehérjéket a KOBAS analízis [60] feltételei alapján a Gene Ontology (GO) és a Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) programokhoz térképezték fel, hogy meghatározzák biológiai és funkcionális tulajdonságaikat. A Cytoscape szoftvert és az R szoftverben lévő igraph csomagot (3.6.1-es verzió) használtuk az exoszóma fehérjék vagy miRNS-ek összefonódó hálózatának megrajzolására a jelátviteli útvonalak között.

Statisztikai analízis

Minden kísérletet három párhuzamosban végeztünk. A fehérjék és a miRNS-ek kvantitatív ismételhetőségét a főkomponens-analízis (PCA), a relatív szórás és a Pearson-féle korrelációs együttható növelte. Az eredményeket nem párosított Student-féle t-próbával elemeztük. Az adatokat az átlag standard hibájaként (SEM) fejezzük ki. A P-értékeket *P-nél statisztikailag szignifikánsnak tekintettük<0.05, **P<0.01, and ***P<0.001.

Eredmények

Exoszóma izolálása és azonosítása

Három humán pluripotens őssejt tenyésztését és azonosítását az 1. további fájl ismerteti. Exoszómákat izoláltunk háromféle őssejtek kondicionált tápközegéből (1. további fájl: S1 ábra), és azonosítottuk morfológia, részecskeméret, koncentráció, és felületi markerek [19]. A TEM kimutatta, hogy ezeknek az exoszómáknak csésze alakú morfológiája volt (1A. ábra), a DLS pedig azt, hogy méreteloszlásuk 50–200 nm között volt (1B. ábra). A Western blotting azt mutatta, hogy az izolált exoszómák tartalmazták a pozitív CD63, TSG101 és HSP70 markereket, de nem a negatív markert, a calnexint (1C. ábra). Mindegyik hESC-nek hasonló exoszómahozama volt, mint a hiPSC-ké, és mindkettő magasabb volt, mint a hUC-MSC-ké (1D. ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a reprezentatív exoszómák leálltak, alakbeli különbségek nélkül; A három őssejttípusból izolált exoszómák koncentrációi között azonban különbségeket találtunk.

Megosztott és felültöltött fehérjék bioinformatikája

The SDS-PAGE and quantitative analyses revealed that while the protein concentrations of hESC-Exos and hiPSC-Exos were not different, they were both higher than those of hUC-MSC-Exos (Additional file 1: Fig.  S2A and B). The PCA plot indicated that exosomes had good uniformity within each group (Additional file 1:  Fig. S2C). The peptide fragments digested via enzymatic hydrolysis passed the quality inspection (Additional file 1: Fig. S2D–G) and then were subjected to the next bioinformatics analysis. Moreover, the proteins of three exosomes were mainly located in the extracellular region,   followed by the cytoplasm (Additional file 1: Fig. S2H).  To describe the protein profiles of the three types of exosomes, we integrated the TMT (Additional file 2) and label-free data (Additional file 3) under the conditions of mascot score>60 and abundance>100 (TMT assay)   and abundance of at least two repetitions>0 (címkementes vizsgálat). Végül 554, 437 és 911 magot választottunk ki a hESC-Exos, a hiPSC-Exos és a hUC-MSC-Exos fehérjeprofiljának elemzésére (1. további fájl: S3A ábra). Ezután ezeket a jelölteket Venn-diagram vizsgálatnak vetették alá a megosztott fehérjék kiválasztásához (1. további fájl: S3B ábra). A bioinformatikai elemzés kimutatta, hogy ezekben a jelátviteli útvonalakban a 303 közös fehérje uralja a szabályozást, beleértve az aktin citoszkeleton szabályozását, a fokális adhéziót, a PI3K-AKT-t, a szén-anyagcserét stb. (1. további fájl: S3C ábra). A GO elemzés azt is jelezte, hogy a megosztott fehérjék extracelluláris exoszómában, membránban, fehérjekötődésben és extracelluláris régióban gazdagodtak (1. további fájl: S3D ábra).

