Absztrakt:Jelen tanulmány fő célja, hogy differenciálanalízissel megbecsülje a Fusarium oxysporum-ra érzékeny vagy rezisztens három datolyapálmafajta alkoholos kivonatának összes fenoltartalmának különböző biológiai aktivitásait. sp Albidinis. Itt a Taabdount (TAAR) rezisztens fajtában antioxidáns és bioaktív képességű sztilbén termékek kerültek kimutatásra. Továbbá a TAAR-rezisztens datolyapálma fajta metanolos frakciója jelentős, LCMS/MS és 1H,13C NMR mérésekkel meghatározott terméket tartalmaz, amely a hidroxi-stilbének családjába tartozik, amely antioxidáns kapacitással rendelkezik, gátolja a gomba tirozináz aktivitását és aktiválja. és védő hatást fejt ki a hipoklorit által kiváltott károsodásra a humán dermális fibroblaszt öregedő sejtek 20S proteaszómájában. Összességében a jelen eredmények azt mutatják, hogy a rezisztens Phoenix dactylifera L.-ben jelenlévő hidroxitoluolt tanulmányozni kell, hogy megértsük, hogyan fejtheti ki a sztilbén öregedésgátló képességét.

A cisztanche glikozidja növelheti az SOD aktivitását a szív- és májszövetekben, és jelentősen csökkentheti az egyes szövetek lipofuscin- és MDA-tartalmát, hatékonyan megkötve a különböző reaktív oxigéngyököket (OH-, H2O₂ stb.) és megvédheti az okozott DNS-károsodást. OH-gyökök által. A Cistanche feniletanoid glikozidok erős szabad gyökfogó képességgel rendelkeznek, nagyobb redukáló képességgel rendelkeznek, mint a C-vitamin, javítják a SOD aktivitását a spermiumszuszpenzióban, csökkentik az MDA-tartalmat, és bizonyos védő hatást fejtenek ki a spermium membrán működésére. A cistanche poliszacharidok fokozhatják a SOD és a GSH-Px aktivitását a D-galaktóz által okozott kísérletileg öregedő egerek eritrocitáiban és tüdőszöveteiben, valamint csökkenthetik a tüdő és a plazma MDA- és kollagéntartalmát, valamint növelhetik az elasztintartalmat. jó eltávolító hatás a DPPH-ra, meghosszabbítja a hipoxia idejét öregedő egerekben, javítja a SOD aktivitását a szérumban, és késlelteti a tüdő fiziológiás degenerációját kísérletileg öregedő egerekben A sejtmorfológiai degenerációval a kísérletek kimutatták, hogy a Cistanche jó antioxidáns képességgel rendelkezik és potenciálisan gyógyszer lehet a bőröregedési betegségek megelőzésére és kezelésére. Ugyanakkor a Cistanche-ban található echinakozid jelentős mértékben képes megkötni a DPPH szabad gyököket, és képes megkötni a reaktív oxigénfajtákat, és megakadályozza a szabad gyökök által kiváltott kollagén lebomlását, valamint jó helyreállító hatással van a timin szabad gyökök anionjainak károsodására.

Kattintson a rou cong rong előnyeire

【További információ:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Kulcsszavak:Phoenix dactylifera L.; Fusarium oxysporum. sp Albidinis (FoA); antioxidáns aktivitások; anti-tirozináz aktivitás; proteaszóma aktiválás; LC-MS/MS analízis; sztilbén származékok

1. Bemutatkozás

A datolyapálma (Phoenix dactylifera L.) az Arecaceae családból származó évelő egyszikű. Ez a fa rendkívül fontos a dél- és délkelet-marokkói szaharai lakosság életében, mind gazdasági, mind társadalmi szempontból. Bayoud-betegség, amelyet a Fusarium oxysporum f. talajgomba okoz. sp Albidinis (FoA) [1], jelentősen csökkentette a marokkói datolyapálmák termését az elmúlt években [2]. Becslések szerint a FoA eltűnt a marokkói phoenicicole örökség kétharmadából, de továbbra is elpusztítja a legjobb minőségű kereskedelmi datolyapálma fajták 4,5–12 százalékát [2]. Sok erőfeszítést tettek e betegség leküzdésére és néhány datolyapálma védekező mechanizmusának kifejtésére [3]. A datolyapálma lehetséges védekezési mechanizmusaival foglalkozó első tanulmányok rávilágítottak a fenolos vegyületek és az antioxidáns kapacitás szerepére a FoA toleranciában [4,5]. A rezisztens és érzékeny gyökérfenolvegyület-fajták biokémiai elemzése volt az első olyan biokémiai vizsgálat, amely feltárta a datolyapálma védekező mechanizmusainak előnyeit. Valójában az irodalom azt jelzi, hogy a rezisztens gyökerű fajták gazdagabbak a 5-kaffeoil-sikiminsavban és annak helyzeti izomereiben, mint az érzékeny gyökerű fajták [5]. Ezek a vegyületek hatékonyan mutattak potenciális gombaellenes hatást in vitro FoA ellen [6].

