A ciklooxigenáz (COX-2) és a hipoxia által kiváltott betegség közötti kapcsolat

további információ:ali.ma@wecistanche.com

Az intracelluláris prosztaglandin E2 hozzájárul a hipoxia által kiváltott proximális tubuláris sejthalálhoz

Coral Garcia-Pastorl, Selma Benito-Martinez, Ricardo J. Bosch1, Ana B. Fernandez-Martinez, Francisco J. Lucio-Cazana

A proximális tubuláris sejtek (PTC) különösen érzékenyek a hipoxia által kiváltott apoptózisra, ami fontos tényezővesebetegség. Feltételeztük, hogy a hipoxiás PTC-elhalást a prosztaglandin E, (PGE) ciklooxigenáz (COX{1}})-függő termelése közvetíti, amit humán proximális tubuláris HK-2sejtekben is megerősítettek a hipoxia miatt. (1 százalék O,) által kiváltott apoptózist (i) egy COX-2(ciklo) akadályozta meg-oxigenáz) inhibitor és a prosztaglandin (EP) receptorok antagonistái által, és (ii) összefüggésbe hozható az intracelluláris PGE (iPGE) növekedésével a hipoxia által indukálható faktor-1 -függő COX transzkripciós felszabályozása miatt }}(ciklo-oxigenáz). Az apoptózist a prosztaglandin felvétel transzporter PGT inhibitorai is megakadályozták, ami arra utalt, hogy az iPGE hozzájárul a hipoxia által kiváltott apoptózishoz (ellenkezőleg, a hipoxia/reoxigenáció által kiváltott PTC halálát kizárólag az extracelluláris PGE okozta). Így az iPGE új szereplő a hipoxia által kiváltott tubuláris sérülések patogenezisében, és a PGT új terápiás célpont lehet a vesebetegségek hipoxia-függő elváltozásainak megelőzésében.

Jól bebizonyosodott, hogy a tubuláris hypoxia releváns tényező mind akut, mind krónikus esetekbenvesebetegség'2 A proximális tubuláris sejtek (PTC) nagyon aktívak az oxigénfogyasztás szempontjából, energiaigényes reabszorpciós tevékenységeik miatt, és ennek következtében érzékenyek a hipoxiára. Kimutatták, hogy az apoptózis jelentős szerepet játszik a hipoxiának kitett tenyésztett PTC-ben, de az apoptotikus gépezet aktiválásáért felelős jelátviteli útvonalakat nem vizsgálták. Mi és mások azt találtuk, hogy a prosztaglandin E (PGE), amely számos fiziológiai és kóros folyamat fontos lipid közvetítője.vese, fontos szerepet játszik a PTC apoptózishoz vezető jelátvitelben a ciszplatin7, albumin8 vagy leptin és gentamicin kezelés során. A PGE növekedése minden esetben a ciklooxigenáz-2(COX-2) fokozott expressziójától függ.(ciklo-oxigenáz), egy indukálható enzim, amely a COX{0}}l-vel együtt a prosztaglandinok szintézisének sebességkorlátozó lépése. Az emberbenvese, bazális COX-2(ciklo-oxigenáz)kifejezés kevésbé intenzív, mint a COX-é-1. COX-2(ciklo-oxigenáz)fiziológiás körülmények között azonosították a podocitákban és a Henle-hurok egyes részein és a vese érrendszerében10. Patológiás állapotokban azonban a COX-2 immunreaktivitás sokkal több sejttípusban is megtalálható.vesebeleértve a PTC-t, és valószínűleg hozzájárul a vesekárosodáshoz. Érdekes módon a hipoxia fokozza a COX expresszióját{0}}(ciklo-oxigenáz)és/vagy PGE,{0}}i7 termelése számos sejttípusban. Valójában korábban azt találtuk, hogy a hipoxia fokozza a PGE intracelluláris tartalmát, valamint annak az extracelluláris közegbe való felszabadulását8. Ezért elméletileg lehetséges, hogy a PGE közvetíti a hipoxia apoptotikus hatását a PTC-re.

A PGE-függő apoptózissal kapcsolatos legtöbb tanulmány alapvetően az extracelluláris PGE-t érintő mechanizmusokra összpontosított, mivel széles körben elfogadott, hogy a PGE biológiai hatásait a plazmamembránon átívelő, G-fehérjéhez kapcsolt PGE-receptorok (E sorozatú prosztaglandin receptorok) aktiválásán keresztül fejti ki. EP1-4)1. Ennek ellenére egyes modellekben az intracelluláris PGE (iPGE) releváns az apoptotikus sejthalálban720-22. Ez azt jelenti, hogy az apoptózis indukálásához a PGE-nek újra el kell érnie az intracelluláris közeget, és aktiválnia kell az EP-receptorok egy részét, amelyek a sejten belül helyezkednek el (iEP-receptorok). Mivel a PGE befogását főként a prosztaglandin felvétel transzporter (PGT)23-26 látja el, a PGT gátlása megakadályozza az iPGE által közvetített apoptotikus sejthalált7.

Ezt a hátteret figyelembe véve jelen munkában azt vizsgáltuk, hogy egy COX{0}}(ciklo-oxigenáz)Az iPGE -függő növekedése a hipoxia által kiváltott apoptózist közvetíti PTC-ben.

Kattintson az organikus Cistanche vesebetegségre

Mód

Reagensek.

