Diabetikus és nem cukorbeteg vérplazma és veseszövet pellet termikus bomlási gáztermékeinek Terahertz nagy felbontású spektroszkópiája
Mar 28, 2022
Kapcsolatba lépni:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Absztrakt
Jelentőség:Az orvosi diagnosztika egyik modern irányzata a metabolomikán alapul, amely megközelítés lehetővé teszi azon metabolitok meghatározását, amelyek a betegség sajátosságai lehetnek. A nagyfelbontású gázspektroszkópia lehetővé teszi a biológiai eredetű minták gázmetabolit tartalmának vizsgálatát. Bemutatjuk egy módszer kidolgozását diabetikus és nem diabéteszes biológiai minták, pelletként előállított, terahertzes (THz) nagyfelbontású spektroszkópiával történő vizsgálatára.
Cél:A munka fő gondolata a diabetikus és nem cukorbeteg szárított termékek termikus bomlástermékeinek vizsgálata.vérplazmaésvese szöveteia cukorbetegséget jellemző gázmarkerek készletének feltárására a THz-es nagyfelbontású spektroszkópiai módszerrel.
Megközelítés:Bemutatunk egy megközelítést a cukorbetegek és a nem cukorbetegek vizsgálatáravérplazma(ember és patkány) ésvese szövetei(patkányok), a THz frekvenciatartomány nem stacionárius hatásán alapuló nagy felbontású spektroszkópiával. Kidolgozásra került a vér- és veseszövetminták pelletként történő elkészítésének, valamint a minták párologtatásának módszerei.
Eredmények:Gőzök forgási abszorpciós spektrumának mérése a vérből készült pellet melegítésénél ésveseszöveta 118-178 GHz-es frekvenciatartományban végezték. A mintagőzök spektrumában megjelenő abszorpciós vonalakat detektáltuk és azonosítottuk. A termikus bomlástermékek molekuláris tartalma különbözött a nem cukorbeteg és a diabetikus minták esetében; pl. a fő marker a cukorbetegek vérében (emberben és patkányban) és a cukorbetegekben megjelenő aceton.veseszövet.
Következtetések: Tanulmányunk bemutatja a biológiai minták metabolittartalmának meghatározását a diagnosztika és a betegségek prognózisának meghatározásában a klinikai orvoslás számára. © A szerzők. Kiadta a SPIE Creative Commons Nevezd meg 4.0 Unported License. E munka részben vagy egészben történő terjesztéséhez vagy reprodukálásához az eredeti kiadvány teljes körű megjelölése szükséges, beleértve a DOI-t is. [DOI: 10.1117/1.JBO.26.4.043008] Kulcsszavak: nagyfelbontású terahertz spektroszkópia; termikus bomlás; szövet;vérplazma; cukorbetegség; liofilizálás.
Kulcsszavak:nagy felbontású terahertz spektroszkópia; termikus bomlás; vérplazma; cukorbetegség; liofilizálás, veseszövet.
1. Bemutatkozás
Napjainkban a társadalmilag fontos betegségek (cukorbetegség, daganatos megbetegedések stb.) diagnosztikájának problémája, beleértve a korai stádiumot is, a világ tudományos csoportjainak nagy figyelmét felkelti.A különböző betegségek diagnosztikájában és kezelésében új lehetőségeket nyitó új megközelítések egyike a metabolomika. A metabolomika egy olyan tudományterület, amely egy biológiai rendszer (sejt, szervek vagy egész szervezet) vég- és köztes anyagcseretermékeit vizsgálja. A metabolomika feltárhatja azokat a metabolitokat, amelyek a betegség sajátos jellemzői lehetnek, és nagy szerepet játszhatnak a betegség diagnózisában és prognózisában. Az emberi szervezetben lévő vég- és közbenső anyagcseretermékeket tartalmazó közeg, amely alkalmas a betegségekhez és patológiákhoz kapcsolódó metabolitok feltárására, a kilégzett lehelet, vér, vizelet, nyál stb.
