A Naringenin hatásai a MiRNS-mRNS profilokra HepaRG sejtekben

További részletekért forduljon:tina.xiang@wecistanche.com

Absztrakt: Naringenin, természetesflavonoidA citrusfélékben széles körben megtalálható, természetes étrend-kiegészítőként antioxidáns, gyulladáscsökkentő és májvédő tulajdonságokkal rendelkezik. A naringenin szabályozó mechanizmusa azonban az emberi májban továbbra is tisztázatlan. Jelen tanulmányban messenger RNS szekvenálást (mRNS-seq), mikroRNS szekvenálást (miRNS-seq) és valós idejű qPCR-t használtunk a kontroll és a naringeninnel kezelt HepaRG sejtek közötti expressziós különbségek megkülönböztetésére. 1037 differenciálisan expresszált mRNS-t és 234 miRNS-t kaptunk. Az in silico célelőrejelzési és integrációs analízis szerint 20 potenciális miRNS-mRNS párt találtunk.májanyagcsere. Ez a tanulmány az első, amely perspektívát ad a miRNS-mRNS kölcsönhatásokról a naringenin szabályozásában az mRNS-seq és miRNS-seq integrált elemzésével HepaRG sejtekben, amely tovább jellemzi a naringenin élelmiszer-adalékanyagként való táplálkozási értékét.

Kulcsszavak: naringenin; mRNS-seq; miRNS-seq; HepaRG sejtek

kattintson a további termékinformációkért

1. Bemutatkozás

Naringenin, egy természetes flavonoid, bőségesen megtalálható a citrusfélékben és más ehető gyümölcsökben, például a grapefruitban, a narancsban, a bergamottban, a paradicsomban és a fügében [1]. Orális adagolás után a naringenin széles körben elterjedt a gyomor-bél traktusban és a májban [2,3], és molekuláris szerkezetének köszönhetően közvetlen antioxidáns tulajdonságot mutat szabadgyökfogó aktivitása révén, és indukálja az endogén antioxidáns rendszert a májban [4]. Az in vitro és in vivo vizsgálatokból származó növekvő bizonyítékok a naringenin különféle védőképességeit azonosították, mint plgyulladáscsökkentő[5], antioxidáns [6], antifibrózis [Z], és májvédő 4,8| tevékenységek. Ezek a képességek arra utalnak, hogy a diétás naringenin alkalmazható a metabolikus szindróma és a rosszindulatú betegségek megelőzésére, beleértve a fulmináns hepatitistmájbetegség, fibrózis stb. 19,10]. Azonban kevés részletes tanulmány létezik a naringeninnek a máj általános génjére gyakorolt ​​​​szabályozó hatásairól [4].

A mikroRNS-ek (miRNS-ek) a nem kódoló, egyszálú, endogén gének által kódolt, 18-26 nukleotid hosszúságú RNS-molekulák osztálya, amelyek biológiai szabályozó funkciók széles skáláját mutatják a filogenetika, a differenciálódás, a proliferáció és az apoptózis területén. [11]. A miRNS, amely szekvencia-specifikus felismeréssel köti meg a hírvivő RNS-eket (mRNS-eket), negatívan szabályozza a génexpressziót a transzkripció utáni szinten a cél-mRNS-ek lebomlásával [12]. Exogén stimuláció hatására a miRNS expresszió megváltozik, majd a cél-mRNS expressziója szabályozódik. Végül a kiterjedt élettani funkciók megváltoznak, hogy megbirkózzanak az exogén stimuláció okozta kihívásokkal [13]. Megbízhatóbb módszer a miRNS-mRNS célkapcsolatok előrejelzésére, ha az mRNS-seq analízist egyidejűleg integrálják a miRNS-seq analízissel egy adott feldolgozási kontextusban in silico [14].

Ezért célunk az volt, hogy tanulmányozzuk a naringenin globális génekre gyakorolt ​​hatását, és rávilágítsunk a miRNS-mRNS párok lehetséges szabályozási mechanizmusára a májban. Jelen tanulmányban az mRNS expressziós változásait és a miRNS expressziós profilokat vizsgáltuk HepaRGsejtekben mRNS-seq, miRNS-seq, bioinformatikai elemzések és valós idejű qPCR elvégzésével, hogy bizonyítékot nyújtsanak a naringenin természetes étrend-kiegészítőként való potenciáljára.