AG1478, Bromocresolgreen (BG), PGE, AH6809, GW627368X, kristályibolya, tripánkék oldatok, brómszulfoftalein (BRS), 3-(5'-hidroximetil2'-furil)-1-benzil-indazol (YC1), és az aktinomicin D-t a Sigmától (St. Louis, MO, USA) vásároltuk. A Z-VAD-FMK és a celekoxib a Calbiochemtől (Darmstadt, Németország) és a Cayman Chemical-tól (Ann Arbor, MI, USA) származott. A TriReagent a Vitro-tól (Madrid, Spanyolország), a PVDF membránokat és a Western blotting luminol reagenst pedig a Santa Cruz Biotechnology-tól (Santa Cruz, CA, USA) vásárolta. }}fenil-indol (DAPI), annexin-V-FITC (fluoreszcein-izotiocianát)/propidium-jodid (PI) apoptózis-detektáló készlet és 2',7'-diklór-fluoreszcein-diacetát (DCFH-DA) szonda az Invitrogentől (Carlsbad, CA, USA), illetve Molecular Probes (Oregon, USA), illetve. Az antitesteket a következő forrásokból szereztük be: anti-PGE és anti-COX-2(ciklo-oxigenáz)az antitestek az Abcam-tól származtak (Cambridge, Egyesült Királyság); az anti-Bax és az anti-Bcl-2 a Santa Cruz Technologies cégtől származott (Santa Cruz, CA.USA); az anti-HIF-la antitest és a -nyúl-Alexa-Fluor 488 a BD Biosciences-től (Palo Alto, CA, USA) és az Invitrogentől (Carlsbad, CA, USA) származott; az anti- -aktin és a nyúl anti-egér IgG peroxidáz konjugátumot a Sigmától (St. Louis, MO, USA) vásároltuk.

Sejttenyésztés és kísérleti körülmények.

A humán proximális tubuláris HK-2 sejteket az American Type Culture Collection-től (ATCC) (Rockville, MD, USA) vásároltuk. A sejteket 5 százalékos CO-ban tartottuk, 37 fokos Cin DMEM/F12-vel kiegészítve 10 százalék borjúmagzattal. szérum (FBS), 1% penicillin/sztreptomicin/amfotericin B és 1% glutamin (Invitrogen. Carlsbad, CA, USA) és 1% inzulin-transzferrin-szelén (ThermoFisher. Grand Island, NY, USA). Minden kísérletben a sejtek 70-90 százalékos összefolyásnál helyeztük el őket, és amikor teljesen összetapadtak, hipoxiás (1 százalék oxigén) vagy normoxiás körülmények között (21 százalék oxigén) tenyésztették őket.Hypoxiaa kísérleteket In vivo200-ban végeztükhypoxiamunkaállomás (Ruskin Technology, West Yorkshire, Egyesült Királyság). Merthypoxia/reoxigénezési kísérletek, sejteket vetettünk aláhypoxia24 órán át, majd ezt követően a sejteket normoxikus körülmények között inkubáltuk legfeljebb 3 óráig (reoxigénezési periódus).

Az iPGE immunfluoreszcencia analízise és a COX Western blot elemzése-2(ciklo-oxigenáz)és HIF-1 .

Az immunfluoreszcencia analízishez és a Western blot analízishez használt sejteket üveg fedőlemezeken (4 × 104 sejt/üveg fedőlemez) vagy hatlyukú lemezekre (15 × 104 sejt/lyuk) hasítottuk, és az "Eredmények" részben leírtak szerint inkubáltuk. Ezután az immunfluoreszcenciát és az immunblot analízist lényegében a korábban leírtak szerint végeztük el. Az antitest munkahígításai a következők voltak: 1/50 PGE, 1/1000 COX{10}}(ciklo-oxigenáz)/HIF-1a/a-rabbit-Alexa-Fluor 568 és 1/5000 az -aktin esetében. Az immunfluoreszcenciás detektálást Leica SP5 konfokális mikroszkóppal (Leica Microsystems, Wetzlar, Németország) végezték a Biomedical Research Networking Center on Bioengineering, Biomaterials és Nanomedicine (CIBER-BBN) Konfokális Mikroszkópiai Szolgálatán (ICTS 'NANBIOSIS'U17) keresztül. Alcali Egyetem, Madrid, Spanyolország)

Átmeneti transzfekció.

Átmeneti transzfekció siRNS PGT-vel (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), a vad típusú humán 15-hidroxi-prosztaglandin-dehidrogenáz (p15-PGDH) cDNS-ét tartalmazó emlős expressziós vektorral, a pcDNA3-mal vagy a luciferáz riporter plazmid konstrukciók a humán COX-hoz-2(ciklo-oxigenáz)phPES2-Luc, emberhypoxiaválaszelem (HRE)p9HIF1-Luc és R. reniformis pRL-CMV (Promega, Madison, WI) és a luciferáz aktivitás meghatározása a másutt leírtak szerint történt27,28.

Sejtszám és sejt/mag morfológia.

A tapadó sejtek számát spektrofotometriásan határoztuk meg módosított kristályibolya festési módszerrel2. Az apoptózis bizonyítékainak kimutatására a sejtmorfológiát fáziskontraszt mikroszkóppal figyelték meg. A sejtmagokat DAPI-val végzett DNS-festés után tettük láthatóvá, a korábban leírtak szerint0. A tipikus apoptotikus morfológiát vizsgáltuk a sejtzsugorodás, a magkondenzáció és fragmentáció, valamint az apoptotikus testek kialakulása. A számszerűsítéshez minden kísérleti körülményben hat mezőt vizsgáltunk vak módon, hogy megbecsüljük az apoptózisszerű megjelenésű magok százalékos arányát.

