Az orális hipoxia-indukálható faktor, a prolil-hidroxiláz-inhibitor, az enarodustat ellensúlyozza a veseenergia-anyagcsere változásait a cukorbeteg vesebetegség korai szakaszában

Kapcsolatfelvétel: emily.li@wecistanche.com

Bevezetés

Nefrológiai és endokrinológiai részleg, University of Tokyo Graduate School of Medicine, Tokió, Japán; Kutatási ösztöndíj Fiatal Tudósok számára, Japan Society for the Promotion of Science, Tokió, Japán; Biológiai és Farmakológiai Kutatólaboratóriumok,

Central Pharmaceutical Research Institute, Japan Tobacco Inc., Takatsuki, Japán; A Tokiói Egyetem Rendszerfarmakológiai Tanszéke Graduate School of Medicine, Tokió, Japán; Laboratory for Synthetic Biology, RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research, Suita, Japán; és a WPI Nemzetközi Neurointelligenciakutató Központ, a University of Tokyo Institutes for Advanced Study (UTIAS), a Tokiói Egyetem, Tokió, Japán.

A hipoxia-indukálható faktor (HIF) prolil-hidroxiláz gátlók, más néven HIF stabilizátorok, fokozzák az endogén eritropoetin termelést, és új terápiás szerekként szolgálnak a vérszegénység ellen.krónikusvesebetegség. A HIF különböző, az energia-anyagcserével kapcsolatos gének expresszióját indukálja a hipoxiára adott adaptív válaszként. Továbbra is homályos azonban, hogy a HIF stabilizálása által a belső szövetek metabolikus átprogramozása hogyan befolyásolja a patofiziológiát.vese betegségek. Korábbi tanulmányok azt sugallják, hogy a szisztémás anyagcsere-rendellenességek, mint például a hiperglikémia és a diszlipidémia a vese metabolizmusának megváltozását okozzák, ami veseműködési zavarokhoz vezet, beleértve a diabéteszes vesebetegséget is. Itt elemezzük az enarodustat (JTZ-951), egy orális HIF-stabilizátor hatását a veseenergia-anyagcserére a diabéteszes vesebetegség korai stádiumában, streptozotocinnal kiváltott cukorbeteg patkányokon és alloxánnal kiváltott cukorbeteg egereken. A transzkriptom analízis kimutatta, hogy az enarodustat ellentétes a diabéteszes vese metabolizmusában bekövetkezett változásokkal. A transzkriptomanalízis azt mutatta, hogy a zsírsav- és aminosav-anyagcserét a cukorbeteg veseszövetben felfelé, az enarodustat pedig lefelé szabályozta, míg a glükóz metabolizmust felfelé szabályozta. Ezeket a szimmetrikus változásokat a metabolomanalízis igazolta. Míg a glikolízis és a trikarbonsavciklus metabolitjai felhalmozódtak és az aminosavak csökkentek a cukorbeteg állatok veseszövetében, ezeket az anyagcserezavarokat az enarodustat enyhítette. Ezenkívül az enarodustatin növelte a glutation-glutation-diszulfid arányt, és enyhítette az oxidatív stresszt a cukorbeteg állatok veseszövetében. Így a HIF stabilizálása ellensúlyozza a veseenergia-metabolizmus kezdeti szakaszában bekövetkező változásaitcukorbetegvesebetegség.

A Cistanche nagyon jót tesz a veseműködésnek

Fordítási nyilatkozat

A Hypoxia-indukálható faktor (HIF) prolil-hidroxiláz gátlók (más néven HIF stabilizátorok) fokozzák az endogén eritropoetin termelést, és új terápiás szerekként szolgálnak a vérszegénység ellen.krónikusvesebetegség. Patkány- és egérdiabéteszes modellekben a veseszövet transzkriptom- és metabolomelemzése kimutatta, hogy az enarodustat (JTZ{0}}), egy orális HIF-stabilizátor, ellensúlyozza a vese energiametabolizmusának változásait a diabéteszes vesebetegség korai stádiumában. Az eredmények fontos adatokkal szolgálnak a HIF-stabilizátorok veseenergia-anyagcserére gyakorolt ​​hatásának extrapolálásához klinikai körülmények között, bár további vizsgálatokra van szükség annak tisztázására, hogy ez a vese-metabolizmus HIF-stabilizátorok általi átprogramozása hogyan befolyásolja acukorbetegvesebetegség.

