A normál és cisztás vese nephronjainak háromdimenziós felépítése
Mar 17, 2022
további információ:ali.ma@wecistanche.com
Thomas Blanc1,2,7, Nicolas Goudin3,7, Mohamad Zaidan1,4,7, Meriem Garfa Traore3, Frank Bienaime1,5,Lisa Turinsky1, Serge Garbay1, Clement Nguyen1, Martine Burtin1, Gerard Friedlander1,6, Fabiola Terzi1,8és Marco Pontoglio1,8
1Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale U1151, Centre National de la Recherche Scientifique UMR8253, Université de Paris, Institut Necker Enfants Malades, Département «Croissance et Signalisation», Párizs, Franciaország;2Service de Chirurgie Viscérale etUrologie Pédiatrique, AP-HP, Hôpital Necker Enfants Malades, Párizs, Franciaország;3Structure Fédérative de Recherche Necker, US{0}}UMS3633, Paris, France; 4Service de Néphrologie-Transplantation, AP-HP, Hôpital Bicêtre, Le Kremlin-Bicêtre, Franciaország;5Service d'ExplorationsFonctionnelles, AP-HP, Hôpital Necker Enfants Malades, Párizs, Franciaország; és6Service d'Explorations Fonctionnelles, AP-HP, HôpitalEuropéen Georges Pompidou, Párizs, Franciaország
KULCSSZAVAK: cisztásvesebetegség;vese; nefron; nephronophthisis; szövettisztítás
Fordítási nyilatkozat
A tisztítási módszerek egyedülálló eszközt nyújtanak annak megértéséhez, hogy a morfológiai változások hogyan vezetnek kóros következményekhez.Vesekritikus szervek, amelyek fenntartják a test homeosztázisát a víz, a metabolit és az elektrolit kezelésén keresztül, amelyek döntően függenek a szervezet összetett 3-dimenziós szerkezetétől.nefronok.Amikor ez a szerkezeti szervezet megváltozik, a vese patofiziológiája következik be. Jelen tanulmányban egy optikai törlésen, többfoton mikroszkópián és digitális nyomkövetésen alapuló hatékony módszert fejlesztettünk ki aveseegynefron szinten fiziológiás és kóros körülmények között. Különösen a policisztás vese első 3-dimenziós rekonstrukcióját biztosítjuk egyetlen léptékben.nefronok. Ez a módszer számos kóros összefüggésben alkalmazható, lehetővé téve a vesekárosodás összetett folyamatának jobb megértését, és ennek következtében célzottabb terápiás stratégiák kidolgozását.
A vese komplexén keresztül tartja fenn a test homeosztázisát3-dimenziós(3D) nefron szerkezet. Ha ez a szerkezeti felépítés megváltozik, a vese patofiziológiája következik be. KrónikusveseA betegségeket a veseelváltozások kialakulása jellemzi. Érdekes módon a patológusok széleskörű heterogenitásról számoltak be a krónikus vesebetegségek során előforduló elváltozások eloszlásában.1,2 Nem ismert, hogy ez azt a tényt tükrözi-e, hogy bizonyos nefronszegmensek eltérően sérülhetnek, vagy pedig azt, hogy egyes nefronok eltérően hajlamosak a sérülésekre. A probléma megoldásához kötelező rekonstruálni a 3D (Háromdimenziós) formájanefronokkóros összefüggésekben.
Tudomásunk szerint,nefronokcsak soros 2D metszetekkel rekonstruálták teljesen.3–5. Bár a szabványos szövettani metszetek nagy felbontást biztosítanak, a 3D-rekonstrukciók munkaigényesek és nehezen elkészíthetők. Ez elsősorban a mechanikai torzulásoknak köszönhető, ami a szeletelési eljárás elkerülhetetlen hatása. Ezenkívül a 3D (2D-s képekből történő rekonstrukció) nem teszi lehetővé a 3D-s struktúrák közvetlen képalkotását az egész szövetekben.