2. Eredmények

2.1. A transzkriptom szekvenálásának elemzése a Naringeninre adott válaszban

Az mRNS expressziós változásainak azonosításaHepaRG sejteka naringenin hatására nyolc komplementer DNS (cDNS) könyvtár a kontrollcsoportban (CK-1, CK-2, CK-3 és CK-4) és a kísérleti csoportban (T-1, T-2, T-3 és T-4) teljes RNS-ből állítottuk elő, és Illumina HiSeq2500 szekvenálásnak vetették alá (Genedenovo Biotechnology Co., Ltd, Guangzhou). , Kína). A kontrollcsoport és a kísérleti csoport szekvenálási és összeállítási eredményeinek áttekintését az 1. táblázat tartalmazza. A génexpressziós változásokat a kezelt és a kontrollcsoportok összehasonlításával elemeztük. Amint az la ábrán látható, a naringeninnek kitett csoport 1037 eltérően expresszált gént (DEG) expresszált a kontrollcsoporthoz képest. Az 1037°-os hőtérkép a kontrollcsoport és a naringenin csoport klaszteranalízisét mutatta (1b ábra; 381 felfelé és 656 lefelé szabályozott gén; S1 táblázat, Kiegészítő anyagok).

A Gene Ontology (GO) osztályozási rendszere szerint 1037 DEG-t három fő funkcionális kategóriába (biológiai folyamat, sejtkomponens és molekuláris funkció) és 61 alkategóriába soroltak (2. ábra). A biológiai folyamatok közül a sejtes folyamat (731) volt a leggyakrabban képviselt, ezt követi az egyszervezetes folyamat (672) és a biológiai szabályozás (595). A celluláris komponens kategóriában a klaszterek jelentős részét a sejthez (727), a sejtrészhez (721) és az organellumhoz (580) rendelték. A kötődésben (666) és a katalitikus aktivitásban (238) részt vevő gének a molekuláris funkció kategóriában jelentős szerepet kaptak.

A Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) besorolását 1037 DEG-re találták, amelyeket a legkisebb q-érték és a legnagyobb génszám szerint a legjobb húsz biokémiai útvonalba soroltak be az útvonal megjegyzésében (3. ábra). A génszám és a jegyzett gének aránya az első öt útvonalon a szisztémás lupus erythematosus (33,8,4 százalék), az alkoholizmus (38,9,67 százalék), a rákos megbetegedések transzkripciós hibája (22, 5,6 százalék), a PI3K-Akt jelátviteli útvonal (34, 8,65 százalék ), valamint komplement és koagulációs kaszkádok (12, 3,05 százalék o). Az öt útvonal között több mint 10 dúsított gén volt. Összességében a naringenin kezelés jelentős hatással volt a HepaRG sejtek globális génexpressziós profiljára. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az ezekben az útvonalakban részt vevő gének döntő szerepet játszhatnak a naringenin szabályozásában.

2.2. A miRNS transzkriptumszintjének elemzése a naringeninre adott válaszban

Ebben a tanulmányban arra törekedtünk, hogy megállapítsuk, vajonnaringeninAz expozíció megváltoztatja a miRNS-ek expressziós szintjét a HepaRG sejtekben. Az expozíció után kis RNS-eket gyűjtöttünk és mértük relatív mennyiségüket az Illumina HiSeq2500 (Genedenovo Biotechnology Co., Ltd, Guangzhou, Kína) segítségével. Amint az a 2. táblázatban látható, nyolc minta tiszta leolvasását állítottuk elő a szennyeződések eltávolítása után. A 2. táblázat áttekintést ad a kis RNS-szekvenálás leolvasásairól a nyers adatoktól a kiváló minőségűekig és minőségi szűréssel. A kis RNS-ek hossz-eloszlása ​​hasonló volt a könyvtárak között, mivel a 21-23 nt RNS-ek voltak a legnagyobb mennyiségben (4. ábra). ).