Bemutatkozás

A hipoxia-indukálható faktor (HIF) prolil-hidroxiláz inhibitorai fokozzák az endogén eritropoetin termelést, és új terápiás szerekként szolgálnak a krónikus vérszegénység ellen.vesebetegség. A sejtek védekező mechanizmussal rendelkeznek a hipoxia ellen, és a HIF ennek a védelemnek a fő szabályozója. A vesék fiziológiailag ki vannak téve a hipoxiának, és a krónikus hypoxia a végső stádiumú vesebetegséghez vezető végső közös út. Tekintettel arra, hogy a HIF különböző, a hipoxia válaszokkal kapcsolatos gének expresszióját indukálja, a HIF stabilizátorok pleiotróp hatást gyakorolhatnak avesebetegségekvalamint a vérszegénység javulása krónikusvesebetegség. Érdekes módon a HIF indukálja a glikolitikus gének és a piruvát-dehidrogenáz kináz expresszióját, ami gátolja a piruvát-dehidrogenázt abban, hogy piruvátot használjon a mitokondriális trikarbonsav (TCA) ciklus táplálására.6,7 Ez a metabolikus átprogramozás a TCA-ciklusról a glikolízisre visszaszorítja az oxigénfogyasztást, és kritikus jelentőségű. hipoxiás környezetnek kitett sejtek adaptációjához. Azonban továbbra is homályos, hogy a veseszövet HIF-stabilizációval történő metabolikus átprogramozása hogyan befolyásolja a vese patofiziológiáját.vese betegségek. A diabéteszes vesebetegség (DKD) a végstádiumú vesebetegség fő oka. A szisztémás anyagcsere-rendellenességek, például a hiperglikémia és a diszlipidémia a vese metabolizmusának megváltozását okozzák, ami veseműködési zavarokhoz vezet, beleértve a DKD-t is. Korábbi tanulmányok megnövekedett metabolikus fluxust és a glükóz- és TCA-ciklus metabolitjainak felhalmozódását mutatták ki a diabéteszes vesekéreg szövetében, ami összefüggésben állhat a mitokondriális diszfunkcióval és a DKD progressziójával. Feltételeztük, hogy a HIF stabilizátorok megfordíthatják a diabéteszes vesekéreg szövetének metabolikus változásait, figyelembe véve, hogy a HIF, mint a hipoxiára adott adaptív válasz, csökkenti a sejtekben az anyagcsere-fluxust az oxigénfogyasztás visszaszorítása érdekében. Így transzkriptom- és metabolomaelemzések felhasználásával koncepcionális vizsgálatot végeztünk annak átfogó megértésére, hogy az enarodustat (JTZ-951), egy orális HIF-stabilizátor, hogyan befolyásolja a DKD korai szakaszában fellépő vese-metabolizmus-változásokat.

EREDMÉNYEK: Az Enarodustat metabolikus átprogramozást indukál a TCA ciklusról glikolízisre a vese proximális tubulus sejtjeiben

Mivel a vesekéreg főként proximális tubulusokból áll, először in vitro vizsgáltuk az enarodustat hatását a vese proximális tubulussejtek metabolikus fluxusára. Először a Mito Stressz Tesztet (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA) és a Glycolytic Rate Assay-t (Agilent) végezték el tenyésztett HK{0}} sejtekben, amely egy humán proximális tubulus epiteliális sejtvonal (1a. ábra). Az Enarodustat jelentősen csökkentette a mitokondriális légzést (TCA ciklus) és növelte a bazális glikolízist, jelezve a metabolikus átprogramozást a TCA ciklusról a glikolízisre (1. ábra; S1 kiegészítő ábra). Kísérletet is végeztünk kis interferáló RNS-sel (siRNS) a HIF-1-hoz (2. ábra; S2 kiegészítő ábra). A HIF-1 siRNS általi leütése megfordította az enarodustat által kiváltott metabolikus változásokat (alaplégzés, maximális légzés, tartalék légzési kapacitás és adenozin-trifoszfát [ATP] termelés), ami azt mutatta, hogy az anyagcsere-átprogramozás főként a HIF-en keresztül történt-1 stabilizálás (2. ábra; S2 kiegészítő ábra). A piruvát-dehidrogenáz aktivitást, amely fontos tényező a sejtek piruvát felhasználásában a TCA-ciklus táplálására, szintén csökkentette az enarodustat (2f ábra), ami kompatibilis a korábban publikált megfigyelésekkel.

