A Cistanche Tubulosa kivonat jótékony hatásai az echinakozid (ECH) és az akteozid (ACT) alacsony bélpermeabilitásának javítására.
Mar 25, 2022
Kapcsolatfelvétel: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Tadatoshi Taninoa, Noriaki Nagaib és Yoshinori Funakamib
* Gyógyszertudományi Kar, Tokushima Bunri Egyetem, Tokushima és b Gyógyszerészeti Kar, Kinki Egyetem, Osaka, Japán
Absztrakt
CélokEnnek a tanulmánynak az volt a célja, hogy megvizsgálja a jótékony hatásokatCistanchetubulosakivonataz echinakozid (ECH) és az akteozid (ACT) alacsony bélpermeabilitásának javításáról.MódAz ECH és az ACT abszorpcióját C. tubulosa kivonatban humán intestinalis Caco{0}} sejt monorétegek és ép vegyületekkel jellemezték. Az ECH és az ACT glükóz transzporter-függő felszívódását in situ intestinalis perfúziós technikával igazoltuk.Kulcsfontosságú leletekA látszólagos permeabilitás (Papp) nem különbözött szignifikánsan az ép ECH és az ép ACT között. Phloridzin jelenlétében az ECH és az ACT Papp nagy dózisa esetén a megfelelő kezelés hiányának 20 százalékára csökkent, de a phloretin és a verapamil nem változtatta meg. A C. tubulosa kivonat kis és nagy dózisokban (mindkettő háromszorosára) fokozta az ECH és az ACT Papp-ját, ami nagymértékben részt vesz a nátrium-függő glükóz transzportertől független felszívódásban. Alacsony koncentrációban a phloridzin szignifikánsan elnyomta a portális vér egyidejű ECH és ACT szintjét.KövetkeztetésAz étrendi és gyógyászati C.tubulosakivonataz ECH és az ACT bélben történő felszívódásának fokozása az emberi egészség jobb kezelését szolgálhatja, bár a phloridzin-érzékeny transzport részvételét csökkenteni kell.
Kulcsszavakakteozid; Caco{0}} sejt monorétegek;Cistanchetubulosakivonat; echinakozid; phloridzin-érzékeny glükóz transzporter
Bevezetés
A gyökereiCistanchetubulosahagyományosan orvosságra és élelmiszerre használták. Ismeretes, hogy a C. tubulosa kivonat farmakológiai hatással rendelkezik különböző agyi betegségekben, öregedésgátló funkciókban, zsíranyagcserében és hajnövekedésben.[1–4] A közelmúltban iridoidokat, monoterpenoidokat, fenil-etanoid glikozidokat és lignánokat izoláltak a C. tubulosa-ból. . [5,6] A feniletanoid-glikozidok, a polifenol vegyületek egy osztálya, a fő kémiai összetevők.Cistanchefajok[7], bár mennyiségük fajonként eltérő. Az echinakozid (ECH; 1. ábra) a Herba Cistanchis egyik fő fenil-etanol-glikozidja. Bakteriális eredetű enzimek a vastagbélben hidrolizálják akteoziddá (ACT; verbaszkozidnak is nevezik). [8,9] Az ECH és az ACT jótékony hatású májvédő[10] és gyulladáscsökkentő[11] hatással bír rágcsáló állatokban. Meglepő módon a vízben jól oldódó ECH javítja a viselkedési és neurokémiai eredményeket a Parkinson-kór egérmodelljében, és gátolja a kaszpáz-3 és kaszpáz-8 aktiválását kisagyi szemcseneuronokban.[9] Köztudott, hogy a vér-agy gát szigorúan korlátozza a xenobiotikumok bejutását és eloszlását az agyba a vérből. Wu és mtsai. [12] azt is kimutatta, hogy a vízoldható ACT gyorsan eloszlik a patkányok agyszövetében. Ezért az ECH-t és az ACT-t specifikus rendszer(ek) szállíthatják az agyba, a belekbe és a májba.
1. ábra Az echinakozid és az akteozid kémiai szerkezete.