A többfoton mikroszkópia javította azon képességünket, hogy vastag metszetekben morfológiai változásokat észleljünk. Jelentős korlátozás azonban a fényszóródás miatti sekély elérhető mélység. A törésmutató-különbségek minimalizálásával a tisztítószerek drámai módon javították a mélység képalkotási képességét.6,7 Annak ellenére, hogy az első tisztítószert egy évszázaddal ezelőtt vezették be,8 csak a közelmúltban fejlesztettek ki több tisztító protokollt, főként az agy számára.9 –17 A legújabb tanulmányok kimutatták, hogy képesek más szilárd szervek, például a máj, a hasnyálmirigy vagyvese.18–26
Policisztásvesea betegség, egy genetikailag heterogén rendellenesség, amely számos ciliáris gén mutációjával jár, a leggyakoribb örökletes vesebetegség.27,28 Policisztásvesea betegségre jellemző a ciszták kialakulása, amelyek a vese teljes pusztulásához vezetnek.28 A mikrodisszekciós vizsgálatok azt sugallták, hogy a ciszták akár egy nefronszegmens „kinyomódásaként” is kialakulhatnak, mint az autoszomális domináns policisztás vesebetegségben; mint a gyűjtőcsatornák (CD-k) eksztatikus expanziója, mint az autoszomális recesszív policisztábanvesebetegség; vagy kizárólag medulláris tubulusokban, mint a nephronophthisis (NPHP) esetén.27,29 Azonban hogyan fejlődnek ki a ciszták 3D-ben (Háromdimenziós) és szerveződnek egymással, és a normál szomszédos tubulesis még ismeretlen.
Itt kombináltuk az optikai törlést a multifotonmikroszkópiával, hogy új betekintést nyújtsunk a módjábanefronokfiziológiás körülmények között formálódnak és szerveződnek, és hogyan módosulnak a betegségek, például a cisztogenezis során. Eredményeink azt mutatják, hogy 3 típusa vannefronokés hogy az erek befolyásolhatják a nefronok térbeli szerveződését. Érdekes módon megfigyeltük, hogy a nefronok hajlamosak meghatározott síkokban feküdni. Amikor ezt a technikát jckegereken alkalmaztuk, váratlanul azt tapasztaltuk, hogy a ciszták csak a specifikus nefron szegmensekben fejlődtek ki, és a fusiform ciszták normális tubulusokkal keveredtek.
Kattintson ideCistanchemellékhatásokvesebetegségre
EREDMÉNYEK
Kísérleti elrendezés
Az egész alakjának tanulmányozásanefronokkörnyezetükkel kapcsolatban optikai tisztításon és multifoton mikroszkópián alapuló technikát alkalmaztunk (S1A kiegészítő ábra). A különböző optikai törlési protokollok összehasonlításával megállapítottuk, hogy avese, a benzil-alkohol / benzil-benzoát (BABB) volt a legmegfelelőbb a hatékonyság szempontjából (S1B és C kiegészítő ábra és S1 kiegészítő táblázat).
3D (Háromdimenziós) a rekonstrukció és a digitális nyomkövetés jó minőségű, nagy felbontású és magas jel-háttér arányú képeket igényel. Megfigyeltük, hogy a natív fluoreszcencia által biztosított optikai jel nem volt egyenletes a vesemetszeteken. Különösen a medulla képei rosszul kontrasztosak voltak az alacsony jel-háttér aránnyal (S2 kiegészítő ábra). A jel-háttér arány javítása érdekében a metszeteket periodikus sav-Schiff-fel megnyugtatjuk (S1D kiegészítő ábra), mert tapasztalati úton megállapítottuk, hogy ez a festés nagy kontrasztot eredményez a vékony metszetekben a 2-fotonfluoreszcencia során. A jel azonban nem volt egyenletes az egész vastag periodikus sav-Schiff-festésselveseszakaszok (S1E kiegészítő ábra). Ezért a vesemetszeteket fluorokróm-kapcsolt lektinekkel festettük meg: földimogyoró-agglutinin és búzacsíra-agglutinin, amelyek megfestik a glomerulusokat és tubulusokat, valamint Griffonia simplicity I folia agglutinin, amely a vérereket jelzi. drámaian megnőtt a teljes vese szakaszokban, jelentős javulással mind az XY síkban, mind a z tengelyben (S1E kiegészítő ábra és S1 kiegészítő film).