Streptozotocinnal indukált cukorbeteg patkányok háttéradatai

Az in vitro kísérletek eredményeiből feltételeztük, hogy a HIF stabilizátorok enyhíthetik a diabéteszes vesekéreg szövetének metabolikus változásait a TCA ciklusról glikolízisre való átprogramozás révén. Először a streptozotocin (STZ) által indukált cukorbeteg patkányokat választottuk modellként a koncepció bizonyítására irányuló kísérlethez, hogy teszteljük a fent említett hipotézist. Ebben a modellben a cukorbetegség gyorsan indukálódik, ami lehetővé teszi, hogy rövid időn belül megfigyeljük a cukorbetegség és a HIF stabilizátorok nettó hatását a veseszövet energiaanyagcseréjére. A vizsgálati protokoll és az STZ-indukált diabéteszes patkányokon végzett kísérletek alapadatai a 3a. ábrán láthatók. A patkányokat 3 csoportra osztottuk: A csoportra (ál), B csoportra (DKD) és C csoportra (DKD þ enarodustat). A vérplazma glükóz, glikozilált hemoglobin HbA1c, triglicerid és összkoleszterin szintje a 14. napon szignifikánsan megemelkedett a cukorbeteg csoportokban az A csoporthoz képest, míg a B és C csoportok között nem volt szignifikáns különbség (3d–g ábra). Bár a plazma kreatinin szintje nem különbözött a csoportok között, a vizelet albumin kiválasztása szignifikánsan megnövekedett, és a glomerulomegália észlelhető volt a B csoportban az A csoporthoz képest, és az enarodustat hajlamos volt megfordítani ezeket a változásokat (4. ábra). A vér karbamid-nitrogénszintje magasabb volt a cukorbeteg csoportokban, ami a cukorbetegség miatti kiszáradást tükrözi. Összefoglalva, vizsgálatunkban STZ-vel kezelt patkányok veséje a DKD korai stádiumát képviseli. A transzkriptom és metabolom elemzéseket ezen patkányok vesekéreg szövetének felhasználásával végeztük.

A vesekéreg szövetének transzkriptom elemzése

A vesekéreg szövetének transzkriptomanalízisének eredményeit az 5. és 6. ábra mutatja. A főkomponens-analízis és a hierarchikus klaszterezési analízis azt mutatta, hogy az A, B és C csoport különböző klaszterekre különült el (5a. és b. ábra). A differenciálisan expresszált géneket │log2 fold-change (FC) │ nagyobb vagy egyenlő 0,5 és Q érték < 0,05="" értékkel="" választottuk="" ki.="" a="" génontológia="" és="" a="" kanonikus="" útvonalelemzések="" feltárták,="" hogy="" a="" zsírsav-anyagcserével="" kapcsolatos="" gének="" a="" b="" csoportban="" az="" a="" csoporthoz="" képest="" felfelé="" szabályozottak.="" ezzel="" szemben="" a="" glükóz="" metabolizmussal="" és="" a="" hipoxiás="" válaszreakcióval="" kapcsolatos="" gének,="" beleértve="" a="" hif-1="" hálózatot="" is,="" a="" c="" csoportban="" felülszabályozottak="" voltak.="" a="" b="" csoporttal="" (5c.="" és="" d.="" ábra).="" a="" transzkriptomikus="" adatok="" felhasználásával="" génkészlet-dúsítási="" analízist="" (gsea)="" is="" végeztünk="" (6.="" ábra,="" 1.="" és="" 2.="" táblázat).="" a="" zsírsav-="" és="" aminosav-anyagcsere="" génkészletei="" a="" b="" csoportban="" az="" a="" csoporthoz="" képest="" felfelé="" szabályozottak="" (6.="" ábra).="" ezzel="" szemben="" ezek="" a="" génkészletek="" leszabályozottak,="" és="" a="" glükóz="" metabolizmus="" génkészletei="" felfelé="" szabályozottak="" a="" c="" csoportban="" a="" b="" csoporthoz="" képest,="" ami="" azt="" mutatja,="" hogy="" az="" enarodustat="" megfordította="" a="" cukorbetegség="" által="" kiváltott="" metabolizmus-változásokat="" (6.="" ábra).="" ezen="" túlmenően,="" a="" tca-ciklus="" génkészletei="" a="" c="" csoportban="" a="" b="" csoporthoz="" képest="" lelassultak="" (2.="" táblázat),="" ami="" összeegyeztethető="" az="" in="" vitro="" vizsgálatunkban="" megfigyelt="" proximális="" tubulusokban="" az="" enarodustat="" által="" kiváltott="" metabolikus="" átprogramozás="" fogalmával.="" összefoglalva,="" az="" enarodustat="" a="" transzkriptomikus="" szempontból="" ellensúlyozta="" a="" diabéteszes="" vese="">

