A veleszületett szívbetegség neuroprotekciójának jelenlegi állapota 1. rész

Absztrakt:

Az ektopiás DNS jelenléte a citoplazmában gyulladást és sejthalált indukál. Széles körben beszámoltak arról, hogy a nukleáris DNS citoplazmába való szivárgása főként a ciklikus GMP-AMP szintáz (cGAS) segítségével érzékelhető.

A DNS az a molekula, amely meghatározza az egyes személyek genetikai információit, és minden sejtünkben megtalálható. A legújabb kutatások azt mutatják, hogy a DNS bizonyos utakon keresztül beszivároghat a citoplazmába, és befolyásolhatja a memóriánkat.

Ez a jelenség gyakori az idősebb felnőtteknél és a kognitív zavarokkal küzdő embereknél. Amikor a DNS beszivárog a citoplazmába, megzavarja a sejt normál működését, és növeli a memóriavesztés és a kognitív károsodás kockázatát.

Ettől azonban nem kell depressziósnak és reményvesztettnek éreznünk magunkat. Számos módja van a memória és a kognitív képességek javításának, hogy segítsen fenntartani az egészséges agyat.

Először is egészséges életmódot kell fenntartania. Ez magában foglalja a kiegyensúlyozott étrendet, az elegendő alvást, a mérsékelt testmozgást és a stressz csökkentését. Ezek a gyakorlatok elősegítik az agy egészségét, ezáltal elkerülik a DNS-szivárgást és javítják a memóriát.

Másodszor, kognitív képzésre van szükség. Ez magában foglalhatja a matematikai játékokat, az olvasást, az új készségek elsajátítását stb. Ezek a tevékenységek segíthetik az agy stimulálását és elősegíthetik a neurogenezist a DNS-szivárgás elkerülése érdekében.

Végül maradjon pozitív hozzáállás. Az érzelmi instabilitás és a túlzott stressz olyan változásokat okozhat az agy kémiájában, amelyek elősegítik a DNS-szivárgást. Ezért meg kell tanulnunk pozitívan nézni az élet kihívásait, és meg kell őriznünk az optimista hozzáállást.

Összefoglalva, bár a citoplazmába történő DNS-szivárgás befolyásolhatja a memóriát, javíthatjuk az agy egészségét, elkerülhetjük a DNS-szivárgást, és végső soron javíthatjuk a memóriánkat, ha helyes életmódot folytatunk, kognitív tréningben veszünk részt, és fenntartjuk a pozitív gondolkodásmódot. Memória és kognitív képességek. Látható, hogy javítanunk kell a memórián, a Cistanche deserticola pedig jelentősen javíthatja a memóriát, mert a Cistanche deserticola egy hagyományos kínai gyógyászati ​​anyag, amelynek számos egyedi hatása van, amelyek közül az egyik a memória javítása. A Cistanche deserticola hatékonysága a benne található számos hatóanyagnak köszönhető, beleértve a csersavat, poliszacharidokat, flavonoid glikozidokat stb. Ezek az összetevők számos úton elősegíthetik az agy egészségét.

Kattintson a Tudjon meg 10 módszerre a memória javítására

Nemrég beszámoltunk arról, hogy a mitokondriumból származó citoplazmatikus kettős szálú DNS (dsDNS), amely elkerülte a lizoszómális degradációt, jelentős citotoxicitást indukál a tenyésztett sejtekben és in vivo. Feltételezik, hogy a citoplazmatikus mitokondriális DNS részt vesz különféle betegségekben és rendellenességekben, és ezt egyre több közlemény erősíti meg. Másrészt a citoplazmában lévő mitokondriális DNS értékelésének jelenlegi módszere nem biztos, hogy kvantitatív.

Itt részletesen bemutatunk egy módszert az ektopiás mitokondriális DNS-sejtek értékelésére. Ez a módszer hasznos az alapkutatásban, valamint az öregedés, a Parkinson-kór, az Alzheimer-kór, a szívelégtelenség, az autoimmun betegségek, a rák és más állapotok tanulmányozásában.

Kulcsszavak: méhen kívüli DNS; mitokondriális DNS; mitokondriális transzkripciós faktor A (TFAM); Parkinson-kór.

1. Bemutatkozás

A DNS fontos információkat tartalmaz a túléléshez és az öröklődéshez, és meg kell védeni a különféle stresszoroktól, beleértve az oxidánsokat és a mutagéneket. Az eukarióta sejtek mitokondriumokat tartalmaznak, amelyek aerob légzéssel energiát, valamint sok aktív oxigénfajtát termelnek.

Így az eukarióta sejtben a DNS a sejtmagban vagy a mitokondriumban található, a nukleáris membránba vagy a mitokondriális membránba csomagolva. A DNS azonban bizonyos körülmények között jelen lehet a citoplazmában, például vírusos vagy nem vírusos fertőzések során [1– 4].

Még néhány nem fertőző állapot (például öregedés vagy különféle, életkorral összefüggő rendellenességek vagy rák) esetén is előfordulhat, hogy a DNS a sejtmagból vagy a mitokondriumból a citoplazmába szivárog [5–7].