Áramlási citometriás apoptózis vizsgálat és sejt életképességi vizsgálat tripánkék festék kizárási teszttel.

A lemezhez tapadt sejteket tripszinezéssel eltávolítottuk, és a tápközegből előzőleg kinyert leszakadt sejtekkel együtt használtuk a vizsgálathoz.

Az Annexin-V-FITC/PI apoptózis-detektáló készlet lehetővé tette az apoptotikus és nekrotikus HK-2 sejtek áramlási citometriás kimutatását, amint azt korábban leírtuk7. A korai és késői apoptotikus sejtek pozitívak voltak az annexin V festődésre, és mindkettőre és az annexin V-re. festés. A nekrotikus sejtek csak PI-re voltak pozitívak, az élő HK-2 sejtek pedig nem mutattak festődést.

A sejtek életképességének felmérésére tripánkék festék kizárási tesztet alkalmaztunk. Az életképes (fehér) és az elhalt sejteket (kék) fénymikroszkóp és hemocitométer segítségével megszámoltuk.

Statisztikai analízis.

Minden kísérletet legalább háromszor megismételtek. Az eredményeket átlag±SEM-ként fejezzük ki. Egyutas varianciaanalízisnek (ANOVA) vetettük alá őket, majd Bonferroni-teszttel végeztük a többszörös összehasonlítást. A szignifikancia szintje P Kisebb vagy egyenlő 0,05-tel.

Eredmények

A hipoxia proximális tubuláris HK{0}} sejthalált okoz.

Hypoxiacsökkentette a HK-2 sejtek számát, amint azt kristályibolya assay-vel értékelték (la ábra), és a sejtek kerekedését és a lemezről való leválást is indukálta (lb. ábra, felső panel). Ahogy az várható volt,hypoxiakiváltotta a sejthalál modelljét az apoptózis egyértelmű morfológiai jellemzőivel (lásd a nukleáris festést DAPI-val az lb. ábrán, alsó panel bal oldalon), mint például a sejtzsugorodás jelentős magkondenzációval, fragmentáció és apoptotikus-szerű testek kialakulása.HypoxiaAz -indukált apoptózist tovább erősítette az annexin V-FITC festődés növekedése, amelyet áramlási citometriával határoztunk meg, és annak megelőzése a pan-kaszpáz inhibitor Z-VAD-FMK-val (lc. ábra).Hypoxiaaz életképes sejtek számának csökkenését is meghatározta, de nem indukált statisztikailag szignifikáns változást a nekrotikus sejtek számában (lc. ábra, betét).

1. ábra: A hipoxia proximális tubuláris HK-2 sejthalált indukál.a) Csökkent sejtszám (kristályibolya vizsgálat). (b) Az apoptózis morfológiai jellemzői. Reprezentatív fáziskontrasztos mikrofényképek (felső panel, eredeti nagyítás, 10×) DAPI festéssel készült mikrofényképek (alsó panel, eredeti nagyítás, 40×). (c) Az apoptózis növekedése (áramlási citometriai vizsgálatok). Az Annexin V plusz sejtek Annexin V plusz/propidium-jodid sejteket (azaz korai apoptotikus sejtek megőrzött plazmamembrán integritással) és annexin V plusz/propidium-jodid plusz sejteket (azaz késői apoptotikus sejtek) tartalmaznak. Beillesztés: A sejtpopulációk típusai (az Annexin V-/propidium-jodid plusz sejtek nekrotikus sejtek, az annexin V-/propidium-jodid pedig élő sejtek). Az eredmények százalékban vannak kifejezve az események teljes számához viszonyítva. Általános információ:(1) A sejteket 24 órán keresztül inkubáltuk normoxikus (21% O2) vagy hipoxiás (1% O) körülmények között, amint azt a "Módszerek" részben jeleztük. A pan-kaszpáz inhibitor Z-VAD-FMK (25 μM) volt. hozzáadva 1 órával az expozíció megkezdése előtthypoxia. (2) A mikrofotók három független kísérlet reprezentatív példái. Oszlopok és hibasávok a grafikonokon: Minden oszlop 3 különböző kísérlet átlag±SEM értékét jelenti *P<0.01 vs.=""><0.01 vs="">hypoxia;**P<0.01 vs.="" normoxia="" and="">hypoxiaplusz ZVAD.

COX-2(ciklo-oxigenáz)/iPGE,/EP receptor útvonal közvetíti a hipoxia által kiváltott proximális tubuláris HK{0}} sejthalált.

A COX szerepének felmérése érdekében-2(ciklo-oxigenáz)/iPGE2/EP receptor útvonal behypoxia-indukált HK-2 sejthalál, először előinkubáltuk a sejteket celekoxibbal, egy COX-2(ciklo-oxigenáz)inhibitor1; AH6809, az EP1, EP2 és EP3 receptorok antagonistája vagy GW627368X, az EP4 receptor antagonistája33; vagy brómkrezolzölddel vagy bromosul-foftállal mindkettőben a PGT435 inhibitorai. A PGT-t is leütöttük siRNS-sel történő transzfekció révén.