A vesekéreg szövet anyagcsere-elemzése

Megmértük 116 energiával összefüggő metabolit abszolút koncentrációját patkányok vesekéreg szövetében (n =4, minden csoportban), véletlenszerűen kiválasztottuk az egyes csoportokból (S1 kiegészítő táblázat; S3 kiegészítő ábra). Részleges legkisebb négyzetek diszkriminanciaanalízist (PLS-DA) végeztünk az osztálydiszkrimináció jelentőségének felmérésére (7. ábra). Metabolitkészlet-dúsítási analízist (MSEA) végeztünk a PLS-DA változó jelentőségű metabolitok segítségével a projekcióban (VIP) $ 1. Különbségek az aminosavak metabolizmusában, mint a glicin, szerin, metionin, aszpartát, glutamát, arginin, prolin, és b-alanint az A és B csoport között. Az aminosav-anyagcserében is különbségeket figyeltek meg a B és C csoportok között. Ezenkívül a glükóz metabolizmus folyamatai, mint például a glikolízis és a glükoneogenezis, eltérő tendenciákat mutattak a B és C csoportok között (7. ábra).

A transzkriptom és metabolom adatok megjelenítése az energia metabolikus útvonal térképén

Vizualizáltuk a transzkriptom és metabolom adatokat, hogy átfogó képet kapjunk az energia-anyagcsere-változásokról (8. ábra). Megállapították, hogy a glikolízis és a TCA ciklus metabolitjai felhalmozódtak a B csoportban az A csoporthoz képest, ami a túlzott glükóz beáramlásnak és a zsírsav-anyagcsere felpörgésének köszönhető DKD-ben. Az aminosav-koncentráció csökkent a B csoportban az A csoporthoz képest, ami az aminosav-anyagcsere fokozódását tükrözi (8a. ábra). Ezzel szemben a glikolízis metabolitok felhalmozódását az enarodustat enyhítette, a glikolízis megkönnyítése miatt. Az Enarodustat emellett visszafordította a cukorbetegség által kiváltott változásokat a TCA-ciklus metabolitjaiban és aminosavaiban (8b. ábra). Ezenkívül az enarodustat enyhítette a glutation-diszulfid (GSSG) felhalmozódását a diabéteszes veseszövetben, és így magasabb glutation/GSSG arányt mutatott, ami arra utalt, hogy az enarodustat enyhítette az oxidatív stresszt DKD-ben (8a és b ábra). Az oxidatív stressz csökkenését megerősítette a lipid-peroxidációs marker malondialdehid szintje a vesekéreg szövetében: az enarodustat megfordította a malondialdehid felhalmozódását a diabéteszes vesekéreg szövetében (S4 kiegészítő ábra). Összefoglalva, a transzkriptom és a metabolom adatok integrálása azt mutatta, hogy az enarodustat ellensúlyozza a DKD korai szakaszában fellépő veseenergia-anyagcsere-változásokat.

A szimmetrikus anyagcsere-változásokat (diabetes kontra enarodustat) egy alternatív modell igazolja

Transzkriptomanalízist végeztünk alloxánnal kiváltott cukorbeteg egereken, a cukorbetegség másik állatmodelljén, hogy megerősítsük a patkánymodellben elért eredményeinket. Az egérmodell vizsgálati protokolljait és háttéradatait a 9. ábra mutatja be. A vizelet albumin-kiválasztása szignifikánsan megnövekedett a B csoportban az A csoporthoz képest, amit az enarodustat megfordított (9d. ábra). Ezenkívül átfogó 3-dimenziós elemzést alkalmaztunk (Tiszta, akadálymentes agy/test képalkotó koktélok és számítógépes elemzés [CUBIC] – vese)16 a vese glomerulusainak megjelenítésére. A glomerulomegalia a B csoportban volt észrevehető az A csoporthoz képest, amit az enarodustat megfordított (9e. ábra). Az alloxánnal indukált diabéteszes egerek veseszövetének transzkriptomális analízise szimmetrikus anyagcsere-elváltozásokat mutatott (diabétesz vs. enarodustat), ugyanúgy, mint az STZ-indukált diabéteszes patkánymodellben (10. ábra): a zsírsav-anyagcserét a cukorbetegség fokozta, míg a glükózt. az anyagcserét az enarodustat szabályozta. Ezenkívül az aminosav-anyagcserét a cukorbetegség fokozta, az enarodustat pedig csökkentette. Így az enarodustat ellensúlyozta a DKD korai stádiumában fellépő veseenergia-anyagcsere-változásokat az alloxánnal kiváltott diabéteszes egérmodellben, valamint az STZ-indukált diabéteszes patkánymodellben.