A természetes antioxidánsok szabad gyökök megkötő képessége növeli népszerűségüket az élelmiszer- és orvosi tanulmányokban [7–10].

Például a reaktív oxigénfajták súlyosbító tényezők a sejtkárosodásban és az öregedési folyamatokban [11], és így számos betegséghez kapcsolódnak. Ennek eredményeként az antioxidáns molekulák segíthetik az emberi egészséget azáltal, hogy megelőzik a degeneratív betegségeket és lassítják az öregedés következményeit [12]. Ebben a tanulmányban arra vagyunk kíváncsiak, hogy az antioxidánsok képesek-e elősegíteni a 20S-proteaszóma aktiválódását és megvédeni azt oxidatív károsodásától. A proteaszóma valóban hozzájárul a sejt homeosztázisának fenntartásához azáltal, hogy lehetővé teszi a sejtben a sérült fehérjék kiürülését és a rövid élettartamú fehérjék kontrollált elpusztítását [13]. Ezért a proteaszóma antioxidánsokkal történő aktiválása új öregedésgátló stratégiának bizonyulhat [14]. Ezen túlmenően ez a munka feltárja a FoA-val szemben rezisztens gyökerek fenoltartalmának potenciálját, mint aktív biológiai vegyületet.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Növényminta

A vizsgálatot minden egyes mintára 1 0 kifejlett datolyapálmafajtából (Phoenix dactylifera L.) származó anyaggal végezték, amelyeket a délkelet-marokkói Palmaria Figuig területén található szennyezett vagy nem szennyezett parcellákon termesztettek. A fő gyökerek (beleértve a levegőt lélegző gyökereiket is) 0,5-2 cm átmérőjűek a fogékony fajtáknál, mint például a charas Bouffegous fertőzött (BI) vagy a nem fertőzöttek (BNI). Ezenkívül begyűjtöttük a Taabdount (TAAR) FoA-rezisztens fajtáját, és két gyógynövény levelét lokálisan alkalmaztuk a FoA elleni profilaktikus kezelésre. Ezenkívül a rozmaringot (R, Rosmarinus officinalis) és a gránátalmát (G, Punica granatum L.) [15] is gyűjtöttük ugyanabban a szennyeződésmentes parcellában, és ezeket elemeztük és kontrollként alkalmaztuk. A mintákat az év két szakaszában, szeptemberben és január végén (2013 és 2015 között) vettük, és szobahőmérsékleten hermetikusan tároltuk. Mivel a mintákat egy tenyérről szerezték be, a marokkói mezőgazdasági miniszter megfelelően hitelesítette (azonosítás és osztályozás) [16].

2.2. A kivonatok elkészítése

Alapos vízzel történő mosás után a gyökereket vagy a leveleket árnyékban szárították, majd turmixgépben őrölték. Mindegyik mintánál (BI, BNI, TAAR, R és G) 10 ml metanolt adtunk 1 g száraz anyaghoz, majd 4 órán át szobahőmérsékleten kevertük. Ezután szűrjük és 37 ◦C-on rotációs gőzzel bepároljuk. A száraz extraktumot 10 mg/ml vagy 50 mg/ml végkoncentrációjú metanolos oldatba helyeztük (később a biológiai aktivitások in vitro vizsgálatára használták). Minden mintánál három független extrakciót végeztünk a biológiai aktivitási vizsgálatokhoz.