Furthermore, the top-loaded proteins were selected from the candidates with high FDR confidence (TMT   assay) and abundance of each repetition>0 (címkementes vizsgálat) (2A. ábra). Ezen eredmények alapján 163, 187 és 451 fehérjét szűrtünk a hESC-Exosban, a hiPSC-Exosban és a hUC-MSC-Exosban (1. további fájl: S3E ábra). Ezután leírtuk a háromféle exoszóma expressziós bőség görbéjét, és azonosítottuk az exoszómákban lévő betöltött fehérjék tíz legjobb génszimbólumát (2B. ábra). ThA nagy terhelésű fehérjéket a KOBAS algoritmus alapján bioinformatikának vetettük alá. A háromféle exoszóma proteomjai mind részt vettek egy komplex jelátviteli útvonal szabályozó hálózatban, és a legjobb 20 útvonalat a -log10 (P-érték) értéke alapján rendeztük (2C-E ábra). Minden proteom gazdagodott az extracelluláris mátrix (ECM)-receptor kölcsönhatásban és a PI3K-AKT jelátviteli útvonalakban. A fehérje-fehérje kölcsönhatás (PPI) analízis kimutatta, hogy mind a hESC-Exos, mind a hiPSC-Exos esetében a legmagasabban töltött fehérjékdúsított a sejtciklusban és az anyagcsere-útvonalban, míg a hUC-MSC-Exos felültöltött fehérjéi az immunitás-szabályozáshoz kapcsolódó útvonalakban gazdagodtak (2F-H ábra).

Az exoszóma proteomika páronkénti összehasonlítása

A két exoszóma-proteóma közötti különbség értékeléséhez Venn-diagramot szerkesztettünk az egyedi és átfedő fehérjekódoló génklaszterek felismerésére. A megosztott fehérjekódoló géneket ezután vulkán- és hőtérkép elemzésnek, valamint GSEA-nak vetettük alá, és a differenciálisan expresszált fehérjéket P-on szűrtük.<0.05 and  |log2FC|≥1. Comparison of hESC-Exos and hiPSC-Exos  (Additional file 1: Fig. S4A) revealed that their unique clusters were both enriched in ECM-receptor interaction and complement and coagulation cascades (Additional file 1: Fig. S4B and C) while overlapping clusters participated in multiple signaling pathways, including metabolic, cell cycle, and Hippo pathways (Fig. 3A). Significant differentially expressed protein-coding genes are presented in the volcano plot (Fig. 3 B). Heatmap analysis revealed that Cluster 1 proteins related to developmental biology, TGF-β signaling, and pluripotency regulation were enriched in hESC-Exos. Proteins in Cluster 2,   which were mainly enriched in hiPSC-Exos, were related to taurine and hypotaurine metabolism, RNA transport,   thiamine metabolism, and folate biosynthesis (Fig. 3 C).  GSEA further emphasized the more important role of hESC-Exos in developmental biology and cell cycle compared to hiPSC-Exos (Additional file 1: Fig. S5).

A hESC-Exos és a hUC-MSC összehasonlítása jelzés (1. további fájl: S4E ábra). Ezzel szemben a hUC-MSC-Exos egyedi klaszterek számos immunregulációval kapcsolatos jelátviteli útvonalban gazdagodtak, mint például a komplementrendszer, a gyulladás szabályozása és a mikrobiális fertőzés (1. további fájl: S4F ábra). Az átfedő klaszterek nagymértékben gazdagodtak az ECM-receptor kölcsönhatásban, a komplement és koagulációs kaszkádokban, valamint a PI3K-AKT jelátvitelben (3D. ábra). A vulkán diagram a hESC-Exos és a hUC-MSC-Exos közötti különbségeket ábrázolja (3E. ábra). A hUC-MSC-Exosban (1. klaszter) a felszabályozott fehérjék főként a komplementválaszban, a természetes ölősejtek aktivitásában, valamint a Rap1 és PPAR jelátvitelben vettek részt. Ezzel szemben a hESC-Exos által szabályozott fehérjék főként a PI3K-AKT, MAPK és AMPK jelátvitelben vettek részt (3F. ábra). A GSEA megerősítette a hiPSC-Exos magasabb szabályozó képességét a pluripotenciában (1. további fájl: S6A és D ábra), a hESC-Exosé pedig az immunregulációban, beleértve a természetes ölősejtek által közvetített citotoxicitást (1. további fájl: S6B és E ábra) és a COVID19-SARS-CoV2 szabályozása (1. további fájl: S6C és F ábra).

