Az életkorral összefüggő neurodegeneratív betegségek preklinikai tanulmányainak előrehaladásának útja: A rágcsálók és a HiPSC-eredetű modellek perspektívája 3. rész

Hasonló vírusvektor-megközelítéseket értékeltek a PD különböző modelljeiben, a legkorábbi átalakítások AAV2/2-t vagy LV-ket alkalmaztak.123–126Ezekkel a felnőtt patkányok agyába injektált vektorokkal a humán a-syn WT, A30P vagy A53T mutánsait betegségek esetén juttatták be. indukció.

A vírusok és a memória közötti kapcsolat sok ember számára negatívnak tűnhet, mivel a vírusok gyakran okoznak testi kényelmetlenséget és betegségeket. A vírusok azonban pozitív hatással is lehetnek a memória javítására, főként azért, mert a vírustámadások elősegíthetik az immunrendszer aktivitását.

Tanulmányok kimutatták, hogy a vírusos támadások hatására a szervezet immunrendszere reagál, ezáltal javítva a szervezet vírusokkal szembeni ellenálló képességét. Ez az immunrendszer válasza magában foglalja a fehérvérsejtek és más termelődő immunsejtek számának növelését, valamint az antitestek termelését. Ezek a válaszok nemcsak segítenek a szervezetnek ellenállni a vírusinváziónak, hanem erősítik az immunrendszer működését és javítják a szervezet általános egészségi állapotát.

A vírusos támadások az immunsejteket is aktiválják az agyban. Ezek az immunsejtek képesek eltávolítani a hulladékot és a korrupt sejteket az agyból, javítják az idegrendszer működését, elősegítik az információátvitelt és a memóriafeldolgozást. Tanulmányok azt is kimutatták, hogy bizonyos vírusfertőzésekben szenvedők jobban teljesítenek memóriafeladatokkal.

Ezenkívül egyes tanulmányok azt találták, hogy bizonyos vírusok serkenthetik a szervezetet az agyból származó neurotróf faktor (BDNF) termelésére, amely egy olyan anyag, amely elősegíti a neuronok növekedését és fejlődését. Ez az anyag pozitív hatással van az agyműködésre, és elősegítheti a fizikai helyreállítást és a memória javítását.

Természetesen a vírus elleni küzdelemben a megfelelő megközelítést és stratégiát kell elfogadnunk, be kell tartanunk a megfelelő higiéniai szokásokat, eleget kell aludnunk és mozognunk, hogy immunrendszerünk a legjobb állapotban legyen. Röviden, bár a vírus fizikai kényelmetlenséget okozhat, egyre több bizonyíték áll rendelkezésre arra vonatkozóan, hogy az immunrendszer működését is elősegítheti, és pozitív hatással van egészségünkre és memóriánkra. Látható, hogy javítanunk kell a memóriánkat, a Cistanche pedig jelentősen javíthatja a memóriánkat, mert a Cistanche szabályozhatja a neurotranszmitterek egyensúlyát is, például növelheti az acetilkolin és a növekedési faktorok szintjét, amelyek nagyon fontosak a memória és a tanulás szempontjából. Ezen túlmenően, a Cistanche javíthatja a véráramlást és elősegítheti az oxigénszállítást, ami biztosítja, hogy az agy elegendő tápanyaghoz és energiához jusson, ezáltal javítva az agy vitalitását és állóképességét.

Kattintson a Tudnivaló-kiegészítőkre a memória javítása érdekében

A szerzők kimutatták az a-syn hatékony expresszióját a nigrális DA neuronokban, amihez molekuláris és celluláris patológiák és nigralDA degeneráció társult, amelyek az idő múlásával fokozatosan fejlődtek ki.