Az egyik társadalmilag fontos, az emberek életminőségét veszélyeztető betegség a cukorbetegség. A 2-es típusú diabetes mellitus korábban középkorúak betegsége volt, de ma már felnőtteknél, fiataloknál és gyermekeknél diagnosztizálják. A 18 év feletti cukorbetegek, valamint az 1-13 éves gyermekek vér- és vizeletmintáinak metabolomikai vizsgálatainak eredményeit a Human Metabolome Database (HMDB) tartalmazza. 30 kémiai anyagot, köztük izomereket, és agy-gerincvelői folyadékot (1 kémiai anyag) vizsgáltunk. Például (R)-3-hidroxi-vajsavat mindhárom típusú folyadékban kimutattak. Egyes anyagokat (acetoecetsavat, D-fruktózt és D-glükózt) mindkét folyadékban (vérben és vizeletben) kimutattak. A cukorbetegségre jellemzőbb vonás (aceton, CH3COCH3) csak a vizeletben volt jelen. A folyadékmintákat, a HMDB-ben bemutatott vizsgálatok eredményeit különböző módszerekkel vizsgáltam - gázkromatográfia; 2 gázkromatográfia tömegspektrometriával; 3,4 gáz-folyadék kromatográfia tömegspektrometriával; 5 nagyfelbontású magspektroszkópia protonmágneses rezonancia;6 és a cukorbeteg állapotellenőrzésére szolgáló speciális eszközöket, a folyamatos glükózmonitorozó rendszert alkalmazó módszerek.7
A krónikus vesebetegség kialakulása a diabetes mellitus egyik fő szövődménye. Bár a szűrés általános megközelítése a glikált albumin meghatározása, a vesekárosodás jóval azelőtt elkezdődhet, hogy a vizelet albuminjában klinikailag jelentős változások jelentkeznének. Tekintettel a krónikus vesebetegség multifaktoriális patogenezisére, különböző markereket vettek figyelembe szűrésére.8,9 Diagnosztikai értékük vesebiopszia nélkül azonban kétségesnek tűnt.
A spektroszkópiai megközelítés a biológiai minták tartalmáról nyújthat információt, amely az orvosi diagnosztikában használható. A terahertzes (THz) frekvenciatartomány nagyon fontos az élő szervezetek gázainak, folyadékainak és szöveteinek vizsgálatához. Vannak olyan áttekintések, amelyek a THz-es frekvenciatartományban alkalmazott módszerek alkalmazására vonatkoznak, beleértve a THz-es időtartomány-spektroszkópiát, a THz-es reflektometriát és a THz-es képalkotást a biológiában és az orvostudományban.10
A THz időtartományú spektroszkópia lehetővé teszi azoknak a spektrumoknak a detektálását, ahol az abszorpciós együttható vagy törésmutató bizonyos spektrális jellemzőkkel rendelkezik, amelyek megfelelnek bizonyos biomolekulák (fehérjék, cukrok stb.) jelenlétének a mintákban vagy azok különböző koncentrációiban.11
A molekuláris abszorpciós spektroszkópia és különösen a THz-es gázspektroszkópia nagyon ígéretes módszer a különböző eredetű többkomponensű gázelegyek vizsgálatára.12 A folyékony és szilárd halmazállapotú minták párologtatással vagy hőbontással vizsgálhatók. A sugárzás gázmintákon keresztül történő továbbításakor végzett abszorpciós spektrumokban spektrális vonalaiból a társadalmilag fontos betegségek (cukorbetegség, rák stb.) metabolitjai-markerei mutathatók ki.
A cukorbetegektől (12 fő) vett kilélegzett lehelet és vizelet acetonszintjét terahertzes spektrométerrel, a ható sugárzás fáziseltolásos kulcsával mértük. A kísérleteket az Almazov Nemzeti Orvosi Kutatóközponttal együttműködve végezték. A méréseket a 150,537 és 151,647 GHz-es központi frekvenciájú aceton abszorpciós vonalakon végeztük. A méréseket fűtés nélkül végeztük. A cukorbetegek kilégzett lehelet- és vizeletmintáinak egyidejű elemzése kimutatta, hogy a vizelet acetonszintje jóval magasabb, mint a kilégzett levegőben, esetenként egy nagyságrenddel is magasabb.13,14
A THz-es nagyfelbontású gázspektroszkópiai vizsgálatok eredményeivérplazmabetegek és patkányok (feltételesen egészségesek és cukorbetegek), valamint a patkányokéveseszövet(egészséges és cukorbeteg) szárított és pelletre préselt termék kerül bemutatásra. A szövetek illvérplazmakészítmény nélkül, a mintavétel után azonnal meg kell vizsgálni. A pelletként történő készítés lehetővé teszi a vizsgálatot kellően hosszú idő elteltével a vérvétel vagy a vesebiopszia után.