Az összes kis RNS-t a GeneBank adatbázisban (Release 209.0) és az Rfam adatbázisban (11.0) sorba rendezték, hogy azonosítsák és eltávolítsák a riboszómális RNS-t (rRNS), a kis feltételes RNS-t (scRNS), kis nukleoláris (snoRNS), kis nukleáris (snRNS) és transzfer RNS (tRNS). A referenciagenomnak megfelelően ezeket az exonokra, intronokra és ismétlődő szekvenciákra leképezett kis RNS-eket is eltávolítottuk. A szűrő kis RNS-eket a miRBase adatbázisban (Release 21) kerestük, hogy azonosítsuk a miRNS-eket. A 3373 miRNS hőtérképe a kontrollcsoport és a naringenin csoport klaszteranalízisét mutatja az 5a. ábrán. A naringenin expozícióban és a kontroll mintákban elemzett 3373 miRNS Illumina HiSeq2500 profilja azt mutatta, hogy összesen 234 eltérően expresszált miRNS (DEM, 174 felfelé és 60 lefelé szabályozott; S2 táblázat, Kiegészítő anyagok) volt kimutatható a HepaRG5b sejtekben (Figure) .

2.3. A naringeninre adott mRNS és miRNS expressziós profilok célelőrejelzése és integrációs elemzése

A poszt-transzkripciós szinten a miRNS-ek elnémítják és/vagy leszabályozzák a celluláris mRNS génexpressziót a cél-RNS hasításával. A 234 DEM célgénjének előrejelzéséhez számítógépes elemzéseket végeztünk az RNAhybrid (v2.1.2) plusz tetőablak (v6) segítségével. .{11}}1), Miranda (v3.3a) és TargetScan (Verzió:7.0). A 234 DEM és 1037 DEG szint egyidejű profilozása in silico képes azonosítani a miRNS-ek feltételezett cél-mRNS-eit. Kiválasztottuk a DEG-k és a DEM-ek célgének metszéspontját, majd bioinformatikai elemzést végeztünk ezeken a metszéspont-géneken. Összesen 5607 negatív miRNS-mRNS párt kaptunk naringenin kezeléshez, 216 DEM és 681 DEG bevonásával (S3 táblázat, kiegészítő anyagok). A GO osztályozási rendszernek megfelelően 681 DEG-t 58 alkategóriába soroltak (6. ábra). Az első három alkategória nem változott három fő funkcionális kategóriában a transzkriptom szekvenálási elemzéshez képest (2. és 6. ábra).

5607 negatív miRNS-mRNS pár 681°-os útvonal-dúsítási analízise azonosította a legjobb húsz útvonalat a legkisebb q-érték és a legnagyobb génszám szerint a naringenin expozíció utáni útvonal annotációjában (7. ábra): PI3K-Akt jelátviteli útvonallal (25,8.96). százalék) ez a nyolcadik útvonal és a második legelterjedtebb.

2.4. A naringenin szabályozás valós idejű qPCR validálása a máj metabolizmusában és a lehetséges szabályozó miRNS-mRNS párokban

Globális génfunkciós annotációk, irodalmi áttekintés és a naringeninre reagáló miRNS-ekkel való lehetséges kapcsolatuk szerint 19 DEG (ALOX15, CA9, TH, HKDC1, NDUFA4L2, RRM2, ACSL5, PLA2G4C, LIPT2, UGDH, FTCD, ABAT, AZSTIN2, , B4GALT6, GUSB, DCT, ALAS2 és MAT1A) manuálisan választották ki a máj metabolizmusában betöltött lehetséges szerepeik képviselőiként. Ezenkívül a PI3K-Akt jelátviteli útvonal jelentősen feldúsult (negyedik az RNS-seq elemzés KEGG-jében, 3. ábra; a nyolcadik a miRNS-RNS-seq analízis KEGG-jében, 7. ábra); ezért.11 DEG-et (PDGFRB. CSF1R. FGFR2, IL2RG, IL7R, ITGB4, GNG4, PCK1, CREB3L3, CREB3L1 és NFkB1) szűrtünk ki a PI3K-Akt jelátviteli útvonalak közül.