3D nephron szegmens vizualizáció
Az egész alakjának vizualizálásanefronok, nyomon követtük útjukat, a glomerulus vizeletpólusától kezdve és a CD csomópontjáig (S2 kiegészítő film). Annak ellenére, hogy a használt lektinek globálisan megkötik az összes nefronszegmentumot, észrevettük, hogy gondos vizsgálat során ezeket a lektinek sajátos mintázata jellemezte a különböző nefronszegmensek bazális vagy luminális membránjainak festődésében. Más szóval, kihasználtuk a lektinfestés sztereotip mintáját a különböző nefron szegmensek azonosítására. Ily módon könnyen azonosíthatunk 6 entitást: a proximális tubulus (PT), a Henleloop vékony végtagja (TL), a HL vastag felszálló végtagja (TAL), a disztális csavart tubulus (DCT), az összekötő tubulus (CNT), és CD-t. A PT és a TL közötti átmenetet a tipikus PT kefe határjelének hirtelen elvesztése és a lumen szélességének csökkenése jellemezte, ami gyakorlatilag hiányzott a TL-ben (1a. ábra). Ezzel szemben a TL és a TAL közötti átmenetet a külső tubuláris átmérő jelentős növekedése és a viszonylag állandó lumenszélesség jellemezte (1b. ábra). Az összes nefronban a TAL átmenete DCT-re szisztematikusan a glomerulus vaszkuláris pólusánál volt megfigyelhető. Ezt az átmenetet a külső tubuláris átmérő hirtelen megnagyobbodása jellemezte, amely túlnyomórészt a lumenátmérő jelentős növekedésének volt köszönhető (1c. ábra). A DCT és a CNT közötti átmenetet mind a tubulus átmérőben, mind a lumenben az ardukció jellemezte (1d. ábra). Végül a CNT és a corticalis CD közötti kapcsolatot a tubuláris átmérő és a lumen hirtelen növekedése jellemezte (1e. ábra). Ezeknek a morfológiai átmeneteknek a számszerűsítése statisztikailag szignifikáns volt (1f ábra), és helytállóságát specifikus tubuláris markerekkel történő festéssel igazoltuk (S3–S5 kiegészítő ábrák és S3–S5 kiegészítő film).
A PT-k alakja és mérete mélységük szerint különbözik
A festés vastagvesemetszetek lehetővé tették számunkra, hogy nyomon kövessük a teljes PT szegmensek térbeli fejlődésének koordinátáit. Érdekes módon felfedeztük, hogy alakjuk rendkívül változó, és a glomerulusaik kéregben elfoglalt helyzete határozza meg. Globálisan 3 mintát azonosítottunk. Az első a legfelszínesebbnek felelt megnefronok(SN-ek) (2a. ábra; S6 kiegészítő film), amely a kéreg legkülső részét foglalta el (a legkülső 30 százalékot a vesekapszulához közel). Tekervényes részeik kompakt struktúrákat alkottak, mindössze 6-7 kanyarulattal a saját glomerulusuk körül, és nagyon kis és szorosan tömött tereket foglaltak el. Ezen SN-ek konvolúciója hosszú és egyenes pars recta-ban végződött, amely a velőbe ereszkedett. Ennek a spektrumnak a másik végén a kéreg