2. ábra: COX-2(ciklo-oxigenáz)/iPGE,/EP receptor útvonal közvetíti a hipoxia által kiváltott proximális tubuláris HK-2 sejthalált.a) A sejthalál megelőzése az útvonal inhibitorai által. Felső panel; Az oszlopok a teljes sejthalál százalékát (balra) vagy az apoptotikus annexin V plusz sejtek százalékát (jobbra) mutatják. Mielőtt kitévehypoxia, a sejteket 1 órán át előinkubáltuk 3 μM celekoxibbal (COX{3}}(ciklo-oxigenáz)inhibitor）;10 μuM AH6809, (EP1-3 receptor antagonista), 10 μM GW627368X (EP4 receptor antagonista); vagy 50 μM brómkrezolzölddel (BG) vagy 25 μM brómszulfoftaleinnel (BrS), két PGT-inhibitorral. Alsó panel: Bal: A sejthalál megelőzése a PGT leállításával siRNS-sel történő transzfekció révén (trypan blue dive kizárási teszt). Inset: A PGT leütésének hatékonysága (Western blot analízis) Jobbra: A brómkrezol zöld (BG) preventív hatásának koncentrációfüggése. (b) A sejthalál megelőzése prosztaglandin-inaktiváló enzimet 15-hidroxi-prosztaglandin-dehidrogenáz(15-PGDH) cDNS-t tartalmazó emlős expressziós vektorral történő transzfekcióval (tripánkék festék kizárási teszt). 11}}PGDH (Western blot analízis) transzfektált sejtekben. c)HypoxiaPGT-érzékeny növekedést indukál az iPGE-ben, Balra: PGE-függő immunfluoreszcencia önmagában vagy DAPI-val való magfestéssel kombinálva látható (eredeti nagyítás, 40×) Jobbra: A bal oldali panelen bemutatott képek kvantitatív megközelítése Image J szoftverrel. (d) Az EGFR aktiváció gátlója Az AG1478 nem akadályozza meg a HK-2 sejthalált EGFR. A sejteket 1 órán át előinkubáltuk 1 μM AG1478-cal, mielőtt alávetettük volnahypoxia. (e) A PGT-gátló BG nem módosítja a Bax és a Bcl{0}} expresszióját a HK-2 sejtekbenhypoxia(Western-blot analízis). (f) Megelőzésehypoxia/reoxigenáció által kiváltott sejthalál az útvonal gátlói által (trypan blue festék kizárási teszt). A sejteket előinkubáltuk az útvonal inhibitoraival, és alávetettükhypoxiamint az a) pontban. Ezután a sejteket 3 órán át normoxiának tesszük ki. Általános információ: (1) A sejteket 24 órán át inkubáltuk normoxikus (21% O) vagy hipoxiás (1% O) körülmények között, amint azt a "Módszerek" részben jeleztük. (2) A mikrofotók három független kísérlet reprezentatív példái. (3) Az inhibitorok oldószerei (luL/mL táptalaj) nem módosították a hatásáthypoxiaa sejthalálra (az eredményeket nem mutatjuk be). (4) Western blot analízis: Az egyenlő fehérje jelenlétét anti- -aktinnal vagy anti-GAPDH antitesttel végzett szondával igazoltuk. 5<0.01><0.01>hypoxiavagyhypoxia/reoxigénezés.

Amint az a 2a. ábrán látható,hypoxia- az indukált proximális tubuláris sejthalál minden esetben megelőzhető volt. Az apoptózis celekoxib általi gátlása azt jelezte, hogy a COX-2(ciklo-oxigenáz)lényeges szerepet játszik abbanhypoxia-indukált apoptotikus sejthalál (2a. ábra, felső panel, jobb). Pontosabban, az a tény, hogy az apoptózist az EP-receptorok antagonizmusa akadályozta meg, arra utal, hogy az apoptózist a COX közvetíti-2(ciklo-oxigenáz)A PGE -függő termelése. Másrészt a legvalószínűbb, hogy az iPGE hozzájárulhypoxia-indukálta a HK-2 sejthalált, mert megakadályozta; (i) a PGT gátlása (2a. ábra) vagy (i) a 15-PGDH túlzott expressziója (2b. ábra), amely inaktiválja az iPGE2-t oxidáció25(megjegyzendő, maga a transzfekciós eljárás megnövelte a HK-2 sejtek érzékenységéthypoxia: a sejthalál 45-55 százalék volt a transzfekció esetén a kontroll körülmények között, míg a nem transzfektált sejtekben mért 15-20 százalék). További támogatás az iPGE hozzájárulásához, ahypoxia-indukált HK-2 sejthalál, korábbi megállapításaink szerinthypoxiameghatározza az iPGE,1 sejttartalom növekedését, és hogy ezt a növekedést a PGT-inhibitorok megakadályozták (2c. ábra).

A MAPK jelátviteli utak apoptózist indukálhatnak. Mivel az iEP receptorok transzaktiválják az epidermális növekedési faktor receptort (EGFR)36, ami az ERK1/2 és p38 MAP kinázok aktiválásához vezet HK-2 sejtekben0, megkérdeztük, hogy - a HK-2 sejtek inkubációja az EGFR aktivációt gátló AG1478-cal megakadályozvahypoxia-indukált sejthalál. Negatív eredményeket találtunk (2d. ábra), ezért nem valószínű, hogy az EGFR transzaktivációja közvetíti a HK-2 sejthalált.hypoxia.