Itt leírtuk a 30°-os és 11 emberi miRNS-ek (hsa-miR-1306-5p, hsa-miR-627-3p, hsa-miR-194-3p, hsa-miR{{9) közötti interakciót. }}p, hsa-miR-6837-5p, hsa-miR-429, hsa-miR-100-3p, hsa-miR-194-5p, hsa-miR{{19} }a-3p, hsa-miR-7-5p és hsa-miR-200a-5p, beleértve 20 negatív miRNS-mRNS kölcsönhatást (9. ábra). A 9. ábrán látható módon egyetlen miRNS több cél-mRNS-t is szabályozhat, és fordítva (pl. az ABAT HS6ST3, B4GALT6 és DCT egyidejűleg szabályozható a hsa-miR-429 segítségével; a HS6ST3 egyidejűleg szabályozható a hsa-miR-rel -429, hsa-miR-100-3p,hsa-miR-519a-3p, hsa-miR-676-3p, hsa-miR-7-5 p és hsa-miR{50}}p; néhány DEG-nek nem volt páros DEM-je). A májmetabolizmushoz kapcsolódó 19 DEG expressziós profilját és a PI3K-Akt jelátviteli útvonalon belüli 11 DEG expressziós profilját tovább validáltuk valós idejű qPCR segítségével (9a, b ábra). 11 humán miRNS expressziós szintjét (két felfelé és kilenc lefelé szabályozott) tovább értékeltük a naringenin által kiváltott változásokra valós idejű qPCR segítségével, összhangban a szekvenálási eredményekkel (9c. ábra). Bár volt némi mennyiségi különbség a két analitikai platform között, az RNS-seq adatok és a valós idejű PCR közötti hasonlóságok arra utalnak, hogy az RNS-seq adatok reprodukálhatók és megbízhatóak.

3. Megbeszélés és következtetések

Az itt tárgyalt eredmények felfedik az első részletes információkat a párhuzamos mRNS és miRNS expressziós változásokról a HepaRG sejtekben válaszulnaringenin. Ezen adatok integrált elemzését végeztük el, beleértve a naringenin által indukált 234 DEM-et és 1037 DEG-et, amelyek globális betekintést nyújtanak a naringenin miRNS-mRNS kölcsönhatásaiba a szabályozó mechanizmusban. A génfunkciós annotációk és az irodalmi áttekintés alapján 19 anyagcserével kapcsolatos DEG-t szűrtünk ki. Különösen a PI3K-Akt jelátviteli útvonal jelentősen gazdagodott mind a transzkriptom szekvenálás elemzésében (a harmadik legbőségesebb és a negyedik helyen), mind a miRNS-mRNS expressziós profilok integrációs elemzésében (a második leggyakrabban előforduló és a nyolcadik helyen). a naringeninre adott válaszként. Ezenkívül a PI3K-Akt jelátviteli útvonal 11 DEG-jét tovább validáltuk valós idejű qPCR elemzéssel. Ebben a munkában miRNS-mRNS szabályozó hálózatot építettünk fel a DEMs és DEGs adatkészletek és a miRNS-célzó információk alapján. Egyes tanulmányok kimutatták, hogy a miRNS-mRNS szabályozó hálózat reagálmájkárosodásideértve a hepatocelluláris karcinómát és az oxidatív stresszt [15]. Bár számos miRNS-indukált RNS-aktivációs jelenséget azonosítottak [16], a legtöbb esetben a miRNS-ek és a cél-mRNS-eik közötti negatív korrelációt gyakran a miRNS-célzás támogatásának tekintik [17]. Végül 20 miRNS-mRNS negatív korrelációs párt azonosítottak a máj metabolizmusának és a PI3K-Akt jelátviteli útvonalnak a részvételével.