2 Kísérletek és módszertan
2.1 Vérplazma pellet és vesepellet készítésének módszere
A 2-es típusú diabetes mellitusban szenvedő betegek és a feltételesen egészséges résztvevők vénás vérét az Almazov Országos Orvostudományi Kutatóközpont Endokrinológiai Osztályán vették; a központ a cukorbetegek orvosi ellátását biztosítja. Három beteg és két résztvevő férfi volt, azonos korú (39-43 évesek). Az ebben a vizsgálatban használt összes kísérleti protokollt a betegek és a résztvevők, valamint az Orvosi Központ használati bizottsága felülvizsgálták és jóváhagyták. A vénás vért reggel 8-12 órás koplalás után vettük egy csőben K3EDTA véralvadásgátlóval (Vacutest Kima, Olaszország). A biokémiai paraméterek elemzéséhez plazmát nyertünk teljes vér centrifugálásával 3000 fordulat/perc sebességgel 15 percig laboratóriumi centrifugában (Eppendorf 5702R, Németország) þ4 fokos hőmérsékleten. Biokémiai paramétereinek értékeivérplazmaA mintákat és a referencia intervallumokat az 1. táblázat mutatja be (a glikált hemoglobin szintjét a teljes vérből határoztuk meg). Az 1. táblázat azt mutatja, hogy a cukorbetegek mintáiban a glükóz, trigliceridek és glikált hemoglobin koncentrációja 1,5, 2, illetve 2,3-szorosára nő.
A vizsgálatot 8 hetes, 180-200 g súlyú Wistar hím patkányokkal is elvégezték, az Almazov Nemzeti Orvostudományi Kutatóközpont Kísérleti Orvostudományi Intézete Állatgondozási és Felhasználási Bizottsága által jóváhagyott kísérleti vizsgálatok protokollja szerint. A kísérleti csoportba tartozó állatok glükózszintje 21 mmol ∕ l volt 120 perccel a glükózterhelés után. Kontrollcsoportként ép patkányokat használtunk. Vénás vért vettünk az inferior vena cava-ból, mielőtt az állatokat elaltatták volna. A vesét is betakarították. A vérmintákat véralvadásgátlót tartalmazó csövekbe gyűjtöttük.
A tesztmintákat –80 fokos hőmérsékleten lefagyasztottuk (alacsony hőmérsékletű hűtőszekrény, DW-86L388A, Haier, Kína). Ezután Vaco 2-vel (ZirBus, Németország) liofilizáltuk fagyasztva szárítással -50 fokos hőmérsékleten és 3 Pa nyomáson. A fagyasztást a liofilizálás előtt végezzük, mivel a nagy belső nyomás hatására történő liofilizálás során a biológiai összetevők meg kell semmisíteni. A szárított minták biológiai kristályokból álló szivacs voltak. A szivacsot egy fém spatula tönkretette, és több tíz mikrométer méretű kristályokká zúzott. A mozsár és mozsártörő használata lehetetlen volt, mivel a minták összetételében lévő fehérjék őrlése nem kívánt tapadáshoz és kerek szemcsék kialakulásához vezet.
A liofilizált mintaport lemértük (OHAUS Discovery analitikai mérleg, Svájc), majd acél présformába helyeztük. Laboratóriumi prések (Angkor, Oroszország és Specac, Egyesült Királyság) használatával bizonyos formázási nyomás mellett avérplazmapelleteket és vesepelleteket kaptunk. A pelletek minden kristálya bizonyos százalékban tartalmaz zsírokat (triglicerideket), fehérjéket (albumint) és fibrinogént – ezek mindegyike normál vagy glikált (cukorbetegség esetén). A kontrollcsoportból származó minták pelletjeit a továbbiakban "nem cukorbeteg pelletnek", míg aA diabetikus csoportot a továbbiakban "diabetikus pelletnek" nevezzük.