Bár erős bizonyítékok vannak arra vonatkozóan, hogy a C. tubulosa kivonat fogyasztása jótékony hatással van az emberi egészségre, a tiszta ECH permeabilitása a Caco{{0}} sejt egyrétegű rétegein 8,4 ± 1,6 ug/ml csúcskoncentrációnál egyenlő vagy alatta a mannit paracelluláris transzport markerének.[13] Ha tiszta ECH-t adnak orálisan patkányoknak (dózis, 1{{10}}0 mg/kg), a felszívódás rendkívül gyors (Tmax, 15 perc), és a maximális szérumkoncentráció nagyon magas. alacsony (Cmax, 0.61 ± 0.32 ug/ml).[14] Az ECH abszolút biológiai hozzáférhetősége csak 0,83 százalék. Hasonlóképpen, ha a Caco-2 sejteket az olajbogyó-malom szennyvízéből részben megtisztított fenolos frakcióval inkubálják, a tiszta ACT-felvétel gyors, a felhalmozódás csúcsa 30 perc után következik be, a teljes felhalmozódási hatékonyság pedig 0,1 százalék. 130 pmol/mg sejtfehérje intracelluláris szintje.[15] Patkányokban a tiszta ACT maximális koncentrációját (0,13 ± 0,03 ug/ml) a 100 mg/kg-os orális adagolás után 30 percen belül érte el,[12] ami gyors bélrendszeri felszívódást jelent. Az ACT, valamint az ECH orális biohasznosulása meglehetősen alacsony (0,12 ± 0,04 százalék), ami arra utal, hogy a bélrendszerben és a májban first-pass hatások jelentkezhetnek. Patkányepében az ECH metilációs és glükuronidációs konjugátumai a fő metabolitok[16], bár a májban történő metabolizmus mértéke továbbra sem tisztázott. Előzetesen azt találtuk, hogy az ECH és az ACT meglehetősen stabil volt a patkány bélnyálkahártya és a mesterséges gyomorsav homogenizátumában (az adatokat nem mutatjuk be). Najar et al. [17] kimutatták, hogy az ACT gátolja a P-glikoprotein (P-GP)-ATPáz aktivitását, hasonlóan a verapamilhoz (egy reprezentatív P-gp inhibitor), ami P-gp modulátort jelent; azonban bizonytalan, hogy az ACT elérhető-e P-gp szubsztrátként. Érdekes módon az étrendi flavonoid-D-glükozidok legújabb eredményei azt mutatták, hogy a multidrug rezisztencia fehérje (MRP2) elfedte a kvercetin 4'-O- -glükóz nátrium-függő glükóz transzporter (SGLT){45}} által közvetített felvételét, [18,19], amely a nagyon rossz felszívódásért felelős. Nagyon keveset tudunk azonban a polifenol-glükozidok abszorpciós transzporterekkel szembeni érzékenységéről, beleértve a glükóz transzportereket is. A kvercetin 4′-glükozid és a gyorsan vér-agygáton áteresztő ECH felszívódási jellemzőire vonatkozó információk arra késztetett bennünket, hogy megvizsgáljuk a feniletanoid-glikozidok transzporter-érzékeny felvételét az étrendi C. tubulosa kivonatban.
Ebben a tanulmányban humán intestinalis Caco{1}} sejt monorétegek felhasználásával vizsgáltuk az érintetlen ECH és ACT glükóz transzporter által közvetített felszívódását. Ezzel egyidejűleg az étrendi C. tubulosa kivonatban az ECH és az ACT egyidejű abszorpciós transzportját egy in vitro modell és in situ bélperfúziós rendszer jellemezte portális vérmintával, amely könnyen megkülönbözteti a felszívódás mértékét és a májban történő első elkerülését. -passz diszpozíció.
Anyagok és metódusok
Anyagok
Az ép ECH és ACT az Eishin Trading Co., Ltd. (Oszaka, Japán) nagylelkű ajándékai voltak. A phloridzint és a phloretint a Tokyo Kasei Co., Ltd.-től (Tokió, Japán) vásároltuk. A nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás (HPLC) vizsgálat belső standardjaként használt verapamil és p-kumársav a Sigma-Aldrich-től (St Louis, MO, USA) származott. Az összes többi felhasznált vegyszer analitikai minőségű és kereskedelmi forgalomban kapható volt.
Növényi anyag és a metanolos kivonat elkészítése
A C. tubulosa (SCHRENK) A R. WIGHT (Orobanchaceae) egy évelő parazita növény, amely Salvadora vagy Calotropis fajok gyökerén nő, és Észak-Afrika, Arab és Ázsiai országokban elterjedt. A C. tubulosa szárított szárát porítottuk, és metanollal háromszor extraháltuk visszafolyató hűtő alatt 3 órán át. Az oldószert csökkentett nyomáson lepároljuk, így a metanolos extraktumot kapjuk. A metanolos kivonat (kereskedelmi minőségű, tételszám: 20070130;
bejegyzett kereskedelmi név, Sabaku Ninnjinn Kanka) az Eishin Trading Co., Ltd. nagylelkű ajándéka volt Muraokán és Morikawán keresztül (Kinki Egyetem, Japán), a botanikai azonosítást pedig Jia Xiaoguang professzor végezte el a Hszincsiangi Hagyományos Kínai és Kínai Intézetben. Etnológiai gyógyszerek.
Növényi kivonat elemzése: kromatográfia
Az alábbiakban ismertetett HPLC-analízissel meghatároztuk az ECH- és ACT-tartalmat a C. tubulosa kivonatban (20070130. tételszám). A kapott adatokat az 1. táblázat tartalmazza.
Sejttenyésztés
Az American Type Culture Collection-től (ATCC, Rockville, MD, USA) vásárolt Caco{{0}} sejteket használtuk a 38–53. passzázsban. Dulbecco módosított Eagle táptalajból (DMEM, Nacalai Tesque Co., Kyoto, Japán) tartalmazó táptalajban neveltük őket, kiegészítve 0,1 mM nem esszenciális aminosavakkal, 10 százalék hővel inaktivált magzati szarvasmarha szérummal, 100 E/ml penicillin G és 0,1 mg/ml sztreptomicin-szulfát.
Közlekedési tanulmányok
A Caco-2 sejteket 6,4 × 103 sejt/cm2 sűrűséggel polikarbonát szűrőkre szélesztettük. A transzportkísérletekhez monorétegeket használtunk 21-25 nappal a vetés után. Sértetlen ECH és ACT, amelyek egyenértékűek voltak a benne lévő tartalommalCistanchetubulosa kivonat(4.5 and 13.5 mg/ml) were mixed with DMEM medium containing 0.5% dimethylsulfoxide to maintain the integrity of the cell monolayer over the periods of the experiments. Intact ACT equivalent to ECH content in the extract was also dosed in the incubation medium. The extract was suspended in a DMEM medium and was centrifuged to remove insoluble components. Supernatants were loaded to the apical side. At the indicated times, an aliquot of the incubation medium was withdrawn from the basolateral side and was mixed with acetonitrile containing an internal standard for the assay. In separate experiments, phloridzin (fifinal concentration, 1 mM) and verapamil (fifinal concentration, 0.2 mM) was added to the apical side of the monolayer; however, phloretin (fifinal concentration, 0.3 mM) was treated on both sides of the monolayer. The integrity of monolayers was monitored by transepithelial electrical resistance (TEER) using Millicell-ERS (Millipore, Bedford, MA, USA) before and after transport experiments. TEER values of monolayers used were >300 Ω·cm2.