Ami a globális géneket illeti, sajátos kutatási kérdésünkkel útútelemzést használtunk, hogy kiemeljük a funkcionális klaszterekhez kapcsolódó 19 DEG-et: anyagcsere, beleértve a lipid metabolizmust (ALOX15, ACSL5, PLA2G4C és B4GALT6), energiaanyagcsere (CA9 és NDUFA4L2) , Kofaktorok és vitaminok metabolizmusa (TH, LIPT2 és FTCD), aminosav-anyagcsere (RRM2, AZIN2, DCT, ALAS2 és MAT1A), glikán bioszintézis és metabolizmus (HS6ST3 és GUSB), valamint szénhidrát-anyagcsere" (HKDC1, PCK1, UGDH és ABAT). Ez az anyagcserében feldúsult 19°C elsősorban az inzulinérzékenységben, a lipid felhalmozódásban, a glikogén raktározásában és az energiafelhasználásban játszik szerepet. Korábbi tanulmányok arról számoltak be, hogy az ALOX15 leszabályozása alkohol által kiváltott egerek májkárosodásában[18], A CA9 BALB/C egerekben [19], a THin nem alkoholos zsírmájbetegség (NAFLD)[20], a HKDC1[21] és az UGDH [22] fokozott szabályozása jelentősen enyhítheti az oxidatív stresszt, a lipid felhalmozódást és a májkárosodást. Az NDUFA4L2 leütése elnyomta a ROS-felhalmozódást hepatocelluláris karcinóma (HCC) sejtekben [23]. Az RRM2 elnémítása gátolta az NCI-H929 sejtproliferációt [24], az FTCD túlzott expressziója pedig gátolta a sejtproliferációt azáltal, hogy elősegítette a DNS károsodását és sejtapoptózist indukált HCC sejtekben [25]. Az ACSL5 ablációja javította az inzulinérzékenységet, növelte az energiafelhasználást, és késleltette a triglicerid felszívódását egerekben [26]. A DCT-kiegészítés javította az életkorral összefüggő májzsugorodást és -gyulladást [27]. A PLA2G4C knockdown sejtekben a zsírsav és a hepatitis C vírus stimulációja következtében kialakuló lipidcseppképződés károsodott [28]. A LIPT2 leszabályozása gátolta a zsírsavszintézist [29]. Az ABAT [30], AZIN2 [31], B4GALT6 [32], HS6ST3 [33] és GUSB [34] fokozott szabályozása elősegítheti a zsírsavak és a glikogén lebomlását. Az ALAS2 túlzott expressziója javíthatja a máj hematopoetikus kapacitását [35l, a hepatocitákban expresszált MAT1A pedig megőrizte e sejtek differenciált állapotát [36]. A fent leírt eredményekkel összhangban ezeknek a metabolikus géneknek a szabályozása eredményeinkben kedvező lehet a naringeninre adott válaszként történő metabolizmus javítására.