Mindazonáltal az ezekben a vizsgálatokban használt rAAV2/2 vektorok első generációja progresszív neuronveszteséget mutatott, bár a tirozin-hidroxiláz-pozitív neuronok neurodegenerációja, valamint az idő lefolyása meglehetősen változó volt (25%–80% és 6 héttől 1 évig). , illetve).123.124

Ezzel szemben a WT-, A30P- vagy A53T-mutált a-syntroint kódoló LV-k késleltetettebb és következetesebb módon (25–40%, illetve 5 hónapig) képesek voltak idegsejt-vesztést indukálni patkányokban.126 Mindkét tanulmány kimutatta, hogy a fennmaradó DA neuronokban a neurit hossza és a duzzadt perikarya progresszív csökkenése.

Ezenkívül az a-syn masszív citoplazmatikus felhalmozódását találták mind a sejttestekben, mind a neuritokban. Ezeket az eredményeket a közelmúltban több tanulmány is megismételte, amelyek mindkét vírusplatformot felhasználták.127–131

Az LV-ket számos egér PD modellben is alkalmazták. Például Lauwers és munkatársai125 kimutatták, hogy az a-syn WT-t vagy A30P mutánsát hordozó LV injekciója a striatumba, az amygdalába vagy az SNof egerekbe képes volt időfüggő módon indukálni a PD-vel kapcsolatos neurodegeneratív változásokat, és magában foglalta az a-független neuritikus megnagyobbodást is. és citoplazma zárványok.

Továbbá, ez a tanulmány kimutatta, hogy az A30P-a-syn nigrális túlzott expressziója körülbelül 25%-os sejtveszteséget eredményezett 10-12 hónapon belül.125 Az A30P, E57K és E35K bejuttatása a patkány SN-ébe LV segítségével hasonló mértéket mutatott a DA neuronban. veszteség (körülbelül 50%) a WT-hez (30%) képest, míg az ugyanebben a vizsgálatban használt gyorsabb fibrillumképző mutáns A53T nem mutatott szignifikáns csökkenést a DA sejtszámban.

Érdekes módon az egereknél megfigyelt általános neuropatológiai jellemzők (azaz a kezdet és a súlyosság) kevésbé súlyosnak tűntek, mint a patkányoknál, bár ezek a különbségek a vírus tisztaságának vagy az injektált vírus termelési titereinek műtermékei és/vagy egyéb kapcsolódó technikai eltérések lehetnek.

Fontos szempontok az AD és PD vírusvektor modelleknél

Az új szerotípusok, köztük az AAV2/1, AAV2/5, AAV2/6, AAV2/8, AAVrh10, DJ és DJ8 fejlesztése kibővítette a sejtcélpontokat és javította az AAV transzdukciós hatékonyságát.

Az ezekkel az új kapszidokkal szerotipizált AAV-ket patkányokon és nem humán főemlősökön tesztelték az a-syn túlexpressziójára.132–137 Az AAV2/5 és AAV2/6 által szállított S129Aform túlzott expressziója következetesen fokozott toxicitást mutat a neurodegenerációs folyamatban.134,138

Ezek a kísérletek azt is kimutatták, hogy a túlzott expressziót okozó transzgén gondos adagolása kulcsfontosságú, mivel még a csak magas titerrel szállított fluoreszcens riportereket hordozó kontrollvektorok is mutathatnak nem specifikus toxikus hatásokat.135

Ezt a figyelmeztetést alaposan figyelembe kell venni az AAV-n alapuló mentési kísérletek tervezésekor. Például kimutatták, hogy az SNCA-t célzó kis interferáló RNS-t (siRNS) tartalmazó terápiás AAV magas toxicitást eredményezett, és jelentős veszteséget okozott a nigrostriatális DA neuronokban. Ez a tanulmány rávilágított az AAV alkalmazásának korlátaira az állatkísérletekben.