In situ bélperfúzió
A hím Wistar patkányokat (23{{20}}–250 g) az SLC Japantól (Hamamatsu, Japán) szereztük be. Az állatokat egy légkondicionált szobában tartottuk 12 órás világos/sötét ciklus alatt 1 hétig használat előtt. A patkányokat standard laboratóriumi táplálékkal (Oriental Yeast Co., Ltd., Tokió, Japán) etettük vízzel ad libitum, és a vizsgálat előtt egy éjszakán át koplaltuk őket. Az in situ recirkulációs perfúziós vizsgálatot a Mihara és munkatársai által leírt módosított eljárás szerint végeztük. [20] Röviden, a patkányokat 25%-os uretán oldattal (1 mg/kg) érzéstelenítettük, hogy elkerüljük a vérnyomás csökkenését. Egy középvonali hasmetszést végeztünk, és a vékonybelet szabaddá tettük. Az epevezetéket lekötöttük, hogy elkerüljük az epe kiválasztását a perfuzátumba. Az egész vékonybelet, mint egy szakaszt (a nyombéltől az ileumig) normál sóoldattal öblítettük 37 fokos hőmérsékleten 10 percig, amíg a mosás tisztának nem tűnt. A szilikon csőhöz csatlakoztatott üvegcsöveket ezután a vékonybél mindkét végébe kanüláltuk, és varrószállal rögzítették. Ezután a vékonybelet kicserélték a hasban, és a kanülöket egy perisztaltikus pumpához csatlakoztatták. A portális vénát polietilén csővel (PE10) kanüláltuk. A kereskedelemben beszerezhető C. tubulosa kivonatot Krebs-Henseleit bikarbonát pufferben (pH 7,4) szuszpendáltuk 4,5 mg/ml végső koncentráció eléréséig, és 10 percig 8000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk az oldhatatlan komponensek eltávolítására. A felülúszót phloridzin (1 mM) hiányában vagy jelenlétében egy tartályba gyűjtöttük, amelyet a kísérlet során 37 ± 0,5 fokos hőmérsékleten tartottunk. A jelzett időpontokban vért vettek a portális véna kanülön keresztül. A vérminták centrifugálása után a kapott plazmát a belső standardot tartalmazó acetonitrillel fehérjementesítettük, és 3000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk. A felülúszókat bepároljuk, és a maradékot acetonitrilt és 0,5%-os ecetsavat tartalmazó mozgófázissal feloldjuk. A kevert oldatot HPLC oszlopra visszük. A patkányokat a japán kormány és a Kinki Egyetem által kiadott Laboratóriumi állatok gondozására és használatára vonatkozó irányelvek szerint etikai eljárásoknak megfelelően használták.
HPLC elemzés
A HPLC analízist Shimadzu SPD{{0}}A, UV detektorral, Shimadzu LC-10A pumpával és Shimadzu C-R4A kronotopikus integrátorral (Kioto, Japán) felszerelt rendszeren végeztük. Az ECH-t és az ACT-t Inertsil ODS oszlopon (5 μm, 4,6 × 15{13}} mm, GL Sciences Inc., Osaka, Japán) választottuk el. Acetonitril és 0,5% ecetsav 15:85 (v/v) arányú mozgófázisát alkalmaztuk 1,0 ml/perc áramlási sebességgel. A detektálást 334 nm-en végeztük.
Kinetikai elemzés
A látszólagos permeabilitási együtthatókat (Papp) a Caco{0}} sejt monorétegeken keresztüli vegyülettranszport időbeli lineáris szakaszának meredekségéből becsültük meg, az alábbiak szerint:
Papp{{0}} （dQ/dt）/ A1C0)
ahol dQ/dt a permeabilitási arány, C0 az oldott anyag kezdeti koncentrációja a donorkamrában, A pedig a membrán felülete (4,7 cm2).
A patkányokon végzett in situ bélperfúziós vizsgálatban a plazmakoncentráció-idő görbe alatti területet (AUC{2}}–90) a portális vénában a nullától az utolsó mérésig a lineáris trapézszabály szerint számítottuk ki.
Fizikai-kémiai tulajdonságok
A vegyületek poláris és nem poláris felületét a SAS program segítségével számítottuk ki (verzió 0.8, Olsson, T.; Sherbukhin, V., Synthesis and Structure Administration, 1997–2001, AstraZeneca, Cary). , NC, USA). A kísérletileg meghatározott log P és pKa értékeket az irodalomból kaptuk.
Statisztikai analízis
Az adatokat egyirányú varianciaanalízissel, majd Tukey posthoc teszttel elemeztük. Az 5 százaléknál kisebb valószínűségi értékeket szignifikánsnak tekintették.