VITA

Ebben a tanulmányban kimutattuk, hogy az enarodustat (JTZ-951), egy orális HIF-stabilizátor, ellensúlyozza a DKD korai szakaszában fellépő veseenergia-anyagcsere-változásokat a cukorbetegség patkány- és egérmodelljében. A transzkriptom és metabolóma analízisek szimmetrikus metabolizmus-változásokat mutattak ki a veseszövetben (diabétesz vs. enarodustat): a zsírsav- és aminosav-metabolizmus DKD-ben fokozódott, míg az enarodustat csökkentette ezeket az útvonalakat, és a glükóz-anyagcserét is fokozta (5–10. ábra).

Nem teljesen tisztázott, hogy a HIF stabilizálása védő hatással van-e a DKD patofiziológiájára vagy sem. Korábbi vizsgálatok kimutatták, hogy a diabéteszes veseszövet hipoxiának van kitéve17, és a HIF expressziója a diabéteszes veseszövetben nem elegendő ahhoz, hogy reagáljon hipoxiás állapotukra, amit részben az oxidatív stressz okoz.18 A HIF kobalt-kloriddal történő stabilizálása javította az oxidatív stressz állapotot és csökkentette a proteinuriát és tubulointerstitiális károsodás STZ-indukált DKD-ben.19 Az állatkísérletek eredményei azt is jelezték, hogy a HIF stabilizálása megvédett az elhízás kialakulásától,20 javította az inzulinérzékenységet,20 és csökkentette a szérum koleszterinszintet.21 Ezek az eredmények a HIF stabilizálásának védő hatását sugallják a DKD. Ezzel szemben a szuprafiziológiás HIF von Hippel-Lindau delécióval történő stabilizálása vesefibrózist indukál.22 A HIF-stabilizáció szerepe a DKD progressziójában kontextusfüggő lehet, tekintettel a HIF pleiotróp hatásaira és a változatos DKD fenotípusok létezésére. A tanulmány célja az volt, hogy tisztázza a HIF stabilizálás nettó hatását a diabéteszes vese energiaanyagcseréjére. Korábbi jelentések azt mutatták, hogy a DKD-ben energia-anyagcsere-változások fordulnak elő. Sas és munkatársai10 fokozott energia-anyagcsere-fluxust és a glükóz metabolitok felhalmozódását mutatták ki a diabéteszes vesekéreg szövetében, ami összefüggésben állhat a mitokondriális diszfunkcióval. You és munkatársai23 arról számoltak be, hogy a fumarát, a TCA ciklus metabolitja felhalmozódott a diabéteszes veseszövetben, és közvetlenül hozzájárult a DKD progressziójához. Korábban kimutattuk, hogy a TCA-ciklus metabolitjai felhalmozódtak a diabéteszes veseszövetben, amit a nátrium-glükóz kotranszporter 2 gátlása vagy kalóriakorlátozás fordított. 1-es típusú cukorbetegeknél, akiknél nem volt DKD, a DKD-s betegekkel összehasonlítva. A PKM2 aktiválása megfordította a glikolízis metabolitok felhalmozódását, és helyreállította a mitokondriális funkciót, részben a glikolitikus fluxus növelésével.24,25 Ezek a korábbi jelentések arra utalnak, hogy a glikolízis és a TCA ciklus metabolitjainak felhalmozódása befolyásolhatja a DKD progresszióját, ami mérsékelhető a megkönnyített PKM2 glikolízissel. aktiválás. Vizsgálatunkban az enarodustattal végzett HIF stabilizálás megfordította az energiametabolizmus változásait, és csökkentette a glikolízis és a TCA ciklus metabolitjainak felhalmozódását a diabéteszes vesekéreg szövetében (8. ábra). A glikolitikus enzimek, köztük a PKM2 expresszióját az enarodustat is felszabályozta (S4B kiegészítő ábra). Ezenkívül az enarodustat enyhítette a GSSG felhalmozódását és növelte a glutation/GSSG arányt, ami arra utal, hogy az enarodustat enyhítette az oxidatív stresszt DKD-ben (8. ábra). Az enarodustat által kiváltott oxidatív stressz-csökkenést a malondialdehid szintjének változása is megerősítette a vesekéreg szövetében (S4A kiegészítő ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a HIF stabilizálásának védő szerepe kell legyen a DKD patofiziológiájában, legalábbis metabolikus szempontból. Az biztos, hogy nem tudjuk megvizsgálni, hogy a HIF stabilizálással történő metabolikus átprogramozásnak van-e közvetlen hatása a DKD progressziójára, mert előfordulhat, hogy a HIF pleiotróp szerepe miatt nem lehet felismerni az anyagcsere-változások nettó hatását a vese kimenetelére. Vizsgálatunkban azonban a cukorbetegség által kiváltott enyhe vizeletalbumin-kiválasztást és a vese patológiás rendellenességeit (glomerulomegalia és glomeruláris alapmembrán