A BRD4 epigenetikai szabályozó részt vesz a kadmium által kiváltott gyulladásos reakcióban a patkány vesében

további információ:ali.ma@wecistanche.com

Zhongguo Gong et al

A Cistanche tubulosa megelőzi a vesebetegséget, kattintson ide atermékek és a Cistanche DHT

ABSZTRAKT

A kadmiumot (Cd) potenciális gyulladást kiváltó anyagként írták le, miközben egyre több bizonyíték mutatja, hogy a nem megfelelő gyulladás hozzájárul avese sérülés. Ezért a Cd által kiváltott gyulladásos válaszreakció kutatásának nagy jelentősége van a Cd által kiváltott nefrotoxicitás mechanizmusának tisztázásában. Brómodomén tartalmú 4(A BRD4) fontos epigenetikai szabályozó, amely számos gyulladásos betegség kialakulásában vesz részt, de szabályozó szerepe a Cd által kiváltottgyulladásosa válasz tisztázásra vár. Itt azt találtuk, hogy a Cd-kezelés Sprague-Dawley patkányokban (2 mg/ttkg, ip, 5 egymást követő napon) és patkánybanvese sejtvonal (NRK{{0}}E, 0–10 μM, 12 óra) gyulladásos citokinek transzkripcióját indukálta, amit JQ1 (BRD4 inhibitor, 25 mg/ttkg, ip) csökkenthetett , 3 egymást követő napon in vivo; 0,5 μM, 12 óra in vitro) vagy BRD4 kis interferáló RNS (siRNS, in vitro), ami arra utal, hogy a BRD4 részt vesz a Cd által kiváltott gyulladásos válaszban. Ezt követően tanulmányunk tisztázta a BRD4 szerepét a Cd által kiváltott gyulladásos válaszban. A BRD4 gátlása csökkentette a Cd által elősegített NF-κB nukleáris transzlokációt és aktivációt in vivo és in vitro. A Cd növelte a RelA K310 acetilezési szintjét és fokozta a BRD4 kötődését az acetilált NF-κB RelA-hoz in vivo és in vitro, amit a BRD4 gátlása megszüntetett. Összefoglalva, tanulmányunk azt sugallja, hogy a BRD4 részt vesz a gyulladásos citokinek Cd által kiváltott transzkripciójában az NF-κB jelátviteli útvonal aktiválásának közvetítésével és az acetilált NF-κB RelA-hoz való kötődésének fokozásával patkányban.vese,ezért a BRD4 potenciális terápiás célpont lehet a Cd által kiváltott vesebetegségekben.

Kulcsszavak: BRD4KadmiumVese gyulladásoscitokinek NF-κB JQ1

1. Bemutatkozás

A kadmium (Cd) nehézfém-szennyező anyag, nagy toxicitású és hosszú felezési idejű. Az ipari termelés fejlődésével a Cd-szennyezés fokozott veszélye a környezet biztonságára és az emberi egészségre aggodalomra ad okot (Wang et al., 2020; Horiguchi és Oguma, 2016). Miután a Cd felszívódik a szervezetben, több szerv károsodását idézi elő és avesea fő célszerv (Fernando et al., 2020; Zhao et al., 2021). Korábban szisztematikusan ellenőriztük, hogy az autofágia gátlása, az oxidatív stressz és az apoptózis szinergikusan hozzájárul a Cd okozta nefrotoxicitáshoz patkányokban (Liu és mtsai, 2017; Wang és mtsai, 2017). A gyulladás egy fiziológiai válasz, amely védekező reakcióként működik a fertőzéssel vagy sérüléssel szemben, de a Cd által kiváltott ellenőrizetlen és nem megfelelő gyulladásos válaszok károkat okozhatnak, például károsíthatják a szemlélő normális szöveteit és elősegíthetik az autoimmun betegségeket (Hossein-Khannazer et al., 2020; Zhang et al. al., 2020). A Cd által kiváltott gyulladásos válasz súlyosbította a szív- és érrendszeri betegségeket és a májkárosodást, ami arra utal, hogy a gyulladás fontos szerepet játszhat a Cd által közvetítettvesekóros folyamatok (Fagerberg et al., 2017; Almeer et al., 2019).