Nem zárható ki azonban, hogy a neurotoxicitást az SNCA-szintek robusztus csökkenése okozta patkánymodellekben, az asa-syn kulcsfontosságú biokémiai szerepet játszik a DA neuronokban, és robusztus redukciója csökkentheti a sejtek életképességét.139 Összességében ez aláhúzza a eszköz kifejlesztése a betegséggel összefüggő gének expressziójának finomhangolására a génterápiás megközelítések megtervezéséhez.

Ebben a tekintetben az újabb CRISPR-dCas{1}}alapú rendszer előnyösebb rendszert jelenthet a génexpresszió pontos és finomhangolt módon történő modulálására.

Ezen a vonalon a közelmúltban fejlesztettük ki az LV-CRISPR-Cas9 rendszert az SNCA génexpresszió precíz és finomhangolt szabályozására. A tanulmány bizonyítékot szolgáltatott arra, hogy a génexpresszió manipulálása (pl. a túlzott expresszió visszafordítása) az epigenom szerkesztésen keresztül értékes terápiás stratégia olyan neurológiai rendellenességek kezelésére, mint például a PD140, amelyet génszabályozási zavar okoz.

Mint ilyen, az LV-t és az AAV-t használó vírusvektor PD modellek az a-syn fehérje túlzott expressziójára PD patológiát mutatnak, amely a DA neurodegenerációjához kapcsolódik, és az új AAV szerotípusok alkalmazása javítja az a-syn expressziót a DA neuronokban az AAV2/2-hez képest.

Összességében mind az AAV-k, mind az LV-k képesek transzgénexpressziót indukálni, és magas szintű tropizmust mutatnak a DA neuronok számára, ami hasonló szintű neurodegenerációt eredményez. Ezen vírusrendszerek további fejlesztésére lesz szükség a sejtes PD fenotípusok lassú progressziójának és a viselkedési károsodások viszonylag alacsony szintjének megkerüléséhez.

In vitro sejtkultúra modellek A jelenlegi in vitro AD és PD modellek áttekintése: korlátok és lehetőségek

Az elmúlt négy évtizedben számos AD és PD in vitro modellt fejlesztettek ki a relatív betegségek patofiziológiájának kulcsfontosságú aspektusai közötti kölcsönhatások vizsgálatára, és ezt követően preklinikai terápiás szűrésre használták őket.

A jelenlegi AD és PD in vitro modellek elsősorban a molekuláris és celluláris betegségek jellemzőinek összefoglalására irányulnak, mint például a mitokondriális diszfunkció, az oxidatív stressz, a sejtek túlélése és az intracelluláris és/vagy extracelluláris fehérje aggregátumok jelenléte. Például az ADare legjelentősebb és legszélesebb körben használt sejtmodelljei, amelyek az Ab40 42 aggregátumok indukcióján vagy a tau hiperfoszforiláción és aggregáción alapulnak141 142 (1. táblázat).

Hasonlóképpen, a PD in vitro modelljei a fent említett toxin által kiváltott mitokondriális diszfunkción (pl. MPTP, rotenon, paraquat, 6-OHDA) és megszakított proteosztázison (pl. thapsigargin, ionomycin, tunicamycin), a-syn túlexpresszión és expresszión alapulnak. a mutált PD familiáris gének (pl. a-syn, Parkin, PINK1)92 (2. táblázat).

Míg ezek a sejtkultúra-modellek felbecsülhetetlen értékűek voltak a releváns neurobiológiával kapcsolatos ismereteink fejlesztésében, még nem eredményeztek életképes DMT-ket, amelyek a megelőzést, a késleltetett megjelenést vagy a betegség progressziójának lelassítását célozták volna, megkérdőjelezve relevanciájukat és transzlációs érvényességüket.

A jelenlegi preklinikai gyakorlatok javítása érdekében ezekben a modellekben számos egyértelmű korlátot is figyelembe kell venni.