A citoplazmában lévő DNS gyulladásos és toxikus lehet a sejtekre. Széles körben beszámoltak arról, hogy a nukleáris DNS citoplazmába való szivárgása gyulladást, citotoxicitást és öregedéssel összefüggő szekréciós fenotípust (SASP) idéz elő, főként az interferon gének (STING) útvonal ciklikus GMP-AMP szintáz (cGAS) stimulátora révén. 5,6].

Nemrég beszámoltunk arról, hogy a lizoszómális lebomlás elől kiszabaduló mitokondriális eredetű citoszolikus kettős szálú DNS (dsDNS) citotoxicitást és neurodegenerációt indukál a Parkinson-kór sejtmodelljeiben [8]. Az ilyen méhen kívüli DNS jelenlétének növekedését gyakran reprezentatív mikroszkópos képek és közvetett bizonyítékok jelezték, nem maga a DNS-szivárgás növekedése.

Várhatóan ennek az ektópiás DNS-nek a kiértékelése egyre fontosabbá válik, nemcsak az alapkutatások, hanem az öregedés és más betegségek, például a Parkinson-kór, az Alzheimer-kór, az amiotrófiás laterális szklerózis, a szívelégtelenség, az autoimmun betegségek, a cukorbetegség, a cukorbetegség, nem alkoholos steatohepatitis (NASH) és rákos megbetegedések. A cGAS–STING útvonalról beszámoltak arról, hogy nemcsak az öregedésben, hanem e betegségek patogenezisében is kulcsfontosságú [8–17].

Valószínűleg a mitokondriumok körüli oxidatív körülmények és a mitokondriális DNS hatékony DNS-javító rendszerének hiánya miatt a mitokondriális DNS sokkal érzékenyebb a mutációra vagy károsodásra, mint a nukleáris DNS [18,19].

A nukleáris DNS-től eltérően a mitokondriális DNS több másolatban létezik egyetlen sejtben, és szükség szerint szintetizálódik. Ezért a mitokondriális DNS sokkal nagyobb eséllyel szivároghat be a citoplazmába öregedés során vagy rosszindulatú állapotok esetén, mint például az életkorral összefüggő rendellenességek, mitokondriális diszfunkciók. , vagy rákos megbetegedések.

Az ilyen citoplazma-mitokondriális DNS kimutatása és mérése fontos lehet a különféle betegségek és az öregedés patogenezisének megértésében, és biomarkerré és terápiás célponttá válhat.

Kidolgoztunk egy félkvantitatív módszert a citoplazmába szivárgó méhen kívüli mitokondriális DNS értékelésére, és itt részletesen ismertetjük a módszert. Ez a tanulmány lehetővé teszi a mitokondriális DNS-szivárgás objektív értékelését, és hasznos a különböző betegségek patológiáinak tanulmányozásában.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Sejtvonalak, siRNS-kezelés és kvantitatív PCR (qPCR) elemzés

A HeLa sejteket egy nőbeteg méhnyakrák sejtjeiből származtatták (ATCC,CCL-2). A HeLa sejteket 37 ◦C-on, 5% CO2 alatt tenyésztettük Dulbecco's Modified EagleMedium (DMEM) (Nacalai Tesque, Kyoto, Japán) tápközegben, amelyet 10% magzati szarvasmarha-szérummal (FBS) (Biowest, Nuaillé, Franciaország) és penicillin-sztreptomicin oldattal egészítettünk ki. 100 egység/ml penicillin G és 100 µg/ml sztreptomicin-szulfát, Wako, Osaka, Japán).

Egy nappal a transzfekció előtt HeLa sejteket szélesztettünk 600 sejt/µl sűrűségben. Az érdeklődésre számot tartó gének expresszióját a HeLa sejtekben Stealth RNAi siRNS (mitokondriális transzkripciós faktor A, TFAM: HSS144251, glukocerebrozidáz, GBA: HSS178140, Thermo FisherScientific, Waltham, MA, USA) segítségével elnémítottuk a Lipofectamine ReFiheraMAX (Transfertamine ReFiaher) szerint. a gyártó utasításai szerint (10 nM végső RNS-koncentráció).

Három nappal az siRNS leütése után a teljes sejt RNS-t izoláltuk TRIzolreagent segítségével a gyártó utasításai szerint (Thermo Fisher Scientific). A cDNS-templátokat a tisztított RNS-ből a ProtoScript II First StrandcDNS Synthesis Kit (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) segítségével, oligo (dT)20 primerekkel szintetizáltuk. A qPCR-t TB Green Premix Ex Taq II (Takara Bio, Kusatsu) segítségével végeztük. , Japán), és egy Thermal Cycler Dice Real Time System Lite (Takara Bio) segítségével elemezték. A jelen vizsgálatban használt PCR primerek a következők voltak: GBA forward (TGCTGCTCTCAACATCCTTGCC), GBA reverse (TAGGTGCGGATGGAGAAGTCAC), TFAM előre (GGCAAGTTGTCCAAAGAAACC), TFAM reverse (GCATCTGGGTTCTGAGCTTTA), Glyceraldehyde (forward) Glyceraldehyde (GAATTCAG) CCPha{1} GAATCte CAGCA) és GAPDH fordított (TGTGGTCATGAGTCCTTCCA).