2.3. Biológiai tevékenységek

2.3.1. Fenoltartalom és antioxidáns aktivitások

A Nacoulma és munkatársai által felvázolt eljárás. Ezt alkalmazták az egyes kivonatok összes fenoltartalmának és összes flavonoid tartalmának értékelésére [17], a térfogatok végső adaptációjával 200 µl-nél, hogy mikrolemez-leolvasón használjuk. Az abszorbanciát 760 nm-en, illetve 510 nm-en metanolos vakpróbához viszonyítva határoztuk meg. A galluszsav (0–300 mg/L) (y=0,0083x plusz 0,9106, r2=0,978) és a kvercetin (0–100 mg/L) (y {{14) standard kalibrációs görbéi }}.0008x plusz 0,0597, r2=0.994), ill.

Az 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil szabadgyök felhasználásával antioxidáns befogó aktivitást (DPPH) vizsgáltunk. A térfogatok 300 µl-es, illetve 275 µl-es végső adaptációját használva mikrolemez-leolvasó alkalmazásához a kivonatok vascsökkentő képességét (III) értékeltük Nacoulma és mtsai. [17]. A metanolos vakpróbához képest az abszorbanciát 517 nm-en, illetve 700 nm-en mértük. Ezután a következő egyenlet segítségével megbecsültük az egyes oldatok szabadgyökfogó aktivitását a gátlás százalékában:

Standard kalibrációs görbét kaptunk az aszkorbinsav ({{0}}–100 mg/L) antioxidáns standard felhasználásával (y=0,0014x plusz 0,0875, r2=0,998).

2.3.2. FoAMyc hélium növekedést gátló vizsgálat

Kis módosítással a Neri et al. [18] segítségével meghatározták, hogy a tiszta vegyszerek milyen mértékben gátolják a FoA micélium növekedését. Egy 7-napos FoA tenyészetben öt milliméteres micéliumkorongokat helyeztek Petri-csészékre, PDA táptalajjal, amelyet a fent felsorolt ​​tiszta vegyszerekkel egészítettek ki 50, 75 és 100 µg/ml koncentrációban. A lemezeket 5 napig inkubáltuk 28 °C-on. A telep két derékszögben mért átlagos átmérőjét használtuk a FoA micélium növekedési gátlásának értékelésére. Mindegyik kezelés három tesztből állt, három különböző FoA-törzzsel: FoA 41818, FoA 41814 (BCCM, Belgium) és FoA Local (Palemeraie of Figuig, Marokkó), valamint egy negatív kontrollból, amelyet nem adtak hozzá.

2.3.3. A sejtek életképessége és a 20S proteaszóma aktivitása

Egy {{0}}éves férfitól (NHDF) (Promocell, Heidelberg, Németország) származó normál humán dermális fibroblasztokat használtak, amelyek során a sejteket 100,{{3 sűrűségben helyezték el. }} sejt/ml RPMI-ben, 10% 10% (w/v) FBS-sel, 1% (w/v) L-glutaminnal, 100 egység/ml penicillinnel és 100 µg/ml sztreptomicinnel. Fehér vagy átlátszó 96-microwell lemezeken tartották őket 24 órán át 37 ◦C-on inkubátorban, 5 százalékos CO2-tartalmú párásított környezetben. A proteaszóma aktivitási vizsgálathoz, valamint a hipoklorit által kiváltott károsodásra gyakorolt ​​​​védő hatás értékeléséhez a sejteket tesztanyagokkal kezeltük (5-50 µg/ml tiszta vegyület, pozitív kontroll 0,5 és/vagy 1 µM, és metanolos növényi kivonatok 15-50 µg/mL) 24 órán keresztül maximum 0,3 százalék DMSO-val a végkoncentrációban, egyidejűleg, változtatás nélkül a negatív kontroll tekintetében. A TAAR kivonat vagy a tiszta vegyületek proteaszómaaktivitásra gyakorolt ​​védőhatásának vizsgálata azt jelentette, hogy a fibroblaszt sejteket később 35 percig 50 µM OCl− hatásnak vetették alá (optimálisnak választották, sejttoxicitás nélkül, a 20S proteaszóma állapot oxidáns-inhibitoraként) [19]. A következő kísérleti szakaszokat a beszállító módszertanával (Proteasome-Glo Chymotrypsin-Like Cell-Based Assay, Promega Corporation, USA) fejezték be: Először egy párhuzamos sejtéletképességi kísérlet kristályibolya kolorimetriás vagy MTT vizsgálatokkal, amelyeket teljesen hasonló körülmények között végeztek. Ezt a sejt-biolumineszcencia vizsgálat normalizálására használták. Megjelennek a standard eltérések és az átlagos fluoreszcencia két különálló vizsgálat három párhuzamos mintájában (n=6). Minden mérést és független kísérletet (n=2) kétszer végeztünk.