megvastagodása) mérsékelte az enarodustat, összefüggésben a renális energia-anyagcsere normalizálásával. Kivontuk azokat a géneket, amelyek expressziós változásai korrelálnak a vizelet albuminszintjével (257 próba; 232 gén) az alloxánnal kiváltott diabéteszes egérmodell microarray adataiból, és elvégeztük az útvonal-dúsítási elemzést (S5 kiegészítő ábra). Ennek eredményeként a mitokondriális membránhoz és a légúti elektrontranszporthoz kapcsolódó útvonalak a vizelet albuminszintjével összefüggésben felfelé szabályozódnak, ami azt jelzi, hogy a mitokondriális terhelés szorosan összefügg a vizelet albumin kiválasztásával. Így fennáll annak a lehetősége, hogy a diabéteszes veseszövet metabolikus normalizálása HIF stabilizátorokkal csökkentheti a mitokondriális terhelést és mérsékelheti a DKD progresszióját. Adataink a DKD patofiziológiájára utalnak metabolikus szempontból: A hiperglikémia energiaigényt okoz a vese proximális tubulusaiban a glükóz reabszorpcióhoz; így a TCA ciklus a mitokondriumokban erőszakosan aktiválódik, hogy kielégítse az energiaigényt a DKD (zsírsav- és aminosav-anyagcsere felpörgése) korai szakaszában. A HIF stabilizátorok pedig mérsékelhetik ezt a mitokondriális terhelést a TCA-ciklusról a glikolízisre (a zsírsav- és aminosav-metabolizmus leszabályozása és a glikolízis felszabályozása) történő metabolikus átprogramozás révén, amely védő szerepet játszhat a DKD progressziójával szemben. További vizsgálatokra van szükség, beleértve az egysejtű ómikát annak tisztázására, hogy a veseszövetben lévő mitokondriális terhelés hogyan befolyásolja közvetlenül a DKD patofiziológiáját. Egy másik érdekes kérdés, hogy a HIF stabilizátorok közvetlenül befolyásolják-e a glükóz felszívódását a proximális tubulusokban. In vitro adataink azt mutatták, hogy az enarodustat jelentősen csökkenti az ATP-termelést a TCA-ciklusból a glikolízis felé történő metabolikus átprogramozás révén (1. és 2. ábra). Tekintettel arra, hogy ATP szükséges a glükóz reabszorpciójához a nátrium-glükóz kotranszporter 2-ben, először azt feltételeztük, hogy az enarodustat inaktiválhatja a glükóz reabszorpciót. A vizelet glükózszintje azonban nem különbözött szignifikánsan a B és a C csoport között mindkét állatmodellben (S6 kiegészítő ábra). Valószínűleg az enarodustat ATP-termelés csökkenése fiziológiás helyzetben sokkal enyhébb, mint az in vitro hatása; így a HIF stabilizálása nem befolyásolja a glükóz felszívódását a nátrium-glükóz kotranszporter 2-n keresztül, legalábbis állatkísérleteinkben. Tanulmányunknak 2 korlátja volt. Először STZ-indukált diabéteszes patkányokat és alloxánnal indukált cukorbeteg egereket használtunk korai stádiumú DKD modellként, és megfigyeltük a diabéteszes állapotok rövid távú hatásait. Klinikai körülmények között azonban HIF-stabilizátorokat adnának a késői stádiumú DKD-ben szenvedő betegeknek. További vizsgálatokra van szükség ahhoz, hogy megértsük a HIF-stabilizáció hatását a vese metabolizmusának megváltozására a késői stádiumú DKD-ben. Másodszor, a vizsgálat nem rendelkezett elegendő statisztikai erővel a metabolitok koncentrációinak a metabolomadatokban való eloszlását illetően, míg a transzkriptom adatok elég nagy statisztikai erővel bírtak ahhoz, hogy tisztázzák az energiaanyagcsere teljes képét. Mivel nem sok metabolit mutatott szignifikáns különbséget a csoportok között, elvégeztük a PLS-DA-t, és kiválasztottuk azokat a metabolitokat, amelyek PLS-DA VIP pontszáma nagyobb vagy egyenlő, mint 1 az MSEA esetében. Bár a metabolikus változások keresztellenőrzése nehéz önmagában a metabolomikai adatok felhasználásával, a metabolóm-analízis eredményei kompatibilisek voltak a transzkriptomikai adatokkal (7. és 8. ábra), további alátámasztást nyújtva a transzkriptomváltozások megfigyelt hatásaihoz a veseenergia-anyagcserére. Összefoglalva, az enarodustat (JTZ{57}}), egy orális HIF-stabilizátor, ellensúlyozza a vese energiametabolizmusának változásait a DKD korai szakaszában. Tanulmányunk azt sugallja, hogy a HIF stabilizálása potenciális beavatkozásként szolgálhat, amely a diszregulált veseenergia-anyagcserét célozza meg DKD-ben.