legmélyebb részében (40 százalékkal nagyobb belső mélységben), a velő mellett (juxtamedulláris nefronok [JN-ek]) egy második nefronmintázatot figyeltünk meg (2a. ábra; S6 kiegészítő ábra és kiegészítő film). S6). PT-jüket egy kezdeti rövid hurok jellemezte, amely szisztematikusan a papilla felé ereszkedett, majd az U megfordult, hogy a vese kapszula felé emelkedjen. Az SN-ekkel ellentétben a JN proximális tekercses tubulusokat nagy tekercsek jellemezték, amelyek saját glomerulusuk körül alakultak ki, és nagy, lazán csomagolt doméneket foglaltak el a juxtamedulláris kéregben. A JN-ek PT-jének csavart része 10-15 konvolúciót tartalmazott, amelyek nagy doméneket alkottak. Végül a harmadik minta a kéreg középső részében található nefronokat tartalmazta (középső nefronok [MN-ek]) (2a ábra; S6 kiegészítő film). Érdekes módon ezeknek a tubulusoknak alakja és térbeli orientációja volt, ami átmenetet jelentett az SN-ek és a JN-ek között. Valójában 8-9 konvolúciót tartalmaztak olyan tekercsekkel, amelyek nagyobbak voltak, mint az SN, de kisebbek a JN-eknél. Ezenkívül az MN-ek pars recta hosszabbak voltak, mint a JN-ek. Érdekes módon a PT-k formáinak globális összehasonlítása azt mutatta, hogy az SN-ek és az MN-ek homogén mintázatot mutattak, míg a JN-k rendkívül heterogének voltak (S6 kiegészítő ábra). Ezen kívül több térbeli rekonstrukciójanefronok feltárta, hogy a PT-k soha nem keverednek egymással (SupplementaryMovie S6), ami azt jelzi, hogy minden nefron elfoglalja a saját egyéni terét a kéregben.
A morfometriai elemzések megerősítették a nagy különbségeket az SN-ek és a JN-ek méretében és alakjában, az MN-ek köztes szempontjával. A JN-ek PT-je több mint 2-szor hosszabb volt, mint az SN-ek PT-je (2b. ábra); az egyenesség azonban nagyobb volt az SN-ekben, mint a JN-ekben (2c. ábra), összhangban azzal a megfigyeléssel, hogy a JN-tubulusok sokkal kanyargósabbak voltak (2a. ábra; S6 kiegészítő ábra).
1. ábra|A nefronszegmensek azonosítására használt morfológiai kritériumok. (a–e) A nephron incontrol egerek különböző szegmenseinek morfológiája.Nefronoka glomerulus vizeletpólusától a gyűjtőcsatornáig vezették le (proximális tubulus [PT]: türkiz; a Henle-hurok vékony szára [TL]: világosszürke; a Henle-hurok vastag felszálló végtagja [TAL]: sötétszürke; disztális csavart tubulus [DCT]: rózsaszín; összekötő tubulus [CNT]: sárga; kérgi gyűjtőcsatorna [CCD]: narancs). A nyilak a különböző nefronszegmensek átmérőjét jelzik. (Folytatás)
1. ábra|(Folytatás) (f) A különböző nefronszegmensek külső csőátmérőjének számszerűsítése. Az adatokat átlagban fejezzük ki±SEM. Varianciaanalízis, majd Tukey-Kramer teszt: **P < 0.01, ***P < 0,001.