2,2 THz-es nagy felbontású spektroszkópiai kísérleti beállítás
A nem stacionárius hatásokon alapuló nagyfelbontású THz spektroszkópia lehetővé teszi a gáz- és gőz többkomponensű gázkeverékek komponens-összetételének elemzését. A spektrométerek az elméleti határhoz közeli érzékenységet biztosítanak, a felbontást csak a Doppler-effektus korlátozza, és gyors folyamatokat rögzítenek. Az érzékenység a gáznyomás jelentős csökkenése mellett is megmarad, és pásztázási módban egyes gázok esetén körülbelül 0,2 ppb (pl. ammónia az abszorpciós vonal mérésénél az 572 GHz-es frekvencia közelében). Ezen túlmenően lehetővé teszi egy gázkeverék komponens-összetételének nagy megbízhatóságú meghatározását.12 A pellet termikus bomlástermékeinek vizsgálatát a 118-178 GHz-es tartomány THz-es nem-stacionárius gázspektroszkópiájával végeztük. A spektrométer fáziszárt hurkot használ a visszafelé irányuló hullám lámpa frekvenciájának és a fáziseltolásnak az automatikus vezérléséhez, az időtartományban történő regisztráláshoz, az átlagoláshoz és a spektroszkópiai átmeneti jel feldolgozásához. A készülék jelet regisztrál az időtartományban. A minták gőzét a következő eljárással elemeztük. A pelleteket kémcsőbe helyeztük, vákuumszivattyúzással, fokozatosan felmelegített kémcsővel (240 fokig), és a minta termikus bomlástermékeinek keletkező keverékét a mérőcellába engedtük. Egy adatfájl általában a spektrométer kiválasztott vagy teljes működési tartományának felvételeit tartalmazza. Ezért a minta teljes spektrumában megjelenő abszorpciós vonalak alapján az anyagok azonosíthatók, és több adatállomány összehasonlításával nyomon követhető a keverékben a koncentráció dinamikája. Az anyagokat nyílt forráskódú MW, mmw és THz adatbázisokban való kereséssel azonosították.15,16
3 Vérplazma gőzök és vese gőzök elemzése nagy felbontású terahertz spektrométerrel
THz-TDS rendszereinkkel a pellet transzmisszióját a 0,2 és 1,4 THz közötti spektrumtartományban mértük,17 de tudjuk, hogy a biomolekuláknak és különösen annak gázállapotú bomlástermékeinek informatív válasza van (forgási abszorpció). spektrumok) ezeken a frekvenciákon és alacsonyabban is, így további vizsgálatot végeztünk THz-es nagyfelbontású gázspektrométeren. Az anyagok kimutatott abszorpciós vonalai cukorbeteg emberbenvérplazmaegybeesik a nem cukorbeteg emberi anyagokkalvérplazma, kivéve az acetont. A spektrométer működési frekvenciatartományában (118-178 GHz) sok aceton abszorpciós vonal található. Általában több mint elegendő egy anyag abszorpciós vonalának kimutatása az anyag többkomponensű gázkeverékben való jelenlétének egyértelmű meghatározásához. Az abszorpciós spektrumok egyes részeinek az aceton abszorpciós vonalával történő rögzítésére az 1. ábrán látható példa. Az aceton szénhidrát-anyagcsere-zavar esetén jelenhet meg a vérben. A szakirodalom szerint a cukorbetegek vére -OH-butirátot és acetoacetátot tartalmazott, de később ezek az anyagok acetonná és szén-dioxiddá bomlottak.18 A szén-dioxidnak nincs dipólusmomentuma; ezért nincsenek forgási átmenetei. Megnövekedett tartalma csak a minta IR tartományban lévő rezgésspektrumának vizsgálatával mutatható ki.