Számos kísérleti modellben a mitokondriális eredetű ATP csökkentése soránhypoxiaa Bax pro-apoptotikus fehérje és az anti-apoptotikus fehérje Bcl-2 expressziós arányának növekedését okozza, ami a citokróm C citoszolba való felszabadulásához, a kaszpáz 9 aktiválásához, majd a lefelé irányuló effektor hasításához és aktiválásához vezet. kaszpázok37,38. Azonban a PGT inhibitor BG-vel való előinkubálás HK-2 sejtekben alatthypoxianem eredményezett olyan változásokat, amelyek összeegyeztethetők a Bc-2 és a Bax expressziója közötti egyensúly antiapoptotikus eltolódásával (2e. ábra), ami nem támogatja e fehérjék szerepét a HK-2 sejtben. halál alatthypoxia.

A hipoxiás expozíciót követően a reoxigenizációs epizódok (ischaemia/reperfúziós sérülés) további sejtkárosodást okozhatnak. A reoxigenációs sérülés "paradoxona" annak figyelembe vételével érthető meg, hogy a sejtek specifikus változásokon mennek keresztül az enzimaktivitásokban, a mitokondriális funkciókban, a citoszkeletális szerkezetben, a membrántranszportban és az antioxidáns védekezésben.hypoxia, amelyek aztán együttesen hajlamosítanak a reoxigenációs sérülésre39. A reoxigénezés hozzájárul az akut vesekárosodáshoz ischaemiás stroke, vesetranszplantáció, keringési elégtelenség vagy vese- és szív- és érrendszeri műtétek során. Ebben az összefüggésben a potenciális terápiás értéke a gátláshypoxia/reoxigenáció által kiváltott proximális tubuláris sejthalál a COX-be való beavatkozás révén-2(ciklo-oxigenáz)Az /iPGE,/iEP receptor útvonal nyilvánvaló. Ezért megkérdeztük, hogy az iPGE konkrétan közvetít-ehypoxia-indukált sejthalált vagy közvetíti ishypoxia/reoxigenáció által kiváltott sejthalál (egy in vitro modell, amely in vivo vese ischaemiát/reperfúziós sérülést utánoz). Amint az a 2f ábrán látható, a sejthalált (a tripánkék merülési kizárási teszttel értékelve) megakadályozta a COX-2(ciklo-oxigenáz)celekoxib inhibitor, valamint az AH6809 vagy GW627368X EP receptor antagonisták. Ugyanúgy, mint a 2a. ábránál, ezek az eredmények arra utalnak, hogy a COX-2 releváns szerepet játszik a folyamatbanhypoxia/reoxigenáció által kiváltott sejthalál, pontosabban a COX által közvetített sejthalál-2(ciklo-oxigenáz)-függő PGE termelés, mivel ezt az EP receptorok antagonizmusa akadályozta meg. Mivel azonban a sejthalált nem akadályozták meg a brómkrezolzöld vagy a bróm-moszulfoftalein PGT-gátlók (2f ábra és 2d kiegészítő ábra), valószínűbb, hogyhypoxiaA /reoxigenáció által kiváltott HK-2 sejthalált kizárólag az extracelluláris PGE közvetíti.

A COX HIF-1 -függő transzkripciós szabályozása-2(ciklo-oxigenáz)génexpresszió hozzájárul ahypoxia-indukált növekedés az iPGE-ben, a proximális tubuláris HK-2 sejtekben. A PGE bioszintézise magában foglalja az arachidonsav felszabadulását a membrán glicerofoszfolipideiből a foszfolipáz A által, majd az arachidonsav COX izoenzimjei által prosztaglandin H-vé történő átalakulását, végül pedig a prosztamirigy izomerizációját H-ben PGE-vé, a prosztaglandin E szintézis által. mint például a mikroszomális PGE-szintáz-1 (mPGES-1)19. Azt találtukhypoxia-a HK-2 sejtekben kiváltott apoptózist nagy valószínűséggel egy COX-2 közvetíti(ciklo-oxigenáz)-függő PGE termelés növekedése,(2. ábra). Tekintettel arra, hogy a COX-2(ciklo-oxigenáz)egy enzim, amelynek expresszióját indukálhatjahypoxia, azt feltételeztük, hogy ahypoxia- a PGE indukált növekedése, a HK-2 sejtek termelése a COX-2 expresszió növekedésének a következménye lehet(ciklo-oxigenáz). Hipotézisünk megerősítésére megvizsgáltuk (i) a hatásáthypoxiaa COX kifejezéséről-2(ciklo-oxigenáz)fehérje és mRNS és (ii) a COX hatása-2(ciklo-oxigenáz)inhibitor celekoxib ahypoxia-indukált iPGE növekedés, Eredményeink azt mutattákhypoxiaátmeneti módon meghatározva a COX transzkripciós felszabályozását-2(ciklo-oxigenáz)kifejezés(3a,b ábra)és a COX-2(ciklo-oxigenáz)gátlás tompította az iPGE növekedését a HK-2 sejtekbenhypoxia(3c. ábra). Érdekes módon,hypoxiaszintén meghatározta az mPGES-1 fehérje expressziójának átmeneti fokozódását (3a. ábra, betét), de nem befolyásolta az mPGES-1 mRNS expresszióját (3b. ábra, betét). Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a COX fokozott expressziója-2(ciklo-oxigenáz)és az mPGES-1 felelős ahypoxia-indukált iPGE növekedés.