Az epigenetika a génexpresszió nem-DNS-szekvencia-változásokon alapuló öröklődő módosulásait jelenti, és e módosítások reverzibilitása új terápiás célpontok felfedezését teszi lehetővé (Vendetti és Rudin, 2013). A bromodomén és extra-terminális domén (BET) családba tartoznak a bromodomént tartalmazó 2 (BRD2), BRD3, BRD4 és bromodomain here-specifikus (BRDT), amelyeket két brómdomén jellemez, és kötődik a hisztonok és nem hisztonok acetilált lizinjéhez ( Lochrin et al., 2014; Chatterjee és Bohmann, 2018). A BET fehérjék számos gén transzkripciós koaktivátoraként működnek, így szabályozzák a sejtciklust, a gyulladásos választ, az oxidatív stresszt és más fiziológiai folyamatokat különböző kóros modellekben (Jiao és mtsai, 2020; Wang és mtsai, 2019b). A BRD4 a BET fehérjecsalád különösen jól tanulmányozott tagja, és a felhalmozódó vizsgálatok új epigenetikai célpontként számoltak be a változatos fehérjék szabályozásában.vesebetegségekideértve a krónikus nephritist, a diabéteszes nephropathiát és a kísérleti vesekárosodást (Zeng és Zhou, 2002; Morgado-Pascual és mtsai, 2019). Megerősítették, hogy a BRD4 részt vesz a nukleáris faktor-κB (NF-κB)-függő transzkripciós folyamatban, hogy szabályozza a gyulladásos válaszokat számos betegségben (Xu és Vakoc, 2014; Suarez-Alvarez és mtsai, 2017). A BRD4-et a 310-es lizin (RelA-K310ac) acetilált RelA (NF-κB alegység, fehérjét kódoló gén) brómdoménjein keresztül toborozhatja, így aktiválja a ciklinfüggő kináz 9-et (CDK9), és foszforilálja az RNS polimeráz II-t. NF-κB célgének transzkripciója (Hajmirza et al., 2018). A közelmúltban végzett vizsgálatok azt sugallják, hogy a BRD4 gátlók potenciális terápiás lehetőséget jelenthetnek gyulladásos betegségek kezelésére. Patkány gerincvelő-sérülési modellekben a BRD4 gátlása gyengítette a gyulladásos választ és elősegítette a mikroglia funkcionális helyreállítását (Dey et al., 2019). Ezenkívül a BRD4 gátlása megszüntette a kísérleti vesegyulladást az egyoldali ureterelzáródás, a membrán ellenes bazális GN és az angiotenzin II infúziójának egérmodelljeiben (Suarez-Alvarez és mtsai, 2017).

Tekintettel a Cd potenciális gyulladásgátló hatásaira és a BRD4 gyulladásra gyakorolt ​​​​szabályozó hatásaira, feltételeztük, hogy a BRD4 részt vesz a Cd által kiváltott gyulladásos válaszban. Ahogy az várható volt, a BRD4 közvetíti a gyulladásos citokinek transzkripciós folyamatát Cd-nek kitett patkányvese modellekben. Vizsgálatunk feltár egy lehetséges mechanizmust a Cd által kiváltott gyulladásos válaszban, és új betekintést nyújt a Cd által kiváltott nefrotoxicitás terápiájába.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Vegyszerek és antitestek

A kadmium-kloridot (CdCl2, vízmentes, 439800) a Sigma-Aldrich-től (Carlsbad, CA, USA) vásároltuk. (plusz )-JQ1 (HY-13030) a MedChemExpress-től (Monmouth Junction, NJ, USA) szereztük be. A nukleáris fehérje extrakciós készletet a Beyotime Institute of Biotechnology-tól (Sanghaj, Kína, P0027) vásároltuk. Egy hatékony kemilumineszcencia készletet (ECL, 32209) és a bicinkoninsav fehérje vizsgálati reagenst (BCA, 23225) a Thermo Fisher Scientific cégtől (Madison, WI, USA) szereztünk be. A következő fehérjék elleni elsődleges antitesteket használtuk: NF-κB p65 (10745-1- AP), IL-1 (26048-1-AP), TNF- (17590-1-AP) Proteintech Group (Wuhan, Kína); -aktint (3700 s), Histon H3-at (His3, 4499), Sirtuin 1-et (Sirt1, 8469), normál nyúl IgG-t (IgG, 4394) a Cell Signaling Technology-tól (Danvers, MA, USA) vásároltuk; A BRD4 (ab128874), a K (lizin) acetiltranszferáz 3 (KAT3B/Ep300, ab14984), az NF-κB RelA (acetil K310) (RelA-K310ac, ab19870), az Alexa Fluor® 488-at vásárolták70 szamár anti-5bbit3 (konjugált) az Abcam-től (Cambridge, Egyesült Királyság). Második antitestek: a Goat Anti-Mouse IgG (H plus L) (115-035-003) és a Goat Anti-Rabbit IgG (H plus L) (111-035-003) a Jackson ImmunoResearch-től (West Grove, PA, USA) vásároltak ).

2.2. Állatok és kísérletek

Huszonnégy Sprague-Dawley patkányt (hím, 6 hetes, 110-120 g) vásároltunk a Pengyue Experimental Animal Breeding Co., Ltd.-től (Jinan, Shandong, Kína). A patkányok szabad hozzáférést kaptak élelemhez és vízhez egy környezetileg ellenőrzött helyiségben (24 ± 5 ​​fok, 12 órás világos/sötét ciklus). A kísérleti eljárások az Európai Közösségek Tanácsának állatkísérletekre vonatkozó 2010/63/EU irányelvére vonatkoztak, és minden eljárást jóváhagyott a Yangzhou Egyetem Állatgondozási és -használati bizottsága. Egy hét akklimatizáció után a patkányokat véletlenszerűen négy csoportra osztottuk: (1) Kontroll csoport: intraperitoneálisan injekcióztuk a megfelelő oldószerrel (fiziológiás sóoldat vagy 2-hidroxipropil- -ciklodextrin oldat). (2) Cd-csoport: CdCl2 (2 mg/testtömeg-kg, fiziológiás sóoldatban oldva) intraperitoneálisan 5 egymást követő napon át a Cd-mérgezési modell megállapítására. (3) Cd plusz JQ1 csoport: CdCl2 (2 mg/ttkg) intraperitoneálisan 5 egymást követő napon keresztül a Cd-mérgezési modell létrehozása céljából, és JQ1 (25 mg/testtömeg-kg, 2-hidroxipropil{{) 25}}ciklodextrin oldat) intraperitoneálisan a 6-8. napon. (4) JQ1 csoport: JQ1 (25 mg/ttkg) intraperitoneálisan a 6–8. napon. A patkányszérumok és a veseszövetek Cd-tartalmának statisztikáit az S1 táblázat sorolja fel, tükrözve a Cd-nek kitett patkánymodellek sikeres létrehozását.