Eredmények
Az echinakozid és az akteozid abszorpciós transzportja a Caco{0}} sejt egyrétegein keresztül
Egerekben és patkányokban ép ECH[1{{20},14] és ACT[12,21] 100–1{{ dózisban szájon át adható. 39}}00 mg/kg. A felhasznált C. tubulosa kivonat körülbelül 30% ECH-t és 15% ACT-t tartalmazott adagonként. Mivel a kivonat megváltoztatta az ozmózisnyomást és a pH-t az inkubációs közegben, az orális adagolás alapján 4,5 és 13,5 mg/ml koncentrációt határoztunk meg (ép vegyületek: 2-20 mg/20 g test). súly) egerekben. Az alacsony (4,5 mg/ml) és nagy dózisú (13,5 mg/ml) kivonat ECH esetében 2,0 és 6,1 mg, ACT esetében 1,0 és 3,0 mg-ot tartalmazott. A C. tubulosa kivonatot olyan mennyiségben alkalmaztuk, amely jóval alacsonyabb volt, mint az ECH és ACT orális adagja, amelyet emberekben jelentettek (a kivonat javasolt étrendi mennyisége: 150 mg, amely körülbelül 45 mg-ot tartalmaz ECH-ra és 22,5 mg-ot ACT-re). Az érintetlen vegyületek kis és nagy dózisainál az abszorpciós profilok (2. ábra) és a Papp nem különböztek szignifikánsan az ECH és az ACT mint ECH-ekvivalens között (2. táblázat). Amikor nagy, 13,5 mg/ml-es C. tubulosa kivonatot töltöttünk a táptalajba, az ECH és az ACT egyidejű Papp-értékei (1,27 ± 0,13 és 0,34 ± 0,03 × 10-6 cm/s) háromszor magasabbak voltak, mint azok. (0,38 ± 0,09 és 0,10 ± 0,03 × 10-6 cm/s) az ép ECH és ACT (2. táblázat). A kivonat az ép vegyületekkel ellentétben jelentősen javította az ECH és az ACT abszorpciós transzportját.
2. ábra Az echinakozid és az akteozid abszorpciós transzportja a Caco-2 sejt egyrétegű rétegein keresztül egy transzwell rendszerben. Az apikális és a bazolaterális transzportot monitoroztuk. A zárt szimbólumok az echinacoside (kör) és az akteozid (négyzet) a következőkCistanchetubulosakivonat kis és magas koncentrációban adagolva, 4,5 (a) és 13,5 mg/ml (b). A nyitott szimbólumok az ép echinakozid (kör) és az ép akteozid (négyzet), amelyek megfelelnek az echinakozid és az akteozid tartalmánakCistanchetubulosakivonatadagolt, ill. Az ép akteozidot (nyitott háromszög) szintén az ép echinakoziddal (nyitott kör) megfelelő dózisban töltöttük a táptalajba. Az eredmények szórással vannak megadva (n=3).
A phloridzin, a phloretin és a verapamil gátló hatása
To characterize the intestinal absorption of ECH and ACT, Caco-2 cell monolayers were incubated with representative inhibitors. Apical glucose transporter 1-sensitive phloridzin dramatically reduced the Papp of intact ECH and ACT to 20% of non-treatment at the high dose (Table 2). Basolateral glucose transporter (GLUT) 2-sensitive phloretin did not decrease the transport of intact ECH and ACT (Figure 3). In this study, higher concentrations (>0,3 mM) phloretint nem lehetett használni, mert észrevehető sejttoxicitást okoz. Ezenkívül a P-gp-t fontos szereplőként azonosították, amely felelős a növényi gyógyszerek és a klinikailag fontos P-gp szubsztrátok közötti kölcsönhatásért. A verapamil nem fokozta az intakt vegyületek abszorpciós transzportját (3. ábra).
Az ECH és az ACT abszorpciós transzportját a kivonatban (alacsony dózisban) a phloridzin jelentősen gátolta (2. táblázat és 4. ábra). A nagy dózisú kivonat elnyomta a phloridzin-érzékeny gátlást, bár az ép ECH és ACT transzportja érzékenyebb volt a phloridzinre (2. táblázat).
3. ábra A floretin és a verapamil hatása az érintetlen echinakozid és akteozid abszorpciós transzportjára. Az apikálistól a bazolaterálisig terjedő transzportot egy 13,5 mg/ml-es kivonat echinakozid tartalmának megfelelő ép echinakozid felvitele után követtük nyomon az apikális oldalon (n=3). Az akteozid (zárt négyzet) dózisa megegyezett az intakt echinakoziddal (zárt kör) inhibitorok hiányában (n=3). A nyitott és zárt gyémántok transzportot mutatnak 0,2 mM verapamil és 0,3 mM phloretin jelenlétében. A gátlási kísérleteket két párhuzamosban végeztük.
Az in situ bélperfúziós vizsgálat
Egy in situ vizsgálatban megvizsgáltuk, hogy a C. tubulosa kivonatban az ECH-t és az ACT-t a vékonybél apikális oldalán található SGLT1 szállítja-e. Amikor az étrendi kivonatot alacsony dózisban (4,5 mg/ml) perfundáltuk, az ECH és az ACT gyorsan megjelent a portális vérben (5. ábra). Az AUC értéke 2702,8 ± 384,1 μm·min az ECH és 698,3 ± 197,2 μm·perc az ACT esetében. Miután az AUC-t a C. tubulosa kivonat tartalmával normalizáltuk, az abszorbeált mennyiség nem különbözött szignifikánsan az ECH és az ACT között. Az SGLT1-érzékeny phloridzin a phloretinnel ellentétben szignifikánsan elnyomta az egyidejűleg alkalmazott ECH (AUC, 649,4 ± 248,2 μm·perc) és ACT (nem detektált) abszorpciós transzportját.