A hiPSC-Exos és a hUC-MSC-Exos összehasonlítás (1. további fájl: S4G ábra) feltárta, hogy az egyedülálló hiPSCExos fehérjét kódoló génkészlet szignifikánsan összefügg a nem homológ végcsatlakozással, a TGF- és B6-vitamin metabolizmussal (további 1. fájl: S4H ábra), míg a hUC-MSC-Exosé főként az immunregulációval kapcsolatos útvonalakban vett részt (További 1. fájl: S4I ábra). Átfedő fehérjéik az ECM-receptor kölcsönhatások, a komplement és koagulációs kaszkádok, valamint a PI3K-AKT jelátvitel szabályozásában is részt vettek (3G. ábra). A vulkán diagram bemutatja a differenciálisan expresszált fehérjéket (3H. ábra). A hőtérkép 1. klaszter fehérjéi azt mutatták, hogy a hUCMSC-Exos főként az immunválaszt és az AMPK jelátviteli útvonalat szabályozta, míg a hiPSC-Exos főként a sejtciklust, valamint az inzulin-, víziló- és mTOR jelátviteli útvonalakat szabályozta (3. I. ábra). A GSEA továbbá támogatta a hiPSC-Exos domináns szerepét a fejlődési folyamatok szabályozásában (1. további fájl: S7A és D ábra) és a pluripotencia fenntartásában (1. további fájl: S7B és E ábra), míg a hUC-MSC-Exos többnyire az immunregulációs folyamatban vesznek részt (1. további fájl: S7C és F ábra).

Átfedő proteomok bioinformatikája

Ezt követően a három exoszómatípus megosztott proteomjait vizsgáltuk. Összesen 309 fehérjét kódoló gént (4A. ábra) vetettünk alá GO- és KEGG-elemzésnek. Az eredmények azt mutatták, hogy a három exoszómatípus között megosztott fehérjekódoló génkészletek főként az extracelluláris aktivitásokban és biológiai folyamatokban vesznek részt, beleértve a sejtfehérje metabolikus folyamatokat, a jelátviteli receptorkötést, az ATP-kötést, a NAD-kötést, a sebgyógyulást és a lipid metabolikus folyamatokat. 4B). Hozzájárultak a jelátviteli útvonalak, például a PI3K-AKT, a glikolízis/glükoneogenezis, a víziló, az oxitocin, a HIF-1, a sejtciklus és az AMPK útvonalak komplex szabályozóhálózatainak felépítéséhez is (4C. ábra). A proteomikus és a kanonikus jelátviteli útvonalak között bonyolult szabályozási kapcsolatok voltak (4D. ábra). A buborékdiagram bizonyítja az egyes fehérjeklaszterek eltérő mennyiségét a kanonikus jelátviteli útvonalon. Míg a hESC-Exos és a hiPSC-Exos erősebb szabályozó képességekkel rendelkezik, mint a hUC-MSC-Exos a sejtciklus és az AMPK jelátviteli útvonalak tekintetében, a hUC-MSC-Exosnak kiemelkedő szabályozó hatása lehet a VEGF és NF-κB jelátviteli útvonalakra (további 1. fájl: S8 ábra).

A hőtérkép elemzés további különbségeket tárt fel a közös fehérjék expressziójában (4E. ábra). Az A klaszterben a PI3K-AKT, a Hippo, a VEGF és a B-sejt receptor jelátviteli útvonalakban részt vevő fehérjék hUC-MSCExos és hESC-Exos gazdagodtak. A B klaszter fehérjéi főként a PPAR jelátvitel, a koleszterin metabolizmus és az IgA termelés szabályozásában vettek részt, és a hESC-Exosban kimerültek. A hUC-MSC-Exos főként C-klaszter fehérjéket tartalmazott, amelyek szabályozták a komplementválaszt, a mikrobiális fertőzést, a HIF-1 jelátvitelt, a MAPK jelátvitelt, a metabolikus útvonalakat és az NF-κB útvonalat. A d klaszterben található fehérjék, amelyek hiPSC-Exosban gazdagodtak, részt vettek a Ras jelátvitel, az oxidatív foszforiláció és az mTOR jelátvitel szabályozásában. Az e klaszterben található fehérjék nagyobb mennyiségben voltak jelen a hiPSC-Exosban és a hESC-Exosban, mint a hUC-MSCExosban, és több anyagcsere-folyamatban is részt vettek, mint például a citrátciklus, a sejtciklus, az inzulin jelátvitel, a zsírsav-anyagcsere és az AMPK jelátvitel. . Az f klaszter fehérjéi részt vettek a kalcium reabszorpció, a glikolízis/glukoneogenezis, az adrenerg jelátvitel és a piruvát metabolizmus szabályozásában, és mind a hUC-MSCExos, mind a hiPSC-Exos esetében kimerültek. A különböző klaszterekben lévő fehérjéket a 4. kiegészítő fájl sorolja fel.