8 napos kezelést követően a patkányokat nyaki diszlokációval, mély érzéstelenítésben, 12 órás éheztetés után elpusztították. A veseszöveteket feldaraboltuk, és mindegyik veséből 1 g szövetet gyorsan tároltunk -80 ◦C-on Western blot és kvantitatív PCR (qPCR) elemzéshez. A fennmaradó mennyiségű szövetet gyorsan fixáltuk 4 százalékos paraformaldehidben (PFA) az immunhisztokémiai (IHC) festéshez.

2.3. Sejttenyésztés és kezelés

A patkányvese sejtvonalat (NRK{{0}}E) a Shanghai Cell Bank of China Academy of Sciences-től szereztük be. Az NRK-52E sejteket Dulbecco módosított Eagle táptalajjal (DMEM, Gibco, 12800-017) tenyésztettük, amely 5% magzati szarvasmarha szérumot (FBS, Gibco, 10437-028), penicillint és sztreptomicint tartalmazott (1 00 U/mL) párásított, 5% CO2-t és 95% levegőt tartalmazó, 37 fokos levegőben. A CdCl2-t (ultratiszta vízben oldott) és a JQ1-et (dimetil-szulfoxidban oldott) külön tároltuk 4 és -20 fokon, és felhasználás előtt munkaoldatba hígítottuk. A kísérleti terv a következő volt: (1) A sejteket 0, 2,5, 5, 10 µM Cd-vel 12 órán át, vagy 5 µM Cd-vel 0, 6, 12, 24 órán át kezeltük a további vizsgálatok elvégzéséhez. (2) A sejteket 5 μM Cd-vel és/vagy 0,5 μM JQ1-gyel kezeltük 12 órán át a következő vizsgálatok elvégzéséhez. (3) A sejteket siBRD4-gyel transzfektáltuk és/vagy 5 μM Cd-vel kezeltük további 12 órán át a következő vizsgálatok elvégzéséhez.

2.4. Kis interferáló RNS transzfekció

20 nM BRD4 kis interferáló RNS-t (siBRD4, Invitrogen, CA, USA) transzfektáltunk az NRK-52E sejtekbe Lipofectamine RNAiMAX transzfekciós reagenssel (Thermo Fisher Scientific, Cat# 13778150) a termékkézikönyvek szerint 24 órán keresztül. A következő szenzoros siRNS-eket használtuk:

siBRD4, 5′-CCGTCAAGCTGAACCTCCCTGATTA-3′ célszekvenciával;

siCt (siRNS negatív kontroll), 5′- UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′ célszekvenciával.

2.5. Western blot

A veseszövetmintákat és az NRK{0}}E sejteket proteázgátlókat tartalmazó RIPA pufferben lizáltuk az összfehérje extrakciója érdekében. A nukleáris fehérjét friss szövetekből és sejtekből előzetesen előállítottuk és –80 fokon tároltuk. A fehérjemintákat (mintánként 20-30 ug) SDS-PAGE elektroforézissel választottuk el, majd polivinilidén-fluorid membránokra vittük át (Millipore, ISEQ00010). A membránokat 5 százalékos sovány tejjel blokkoltuk 90 percig, majd 12 órán át 4 fokon inkubáltuk a következő elsődleges antitestekkel: -aktin (1:5000), NF-κB p65 (1:1000), IL-1 ( 1:600), TNF- (1:600), BRD4 (1:1000), Ep300 (1:1000), Sirt1 (1:1000), His3 (1:1000), RelA-K310ac (1:1000). Ezután a membránokat TBST-vel mostuk, és a megfelelő másodlagos antitestekkel (1:10000) 90 percig szobahőmérsékleten (RT) inkubáltuk. A membránokat elektrokemilumineszcenciával (ECL, ThermoFisher Scientific) inkubáltuk, és Chemidoc XRS-en (Bio-Rad, Marnes-La Coquette, Franciaország) határoztuk meg, az optikai sűrűséget pedig ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA) segítségével elemeztük.