Vita
Egyes növényi összetevők a májban, a belekben, az agyban és a vesében erősen expresszálódó P-gp szubsztrátjai. A P-gp meghatározó tényező a gyógynövénykészítmények in vivo biológiai hozzáférhetőségében, eloszlásában és eloszlásában, beleértve az orbáncfüvet, kurkumint, echinaceát, ginzenget, ginkgot és gyömbért.[22,23] A genistein biológiai hozzáférhetősége{{5} }a glikozidot, egy flavonoid származékot a bélrendszer MRP2 transzportere is korlátozta.[24] Ezért ezt a tanulmányt az ECH és az ACT abszorpciós tulajdonságainak vizsgálatára tervezték, amelyek egyidejűleg az étrendi és gyógyászati C. tubulosa kivonatban vannak jelen.
A polarizált Caco{{0}} sejt egyrétegű sejtjei, valamint a bél[25] a főbb bélrendszeri gyógyszerkiáramlás transzportereket, például a P-gp-t, az MRP-ket és a mellrák rezisztencia fehérjét expresszálják.[26] A kvercetin[27] és a miricetin[28] étrendi flavonoidjairól kimutatták, hogy gátolják a P-gp által közvetített kiáramlást mind a sejtvonalakban, mind az állatmodellekben. A verapamil, egy P-gp inhibitor, nem változtatta meg az ACT és az ECH permeabilitását a Caco-2 sejt egyrétegű rétegeiben (3. ábra), ami arra utal, hogy az érintetlen ECH-t és ACT-t nem korlátozza a P-gp efflflux pumpa. Korábbi vizsgálataink azt mutatták, hogy az MRP2 fehérjék nem expresszálódnak Caco{13}} sejt monorétegekben.[29] A P-gp és MRP{16}}közvetített efflflux kizárható az ECH és ACT transzportban. A kvercetin egyes alacsony lipofilitású glikozidjai hatékonyabban szívódnak fel, mint maga a kvercetin.[30] Fontos megjegyezni azt is, hogy a cukorrésszel rendelkező ACT gyorsan eloszlik az agyszövetekben. Figyelmünk középpontjában két glükóz transzporter együttes hatása áll az enterocitákban: az SGLT a kefe-border membránban és a elősegített diffúziós glükóz transzport (GLUT) a bazolaterális membránban. A Caco-2 sejttenyészet modellként használható a floretin-érzékeny GLUT2, valamint a phloridzin-érzékeny SGLT1 és 2 transzporterek tanulmányozására.[31–34] A glükóz a Caco{{27 apikálisától a bazolaterális oldaláig transzportálódik. }} egyrétegű rétegeket nagy sebességgel, 36,8 ± 1,1 × 10-6 cm/s Papp-val.[35] Magasabb Papp-értékkel rendelkezik, mint a transzcelluláris transzport marker, a propranolol (23,4 ± 2,8 × 10-6 cm/s). Amint a 2. táblázat mutatja, az érintetlen ECH és ACT Papp sokkal alacsonyabb volt, mint a glükóz és a passzív propranolol esetében. Kiszámítottuk a megoszlási együttható (oktanol-víz) logaritmusát, amely log P -2,32 és 0,077 az ECH és az ACT esetében. Úgy gondolják, hogy a poláris vagy hidrofil vegyületek paracelluláris úton (szoros csomópontokon keresztül) szállítódnak. Úgy tűnik, hogy a két fenil-etanoid-glikozid, mint a mannit, paracelluláris úton szállítódik. A phloridzin azonban drámaian csökkentette az ép ECH és ACT abszorpciós permeabilitását (2. táblázat), ami arra utal, hogy az apikális SGLT1 jelentős szerepet játszik az ép ECH és ACT bélből történő felszívódásában. Egyenértékű dózis mellett a nagyobb hidrofób ACT permeabilitás közel volt az ECH permeabilitáshoz (2. ábra és 2. táblázat). Yoshikawa et al. [36] kimutatták, hogy a facilitatív transzporterek (GLUT 1 és 2), valamint a phloridzin-érzékeny SGLT1 intenzíven expresszálódnak a vékonybélben. Mivel az elnyelt vegyületek mennyisége a felvétel és az elimináció közötti tömegegyensúlyon alapul, értékeltük a GLUT2 részvételét. A glükóz az SGLT1 által nagy affinitással és kis kapacitással átjut az enterociták apikális membránjain, és a GLUT2-n keresztül kis affinitással és nagy kapacitással lép ki a bazolaterális membránon keresztül. A Phloretin (a GLUT2 specifikus inhibitora) nem szüntette meg az ép ECH és ACT transzportját (3. ábra). Funes et al. [37] kimutatta, hogy az ACT erős kölcsönhatásba lép a foszfolipid membránok foszfátcsoportjaival. Mivel az ACT szerkezetében bőségesen fordulnak elő hidroxilcsoportok, az ezen csoportok és a glicerin poláris fejei vagy a foszfolipidek foszfátcsoportjai közötti hidrogénkötések a legvalószínűbb kölcsönhatások. Amikor az érintetlen ECH-t és az azzal egyenértékű ACT-t Caco-2 egyrétegű rétegekkel 11 órán át inkubáltuk, az ACT sejtszintű felhalmozódása (0,24 ± 0,04 nmol/cm2) háromszor nagyobb volt, mint az ECH-é (0,07 ± 0,01 nmol/cm2). Úgy gondoltuk, hogy az SGLT1- érzékeny ECH és ACT lassan átkerült az enterocitákból a véráramba, ami valószínűleg a megfigyelt alacsony Papp-szinthez vezethet. Az erősen hidrofil ECH-val összehasonlítva az ACT alacsony permeabilitása a sejtmembránokba való interkaláció következménye lehet.