A plazmagőz anyagokat, mint például a karbonil-szulfidot (OCS), a kén-dioxidot (SO2), a hangyasavat (HCOOH), az izociánsavat (HNCO) és az ammóniát (NH3) kimutatták mind a humán, mind a nem cukorbeteg mintákban. Egyes esetekben a minta spektrumában egy kísérleti vonal található, amely több vonalnak felel meg, mint egy anyag (pl. izociánsav) a katalógusadatokban (lásd a 2. táblázatot).15,16
Ez azzal magyarázható, hogy a katalógusok olyan anyagok hiperfinom szerkezetére vonatkozó adatokat tartalmaznak, amelyeket ebben a kísérletben nem oldunk meg, mivel a vonalak véges, több száz kHz-es nagyságrendűek. A vizsgált anyagok kapott abszorpciós vonalai egybeesnek a kapilláris vér gőzeinek abszorpciós spektrumával, ill.vérplazmaA cukorbetegek és a feltételesen egészséges résztvevők esetében, amelyeket korábbi munkánkban közöltünk.19 A kimutatott gáznemű anyagok mintaelőkészítés során keletkezhettek az aminosavak kémiai átalakulásának termékeiként. Vizsgálatot igényel az a kérdés, hogy ezek a vegyületek diagnosztikai értékkel bírnak-e. A diabetológia klinikai gyakorlatában ezen anyagok tartalmának elemzését még nem alkalmazzák.
A gőzök avérplazmaegészséges patkányok karbonil-szulfidot (OCS), metántiolt (CH3SH), butironitrilt (C3H7CN), acetaldehidet (CH3CHO) és hangyasavat (HCOOH) tartalmaztak. A mintavérplazmaA diabéteszes patkányok esetében az aceton jelenléte különbözött. A propionitril (C2H5CN) abszorpciós vonalain kívül metil-formiátot (CH3OCHO) is kimutattunk.
Egészséges és cukorbeteg patkányok szárított pelleteinek gőzmintáivese szöveteitanulmányozták. A gőzeiveseszövetegészséges patkányok karbonil-szulfidot (OCS), kén-dioxidot (SO2), hangyasavat (HCOOH), izociansavat (HNCO), etil-formiátot (C2H5OCHO) és propilénglikolt (CH2ðOHÞCHðOHÞCH3) tartalmaznak. A cukorbeteg patkány gőztartalmaveseszövetaz egészséges patkánytól nemcsak karbonil-szulfid (OCS), hanem izotopológja OCS-34 jelenléte is különbözött. Az acetaldehidet (CH3CHO), a metántiolt (CH3SH), az etilén-szulfidot (C2H4S), a metanolt (CH3OH) és a glikolaldehidet (CH2ðOHÞCHO) is kimutatták egy cukorbeteg patkány pelletjének gőzeiben.veseszövet(lásd 2. és 3. ábra).
A kénvegyületek, például a metántiol jelenléte a kén-aminosavak (metionin, cisztein és cisztin) hőbomlása révén határozható meg a vérfehérje-összetételben. A metionin esszenciális aminosav, amely az emberi szervezetben nem szintetizálódik. Élelmiszerből nyerik, és a cisztein bioszintéziséhez kénforrás. Amikor a kén aminosavakat körülbelül 240 fokos hőmérsékletre melegítettük, ezeknek az anyagoknak a tömegspektrumában metántiol és etilén-szulfid (metioninbomlás) volt kimutatható.
4 Következtetés
Az ember és a patkány molekulatartalmavérplazmaés patkányveseszövetA minták hőbomlása során THz-es nagyfelbontású spektrométerrel vizsgáltuk. Bemutatták a biológiai minták pelletek készítésének módszerét. Ez a módszer lehetővé teszi a minták tárolását és szállítását. A nagyfelbontású gázspektroszkópia lehetővé teszi bármilyen eredetű többkomponensű gázkeverékek tartalmának meghatározását, beleértve a biológiai eredetűeket is, nyomokban gázkomponensek koncentrációjával. Acetont mutattak ki cukorbetegeknélvérplazmaminták. Tájékoztatás a cukorbeteg és az egészséges tartalom különbségérőlvérplazmaférfiak és patkányok, valamint cukorbeteg és egészséges patkányokvese szöveteigőzök abszorpciós forgási spektrumaiból kaptuk. A THz-es nagyfelbontású spektroszkópia minőségi elemzést tesz lehetővé a vérgőzök és a minták összetevőiről.vese szöveteipellet. A fontos cukorbeteg gázmarkerek koncentrációinak kvantitatív becslésének lehetősége a betegek állapotától függőentovábbi vizsgálatok során tanulmányozni kell.