2.6. Immunfluoreszcens (IF) festés

Az NRK{{0}}E-sejteket egy 24-lyuklemezre oltottuk körülbelül 60 százalékos összefolyásig. A sejteket 5 μM Cd-vel és/vagy 0,5 μM JQ1-gyel kezeltük 12 órán át, majd PFA-val fixáltuk (4 százalék, 10 perc), Triton X{10}}-val permeabilizáltuk (0,1 százalék, 15 perc), BSA-val blokkoltuk. (2 százalék, 90 perc) szobahőmérsékleten, és elsődleges antitesttel (NF-κB p65, 1:50 hígítás) inkubáltuk egy éjszakán át 4 °C-on. Háromszori PBS-sel történő mosás után a sejteket másodlagos antitesttel (1:500 hígítás) 90 percig, majd DAPI-val 5 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk, majd a sejteket konfokális mikroszkóp alatt megfigyeltük. Az NF-κB nukleáris transzlokációt három független tanulmányban elemezték.

2.7. qPCR

A veseszövetek teljes RNS-ét és az NRK{0}}E-sejteket RNAiso Plus kittel (Takara Bio, Shiga, Japán) extraháltuk. 1 ug teljes RNS-t használtunk az 1. láncú cDNS szintetizálására a gyártó kézikönyve szerint (Roche, Basel, Svájc). Lyukanként 2 μL komplementer DNS-t (cDNS) vettünk a relatív mRNS-szintek kimutatására LightCycler® 96 Real-Time PCR System (Roche) segítségével. Számítsa ki a relatív mRNS-szinteket a 2-△△CT egyenlet alapján. A primereket az S2 táblázat tartalmazza. -aktin egy patkány referenciagén volt.

2.8. Koimmunoprecipitáció (Co-IP)

A veseszöveteket és az NRK{0}}E sejteket frissen készített sejtlízis pufferben (20 mM HEPES-KOH pH 7,5, 150 mmol/L NaCl, 2 mmol/L EDTA, 1% Triton X{{8}) lizáltuk. }), amely PMSF-et tartalmaz. Protein G gyöngyöket (mintánként 100 μl, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) mintánként 2 ug BRD4, RelA-K310ac vagy IgG antitesttel kevertük össze, és 10 percig szobahőmérsékleten forgattuk. Ezután az összes fehérje-lizátumot gyöngyök-antitest komplexszel inkubáltuk egy éjszakán át 4 °C-on. Miután háromszor mostuk sejtoldó pufferrel, az immunprecipitátumokat 1 × SDS PAGE mintapufferrel szuszpendáltuk a minták konfigurálásához. A célfehérjéket Western blottolással detektáltuk anti-BRD4 és anti-RelA K310ac primer antitestekkel.

2.9. Statisztikai analízis

Minden adatot legalább három független kísérletből nyertünk, és átlag ± SEM-ben fejeztük ki, hacsak másként nem említjük. A kísérleti csoportokat nem párosított, kétirányú Student-féle t-teszttel vagy egyirányú varianciaanalízissel (ANOVA) hasonlítottuk össze SPSS 22 segítségével.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). A szignifikancia értéke p <>

3. Eredmények

3.1. A Cd in vivo és in vitro indukálja a gyulladásos citokinek expresszióját

Környezetszennyező anyagként a Cd bizonyítottan vesekárosodást okoz számos biológiai folyamat szabályozásával (Wang et al., 2019c). Ebben a vizsgálatban a gyulladásos citokinek transzkripciós szintjében bekövetkezett változásokat vizsgálták Cd expozíció után, hogy megvizsgálják, hogy a gyulladás szerepet játszik-e a Cd által kiváltott nefrotoxicitásban. Az adatok azt mutatták, hogy a Cd expozíció szignifikánsan növelte az interleukin (IL)-1 és a tumor nekrózis faktor (TNF) fehérje szintjét az NRK-52E sejtekben (1A-B. ábra) és a patkány veseszövetekben (1C. ábra). -D). Mindeközben, amint az 1E-F. ábrákon látható, a Cd-expozíció növelte a gyulladásos citokinek (IL-1, IL-6, TNF- és (monocita kemoattraktáns fehérje-1) MCP transzkripciós szintjét -1) in vivo és in vitro. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a Cd gyulladásos citokinek expresszióját indukálja patkány vesében.

3.2. A BRD4 részt vesz a gyulladásos citokinek Cd-indukálta transzkripciós folyamatában

A BRD4 egy újonnan leírt epigenetikai szabályozó, amely acetilált vagy nem hisztonokhoz kötődik, hogy szabályozza a gyulladásos folyamatokat számos betegségben. Itt a JQ1 BRD4 inhibitort és a BRD4-siRNS-t használtuk a BRD4 szerepének vizsgálatára a Cd által kiváltott gyulladásos válaszra. Az adatok azt mutatták, hogy a Cd-emelkedett IL-1 és a TNF-fehérje szintet csökkentette a JQ1 kezelés in vivo és in vitro (2A–D. ábra), valamint a BRD4 in vitro leütése (S1A–B. ábra). Eközben a JQ1 kezelés jelentősen gátolta az IL-1, IL-6, TNF- és MCP-1 Cd-fokozott transzkripciós szintjét NRK-52E sejtekben (2E. ábra) és patkányvese szövetei (2F. ábra). Ezenkívül a BRD4 leütése jelentősen csökkentette a gyulladásos citokinek Cd-vel megnövekedett transzkripciós szintjét az NRK-52E sejtekben (S1C. ábra). Ezek az eredmények együttesen azt sugallják, hogy a BRD4 a Cd által kiváltott gyulladásos válasz kritikus szabályozója patkányvesékben.