A polifenolos vegyületeket gyógynövénykeverékekben fogyasztják klinikai alkalmazásuk során, és a kereskedelemben étrend-kiegészítőként kaphatók. Egy in vitro vizsgálat kimutatta, hogy a fenolos epikatekin felszívódását nem befolyásolta az italok élelmiszer-alapanyagainak összetétele.[38] Ezzel szemben a Hypericum perforatum L. termékmátrixai befolyásolják a kvercetin-glükozidok (rutin és izokvercitrin) és a hiperozidok Caco-2 sejtek közötti transzportját a mátrix fitokémiai összetételében és szállítási jellemzőiben, azaz a paracelluláris transzferben és a hordozó által közvetített vagy aktívan fennálló különbségek miatt. közlekedés.[39] Ebben a vizsgálatban a C. tubulosa háromszor nagyobb transzepiteliális transzportot biztosított, mint az ép ECH és ACT (2. ábra és 2. táblázat). Feltételezzük, hogy a C. tubulosa kivonat komponensei aktiválják a phloridzin-érzékeny transzportert és/vagy felgyorsítják az intracelluláris ECH és ACT eliminációját. Úgy tűnt, hogy a C. tubulosa kivonat nagy dózisban nagymértékben elfedi a phloridzin-érzékeny transzport erejét (2. táblázat). Az étrendből származó szénhidrátok[40] és fehérjék[41] kölcsönhatásba lépnek néhány polifenollal a gyomor-bél traktusban. Morikawa et al. [10] kimutatta, hogy a jelenleg használt C. tubulosa kivonatból öt iridoid, kankanosid AD és kankanol, egy monoterpén-glikozid, kankanosid E, két fenil-etanoid oligoglikozid, F és G, valamint egy acilezett oligocukor, a kankanóz izolálható. Más összetevők, köztük a C. tubulosa kivonat fehérjéi továbbra is tisztázatlanok. A fenti spekulációval együtt azt terveztük, hogy megvizsgáljuk, hogy más komponensek kölcsönhatásba lépnek-e az SGLT1-gyel, és gátolják-e az ECH és az ACT abszorpcióját.
In-vivo experiments cannot easily distinguish between the extent of absorption and avoidance of first-pass disposition through the liver. The in-situ intestinal perfusion model has an advantage over in-vivo and in-vitro models due to the easy control of experiment parameters exclusion of the impact of other organs and maintenance of an intact intestinal blood supply.[22] The involvement of the phloridzin-sensitive glucose transporter was evaluated in an in-situ intestinal perfusion system. As shown in Figure 5, absorbed amounts of ECH and ACT concomitants in C. tubulosa extract (low dose) were greatly abolished by phloridzin, which agrees with our in-vitro data (Figure 4). Using peptides and 20 drugs passively absorbed, a good correlation is obtained between in-vivo drug absorption and the drug permeability of Caco-2 monolayers.[42] Drugs with a Papp of >1 × 10-6 cm/s teljesen felszívódik az emberben, míg a rosszul felszívódó gyógyszerek és peptidek (<1% of="" dose)="" have="" papp="" values="" of=""><1 ×="" 10−7="" cm/s.="" surprisingly,="" the="" papp="" of="" the="" ech="" concomitant="" (high="" dose)="" was="">1 × 10-6 cm/s (2. táblázat), ami magas orális biohasznosulásra utal állatokban és emberekben. Crespy et al. [43] kimutatta, hogy egy in situ bélperfúziós vizsgálatban az efflflux nem különbözött szignifikánsan a phloridzin és a phloretin között. Azt is kimutatták[44], hogy az SGLT1-re nagy érzékenységű phloridzin orális biohasznosulása csak 10 százalék volt patkányokban. A jövőbeni vizsgálatoknak értékelniük kell az ECH biohasznosulását és a hepatikus first-pass hatást egyidejűleg az étrendi kivonat nagy dózisú orális adagolása után. Az in situ eredmények arra utalnak, hogy a C. tubulosa kivonat bevitele javíthatja az intakt ECH és ACT alacsony orális felszívódását.
4. ábra A phloridzin gátló hatása az echinakozid és az akteozid abszorpciós transzportjáraCistanchetubulosakivonat. Az apikális és a bazolaterális transzportot monitoroztuk. A 4,5 mg/ml-es phloridzin nélküli kivonatban a zárt körök és négyzetek az echinakozidot (a) és az akteozidot (b) jelzik. A zárt gyémántok a 4,5 mg/ml kivonattal végzett kezelést mutatják, amely 1 mM phloridzint tartalmaz. Az eredmények szórással vannak megadva (n=3).