2. ábra |HáromdimenziósA (3D) proximális tubulus rekonstrukció 3 különböző formát és szervezetet tár fel. (a) A proximális tubulusok reprezentatív 3D-rekonstrukciós képei a teljes vesekéregen keresztül, 3 szintre (fehér vonalak) osztva a proximális tubulusok (PT-k) alakja szerint: felületes (kék), középső (zöld) és juxtamedulláris (vörös) kéreg, a kéreg külső 30 százalékának, középső 30 százalékának és belső 40 százalékának felel meg. Vegye figyelembe a 3 típus különböző alakjátnefronokés különösen a juxtamedulláris tubulusok hossza és tekervényessége. Bar{{0}} mm. (b,c) A 3 típusú proximális tubulus (b) hosszának és (c) egyenességének számszerűsítése. d) A glomerulusok térfogatának mennyiségi meghatározása az egyes kéregrégiókból. Az adatokat átlagos SEM-ként fejezzük ki. Varianciaanalízis, majd a Tukey-Kramer teszt: juxtamedulláris PT versus felületes PT: ###P < 0.001;="" juxtamedulláris="" pt="" versus="" középső="" pt:="" ***p="">< 0,001;="" felületes="" pt="" versus="" középső="" pt:="" $$$p=""><>
3. ábra |HáromdimenziósA (3D) nefron rekonstrukció 3 különböző típusú nefront tár fel. (a) Reprezentatív 3D képek egy egész nefronról (bal oldali panelek) a glomerulusoktól a gyűjtőcsatornáig a felületes kéregben (kék), a középső kéregben (zöld) és a juxtamedulláris régióban (piros) a kontroll egerekben. Nefronszegmentáció (jobb oldali panelek) a 3 különböző típusú nefronhoz. Bar=150 mm. (b) A Henle-hurok két szára közötti belső távolság számszerűsítése a 3 típusú nefron esetében. c) A nefron hosszának számszerűsítése a (folytatás)
3. ábra|(folytatás) 3 félenefronok. (d) A nefron különböző szakaszai hosszának számszerűsítése a nefron típusa szerint. Az adatokat átlagban fejezzük ki±SEM. Varianciaanalízis, majd a Tukey-Kramer teszt: juxtamedullaris nephron (JN) versus felszíni nefron (SN): ###P < 0.001;="" jn="" versus="" középső="" nefron="" (mn):="" *p="">< 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001.="" cnt,="" összekötő="" cső;="" dct,="" disztálisan="" csavarodott="" tubulus;="" pt,="" proximális="" tubulus;="" tal,="" a="" henle-hurok="" vastag="" felszálló="" ága;="" tl,="" a="" henle="" hurok="" vékony="">
A glomeruláris mérete a mélységtől függően változik
Ezután elemeztük a 3 zóna mindegyikéből véletlenszerűen kiválasztott glomerulusok mélységét és átmérőjét. A morfometrikus elemzések kimutatták, hogy a glomerulusok átlagosan 783, illetve 355 mm-re helyezkedtek el a vesekapszulától JN-ben, illetve SN-ben. Amint arról korábban beszámoltunk, megfigyeltük, hogy a glomerulusok mérete a mélységüktől függően változott. Különösen a JN-ek glomeruláris térfogata volt háromszor nagyobb, mint az SN-eké és az MN-eké (2d. ábra).
3D nephron rekonstrukció
Ezután nyomon követtük az egész térbeli fejlődésétnefronokPT-től CNT-ig. 3D-s képük globális képe (Háromdimenziós) rekonstrukciója megerősítette, hogy a nefron alakja különbözött az SN-ek, MN-ek és JN-ek között (3a. ábra; S7 kiegészítő film). Ez a különbség főként a PT szerkezetének köszönhető. Ezenkívül megfigyeltük, hogy a HL-nek más a 3D térbeli szervezete. Különösen a TL és a TAL távolabbi elkülönülést mutattak a JNsthanban az SN-ekben és az MN-ekben (3b. ábra). A morfometriai elemzések kimutatták, hogy a JN-ek globálisan 2-szer hosszabbak, mint az SN-ek (3c. ábra). A megnövekedett hossz arányosan eloszlott minden szegmensben, kivéve a TAL-t és a DCT-t, amelyek általában hasonló abszolút hosszúságúak voltak minden nefrontípusban (3d. ábra). Ez arra utalt, hogy a nephron megnyúlása meglepően homogén mintázatú folyamat.