A PI3K-Akt jelátviteli útvonal támpontokat adhat az anyagcserében, a gyulladásban és az oxidatív stresszben szerepet játszó molekuláris mechanizmusokhoz [37], amelyek kulcsszerepet játszanak a naringeninre adott válaszban. A PI3K-Akt jelátviteli útvonalnak változatos downstream hatásai vannak a sejtmetabolizmusra a tápanyag-transzporterek és a metabolikus enzimek közvetlen szabályozása, vagy a transzkripciós faktorok szabályozása révén, amelyek szabályozzák a metabolikus útvonalak kulcsfontosságú összetevőinek expresszióját [38,39], beleértve a glükóz metabolizmust és bioszintézist. makromolekulák termelése és a redox egyensúly fenntartása. Beszámoltak arról, hogy a PDGFRB elnémítása gátolta a májcsillagsejtek aktivációját és proliferációját, és javította a májfibrózist [40]. A CSF1R és az FGFR2 kollaboratív gátlása várhatóan fokozza a daganatellenes hatásokat azáltal, hogy megcélozza az immunelkerülést és az angiogenezist a tumor mikrokörnyezetében [41]. Az ITGB4 leütése elnyomta a glikolízist a rákkal összefüggő fibroblasztokban [42]. A PCK1 genetikai leütése megakadályozta az oxidatív fluxus, az oxidatív stressz és a gyulladás zsírsavak által kiváltott növekedését [43], amely összefüggésben volt az inzulin által szabályozott jelátviteli útvonalakkal is [44]. Kimutatták, hogy a nukleáris CREB3L3 túlzott expressziója szisztémás lipolízist, máj ketogenezist és inzulinérzékenységet indukált megnövekedett energiafelhasználással [45]. A CREB3L1 gátlása állítólag blokkolta a rák invázióját és az áttéteket [46]. Az NFkB az immunfejlődés, az immunválaszok, a gyulladás és a rák kulcsfontosságú szabályozója [47]. Jól bebizonyosodott, hogy az NFkB elnyomása gyulladásgátló jeleket vált ki, és csökkenti a gyulladást [48]. A PI3K-Akt jelátviteli útvonalon eredményeink azt mutatták, hogy a naringenin jelentősen csökkentette a PDGFRB, PCK1, CREB3L1 és NFkB1 mRNS expresszióját a rokon miRNS-ekkel (has-miR-1306-5p és hsa-miR{{40}). }p) jelentősen leszabályozott. Emiatt adataink arra utalnak, hogy a naringenin a PI3K-Akt jelátviteli útvonal gátlásán keresztül üdvözítő szerepet játszhat a gyulladáscsökkentő, antioxidatív stresszben és a metabolizmus javításában.

Ez a tanulmány volt az első, amely integrálta az mRNS-seq és a miRNS-seq analízisét a májban a naringeninre adott válaszként, és perspektívát adott a naringenin szabályozásában a metabolizmusra. Ami az anyagcserét és a PI3K-Akt jelátviteli útvonalat illeti, a 11 DEM, 30 DEG és 20 miRNS-mRNS pár további kutatást igényel a naringenin aktivitása tekintetében. Ennek a kutatásnak vannak bizonyos korlátai; például a naringenin dózis- és időfüggő hatásai a miRNS-mRNS kölcsönhatásokban még mindig tisztázatlanok voltak. Bár az in silico elemzett miRNS-ek szabályozó képességet sugalltak, funkciójukat tovább kell igazolni egy élő rendszeren belüli meghatározott kontextusban. Összefoglalva, előzetes kutatást nyújtottunk az mRNS és miRNS expresszió elemzésére és az anyagcsere profilozására. A miRNS-mRNS párok szabályozó mechanizmusa további lehetséges bizonyíték lehet a naringenin táplálkozási értékének megjegyzésére.

4. Anyagok és módszerek

4.1. Vegyszerek és reagensek

A HepaRG sejtvonalat eredetileg a Biopredic International-től (Rennes, Franciaország) vásárolták. Az RPMI{0}} táptalajt és a penicillin-sztreptomicin-glutamin oldatot a Gibco-tól (Gaithersburg, MD, USA) szereztük be. A magzati szarvasmarha szérumot (FBS) a Corningtől (Auckland, Új-Zéland) vásároltuk. A naringenint és a dimetil-szulfoxidot (DMSO) a Sigma-Aldrich-től (St. Louis, MO, USA) szereztük be. A TRIzolTM reagenst a Thermo Fisher (Carlsbad, CA, USA) szállította. Az ultratiszta vizet Milli-O akadémiai víztisztító rendszerrel (Millipore, Bedford, MA, USA) tisztították. Az összes többi reagens az elérhető legmagasabb analitikai minőségű kereskedelmi forgalomba hozott termék volt.

4.2. HepaRG sejtkultúra

A HepaRG sejteket 5×10* sejt/cm-ben hatlyukú lemezekre oltottuk, és RPMI-1640 tápközegben növesztettük, 100 uM naringeninnel vagy anélkül tenyésztettük 48 órán keresztül, és kiegészítettük 10% FBS-sel és 1% antibiotikummal. (100 U/ml penicillin és 100 ug/ml sztrepto-micin) 37°C-on párásított 5%-os CO, inkubátorban. A CK-1, CK-2, CK-3 és CK-4 a kontroll-ellenőrző csoportra utal; A T-1, T-2, T-3 és T-4 a 100 μM naringeninnel kezelt csoportra vonatkozik. Az 1-es, 2-es, 3-as és 4-es számok négy független, ismételt kísérletből származó mintákat jelölnek.