3.3. A BRD4 expressziós szintje változatlan marad a Cd expozíció után

Ezután a BRD4 expressziós szintjének változásait detektáltuk a Cd expozíció után. Az NRK-52E sejteket Cd-vel kezeltük koncentrációgradiens mellett, és patkányokat intraperitoneálisan Cd-vel injektáltunk 5 napig, hogy tisztázzuk a Cd hatását a vese BRD4 expressziójára in vivo és in vitro. Az eredmények azt mutatták, hogy a BRD4 fehérjeszintek változatlanok maradtak mind a Cd-nek kitett NRK-52E-sejtekben (3A-B. ábra), mind a patkányveseszövetekben (3C-D. ábra). Ezenkívül a BRD4 mRNS szintje nem változott a Cd expozíció után (3E-F. ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a BRD4 közvetíti a Cd által kiváltott gyulladásos választ, nem függ az expressziós szint változásaitól.

3.4. A BRD4 szabályozza a Cd által elősegített NF-κB nukleáris transzlokációt

Vizsgálatunk során feltártuk a BRD4 szerepét a Cd által kiváltott gyulladásos válaszban. Az NF-κB jelátviteli útvonal változása szorosan összefügg a gyulladásos citokinek transzkripciójával (Chi et al., 2021). Vizsgálatunk kimutatta, hogy a BRD4 részt vesz a Cd által szabályozott nukleáris transzlokációban és az NF-κB aktiválásában. Először az NF-κB szubcelluláris lokalizációját határoztuk meg IF-festéssel és IHC-festéssel. A 4A és D ábrán látható adatok azt mutatták, hogy a JQ1 gátolja a Cd által elősegített NF-κB nukleáris transzlokációt az NRK-52E sejtekben és a patkányvese szöveteiben. Eközben a Western blot eredmények azt mutatták, hogy a JQ1 szignifikánsan csökkentette az NF-κB Cd-növekedett nukleáris fehérjeszintjét in vivo (4B-C. ábra) és in vitro (4E-F. ábra). Hasonlóképpen, a BRD4 knockdown szintén jelentősen gátolta a Cd által elősegített NF-κB nukleáris transzlokációt (S2A ábra), és csökkentette az NF-κB Cd-vel megnövekedett nukleáris fehérje szintjét (S2B-C ábra) az NRK-52E sejtekben. Összességében a BRD4 gátlása csökkentheti a Cd által elősegített NF-κB nukleáris transzlokációt, ami arra utal, hogy a BRD4 közvetíti az NF-κB jelátviteli útvonal aktiválását a vesében a Cd expozíció után.

3.5. A Cd növeli a RelA K310 acetilezési szintjét

Tanulmányok megerősítették, hogy a BRD4 brómdoménjein keresztül kötődik az acetilált RelA K310-hez, hogy szabályozza az NF-κB-függő transzkripciót (Morgado-Pascual et al., 2019; Zhong és mtsai, 2018). Így a RelA K310 acetilációs szintjét és két enzim expresszióját detektáltuk. Az adatok azt mutatták, hogy a RelA-K310ac és az acetiláz Ep300 fehérje szintje folyamatosan csökkent a Cd koncentrációjának növekedésével, míg a Sirt1 dezacetiláz fehérje szintje fokozatosan nőtt az NRK-52E sejtekben (5A-B. ábra) és a patkány veseszövetekben (1. ábra). 5C-D). Az Ep300 és Sirt1 mRNS szintjei is ugyanazokat a tendenciákat mutatták (5E-F. ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a Cd elősegíti a RelA K310 acetilációs szintjét, így a BRD4 részt vehet a Cd által kiváltott gyulladásos citokinek transzkripciójában a vesében.

3.6. A Cd növeli a BRD4 kötődését a RelA-K310ac-hoz, hogy fokozza annak transzkripciós funkcióját

Az acetilációs helyekhez való kötődés a BRD4 transzkripciós szabályozásának alapja (Huang et al., 2009). Annak ellenőrzésére, hogy a Cd szabályozza-e a BRD4 funkcióját azáltal, hogy növeli a BRD4 kötődését a RelA-K310ac-hoz, a RelA-K310ac és a BRD4 közötti kölcsönhatást Co-IP-n keresztül észlelték. A 6A. ábra adatai azt mutatták, hogy a Cd szignifikánsan fokozta a RelA-K310ac és a BRD4 közötti interakciót NRK-52E sejtekben, amit a JQ1 kezelés vagy a BRD4 leütés enyhített. Ugyanez a tendencia volt megfigyelhető a patkányvese szöveteiben is (6B. ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a Cd fokozza a BRD4 kötődését a RelA-K310ac-hoz, ami elősegíti az NF-κB-függő transzkripciót, és ezt követően hozzájárul a Cd által kiváltott gyulladásos válaszhoz.