2.3.4. A sejtmentes gomba tirozináz gátló hatása

Az enzimaktivitásra gyakorolt ​​hatás vizsgálatára a tesztanyagokat (tiszta antioxidánsok vagy metanolos növényi kivonatok) enzimekkel előinkubáltuk foszfátpufferben szobahőmérsékleten. Dióhéjban: 300 ml 5 mM L-DOPA-oldatot 50 mM foszfátpufferrel (pH 6,5) különböző koncentrációjú vizsgálati anyagokkal vagy anélkül hozzáadtunk egy 96-üreges mikrolemez 100 ml gomba-tirozináz vizes oldatával (20 egység) együtt. 40 percig a vizsgálati keveréket 25 °C-on inkubáltuk. Inkubálás után a reakcióelegy dopakróm termelési szintjét spektrofotometriásan mértük 492 nm-en [20]. Egy standard kalibrációs görbét ábrázoltunk galluszsav (0–1000 µg/ml) felhasználásával (y=−0,087 × plusz 0,45; r2=0,97). Minden független mérést és kísérletet (n=2) kétszer végeztünk.

2.4. Elemzések, izolálás és szerkezetfeltárási eljárások

Az őrölt gyökeret (20 g) 200 ml metanollal extraháltuk, 24 órán át szobahőmérsékleten kevertük, szűrtük, 10, 000× g-vel centrifugáltuk 15 percig, majd 35 ◦C-on rotációs készülék segítségével bepároltuk. vákuum párologtató berendezés. A nyers extraktumot 20 ml desztillált vízzel hígítottuk, 2 x 20 ml etil-acetáttal újra extraháltuk, majd rotációs vákuumbepárló rendszerrel 35 °C-on bepároltuk. A fő terméket preparatív HPLC-vel tisztítottuk Waters C18 oszlopon (SymmetryPrep 150 × 19 mm, 7 µm részecskeméret), a fent használt LC gradiens körülmények között és 5 ml/perc áramlási sebességgel. A csúcs szobahőmérsékleten 38,8 és 40,8 perc között volt, az összegyűjtés 39,2 és 40,2 perc között volt; a teljes térfogatú gyűjteményt liofilizáljuk, így 27 mg vegyületet kapunk. MS és NMR 1H és 13C ezután azonosította.

Az elemzéseket gyorsfelbontású LC 1200 sorozatú rendszerrel végeztük, 320 nm-es UV-spektrumok monitorozására használt diódasoros detektor (DAD) segítségével (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). A vegyület elválasztását Beckman C18 oszlopon (ULTRASPHERE 250 mm × 4,6 mm, 5 µm részecskeméret) végeztük, 10 mM ammónium-acetát/0,2 % hangyasav vízben (v/v), pH 2,9 ({{) 47 perces gradiensével. 13}}A oldószer) és 30:70 arányú acetonitril/metanol keverék (=B oldószer). Az áramlási sebesség 0,8 ml/perc volt, és a B oldószer mennyiségét 5-ről 35%-ra emeltük 45 perc alatt, majd 2 percig újra egyensúlyba hoztuk. A DAD-vel végzett sorozatban egy ESI-QTOF 6520 sorozatot (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) használtak a nagy felbontású MS és a célzott tandem MS (MS/MS) elemzésekhez. A spektrumokat negatív és nagy felbontású (4 GHz) felvételi módban vettük fel.

Az1H-NMR- és 13C-NMR-spektrumokat Bruker Avance 300 spektrométeren vettük fel 300 MHz-en. A szabad indukciós bomlásokat a MestreLab Research SL MestreNova 5.3.2 NMR-készletével dolgoztuk fel.