3. ábra. A COX HIF-la-függő transzkripciós szabályozása-2(ciklo-oxigenáz)A génexpresszió hozzájárul az iPGE hipoxia által kiváltott növekedéséhez a proximális tubuláris HK-2 sejtekben.(a) A COX kifejezése-2(ciklo-oxigenáz)a fehérje átmenetileg megnövekszikhypoxia(Western-blot analízis). Inset: Az mPGES{0}} fehérje expresszióját szintén átmenetileg szabályozzahypoxia. (b)COX kifejezés-2(ciklo-oxigenáz)Az mRNS átmenetileg megnövekszik ahypoxia. Inset: Az mPGES{0}} mRNS expresszióját nem befolyásoljahypoxia. (c)Celekoxib, egy COX általi megelőzés-2(ciklo-oxigenáz)által kiváltott iPGE növekedésének inhibitorahypoxia. A sejteket 1 órán át előinkubáltuk 3 μM celekoxibbal. A bal∶PGE-függő immunfluoreszcencia önmagában vagy a DAPI-val végzett magfestéssel egyesítve látható (eredeti nagyítás, 40×). Jobbra: A bal oldali panelen megjelenített képek mennyiségi megközelítése az Image J szoftverrel. d) A transzkripciós mechanizmusok hozzájárulása. Balra: A transzkripciós inhibitor actinomycin D(Act. D) megakadályozza ahypoxia-indukált COX növekedés-2(ciklo-oxigenáz)fehérje expressziója (Western blot analízis). A sejteket 1 órán át előkezeltük 1 ug/ml Act-tel. D, mielőtt ki lenne tévehypoxia3 óráig.Jobbra: COX aktivitásának növekedése-2(ciklo-oxigenáz)riporter konstrukció. (e) A HIF-la YC-1 inhibitora megakadályozzahypoxia-indukált transzkripciós COX-2(ciklo-oxigenáz)fel-szabályozás. A sejteket 1 órán át előinkubáltuk 0,5 uM YC-1-val. Balra: COX megelőzése-2(ciklo-oxigenáz)fel-szabályozás. A sejteket exponáltukhypoxia8 óráig. Központ: COX aktivitás növekedésének megelőzése-2(ciklo-oxigenáz)riporter konstrukció. Jobbra: HRE-vezérelt riporter konstrukció aktivitásának gátlása. A sejteket exponáltukhypoxia8 órán keresztül.(f) A HIF-la inhibitor YC-1 növeli az apoptotikus sejthalált (áramlási citometriai vizsgálatok). Mielőtt kitévehypoxia, a sejteket 1 órán át előinkubáltuk 0,5 μM YC-1-val. Inset∶ YC-1 gátolja ahypoxia-indukált növekedés a HIF-1a expresszióban (Western blot analízis). Általános információ: (1) A sejteket 24 órán át inkubáltuk normoxikus (21% O) vagy hipoxiás (1% O,) körülmények között, amint azt a "Módszerek" részben jeleztük. (2) A mikrofotók három független kísérlet reprezentatív példái. (3)Western-blot analízis: A fehérje egyenlőségét anti- -aktin antitesttel végzett szondázással igazoltuk. (4) Oszlopok és hibaoszlopok a grafikonokon: Minden oszlop 3 különböző kísérlet átlag±SEM értékét jelenti *P<0.01 vs.="" other="">

A transzkripciós mechanizmusok COX növekedéséhez való hozzájárulásának további vizsgálata-2(ciklo-oxigenáz)alatti fehérje expressziójahypoxia, a COX kifejezése-2(ciklo-oxigenáz)HK{0}} sejtekben értékelték, amelyeket a transzkripciót gátló aktinomicin D-vel előinkubáltak, mielőtt alávetettük volnahypoxia5 órán keresztül. Ahogy a 3d. ábrán látható,hypoxia-indukált COX növekedés-2(ciklo-oxigenáz)A fehérje expresszióját az aktinomicin D megakadályozta.hypoxiaegy COX aktivitásának növekedését is meghatározta-2(ciklo-oxigenáz)HK-2 sejtekben korábban transzfektált promóter konstrukció (3d. ábra jobbra). Összességében a 3d. ábrán látható eredmények arra utalnak, hogy a transzkripciós mechanizmusok hozzájárulnak ahypoxia-indukált COX növekedés-2(ciklo-oxigenáz)fehérje expresszió. Ennek ellenére eltérés volt a COX-2 promóter aktiválásának és a maximális COX-2 időzítése között.(ciklo-oxigenáz)mRNS expresszió: míg a COX átmeneti növekedése-2(ciklo-oxigenáz)Az mRNS expressziója 2 óra elteltével volt maximális (3b. ábra), a COX-2 promoter 3 óra múlva aktiválódott (3d. ábra), ami valószínűleg a poszttranszkripciós mechanizmusok hozzájárulását tükrözi a COX{{6} növekedéséhez. }}(ciklo-oxigenáz)kifejezés4. Ennek megfelelően azt feltételezzük, hogy a COX-2(ciklo-oxigenáz)alatt stabilizálódik az mRNShypoxia, ami megnövekedett COX-szintet eredményezne-2(ciklo-oxigenáz)mRNS expressziója anélkül, hogy (abban a pillanatban) hozzájárulna a COX fokozott aktivitásához-2(ciklo-oxigenáz)promóter. Az is lehetséges azonban, hogy a promoter aktiválása és a mérhető szubsztrát felhalmozódása közötti időeltolódás szintén hozzájárulhat a COX-2 promoter aktiválásának és a maximális COX{{1} időzítése közötti eltéréshez. }}(ciklo-oxigenáz)mRNS expresszió.