4. Megbeszélés

A Cd-t magas toxicitása miatt a gyulladás lehetséges kiváltójaként számolták be, miközben a pontos mechanizmus még mindig nem teljesen ismert (Arab-Nozari et al., 2020; Ghosh, 2018). Vizsgálatunk megerősítette, hogy a Cd gyulladásos citokinek expressziót indukál patkány vesesejtekben, és azt találtuk, hogy a BRD4, egy epigenetikai célpont, amely kritikus funkciókat tölt be számos sejtfolyamatban, beleértve a gyulladást is, hozzájárul a Cd által kiváltott gyulladásos válaszhoz. További kísérletek azt mutatták, hogy a BRD4 részt vesz a Cd által támogatott NF-κB jelátviteli útvonal aktiválásában. Ezenkívül a Cd növelte a RelA K310 acetilációs szintjét, ezáltal növelve a BRD4 kötődését az acetilált NF-κB RelA-hoz, elősegítve az NF-κB-függő gyulladásos citokinek transzkripcióját.

A gyulladás az egyik természetes védekező mechanizmus az exogén vegyi anyagokkal szemben, míg az ellenőrizetlen és nem megfelelő gyulladásos válasz károsíthatja a normál szöveteket és autoimmun betegségeket indukálhat (Jian et al., 2018). A gyulladás Cd-szintjének növekedésével járó biológiai markerek gyakran társultak különféle betegségekkel. Tanulmányok kimutatták, hogy a Cd által kiváltott gyulladás részt vesz az atherogenezisben (Tinkov et al., 2018). Ezenkívül a Cd elősegítette a gyulladásos citokinek expresszióját, ami hozzájárult a tüdő- és a hereszövet károsodásához, és hepatotoxicitást vált ki (Koopsamy Naidoo és mtsai, 2019; Arafa és mtsai, 2014). Ezek a káros hatások összhangban vannak eredményeinkkel, miszerint a gyulladásos válasz szerepet játszik a Cd által kiváltott vesekárosodásban. Egyre nagyobb kutatások irányulnak a Cd-indukálta gyulladás előfordulási mechanizmusaira. A BET fehérjecsalád jól tanulmányozott tagjaként a BRD4 kritikus szerepet játszik számos biológiai folyamatban, beleértve a gyulladást is. Itt a JQ1-et (a BRD4 inhibitora) és az siRNS-t használták a BRD4 funkcionális aktivitásának deregulációjára, és azt találták, hogy a BRD4 gátlása csökkentette a gyulladásos citokinek Cd-indukálta transzkripcióját patkányvesékben, ami arra utal, hogy a BRD4 részt vesz a Cd által kiváltott gyulladásos válaszban. . Általában úgy gondolják, hogy a BRD4 expressziójának diszregulációja kulcsfontosságú esemény a gyulladásos válasz előfordulásában. Gerincvelősérülések, patológiás szívhipertrófia és más gyulladással összefüggő betegségek esetén a BRD4 zavaros expressziója hozzájárult a gyulladásos citokinek expressziójához (Zhu és mtsai, 2020; Marazzi és mtsai, 2018; Ren et al., 2019). A Cd azonban nem volt hatással a BRD4 expressziós szintjére a jelen kísérleti körülmények között, ami arra késztetett bennünket, hogy megvizsgáljuk, vajon a BRD4 közvetíti-e a Cd által kiváltott gyulladásos választ más útvonalakon keresztül.

Az NF-κB a gyulladásos folyamatok fontos szabályozó tényezője, és számos gyulladásos mediátor expressziójának szabályozásáért felelős (Lawrence, 2009). Tanulmányok szerint a BRD4 részt vesz az NF-κB jelátviteli útvonal szabályozásában. Huang et al. (2017) azt javasolta, hogy a BRD4 szabályozza az IKK-közvetített NF-κB aktivációt a p38 és a JNK–MAPK útvonalakon keresztül. Wang és mtsai. (2019a) azt találták, hogy a BRD4 knockdown vagy a JQ1 kezelés blokkolja a lipopoliszacharid (LPS) által aktivált NF-κB jelátviteli útvonalat a mikrogliákban. Meng és mtsai. (2014) kimutatták, hogy a JQ1 kezelés blokkolta a gyulladásos citokinek expresszióját az NF-κB aktiválásának gátlásával LPS-sel kezelt RAW 264.7 sejtekben. Ezek a jelentések azt mutatták, hogy a BRD4 számos gyulladásos modellben közvetíti az NF-κB aktiválását, míg a BRD4 gátlása hatékony terápiás megközelítés a gyulladásgátló kezelésben. A jelenlegi vizsgálatban a BRD4 gátlása blokkolta az NF-κB nukleáris transzlokációját Cd-nek kitett patkányveseszövetekben és NRK-52E-sejtekben, ami arra utal, hogy a BRD4 közvetíti a Cd-aktivált NF-κB jelátviteli útvonalat.