Például, a megfelelő betegséggel összefüggő gének túlzott expresszióján és kiütésén/leállásán alapuló modellek köztudottan változékonyak a fehérjeszintek mennyiségi változásaiban és a génexpresszió változásának indukálására használt módszerekben (azaz vírus által közvetített, tenyésztésen alapuló, konstitutív vagy átmeneti expresszió) ami egymásnak ellentmondó adatokhoz és következtetésekhez vezethet.92

Ez a konzisztencia hiánya a betegséggel összefüggő fenotípusok kiváltásában figyelmeztetést jelent a preklinikai vizsgálatokhoz, amelyek ezeket a modelleket használják a potenciális DMT-k tesztelésére. Ezen túlmenően, a preklinikai NDD modellekben megfigyelt sejtfenotípusok és módszertan variabilitása (pl. a fehérje túlexpressziójának többszörös változása vagy knockdown) erőteljesen sugall egy nagyobb genetikai heterogenitást, amely a jelenlegi sejtmodellekben nem teljesen feltárható.

Ezt tovább bonyolítja a családi kohorszokban azonosított genetikai variánsokon alapuló sejtmodellek elterjedése, annak ellenére, hogy a családi variánsok az összes NDD eset kis kisebbségét képviselik.109 143

A feltárt genetikai okok miatt továbbra is nehéz a nem mendeli genetikával rendelkező sporadikus NDD kohorszokat vagy betegségek altípusait pontosan reprezentálni preklinikai modellekben, ami jelentős akadályt képez a releváns betegségmechanizmusok feltárásában, a lehetséges terápiás célpontok azonosításában és a gyógyszerfejlesztésben.

Tekintettel ezekre a kihívásokra, a kutatók kénytelenek voltak értékelni ezeket a modelleket, hogy azonosítsák a fejlesztendő területeket, és értékeljék az új sejttenyésztési technikák által kínált lehetőségeket.

Az elmúlt években ezekre a modellekre építettünk, új génszerkesztési technológiát alkalmazva, és javított szövettenyésztési modellekben értékeltük a GWAS-okban nyert fontos genetikai betegségek asszociációit.144,145

A hiPSC technológia fokozott beépítése jelentős előrelépést jelent az NDD in vitro modellezés területén, és korábban nem elérhető lehetőségeket kínál a betegekből származó, a betegség szempontjából releváns sejttípusok felhasználására a betegség patogenezisének az emberi genom összefüggésében történő feltárására.

A hiPSC-eredetű NDD-modellek előnyeinek és korlátainak teljes spektrumát, különösen az AD-vel és a PD-vel kapcsolatos modelleket, a következő rész teljes egészében feltárja.

Az NDD-k hiPSC-eredetű modelljei: sokoldalú és genetikailag "hűséges"

A sejtkultúra-technológia modern fejlődése az egyik legizgalmasabb áttörést jelenti az NDD-k kutatásában, lehetőséget adva a jobb betegségmodellezésre, gyógyszerszűrésre és személyre szabott orvoslásra.

Egészen a közelmúltig a posztmortem agyvizsgálatot az aranystandard humán alapú biológiai anyagnak tekintették, hogy betekintést nyerjenek az emberi neurodegeneratív állapotok kóros folyamataiba.

A modern őssejt-technológiák azonban, beleértve a betegspecifikus neuronok és gliasejtek elemzését, új utakat nyitottak meg az NDD-k kóros mechanizmusainak vizsgálatában, és egyre inkább kiaknázzák a fokozott genetikai komplexitású NDD-k molekuláris disszekciójában, mint pl. PD.

A betegek bőrmintáinak egyszerű, non-invazív biopsziájával a különféle alternatív biológiai minták mellett a hiPSC-k létrehozása lehetővé teszi a kutatóknak, hogy olyan molekuláris útvonalakat és betegségmechanizmusokat tárjanak fel, amelyek az NDD-k hátterében állnak, oly módon, ami a korábbi sejttenyésztési módszerekkel lehetetlen volt.