4.3. Teljes RNS extrakció

A HepaRG sejteket kétszer mostuk jéghideg foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS), és TRIzolTM reagenssel gyűjtöttük össze a gyártó ajánlása szerint. Az egyes minták RNS minőségének és mennyiségének mérésére Thermo Scientific NanoDropTM2000 c spektrofotométereket (Wilmington, DE, USA) használtunk a gyártó protokollja szerint.

4.4.RNS-szekvenálás

Az mRNS-t Oligo(dT) gyöngyökkel dúsítottuk, majd a dúsított mRNS-t fragmentáltuk, és véletlenszerű primerekkel cDNS-vé reverz transzkripciót végeztünk OiaOuick PCR extrakciós kittel (Qiagen, Venlo, Hollandia). A 18-30 nt mérettartományban lévő RNS-molekulákat poliakrilamid gélelektroforézissel dúsítottuk. Hozzáadtuk a 3' és 5' adaptereket, majd a dúsított RNS-eket a QiaQuick PCR extrakciós kittel reverz transzkripcióval végeztük a gyártó utasításai szerint (Qiagen, Venlo, Hollandia). A ligációs termékeket agaróz gélelektroforézissel méret szerint szelektáltuk. Négy minta volt a naringenin csoportban és négy minta a kontrollcsoportban. Mindegyik minta két cDNS könyvtárat generált: az egyiket az mRNS-seq, a másikat a miRNS-seg számára. A PCR-rel amplifikált termékeket feldúsítottuk, hogy rendre 16 cDNS-könyvtárat hozzunk létre, és Ⅲlumina HiSeq2500 alkalmazásával szekvenáltuk a Genedenovo Biotechnology Co. (Guangzhou, Kína). Az RNS és a kis RNS szekvenálási adatait az NCBI Sequence Read Archive-ban helyeztük el (hozzáférési számok SRR13675952-től SRR13675963-ig).

4.5. Valós idejű qPCR

Az mRNS cDNS-vé történő transzkripcióját a GoScriptTM Reverse Transcription System (Promega, Madison, WI, USA) segítségével végeztük 3 ug teljes RNS-ből, a gyártó utasításai szerint. A miRNS-analízishez a cDNS-szintézist a miRNS First Strand cDNS-szintézissel (Tailing Reaction, Sangon Biotech, Shanghai, Kína) hajtottuk végre 2 ug teljes RNS-ből.

GoTaq® qPCR Master Mix-el(Promega, Madison, WI, USA) egy LightCycler 480-on (Roche, Mannheim, Németország), a gyártó ajánlása szerint. A termikus ciklusos eljárás kezdeti denaturálással kezdődött 95 °C-on 10 percig. Ezt követte 45 ciklus denaturálás 10 másodpercig 95 fokon, primer kötés 20 másodpercig 60 fokon, és megnyújtás 20 sat 72 fokon. Az eljárás egy végső amplifikációval zárult 95 °C-on 5 másodpercig, 65 °C-on 1 percig, egy disszociációs görbe hozzáadásával és egy hűtési lépéssel. A primereket a Sangon Biotech-től (Sanghaj, Kína) vásároltuk. Az aláírás érvényesítéséhez használt primer pár szekvenciákat a 3. és 4. táblázat írja le. A Ct-értékeket -aktinra vagy U6-ra vonatkoztatva számítottuk ki.

4.6.Bioinformatikai elemzés és statisztika

A DEG-eket és a DEM-eket R-alapú szoftvercsomag segítségével azonosították. A DEG-ek és DEM-ek kiválasztásának küszöbértéke q-érték (korrigált p-érték) volt, kisebb vagy egyenlő, mint 0.05 és a változás (FC) nagyobb vagy egyenlő, mint 2 vagy kisebb 0,5 vagy egyenlő. A DEG-ek és DEM-ek elemzéséhez KEGG és GO osztályozást használtak, beleértve a molekuláris funkciókat, a biológiai folyamatokat és a sejtkomponenseket.