MÓD

Mito stresszteszt és glikolitikus ráta vizsgálat

HK-2 sejteket oltottunk egy 96-lyuk mikrolemezre 1*10 sűrűséggel⁴sejt/kút. A következő napon a metabolikus fluxust valós időben mértük a Seahorse XFe96 Analyzer (Agilent) segítségével a Mito Stress Test Kit (103015-100; Agilent) vagy a Glycolytic Rate Assay Kit (103344- 100; Agilent) segítségével. A glükóz, piruvát és glutamin koncentrációja a tápközegben 10 mmol/l, 1 mmol/l és 2 mmol/l volt.

siRNS transzfekció

A HIF-1 leütést a Stealth RNAi végezte el az emberi HIF1A-hoz (HSS104774 [#1] és HSS104775 [#2]; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Stealth RNAi siRNA negatív kontroll Med GC Duplex #2 (12935112; Thermo Fisher Scientific) használtunk negatív kontrollként.

Western blot

A festéshez használt elsődleges antitestek az anti-humán HIF-1 antitestek (nyúl poliklonális, 1:500; Novus Biologicals, Littleton, CO) és az antihumán aktin antitestek (nyúl poliklonális, 1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Másodlagos antitest volt a torma-peroxidázzal konjugált kecske anti-nyúl IgG antitest (170-6515, 1:5000; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).

Állatkísérletek

Crl: CD (Sprague Dawley) patkányok és Crl: CD1 (Institute of Cancer Research) egerek a Charles River Laboratories Japan Inc.-től (Yokohama, Japán) szereztük be. Minden kísérletet jóváhagyott a Tokiói Egyetem Intézményi Felülvizsgáló Testülete (jóváhagyási szám: P17-110). Az összes állatkísérletet a National Institutes of Health irányelvei szerint végezték (Útmutató a laboratóriumi állatok gondozásához és használatához). A vizsgálati protokollok a 3. és 9. ábrán láthatók.

Transzkriptom elemzés

A vesekéreg szövetéből származó teljes RNS-t GenElute Mammalian Total RNA Miniprep Kit (RTN7{{10}}; Sigma-Aldrich) segítségével izoláltuk. A teljes RNS-t (100 ng) Low Input Quick Amp Labeling Kit (Agilent) segítségével jelöltük, majd hibridizáltuk SurePrint G3 Rat GE v2 8x60K Microarray-vel (patkányokhoz; Agilent) és SurePrint G3 Mouse GE v{{7 }}x60K Microarray (egérhez), ill. Az összes microarray kísérletet a DNA Chip Research Inc. (Tokió, Japán) végezte. A nyers adatokat a Bioconductor (http://www.bioconductor.org/) R csomag limma segítségével dolgoztuk fel a háttérkorrekció és az adatok normalizálása céljából a kvantilis normalizálási módszerrel. A Batch hatásokat a ComBat (Bioconductor) segítségével távolította el a patkánykísérletben. A differenciálisan expresszált géneket a │log2 FC│ értékkel határoztuk meg, amely nagyobb vagy egyenlő, mint 0,5 és a Q érték < 0,05.="" a="" génontológiát="" és="" a="" kanonikus="" útvonalelemzéseket="" a="" basespace="" correlation="" engine="" (illumina,="" san="" diego,="" ca)="" segítségével="" végeztük.="" a="" microarray="" adatokat="" a="" national="" center="" for="" biotechnology="" information="" gene="" expression="" omnibusban="" helyezték="" el="" gse131221="" (patkány)="" és="" gse139317="" (egér)="">