A három exoszómatípus miRNS-profilja

A három exoszómatípus miRNS-profiljának vizsgálatához teljes RNS-t izoláltunk az exoszómákból, hogy összekapcsoljuk az 5' és 3' végeket a későbbi inverz transzkripcióhoz. A kapott cDNS-t könyvtárépítéshez és széles körű teszteléshez használjuk. Az RNS integritási száma (RIN) 2,7, 2,6 és 2,6 volt a hESC-Exos, a hiPSC-Exos és a hUC-MSC-Exos esetében (1. további fájl: S9A ábra). Az RNS-koncentráció meghatározása kimutatta, hogy a hESC-Exos uralta az RNS-terhelést, majd a hiPSC-Exos és a hUC-MSCExos (1. további fájl: S9B. ábra). A Pearson-féle korrelációs együtthatót (1. további fájl: S9C ábra) és PCA-t (1. további fájl: S9D ábra) használtuk a miRNS-ek megismételhetőségének kvantitatív értékelésére. Hőtérképeket használtunk a három exoszómatípusban a differenciálisan expresszált miRNS-ek ábrázolására (1. további fájl: S9E ábra), valamint a differenciálisan expresszált miRNS-ek számának ábrázolására P-nél.<0.05 or 0.01,   was evaluated between each two exosome types (Additional file 1: Fig. S9F). Based on the sequencing results, the top 20 miRNAs in each of the three exosome types were identified (Fig. 5 A–C). In hESC-Exos, has-miR-302 dominated the read counts and comprised has-miR-302b-3p,   has-miR-302a-5p, and has-miR-302d-3p (Fig.  5A). The three miRNAs with the highest read counts were has-miR- 372-3p, has-miR-371a, and has-miR-302a in hiPSC-Exos and has-miR-21-5p (Fig.  5B), has-miR-146a-5p, and hasmiR-320a-3p in hUC-MSC-Exos (Fig. 5C).

A biológiai folyamatokban részt vevő miRNS-ek vizsgálatához a felső miRNS-eket a P-nél szűrtük<0.05 and read count>1000 a további célgén előrejelzéséhez. A dúsított géneket ezután GO és KEGG elemzésnek vetettük alá. Az eredmények azt mutatták, hogy a hESC-Exos miRNS-ek jelentősen befolyásolták a következő folyamatokat: Rap1, PI3K-AKT, kalcium, víziló, cAMP, ErbB, Foxo, sejtciklus, AMPK jelátviteli útvonal stb. (KEGG analízis) (5D ábra), ill. a sejtciklus, több szervezet fejlődése, intracelluláris jelátvitel, sejtdifferenciálódás, öregedés, Wnt jelátvitel és zsírsav-anyagcsere. (biológiai folyamat) (5G. ábra). A hiPSC-Exos miRNS-ek célgén-dúsítása azt jelezte, hogy a következő folyamatok szignifikánsan szabályozottak: PI3K-AKT, Rap1, Ras, Calcium, Hippo, cAMP és cGMP-PKG jelátviteli út stb. (KEGG analízis), valamint a sejtciklus, többszörös szervezet fejlődése, foszforilációja, sejtdifferenciálódás, sejtmigráció és hipoxiára adott válasz. (biológiai folyamat) (5H. ábra). A hUC-MSC-Exos miRNS-ek szabályozó hálózatában a legvalószínűbb biológiai folyamatok a következők voltak: Rap1, Ras, PI3K-AKT, kalcium, cAMP, Hippo, sejtciklus, JAK-STAT és HIF-1 jelátviteli út. . (KEGG analízis) (5F. ábra), valamint foszforiláció, intracelluláris jelátvitel, ATP-kötés, sejtosztódás, lipidmetabolizmus, T-sejt-kostimuláció, sebgyógyulás, NF-κB kötődés és gyulladásos válasz. (biológiai folyamat) (5. kép I). Az első öt miRNS hálózatát és azok szabályozási útvonalait is ábrázoltuk (1. további fájl: S10. ábra).

【További információ:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】