A HIF-1 egy heterodimer transzkripciós faktor, amely az oxigénfüggő -alegységből és a konstitutívan kifejezett -alegységből áll. Alatthypoxia, a HIF-l felhalmozódik és belép a sejtmagba, ahol a HIF-1 dimerizálás után létrehozza a HIF-1 transzkripciós faktort. A HIF-1 ezután elősegíti a célgénjei expresszióját azáltal, hogy kötődikhypoxia- reagáló elemek (HRE-k), amelyek a szabályozó régiójukban jelen vannak, és ezt követően a celluláris adaptív válaszokat irányítják a leküzdés érdekébenhipoxia 3. Tekintettel arrahypoxiaaktiválhatja a COX-ot-2(ciklo-oxigenáz)HIF{0}}függő módon, a COX-2 promoterszekvenciában jelen lévő funkcionális HRE-n keresztül2, megvizsgáltuk a HIF-l szerepét egyhypoxia-indukált COX növekedés-2(ciklo-oxigenáz)kifejezés. Megvizsgáltuk a HK-2 sejtekben transzfektált COX-2 promoter konstrukció aktivitását is. Amint a 3e. ábrán látható, előinkubálás a HIF-1a YC-1 inhibitorral, amely eltompulthypoxia- egy HRE riporter konstrukció HIF-la expressziójának és aktivitásának indukált növekedése, ami megakadályozta a COX mindkét expressziójának növekedését-2(ciklo-oxigenáz)és a COX tevékenysége-2(ciklo-oxigenáz)HK{0}} promóter konstrukciója alá van vetvehypoxia. Összefoglalva, az eredmények a 3a-e ábrákon láthatók alátámasztják azt az elképzelést, hogy a COX-2 HIF-1 -függő transzkripciós felszabályozása(ciklo-oxigenáz)felelős ahypoxia-indukált iPGE2 növekedés.

Bár a HIF aktiválásának következményei-1a onhypoxia-indukált apoptózis ellentmondásosak (valószínűleg azért, mert kontextusfüggőek lehetnek), elemeztük (előzetesen) a HIF-1a szerepét kísérleti rendszerünkben. Mivel korábban azt tapasztaltuk, hogy a beavatkozás a COX-ban-2(ciklo-oxigenáz)/iPGE, EP receptor útvonal gátolja a HIF-la expresszió növekedését, amelyet ahypoxia8,56 megkérdeztük, hogy a HIF-la gátlása megelőzi-e ahypoxia-indukált HK-2 sejt apoptózis. A 3f. ábrán látható, hogy az YC-1-val, egy HIF-l-inhibitorral végzett előinkubálás ténylegesen megnövekedetthypoxia- indukált apoptózis. Ezért nem valószínű, hogy a HlF-la

Vita

Szövethypoxiaúgy gondolják, hogy mind a krónikus vesebetegség, mind az akut vesekárosodás patofiziológiájában kritikus jelentőségű, mivel a PTC a vesetubulusok legérzékenyebb része a vesetubulusok ellen.hypoxia. Itt megvizsgáltuk a PGE szerepét az általa okozott kárbanhypoxiahumán PTC-re, és azt találták, hogy az iPGE fokozott termelése a COX HIF-la-függő felszabályozásából ered.{3}}(ciklo-oxigenáz)génexpresszió és az mPGES{0}} fokozott expressziója hozzájárulhypoxia-indukált apoptotikus sejthalál HK-2 sejtekben. Tekintettel arra, hogy a tubuláris hipoxia mind az akut, mind a krónikus vesebetegségek szempontjából releváns tényező-2, ezek az eredmények a prosztaglandin transzporter PGT-t, mint új terápiás célpontot mutatnak a vesebetegségekben.

Hypoxianemcsak növeli az iPGE-t, hanem annak az extracelluláris közegbe történő felszabadulását is, így a szekretált (sejten kívüli) PGE szintén szerepet játszhathypoxia-indukált apoptózis (például apoptotikus kaszkádok kiváltása a sejtmembránon található EP receptorok kanonikus aktiválása révén). Két korábbi tanulmány kimutatta, hogy a sejthalál alatthypoxiaszintén a COX miatt volt-2(ciklo-oxigenáz)-függő termelés a PGE,1345. Másrészt bizonyos sejttípusokban (fibroblasztok, mikroglia, neuronok és akut limfoblaszt leukémia sejtvonalak) a PGE. által kiváltott apoptózist az EP-receptorok PGE-függő aktiválása közvetíti46-48. Itt azt találtukhypoxia-indukált HK-2 sejt apoptózist az EP receptorok antagonizmusa is megakadályozta (2a. ábra, jobb oldali felső panel). De mivel az EP-receptorokat klasszikusan plazmamembrán-receptorokként írják le – így az iPGE2- számára elérhetetlenek, úgy gondoljuk, hogy az iPGE apoptotikus hatását közvetítő EP-receptorok a hipoxiás HK-2 sejtekben intracellulárisan elhelyezkedő alcsoport (azaz iEP receptorok).