5. ábra Az echinakozid és az akteozid koncentrációjának időbeli lefutása a portális vérben in situ recirkulációs patkány bélperfúzió során. A kör és a négyzet szimbólumok echinakozid, illetve akteozid.Cistanchetubulosakivonat4,5 mg/ml koncentrációban perfundáltuk 1 mM phloridzin hiányában (zárt szimbólumok) vagy jelenléte (nyitott szimbólumok) 37 °C hőmérsékleten. Az eredmények szórással vannak megadva (n=3–4). *P < 0,05="" a="" diétás="" kivonattal="" szemben="" phloridzin="">
Következtetés
Az ECH és az ACT bélrendszeri felszívódását fokozó étrendi és gyógyászati C. tubulosa kivonat az emberi egészség jobb kezelését szolgálhatja, bár a phloridzin-érzékeny transzport szerepét csökkenteni kell.
Nyilatkozatok Összeférhetetlenség
A Szerző(k) kijelenti(k), hogy nincs nyilvánosságra hozandó összeférhetetlenségük.
Finanszírozás
Ezt a munkát részben a Kinki Egyetem High-Tech Kutatóközpontja támogatta.
Köszönetnyilvánítás
A szerzők köszönetet szeretnének mondani Osamu Muraokának (Kinki Egyetem, Osaka, Japán) és Toshio Morikawának (Kinki Egyetem, Osaka, Japán)Cistanchetubulosakivonatés tiszta összetevők. Nagyon hálásak vagyunk Masahiro Iwakinak (Kinki Egyetem) tanulmányi támogatásáért.
Hivatkozások
1. Tanaka J et al. HatásaCistanchetubulosa kivonatkülönböző agyi betegségekben. Ételstílus 21 2008; 12: 24–26.
2. Tanaka J et al. Öregedésgátló funkcióiCistanchetubulosa kivonat. Ételstílus 21 2008; 12: 27–29.
3. Tanaka J et al. A szépség és a hajnövekedés funkcióiCistanchetubulosakivonat. Ételstílus 21 2008; 12: 29–32.
4. Tanaka J et al. Zsír metabolizáló hatásaCistanchetubulosakivonat. Ételstílus 21 2008; 12: 30–33.
5. Yoshizawa F et al. Az alkotórészeiCistanchetubulosaSchrenk (Horog) f.II. egy új feniletanoid glikozid és egy új neolignán glikozid izolálása és szerkezete. Chem Pharm Bull 1990; 38: 1927–1930.
6. Yoshikawa M et al. Érrelaxáns hatással rendelkező fenil-etanoid aminoglikozidok és acilezett oligocukrokCistanchetubulosa. Bioorg Med Chem 2006; 14: 7468–7475.
7. Tu PF et al. A Herba cistanche fenil-etanoid glikozidjainak elemzése RP-HPLC-vel. Yao Xue Xue Bao 1997; 32: 294–300.
8. Lei L et al. A Herba fenil-etanol-glikozidjainak metabolikus szabályozásaciszternáka kutya gyomor-bélrendszerében. Yao Xue Xue Bao 2001; 36: 432–435.
9. Geng X et al. Az echinakozid neuroprotektív hatásai a Parkinson-kór egér MPTP-modelljében. Eur J Pharmacol 2007; 564: 66–74.
10. Morikawa T et al. Acilezett feniletanoid aminoglikozidok májvédő hatással, sivatagi növénybőlCistanchetubulosa. Bioorg Med Chem 2010; 18: 1882–1890.
11. Paola RD et al. A syringa Vulgaris növényi sejttenyészetekkel biotechnológiailag tisztított verbaszkozid hatása a parodontitis rágcsálómodelljében. J Pharm Pharmacol 2011; 63, 707–717.
12. Wu YT et al. Az akteozid meghatározása inCistanchedeserticola és Boschniakia rossica, valamint farmakokinetikája szabadon mozgó patkányokban LC-MS/MS alkalmazásával. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2006; 844: 89–95.
13. Matthias A et al. Echinaceából származó alkilamidok és kávésavkonjugátumok permeabilitási vizsgálata caco-2 sejt egyrétegű modell segítségével. J Clin Pharm Therapeut 2004; 29: 7–13.
14. Jia C et al. Az echinakozid meghatározása patkányszérumban fordított fázisú, nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával ultraibolya detektálással és alkalmazása a farmakokinetikára és a biohasznosulásra. J Chromatogr 2006; 844: 308–313.
15. Cardinali A et al. Verbaszkozidok olíva malomvízből: biológiai hozzáférhetőségük és bélrendszeri felszívódásuk értékelése in vitro emésztési/caco{1}} modellrendszerrel. J Food Sci 2011; 176: H48–H54.
16. Jia C et al. Az echinakozid, egy jó antioxidáns metabolizmusa patkányokban: epe metabolitjainak izolálása és azonosítása. Drug Metab Dispos 2009; 37: 431–438.
17. Najar IA et al. A P-glikoprotein ATPáz aktivitásának modulálása egyes fitokomponensek által. Phytother Res 2009; 24: 454–458.
18. Walgren RA et al. Az étrendi flavonoid kvercetin 4'-béta-glükozid kiáramlása a humán bél caco-2 sejt monorétegein az apikális multidrog rezisztenciával összefüggő fehérje-2 révén. J Pharmacol Exp Ther 2000a; 294:830–836.
19. Walgren RA et al. Az étrendi flavonoid kvercetin 4'-béta-glükozidáz sejtfelvétele az SGLT1 nátrium-függő glükóz transzporter által. J Pharmacol Exp Ther 2000b; 294: 837–843.
20. Mihara K et al. Az eperizon bélrendszeri first-pass metabolizmusa patkányban. Pharm Res 2001; 18: 1131–1137.
21. Isacchi B et al. A verbaszkozid antihiperalgéziás hatása a neuropátiás fájdalom két modelljében. J Pharm Pharmacol 2011; 63: 594–601.