2.5. Statisztikai analízis

Minden független kísérletet három párhuzamosban végeztünk. Az összes adatot átlagértékként ± SD-ként adtuk meg. A GraphPad Prism program 6-os verzióját használva az eredményeket a nem paraméteres Kruskal–Wallis teszttel, valamint Dunn többszörös összehasonlító tesztjével elemeztük. A 0,05 és alacsonyabb p-értékek szignifikánsnak minősülnek.

3. Eredmények és megbeszélés

3.1. A metanolos kivonatok összes fenolos és flavonoid tartalma

Redox tulajdonságaik miatt a növényi fenolos vegyületekről azt találták, hogy számos biológiai hatást fejtenek ki, beleértve az antioxidáns hatást is [21]. Az 1. táblázat mutatja a metanolos gyökérkivonatok teljes fenoltartalmát (500 µg/ml) a Bouffegous-fertőzött (BI) és a nem fertőzött (BNI) ghagra fogékony fajtáinál, vagy rezisztens mint Taabdount (TAAR). Koncentrációjuk 171 ± 14 és 253 ± 47 mg galluszsav ekv./g között változott. A legtöbb ilyen vegyületet a BNI fajtában, míg a legalacsonyabb koncentrációt a BI metanolos gyökérkivonatában találtuk. A flavonoidok száma ugyanezekben a kivonatokban (1. táblázat)) 240 ± 25 és 406 ± 66 mg kvercetin ekv./g között változott, és ismét a BNI fajtának tulajdonítható a legnagyobb mennyiség. A nem fertőzött (BNI) és a fertőzött (BI) vagy rezisztens (TAAR) fajták között az összes polifenol és flavonoid mennyiségének körülbelül 1/3-a veszít az FoA-val szemben. Emiatt érdemes megvizsgálni, hogy a növény antioxidáns kapacitása szempontjából kritikusnak tartott vegyületek elvesztése hogyan befolyásolhatja az általunk érdekelt biológiai aktivitásokat.

3.2. A metanolos kivonatok antioxidáns potenciálja

A DPPH gyökfogó aktivitása egy széles körben alkalmazott módszer a növényi kivonatok antioxidáns aktivitásának szűrésére [22]. Ez a teszt meghatározza, hogy a kivonatokban található antioxidáns vegyszerek képesek-e megkötni a stabil gyökfajtát, a DPPH-t. A kísérleti adatok (1. ábra) azt mutatják, hogy az összes metanolos kivonat (100 vagy 500 µg/ml koncentrációban) valószínűleg a szabad gyökök megkötő hatását fejti ki a TAAR gyökerekben megfigyelhető legmagasabb DPPH-megkötő aktivitással (87,0). százalékos DPPH-gátlás). Úgy tűnik, hogy az antioxidáns hatás nem függ a polifenol- vagy flavonoidvegyületek teljes mennyiségétől. A TAAR gyökér metanolos kivonatainak jobb aktivitása azonban annak köszönhető, hogy a kivonat több hidrogént adományozó komponenst tartalmaz.

A redukálóképességet a metanolos kivonat azon képessége alapján értékeljük, hogy a Fe(III)-t Fe(II)-vé alakítja. Ez a Fe(III) redukáló képesség a fenolos vegyületekben jelenlévő hidroxilcsoportok számának és helyzetének, valamint hidrogén-donor képességüknek tulajdonítható [23]. A 2. táblázat a növénymintáink metanolos kivonatainak redukáló aktivitását mutatja a standard aszkorbinsavhoz képest. A TAAR gyökér metanolos kivonata magas redukciót tartalmaz (95 ± 1 mg aszkorbinsav ekv./g), míg a legalacsonyabb tartalmat a BNI gyökérkivonat (27 ± 2 mg aszkorbinsav ekv./g) kapta.