Ellentétben az iPGE2 szerepével ahypoxia-indukált apoptózist HK-2 sejtekben, azt találtuk, hogy csak az extracelluláris PGE közvetíthypoxia/reoxigenáció által kiváltott HK-2 sejthalál, mivel azt nem akadályozták meg a PGT inhibitorai (2f. ábra). Bár a sejtsérülés kóros mechanizmusai utánhypoxia/reoxigénezés nem teljesen ismert, elfogadott, hogy a sejthalál nagyrészt túlzott reaktív oxigénfajták (ROS) termelése révén következik be. Ez különösen igaz a HK-249,50-es cellákra. Azonban bárhypoxianövelheti a ROS termelését is, legjobb tudomásunk szerint nincs bizonyíték arra, hogy a ROS szerepet játszanahypoxia-indukált HK-2 sejthalál. Ez arra utal, hogy a hipoxia és a hipoxia/reoxigenáció halálos hatásait a HK-2 sejtekben különböző mechanizmusok közvetítik, ami megmagyarázhatja, hogy a BG és a BS miért védelmethypoxiade nem ellenehypoxia/reoxigénezés. Következésképpen a PGT gátlása terápiás előnyökkel járhat a PTC-ben a hipoxia által kiváltott sejtkárosodás ellen, de nem a PTC káros hatásai ellen.hypoxia/reoxigénezés.

HIF-1 -függő COX-szabályozás-2(ciklo-oxigenáz)számára kritikus esemény volthypoxia-indukált HK-2 sejt apoptózis (3e. ábra). Az a megfigyelésünk azonban, hogy a HIF inhibitor YC-1 fokozta az apoptotikus sejthalált (3f. ábra), elgondolkodtató, bár korábbi jelentések már hasonló eredményeket mutattak1. Az egyik lehetséges magyarázat egy hipotetikus forgatókönyv, amelyben a HIF-la nemcsak a COX pro-apoptotikus felszabályozását közvetíti{10}}(ciklo-oxigenáz)hanem a védőmolekulák felszabályozása is. Valójában a HIF{1}}szabályozta a védőmolekulák kifejeződéséthypoxiamint például a hosszú, nem kódoló RNS DARS-AS1' és mikroRNS-2103 specifikusan megtalálható a HK-2 sejtekben. Bár ezek a bizonyítékok alátámasztják hipotetikus forgatókönyvünket, konkrét kísérleteket kell végezni ennek megerősítésére.

A vesesejtek válaszának vizsgálata ahypoxiajavíthatja a vesepatológia megértését. Megvizsgáltuk, bár előzetes módon, a Bax pro-apoptotikus fehérje és az anti-apoptotikus fehérje Bcl-2 expressziós arányának növekedésének szerepéthypoxia-indukált apoptózis a HK-2 sejtekben. Eredményeink azt mutatták, hogy a PGL gátlása nem eredményezett olyan változásokat, amelyek összeegyeztethetőek a Bcl-2 és a Bax expressziója közötti egyensúly antiapoptotikus eltolódásával (2e. ábra), ami nem támasztja alá e fehérjék szerepét a iPGE-függő HK-2 sejthalál alatthypoxia. Legjobb tudomásunk szerint csak két tanulmány létezik a Bcl{{0}}/Bax tengelynek a hipoxia által kiváltott apoptózisban való szerepéről PTC-ben, és mindkettő anoxikus" vagy közel anoxikus oxigénkoncentrációt tartalmaz5 Amikor a PTC-t 0,2 százalékos O. hatásnak tették ki, a Bax-expresszió változatlan maradt, és az apoptózis a csökkent Bcl-2 expressziós fokhoz kapcsolódott. A Bcl-2 expresszióját azonban 1% O nem befolyásolta, annak ellenére, hogy Az apoptózis jelenléte, ami egybeesik az eredményeinkkel, ezért más olyan mechanizmusokat is figyelembe kell venni, amelyek nem feltétlenül járnak együtt a Bcl-2 vagy a Bax expresszió mennyiségi változásával: például az apoptózis indukálásához tenyésztett gliómasejtekben iPGE2-vel csak az szükséges. fizikai kapcsolata a Bax-szal, ami kiváltja a Bax transzlokációját a mitokondriumokba202. Így az a mechanizmus, amelyen keresztül az iPGE hozzájárul a HK-2 sejt apoptózisához, további vizsgálatokat érdemel.

Csoportunk úgy találta, hogy egy COX-2(ciklo-oxigenáz)-függő iPGE növekedés, apoptotikus halált közvetít a ciszplatinnak kitett HK-2 sejtekben, apoptotikus testek7" éshypoxia(jelenlegi eredményeink). Mivel a PGE gyorsan kiszabadul a sejten kívülre, miután megtestesült2, a PGl általi befelé irányuló transzportja kritikus szerepet játszik a HK-2 sejtekben az iPGE által kiváltott apoptózisban. Ezért, amikor a PTC-károsodást az iPGE közvetíti, a PGT-inhibitorokkal végzett kezelés hasznos terápiás megközelítés lehet olyan potenciális alkalmazásokban, mint a ciszplatin által kiváltott PTC-károsodás megelőzése, a tubuláris sérülések apoptotikus testeken keresztüli terjedésének gátlása vagy a káros hatásahypoxiaa PTC-n.