Jelenleg a legelterjedtebb donorsejtek a fibroblasztok, amelyeket az összes publikált újraprogramozási kísérlet több mint 80%-ában használnak fel;146 azonban a hiPSC-k számos forrásból beszerezhetők, beleértve az embrionális őssejteket, a köldökzsinórvért, a szaruhártya epiteliális sejtjeit, és vérsejtek, például perifériás vér mononukleáris sejtjei147–149 (1. ábra).

Következésképpen a hiPSC-eredetű modellek sokoldalú alternatívát jelentenek a létező sejtes betegségmodellekhez képest, és a páciens olyan szomatikus szöveteiből származnak, amelyeket a pluripotenciára kényszerítenek különféle újraprogramozó eszközök, például plazmidok, vektorok (pl. episzomális) és vírustranszdukció (pl. , adenovírus, Sendai vírus, lentivírus, ezeket a módszereket átfogóan áttekinti a Brouweret al.150 és a Malik and Rao151;

Ezek a sejtek önmegújulóak, és alternatívát kínálnak az embrionális őssejtekhez (ESC), amelyekhez etikai megfontolások és társadalmi megfontolások társulnak. Jelenleg számos hiPSC adattár létezik, amely összegyűjti és terjeszti az NDD-s betegektől származó hiPSC-vonalakat és az életkorhoz igazodó kontrollokat, hogy központosítsa a mintákat, és könnyen elérhetővé tegye azokat a kutatók számára (S2 táblázat).

A hiPSC-k egyik fő alkalmazása a specifikus sejttípusokká történő differenciálódás, amelyeket ennek következtében számos biológiai kontextusban alkalmaztak, ideértve az idegrendszer fejlődését152 és a neurodegenerációs vizsgálatokat,144 ex vivo transzplantációt,153154 betegségmodellezést, célpont validálást és gyógyszerkutatást.155

A mai napig számos sejtdifferenciálódási protokollt fejlesztettek ki, amelyek nemcsak generikus neuronokat, hanem specifikus idegsejt-típusú populációkat is generálnak, beleértve a serkentő, kolinerg, DA és gátló GABAerg neuronokat. beleértve az asztrocitákat, 159-161 oligodendrocitákat, 162, 163-at és mikrogliát.164-166

Számos új génszerkesztési technika, köztük a CRISPR-Cas9, a cink-ujj nukleázok (ZFN) és a transzkripciós aktivátor-szerű effektor nukleázok (TALENS) további dimenziót vezetett be a hiPSC-eredetű rendszerbe – olyan izogén modellek létrehozását, amelyek azonos genetikai hátterűek. és csak a választott mutációban különböznek.167

A sejtdifferenciálódási protokollok sokfélesége elősegítette a mechanisztikus vizsgálatokat, az izogén vonalak elérhetősége pedig támogatta a génfunkciók genetikai elemzését és az NDD-kben betöltött patogén szerepét. A hiPSC-eredetű modellek alkalmasak ezekre a vizsgálatokra, mivel kulcsfontosságú betegséggel kapcsolatos jellemzőket mutatnak.

Például a PS1 és PS2 mutációt (A246E és N14II)168 és APP duplikációs mutációt169 hordozó fAD- és sAD-eredetű hiPSCneuronális modellek fontos AD biokémiai jellemzőket mutatnak, beleértve az Ab-szekréciót, a megnövekedett Ab42:Ab40 arányt és a megnövekedett tauphost.

Fontos megjegyezni, hogy az Ab-vel kapcsolatos fenotípusokat generáló hiPSC modellek használata pontosabb eszközt jelent az Ab-expresszió AD neurodegenerációban betöltött szerepének feltárására, összehasonlítva a hagyományos ektópiás expressziós modellekkel vagy olyan modellekkel, amelyek kiegészítést és/vagy Ab-aggregátumok indukcióját igénylik. ezek átveszik az Ab-lerakódásokkal kapcsolatos "természetes" kóros folyamatokat.

For more information:1950477648nn@gmail.com