22. Cook TJ et al. A klórpirifosz bélpermeabilitása az egyszeri áteresztő bélperfúziós módszerrel patkányban. Toxikológia 2003; 184: 125–133.23. Kumar YS et al. P-glikoprotein és citokróm P-450- által közvetített növényi gyógyszerkölcsönhatás. Drug Metabol Drug Interact 2010; 25: 3–16.
24. Walle UK et al. A genistein- 7-glükozid transzportja az emberi bél CACO-2 sejtjeivel: az MRP2 potenciális szerepe. Res Commun Mol Pathol Pharmacol 1999; 103: 45–56.
25. Ito K et al. A gyógyszertranszporterek apikális/bazolaterális felszíni expressziója és szerepe a vektorális gyógyszertranszportban. Pharm Res 2005; 22: 1559–1577.
26. Laitinen L et al. Caco-2 sejtkultúrák a bélrendszeri felszívódás értékelésében: egyes együtt adott gyógyszerek és természetes vegyületek hatásai a biológiai mátrixokban. (University of Helsinki, Finnország, 2006) Akadémiai Értekezés, 1–66.
27. Scambia G et al. A kvercetin fokozza az adriamicin hatását egy multirezisztens MCF-7 humán emlőrák sejtvonalban: a P-glikoprotein mint lehetséges célpont. Cancer Chemother Pharmacol 1994; 34: 459–464.
28. Choi DH et al. A miricetin, egy antioxidáns hatása a lozartán és aktív metabolitja, az EXP-3174 farmakokinetikájára patkányokban: a citokróm P450 3A4, a citokróm P450 2C9 és a P- lehetséges szerepe glikoprotein gátlás a miricetin által. J Pharm Pharmacol 2010; 62: 908–914.
29. Tanino T et al. A paklitaxel-2′-etil-karbonát prodrug képes megkerülni a P-glikoprotein által közvetített sejtkiáramlást, hogy növelje a gyógyszer citotoxicitását. Pharm Res 2007; 24: 555–565.
30. Hollman PC et al. Az étrendi kvercetin-glikozidok és kvercetin felszívódása egészséges ileostomiás önkéntesekben. Am J. Clin Nutr 1995; 62: 1276–1282.
31. Kellett GL et al. A bélrendszeri glükózfelszívódás diffúz komponensét a GLUT2 glükóz által kiváltott toborzása közvetíti az ecsettábla membránjába. Biochem J 2000; 350: 155–162.
32. Matter K et al. Az endogén plazmamembrán fehérjék válogatása két helyről történik tenyésztett humán bélhámsejtekben (Caco-2). Cell 1990; 60: 429–437.
33. Mahraoui L et al. SGLT1, GLUT1, GLUT2, GLUT3 és GLUT5 hexóz transzporter mRNS-ek jelenléte és eltérő expressziója Caco-2 sejtklónokban a sejtnövekedéssel és a glükózfogyasztással összefüggésben. Biochem J. 1994; 298: 629–633.
34. Mesonero J et al. A GLUT 5 fruktóz transzporter cukorfüggő expressziója Cac-2 sejtekben. Biochem J. 1995; 312, 757–762.
35. Walgren RA et al. A kvercetin és glükozidjainak transzportja az emberi bélhám Caco-2 sejtjein keresztül. Biochem Pharmacol 1998; 55: 1721–1727.
36. Yoshikawa T et al. A hexóz transzporterek (SGLT1, GLUT1, GLUT2 és GLUT5) összehasonlító expressziója az egér gyomor-bél traktusában. Histochem Cell Biol 2011; 135: 183–194.
37. Funes L et al. A verbaszkozid, a citrom-verbénából származó fenilpropanoid-glikozid hatása a foszfolipidek modellmembránjain. Chem Phys Lipids 2010; 163: 190–199.
38. Neilson AP et al. A csokoládémátrix összetételének hatása a kakaó-flavan{1}}ol biológiai hozzáférhetőségére in vitro és emberi biológiai hozzáférhetőségre. J Agric Food Chem 2009; 57: 9418–9426.
39. Gao S et al. Az orbáncfű-termékekben lévő fenolok igen változó tartalma befolyásolja azok transzportját az emberi bélrendszerben a Caco{1}} sejtmodellben: a termékek szabványosításának gyógyszerészeti és biofarmakonikus indoklása. J Agric Food Chem 2010; 58: 6650–6659.
40. Schramm DD et al. Az élelmiszerek hatása a kakaóflavanolok felszívódására és farmakokinetikájára. Life Sci 2003; 73: 857–869.
41. Laurent C et al. Az etanol és a polifenolmentes bormátrix serkenti az emberi bél Caco{1}} sejtjeinek differenciálódását. Procianidinben gazdag szőlőmag-kivonattal való társulásuk hatása. J Agric Food Chem 2005; 53: 5541–5548.
42. Artursson P et al. Összefüggés az emberi orális gyógyszerfelszívódás és a humán belső hámsejtek (Caco-2) látszólagos gyógyszer-permeabilitási együtthatói között. Biochem Biophys Res Commun 1991; 175: 880–885.
43. Crespy V et al. A kvercetin, phloretin és glükozidjaik bélrendszeri felszívódásának összehasonlítása patkányokban. J Nutr 2001a; 131: 2109–2114.
44. Crespy V et al. A floretin és a phloridzin biohasznosulása patkányokban. J Nutr 2001b; 131: 3227–3230.