Génkészlet-dúsítási elemzés

A GSEA egy számítási módszer, amely meghatározza, hogy egy a priori meghatározott génkészlet statisztikailag szignifikáns, egybevágó különbséget mutat-e két biológiai állapot között. A GSEA a GSEA v.3 segítségével történt.{2}} (Broad Institute, Cambridge, MA). Szignifikánsnak tekintették azokat az útvonalakat, amelyek hamis felfedezési aránya <>

Metabolomelemzés

A metabolom méréseket a Human Metabolome Technologies Inc. (Tsuruoka, Japán) végezte. A metabolitkoncentrációkat úgy számítottuk ki, hogy az egyes metabolitok csúcsterületét a belső standard területéhez viszonyítva normalizáltuk, és standard görbéket használtunk, amelyeket 3-pontkalibrálásokból kaptunk. Lásd még a Kiegészítő módszereket.

Metabolitkészlet-dúsítási elemzés

A metabolomikai adatok elemzése a MetaboAnalyst 4 integrált webalapú platformon történt.{2}}. PLS-DA-t végeztünk, és kiszámítottuk a kapcsolódó VIP pontszámokat. Az 1-nél nagyobb vagy egyenlő PLS-DA VIP pontszámú metabolitokat használtuk az MSEA-hoz.

A glomeruláris területek számszerűsítése vesepatológiákban

Véletlenszerűen 3 kóros képet készítettünk minden minta periodikus sav–Schiff festési képéről, és minden glomeruláris területet megmértünk Fidzsi-szigeteken (az ImageJ eloszlása; National Institutes of Health, Bethesda, MD).

CUBIC-vese

A veseszövetben található glomerulusok átfogó 3-dimenziós képalkotását CUBIC segítségével végeztük korábbi munkáink szerint. Röviden, a rögzített egérveséket CUBIC-L-be merítettük lipidmentesítés céljából, majd immunfluoreszcens festésnek vetettük alá. Végül a törésmutatót a minták CUBIC-R plusban való elhelyezésével egyeztettük. Átfogó 3D-dimenziós képeket átlátszó vesékből egyedi gyártású fénylemezes fluoreszcens mikroszkóppal (MVX10-LS; Olympus, Tokió, Japán) készítettünk. A festéshez használt elsődleges antitest az anti-podocin antitest volt (nyúl poliklonális, 1:100, P0372; Sigma-Aldrich). A másodlagos antitest Alexa Flour 555- konjugált szamár anti-nyúl IgG (1:100, A-31572; Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) volt.

Statisztikai analízis

Többszörös összehasonlításhoz {{0}}módszeres varianciaanalízist, majd adott esetben a post hoc Tukey többszörös összehasonlítási tesztet alkalmaztuk. Minden statisztikai elemzést GraphPad Prism 7 szoftverrel (GraphPad Software, San Diego, CA) végeztünk. P < 0,05="" statisztikailag="" szignifikánsnak="" tekinthető.="" az="" adatokat="" átlag±sd-ként="" adjuk="">

KÖZZÉTÉTEL

Az MN tiszteletdíjat, tanácsadói díjat vagy kutatási támogatást kapott a KyowaHakko-Kirin, Akebia, Astellas, Chugai, GlaxoSmithKline, Japan Tobacco Inc. (JT), Torii, Tanabe-Mitsubishi, Daiichi-Sankyo, Takeda, Ono, Ingelheim, Boehringer cégektől. és Alexion. A TT kutatási ösztöndíjat kapott a JT-től. Az Enarodustat (JTZ-951) a JT, Tokió, Japán biztosította. Az EAS és a HRU a RIKEN tulajdonában lévő szabadalmak társfeltalálói. A tanulmány egy része az Olympus Corporationnel és a Bitplane által támogatott szoftverrel együttműködve készült. A másik szerző nem nyilatkozott egymással versengő érdekekről.

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Hálásak vagyunk Dr. Shuhei Yao-nak és Dr. Shinji Tanakának az értékes megbeszélésekért. Köszönjük továbbá Dr. Tsuyoshi Inoue-nak, Dr. Satoru Fukudának és Ms. Kahoru Amitani-nak a technikai támogatást. Ezt a munkát részben az Izotóp Tudományos Központ, a Tokiói Egyetem támogatásával végezték. Ezt a munkát a Grant-in-Aid for Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) kutatói ösztöndíjas (JSPS KAKENHI 19J11928 támogatás, SH), Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (JSPS KAKENHI 18H02824 ösztöndíj, MN) támogatta. ), Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (JSPS KAKENHI támogatás 17K09688, TT), és Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (KAKENHI grant 26111003, MN).