A statisztikai elemzéseket a GraphPad Prism szoftververzió 9.3.1 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) segítségével végeztük. Kétoldalas Student-féle t-próbát használtunk a két csoport számtani átlagának összehasonlítására. Az adatokat az átlagok és az átlagok ± standard hibájaként adjuk meg.

2.2. Az ektópiás mitokondriális DNS immunfluoreszcens kimutatása és képanalízis

Egy nappal a transzfekció előtt a HeLa sejteket 600 sejt/µL sűrűségben szélesztettük. Az érdeklődésre számot tartó gének expresszióját a HeLa sejtekben elnémítottuk Stealth RNAi siRNA (Thermo Fisher Scientific) alkalmazásával Lipofectamine RNAiMAX transzfekciós reagensben (ThermoFisher Scientific) a szabvány szerint. a gyártó utasításai szerint (a végső RNS-koncentráció 10 nM).

Három nappal az siRNS leütése után a sejteket immunfluoreszcens festésnek vetettük alá. Mitokondriális DNS kimutatására anti-dsDNS antitest (Abcam, Cambridge, Egyesült Királyság, 35I9 klón, Cat# ab27156, RRID: AB_470907 vagy EMD Millipore, Billerica, MA, USA, AC klón-30-10 , Cat# CBL186, RRID: AB_11213573) jobb jel-zaj arányt mutatott, mint a Hoechst 33258, DAPI vagy a Picogreen. Itt három elsődleges antitestet kombináltunk: anti-dsDNS antitest (35I9 DNS) (Abcam, Cat# ab27156, RRID: AB_470907), anti-hiszton-H2B antitest (Abcam, Cat# ab134211) és anti-heat- shock-protein-60 (Hsp60)antitest (Abcam, Cat# ab46798, RRID: AB_881444).

Más antitestek választhatók vagy hisztonnal fluoreszcensen megjelölhetők, vagy alternatívaként Hsp60 is használható, de minden egyes kombinációhoz optimalizálni kell a tripla festés feltételeit.

A sejteket kétszer mostuk foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS), és jéghideg metanollal fixáltuk 10 percig 4 ◦C-on. Alternatív megoldásként 4%-os paraformaldehidet (PFA) is használhatunk a rögzítéshez, de úgy tűnik, hogy a háttérjelek sokkal nagyobb a PFA-fixált mintákban. A fixálás után a sejteket háromszor mostuk foszfáttal pufferolt sóoldattal Tween 20-zal (PBST) 5 percig. A sejteket 0,2% (w/v) Triton X{11}} PBS-sel permeabilizáltuk 10 percig.

Miután háromszor 5 percig PBST-vel mostuk, a sejteket 2%-os (w/v) szarvasmarha szérumalbuminnal (BSA) PBST-ben inkubáltuk 30 percig. A sejteket egyetlen primer antitesttel, anti-hiszton-H2B antitesttel (1/400, Abcam, Cat# ab134211) inkubáltuk, 2% (w/v) BSA-val hígítva PBST O/N-ben 4 °C-on. Miután háromszor, 5 percig PBST-vel mostuk, a sejteket Alexa Fluor 488-AffiniPure Donkey anti-Chicken IgY(IgG) (H+L) (1/200, Wako, Cat# {{17) segítségével inkubáltuk. }}) 2%-os (w/v) BSA-val hígítva PBST-ben 1 órán át szobahőmérsékleten (RT).

Miután háromszor 5 percig mostuk PBST-vel, a sejteket elsődleges antitestekkel és anti-dsDNS antitesttel (35I9 DNS) (1/800, Abcam, Cat# ab27156, RRID: AB_470907) és antitesttel inkubáltuk. - Hsp60 antitestet (1/400, Abcam, Cat# ab46798, RRID: AB_881444) 2%-os (w/v) BSA-val hígítva PBST-ben alkalmaztuk 1 órán át szobahőmérsékleten vagy egy éjszakán át (O/N) 4◦C.

Miután háromszor, 5 percig PBST-vel mostuk, a sejteket erősen keresztben adszorbeált Alexa Fluor 680-konjugált szamár anti-nyúl IgG(H+L)-vel (1/200, Thermo Fisher Scientific, Cat# A10043) inkubáltuk. , RRID: AB_2534018) ​​és Donkeyanti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor® 594) (1/200, Abcam Cat# ab150108, RRID: AB_2732073) 2%-os (w/v) hígításban BSA PBST-ben 1 órán át szobahőmérsékleten.

A sejteket háromszor mostuk PBST-vel 5 percig, és a mintát A1R+ konfokális mikroszkóppal (Nikon, Tokió, Japán) elemeztük.

For more information:1950477648nn@gmail.com