A kapott eredmények korrelációja érdekében regressziós elemzést végeztünk (korrelációs együttható (R)). Szignifikáns lineáris korrelációt találtunk a teljes fenol- és flavonoidtartalom között (R {0}}.849, p < 0.05), valamint a DPPH és a redukáló teljesítmény vizsgálata között (R=0). 816, p < 0,05), de a metanolos kivonatok fenolos vagy flavonoid tartalma és antioxidáns aktivitása között nem volt eltérés. Végül, az összes metanolos kivonat jelentős antioxidáns aktivitást mutatott a DPPH gyökfogó aktivitásával és redukáló erejével szemben, de úgy tűnik, hogy ezek az antioxidáns aktivitások nincsenek összefüggésben a teljes fenol- vagy flavonoidtartalommal. Ezért ezek az eredmények azt sugallják, hogy a vizsgált növényi kivonatok antioxidáns aktivitásáért nagy valószínűséggel egy bizonyos típusú vegyszer felelős, nem pedig a különféle kivonatainkban található fenolos vagy flavonoid vegyületek mennyisége. Néhány korábban leírt fenolos komponens, amelyek nagy aktivitású egyedek, szintén befolyásolhatják a növényi kivonatok antioxidáns hatását: koncentrációjuktól függetlenül az érlelt vörösborban található fenolos vegyületek szerkezeti vonatkozásaikhoz kapcsolódóan különféle radikális tulajdonságokat mutathatnak [ 24].

A TAAR FoA-rezisztens fajta mutatja a legmagasabb antioxidáns aktivitást a különböző datolyapálmafajták közül. A szakirodalom alapján a rezisztencia kialakulása ezekben a datolyapálmákban a koffeoil-szikiminsav különböző helyzeti izomereinek mennyiségének növekedésével magyarázható [5].

3.3. Gomba tirozináz aktivitás

A gomba tirozináz difenoláz aktivitása katalizálja két dopakinon-származék oxidációját, ami melaninszintézishez vezet. A 3. táblázatban bemutatott eredmények azt mutatják, hogy a TAAR, BI és BNI metanolos kivonataiban jelen lévő vegyületek a gomba tirozináz aktivitásának gátlásán keresztül megzavarják az l-DOPA hidroxilezését. Továbbá ezek az eredmények azt mutatják, hogy a TAAR metanolos kivonata statisztikailag aktívabb a gomba tirozináz aktivitására, mint a BI (p < 0.05) és BNI (p < 0,05) kivonata. Tehát úgy tűnik, hogy a pálmadatolyagyökér-kivonatok tirozináz aktivitást gátló képessége ugyanazt a tendenciát követi, mint az antioxidáns képességek esetében.

A tirozinázok elsősorban a bőr, a szem és a haj pigmentációjához kapcsolódnak. Valójában a tirozinázok melanogenezis enzimek, amelyek részt vesznek a melanin bioszintézisének első lépéseiben, és a melanin az ultraibolya (UV), a nap- vagy gammasugárzás elleni védelemmel, a csökkent sejtérzékenységgel és a sejtfal hidrolitikus enzimekkel szembeni rezisztenciájával kapcsolatos [20]. Ezzel szemben a melanin túltermelése szerepet játszhat a bőr anomáliáiban vagy olyan súlyosabb betegségekben, mint a rák (pl. melanoma), a dopakinon felesleg pedig neurodegeneratív betegségekhez (pl. Parkinson-kór) vezethet [20,25]. Ezenkívül a melanogenezisről beszámoltak arról, hogy hidrogén-peroxidot és más ROS-t termel, ami az emberi melanocitákat magas szintű oxidatív stressznek teszi ki [26]. Számos, növényekből nyert természetes antioxidáns vegyület (fenolok, flavonoidok és mások) gátolta a tirozináz fenoláz aktivitását [27,28]. Itt úgy tűnik, hogy a TAAR kivonat olyan vegyület(eke)t tartalmaz, amelyek érzékenyek a bőr öregedésének és a melanogenezis gátlására.