A biológiai vizsgálat eredményeit négy független GraphPad Prism 8 kísérleten alapuló átlag ± SD formájában mutatjuk be.

Kiegészítő anyagok: Az alábbiak elérhetők online a https://www.mdpi.com/1422-0 067/22/5/2292/s1 címen: S1 táblázat: 1037 differenciálisan expresszált mRNS azonosítása a naringenin hatására; S2 táblázat: A naringeninre adott válaszként 234 differenciálisan expresszált miRNS azonosítása; S3 táblázat: 5607 negatív miRNS-mRNS pár azonosítása naringeninre adott válaszként, összesen 216 DEM és 681 DEG bevonásával

Hivatkozások

1. Szalehi, B.; Fokou, PVT A Naringenin terápiás potenciálja: A klinikai vizsgálatok áttekintése. Pharmaceuticals 2019, 12, 11. [CrossRef] [PubMed]

2. Bai, Y.; Peng, W.; Yang, C.; Zou, W.; Liu, M.; Wu, H.; Fan, L.; Ajak.; Zeng, X.; Su, W. A Naringin és az Active Metabolite Naringenin farmakokinetikája és metabolizmusa patkányokban, kutyákban, emberekben és a fajok közötti különbségek. Elülső. Pharmacol. 2020, 11, 364. [CrossRef]

3. Joshi, R.; Kulkarni, YA; Wairkar, S. A Naringenin farmakokinetikai, farmakodinamikai és formulázási vonatkozásai: Frissítés. Life Sci. 2018, 215, 43–56. [CrossRef]

4. Hernández-Aquino, E.; Muriel, P. A naringenin jótékony hatásai májbetegségekben: Molekuláris mechanizmusok. World J. Gastroenterol. 2018, 24, 1679–1707. [CrossRef]

5. Wang, Q.; Ó, Y.; Ölelés.; Wen, C.; Yue, S.; Chen, C.; Xu, L.; Xie, J.; Dai, H.; Xiao, H.; et al. A Naringenin enyhíti az alkoholmentes zsírmájbetegséget azáltal, hogy csökkenti az NLRP3/NF-κB útvonalat egerekben. Br. J. Pharmacol. 2020, 177, 1806–1821. [CrossRef]

6. Khan, TH; Ganaie, MA A naringenin megakadályozza a doxorubicin által kiváltott toxicitást a veseszövetekben azáltal, hogy szabályozza az oxidatív és gyulladásos inzultusokat Wistar patkányokban. Boltív. Physiol. Biochem. 2020, 126, 300–307. [CrossRef]

7. Wang, J.; Ding, Y.; Zhou, W. Albumin önmódosított liposzómák májfibrózis kezelésére SPARC-függő útvonalakon keresztül. Int. J. Pharm. 2020, 574, 118940. [CrossRef]

8. Komecsi, L.; Govender, K.; Mofo Mato, EP; Hurchund, R.; Owira, PMO Az oxidatív stressz csökkentésével a naringenin enyhíti a hiperglikémia által kiváltott májnukleáris faktor eritroid 2-kapcsolódó 2-es faktor fehérje növekedését. J. Pharm. Pharmacol. 2020, 72, 1394–1404. [CrossRef] [PubMed]

9. Rossino, MG; Casini, G. Nutraceuticals for the Treatment of Diabetic Retinopathia. Nutrients 2019, 11, 771. [CrossRef] [PubMed]

10. Hernández-Aquino, E.; Quezada-Ramírez, MA; Silva-Olivares, A.; Casas-Grajales, S.; Ramos-Tovar, E.; Flores-Beltrán, RE; Segovia, J.; Shibayama, M.; Muriel, P. A Naringenin csökkenti a májfibrózis progresszióját a máj csillagsejtek inaktiválásával és a profifibrogén utak inaktiválásával. Eur. J. Pharmacol. 2019, 865, 172730. [CrossRef] [PubMed]