Jellemzően, miután az NF-κB különböző ingerek hatására aktiválódott, és áthelyeződik a sejtmagba, a BRD4 a K310 helyen kötődik acetilált NF-κB RelA-hoz, ami növeli stabilitását és transzkripciós aktivitását a sejtmagban (Hajmirza et al., 2018). Így a RelA K310 acetilációs szintje befolyásolja a BRD4 szabályozó funkcióját a gyulladásos válaszra. Hippocampalis neuronokban a Sirt1 dezacetiláz a RelA K310 dezacetilációját közvetítette a BACE1 expresszió szabályozása érdekében, ami hozzájárult a neuronális amiloid termeléséhez (Flores-Leon és mtsai, 2019). A glioblasztóma sejtekben a fotodinamikus terápiás stressz leszabályozta a Sirt1 deacetilázt és aktiválta az Ep300 acetilázt, ami növelte a RelA-K310ac szintjét, és a túlélést elősegítő nitrogén-monoxid termelésének növekedéséhez vezetett (Fahey et al., 2019). Vizsgálatunk szerint a Cd elősegíti a RelA K310 acetilációs szintjét az Ep300 expressziójának növelésével és a Sirt1 expresszió csökkentésével, ami azt jelzi, hogy a Cd befolyásolja a BRD4 szabályozó funkciót azáltal, hogy növeli a RelA K310 acetilációs szintjét.

Eredményeink azt mutatták, hogy a JQ1 kezelés hatékonyabb volt, mint a BRD4 knockdown a Cd által kiváltott gyulladásos válasz enyhítésében. A JQ1-nek nagy a kötődési affinitása a BRD4-hez, és szinte teljesen blokkolja a BRD4 kötődését a kromoszómához, míg az siBRD4 csak a BRD4 fehérje expresszióját tudja zavarni, hogy csökkentse a BRD4 kötődését a célhelyhez, ami arra utal, hogy a BRD4 közvetíti a Cd által kiváltott gyulladásos választ. kötődés acetilezett NF-κB RelA-val. A közelmúltban végzett vizsgálatok hasonló szabályozási mechanizmust mutattak ki: az NF-κB nukleáris transzlokációja és aktiválása után a BRD4 kölcsönhatásba lép az acetilált RelA-val, hogy koaktiválja az NF-κB transzkripciós aktiválását (Huang és mtsai, 2009). A RelA–BRD4-et az NF-κB célpromoterek közé toborozták különböző gyulladásos stimulációs körülmények között, míg a JQ1 kezelés megakadályozta a BRD4 acetilált NF-κB RelA-hoz való kötődését, így csökkentve az NF-κB transzkripciós aktivitását (Zou et al., 2014). Eredményeink azt mutatták, hogy a BRD4 gátlása blokkolja a BRD4 és a RelA-K310ac közötti Cd-fokozott kölcsönhatást patkányvesékben, alátámasztva a fenti eredményeinket, miszerint a BRD4 gátlása elnyomja az NF-κB Cd-indukálta transzkripciós aktivitását, ami azt jelzi, hogy a Cd fokozza a BRD4 kötődését az acetilezetthez. NF-κB RelA a gyulladásos citokinek transzkripciójának fokozására.

Összefoglalva, vizsgálatunk feltárta a BRD4 szabályozó mechanizmusait patkányvese Cd által kiváltott gyulladásos válaszában: (1) A BRD4 közvetíti a Cd által kiváltott NF-κB sejtmag transzlokációját és aktiválását. (2) A Cd növeli a RelA K310 acetilációs szintjét és fokozza a BRD4 kötődését az acetilezett NF-κB RelA-hoz, ami elősegíti az NF-κB-függő gyulladásos citokinek transzkripcióját. Ezenkívül a BRD4 gátlása jelentősen enyhítette a Cd-emelkedett gyulladásos citokinszinteket, ami arra utal, hogy a célzott BRD4 potenciálisan hatékony eszköz a gyulladásos betegségek, köztük a Cd által kiváltott nephritis kezelésében.

CRediT szerzői hozzájárulási nyilatkozat

Zhongguo Gong: Koncepció, módszertan, vizualizáció, formális elemzés, érvényesítés, vizsgálat, formális elemzés, adatkezelés, írás – eredeti tervezet. Gang Liu: Koncepció, Módszertan, Vizualizálás, Adatkezelés, Írás – eredeti tervezet, Projektadminisztráció, Finanszírozás. Wenjing Liu: Szoftver, erőforrások, módszertan, formális elemzés. Hui Zou: Projekt adminisztráció, felügyelet. Ruilong Song: szoftver, formális elemzés, felügyelet. Hongyan Zhao: Szoftver, formális elemzés, felügyelet. Yan Yuan: Felügyelet. Jianhong Gu: Felügyelet. Jianchun Bian: Finanszírozás megszerzése, felügyelet. Jiaqiao Zhu: Írás – áttekintés és szerkesztés, felügyelet. Zongping Liu: Írás – áttekintés és szerkesztés, felügyelet,

Projekt adminisztráció, Finanszírozás beszerzése, Koncepció.

Nyilatkozat a versengő érdekeltségről

A szerzők kijelentik, hogy nincsenek ismert versengő pénzügyi érdekeltségeik vagy személyes kapcsolataik, amelyekről úgy tűnik, hogy befolyásolhatták volna a jelen tanulmányban közölt munkát.