3.4. A metanolos gyökérpálma kivonatok proteaszóma aktivitása

Beszámoltak arról, hogy a 20S proteaszóma emelkedett szintje az oxidatív stresszel szembeni fokozott toleranciához vezet [13]. Ezért a proteaszóma aktivitás szabályozását a BI, BNI és TAAR fajták gyökérkivonataival vizsgáltuk. A mért 20S proteaszóma aktivitás összefügg a kimotripszin-szerű (CT-L) aktivitással NHDF-korú sejtekben (lásd Anyagok és módszerek). A 2A. ábrán látható módon, a 24 órán keresztül 50 µg/ml metanolos kivonattal kezelt sejtek a BI- és TAAR-kivonatok CT-L-jének szignifikáns aktiválását és a BNI-gátlást mutatták anélkül, hogy a sejttoxicitás több mint 30 százalékát generálták volna. A TAAR gyökérkivonat vonzó proteaszóma aktivációt mutatott az 1 µM liponsavhoz (Ct plusz) képest (212%, illetve 248%). A proteaszóma egy hengeres proteináz komplex, amely négy egymásra halmozott gyűrűből álló magot tartalmaz, amelyek felelősek a rendellenesen lebomlott (26S) proteaszómák és az oxidatívan (20S proteolitikus magkomplex) sérült fehérjék eltávolításáért (Ciechanover, 1998). Amint azt Hwang munkája [29] bemutatja, a proteaszóma diszfunkció hozzájárulhat az emberi bőr öregedéséhez. Valójában az öregedő és replikatív öregedő sejtekről kimutatták, hogy csökkent a proteaszóma aktivitással, valamint a proteaszóma alegységeinek fehérjeszintjével. Az a tény, hogy mind az oxidált, mind a sérült sejtfehérjék gyakrabban halmozódnak fel ezekben a sejtekben, arra utal, hogy a fehérje lebomlásának ubiquitin-proteaszóma útvonala szerepet játszik a belső öregedési folyamatokban. A 2B. és C. ábra a TAAR metanolos kivonat azon képességét mutatja, hogy megvédi az NHDF-korú sejteket a 20S proteaszóma aktivitásának OCl-oxidáns általi gátlásától. Valójában az OCl-oxidáns 50 százalékban gátolja a kontrollsejtek proteaszóma aktivitását (Ct), míg a legmagasabb 20S-proteaszóma aktivátor (liponsav 1 µM-nál, Ct plusz) több mint 50 százalékos gátlási aktivitással nem fordítja meg a gátlást. A 20S proteaszóma aktivitását az OCl− okozza, míg a TAAR metanolos kivonat összes többi vizsgált koncentrációja (15, 50 és 75 µg/ml) megfordítja ezt a gátlást (a gátlás 0-19 százaléka). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a TAAR gyökérkivonatok olyan molekulákat tartalmazhatnak, amelyek nemcsak a proteaszóma aktivitásának fokozásával, hanem az oxidálószerek gátló hatásának ellensúlyozásával is késleltethetik a bőr öregedését. Ezen molekulák közül a legvalószínűbb a koffeoil-szikiminsav, valamint más vegyületek. Ezenkívül LC-DAD-MS (MS) és NMR analíziseket végeztek a kivonatok főbb vegyületeinek azonosítására, és ezeket a következő részben tárgyaljuk.

3.5. Spektrometriai elemzések

3.5.1. Metanolos kivonatok LC-DAD-MS elemzése

A datolyapálma gyökereinek összehasonlító vizsgálata nem tárt fel minőségi különbségeket, ehelyett bizonyos mértékig szemi-kvantitatív különbségeket (DAD és MS kromatogramokban) észleltek a fajták között (3A, D ábra). Valójában a jelen eredmények nem teszik lehetővé a kapcsolatot a datolyapálmák rezisztenciája és a koffeoil-szikiminsav különböző helyzeti izomerjei mennyiségének növekedése között, mivel a rezisztens fajta (TAAR) mutatja a legalacsonyabb relatív mennyiséget ezekből a vegyületekből (3C. ábra). A koffeoil-szikiminsav mindhárom helyzeti izomerjét (m/z=335.0768 1,2 ppm hibával) MS/MS spektrumaik alapján azonosítottuk (S6. ábra) egy m/z-nél lévő fragmenssel. 179,0340, amely egy kávésav A fragmensének (C9H7O4) és egy 135,0443 m/z-nél lévő fragmensnek felel meg, amely a kávésav (C8H7O2) dekarboxilezésének felel meg. Mindazonáltal egy másik vegyület, amely nem felel meg a koffeoil-szikiminsavnak (3C. ábra), és amelynek retenciós ideje 29 perc m/z=259.0607 (vagy 373.0543 TFA-addukt esetén), egyértelműen megkülönböztethető a különböző fajták között. (3D. ábra). Ennek a vegyületnek az érzékeny és rezisztens fajták gyökereiben való felhalmozódásában mutatkozó különbség (0,135 százalék), 1:35 körüli arányban (m/z=259.06, MS adatok) magyarázhatja a kiemelkedő biológiai a gyökér metanolos kivonatánál megfigyelt aktivitások.

【További információ:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】