Elismerés

Ezt a munkát a Kínai Nemzeti Természettudományi Alapítvány (31872533., 31902329., 32072933. sz.), Kína Nemzeti Kulcsfontosságú Kutatási és Fejlesztési Programja (2016YFD0501208. sz.), valamint a Jiangsu Felsőoktatási Kiemelt Akadémiai Program fejlesztése projektje támogatta. Intézmény (PADP). A kéziratot az ELIXIGEN egy vagy több magasan képzett, angol anyanyelvű szerkesztője szerkesztette a megfelelő angol nyelv, nyelvtan, írásjelek, helyesírás és általános stílus érdekében.

Hivatkozások

Almeer, RS, AlBasher, GI, Alarifi, S., Alkahtani, S., Ali, D., Abdel Moneim, AE, 2019. A méhpempő csillapítja a kadmium által kiváltott nephrotoxicitást hím egerekben. Sci. Rep. 9 (1), 5825.

Arab-Nozari, M., Mohammadi, E., Shokrzadeh, M., Ahangar, N., Amiri, FT, Shaki, F., 2020. Nem toxikus szintű kadmium és fluorid együttes expozíció hepatotoxicitást okoz patkányokban keresztül kiváltja a mitokondriális oxidatív károsodást, az apoptózist és az NF-kB útvonalakat. Environ. Sci. Szennyez. Res. Int. 27 (19), 24048–24058.

Arafa, MH, Mohammad, NS, Atteia, HH, 2014. A görögszéna magpor mérsékli a kadmium által kiváltott herekárosodást és a hepatotoxicitást hím patkányokban. Exp. Toxicol. Pathol. 66 (7), 293–300.

Chatterjee, N., Bohmann, D., 2018. BET-ting on Nrf2: hogyan befolyásolhatja az Nrf2 jelátvitel a BET fehérje inhibitorok terápiás aktivitását. Bioessays 40 (5), 1800007.

Chi, Q., Zhang, Q., Lu, Y., Zhang, Y., Xu, S., Li, S., 2021. A szelenoprotein S szerepe a reaktív oxigénfajtáktól függő neutrofil extracelluláris csapdaképződésben induced by szelén- hiányos arteritis. Redox Biol. 44, 102003 Dey, A., Yang, W., Gegonne, A., Nishiyama, A., Pan, R., Yagi, R., Grinberg, A., Finkelman, FD, Pfeifer, K., Zhu, J ., Singer, D., Zhu, J., Ozato, K., 2019. A BRD4 irányítja a hematopoietikus őssejtek fejlődését és modulálja a makrofágok gyulladásos válaszait. EMBO J. 38 (7)

Fagerberg, B., Szül, Y., Barregard, L., Sallsten, G., Forsgard, N., Hedblad, B., Persson, M., Engstrm, G., 2017. A kadmium expozíció az oldható urokináz plazminogén aktivátor receptorhoz kapcsolódik, amely a gyulladás és a jövőbeni szív- és érrendszeri betegségek keringő markere. Environ. Res. 152, 185–191.

Fahey, JM, Korytowski, W., Girotti, AW, 2019. Az upstream jelátviteli események a túlélést elősegítő nitrogén-monoxid fokozott termeléséhez vezetnek fotodinamikusan kiváltott glioblasztóma sejtekben. Free Radic. Biol. Med. 137, 37–45.

Fernando, TD, Jayawardena, BM, Mathota Arachchige, YLN, 2020. Különböző metabolitok és nehézfémek változása Oryza sativa L.-ben, ismeretlen etiológiájú krónikus vesebetegséggel kapcsolatos Srí Lankán. Chemosphere 247, 125836.

Flores-Leon, M., Perez-Dominguez, M., Gonzalez-Barrios, R., Arias, C., 2019. A palmitinsav által kiváltott NAD( plus ) kimerülés a SIRT1 csökkent funkciójával és a BACE1 fokozott expressziójával jár a hippocampális neuronokban. Neurochem. Res. 44 (7), 1745–1754.

Ghosh, KNI, 2018. A kadmiummal végzett kezelés echinococcosist, DNS-károsodást, gyulladást és apoptózist vált ki az albínó Wistar patkányok szívszövetében. Environ. Toxicol. Pharmacol. 59, 43–52. gyulladás és rák. Biomedicina 6 (1), 16.

Horiguchi, H., Oguma, E., 2016. A kadmiumnak való akut expozíció hosszan tartó neutrofiliát indukál, valamint a granulocita telep-stimuláló faktor késleltetett indukcióját egerek májában. Boltív. Toxicol. 90 (12), 3005–3015.

Hossein-Khannazer, N., Azizi, G., Eslami, S., Alhassan Mohammed, H., Fayyaz, F., Hosseinzadeh, R., Usman, AB, Kamali, AN, Mohammadi, H., Jadidi-Niaragh, F., Dehghanifard, E., Noorisepehr, M., 2020. A kadmium expozíció hatása a gyulladás indukciójában. Immunopharmacol. Immunotoxikol. 42. (1), 1–8.