Az íves erek befolyásolják a juxtamedulláris PT konvolúciót
Ahhoz, hogy átfogóbb perspektívát nyerjünk aveseszerkezetében kihasználtuk a Griffonia simplicifoliaagglutinin festést, amely lehetővé tette, hogy nyomon kövessük az íves ereket és azok ágait a kortikális sugárerekbe (4a ábra; S8 kiegészítő film). Érdekes módon az egyidejű 3D (Háromdimenziós) a nefronok és erek rekonstrukciója azt mutatta, hogy az íves erek meglepően párhuzamos térbeli elrendezésben vannak a közeli tubulusokkal. Különösen azt figyeltük meg, hogy az adott JN-ek (korlátozott JN-ek) által követett útvonal általában a közeli ér útját követi (4b. ábra; S9 kiegészítő film). Figyelemre méltó, hogy ez a torzítás (csak a JN egy részhalmazában figyelhető megnefronok) magyarázza a PT alakjainak nagy heterogenitását (S6 kiegészítő ábra). A morfometriai elemzések kimutatták, hogy a „korlátozott” PT-k szignifikánsan hosszabbak és kanyargósabbak (csökkentett egyenesség), mint a „nem kényszerítettek” (4c. és d. ábra). Érdemes megjegyezni, hogy mind az SN-ek, mind az MN-ek csavart részei az íverek felett helyezkedtek el, és nem voltak korlátozva.
Cisztanche-krónikus vesebetegség
A tubulusok hajlamosak síkban feküdni
Érdekes módon a 3D (Háromdimenziós) alakjainefronokjelezte, hogy hajlamosak síkban feküdni (5a. ábra; Kiegészítő film S10). Ennek a paraméternek a számszerűsítésére és ennek a konformációnak a lehetséges statisztikai torzításának felmérésére megmértük a tubulusok általános hajlamát arra, hogy kihajoljanak a hurok által meghatározott síkból. Méréseink azt mutatták, hogy összehasonlítva a véletlenszerű séta szimulált modelljével, amelyet az egymást követő pontok között mért azonos szögekkel és hosszúsággal generáltak (5b. ábra), a tubulusok a síktól való kisebb eltéréssel fejlődtek ki (5c. ábra). Ez azt jelezte, hogy a csővezetékek korlátozzák az útjukat egy sík mentén. A megfigyelt különbségek statisztikailag erősen szignifikánsak voltak (P <>
A 3D-s nephron rekonstrukció a cisztafejlődés sajátos mintáját tárja fel
Annak megállapítására, hogy protokollunk lehetővé teszi-e a nefronok nyomon követését rendezetlen patológiás szövetekben, jellemeztük a ciszták alakját és térbeli eloszlását jack egerekben, amely az NPHP és a cisztás betegség széles körben használt modellje.31–33 3D képek azt mutatták, hogy annak ellenére, hogy kiemelkedő ciszták megjelenése, az általános 3D (Háromdimenziós) a nefronok lefutása nem tért el szignifikánsan a kontroll egerekétől (S11 kiegészítő film). Hasonlóképpen a morfometriai elemzések is megerősítették, hogy anefronok, a glomeruláris térfogat és az egyes nefron szegmensek hossza összehasonlítható volt a kontroll egerekével (S7 kiegészítő ábra). Megjegyzendő, hogy a ciszták kialakulása miatt nem tudtuk megkülönböztetni a TL-t a TAL-tól a HL-ben. Minden nefronban fusiform ciszták fejlődtek ki (S11 és S12 kiegészítő filmek). Az egyik legszembetűnőbb jellemző az volt, hogy a fusiform cisztás tágulások több helyen is előfordultak ugyanazon nefronszegmens mentén (S12 és S13 kiegészítő filmek). Érdekes módon megfigyeltük, hogy ciszták soha nem fejlődtek ki a PT-kben és a HL-es leszálló végtagokban (6a ábra; S12 kiegészítő film). Ezzel ellentétben túlnyomórészt HL felszálló végtagokban, DCT-ben, CNT-ben és a CD-k felső részében voltak kimutathatók, a CNT-vel folytonosan (6a. ábra; S12 kiegészítő film). Különösen azt figyeltük meg, hogy a DCT, valamint a CNT szegmensek sajátosan megnövelték a ciszták kialakulásának valószínűségét a megfelelő távolabbi részeikben (6b. ábra). A 3D rekonstrukciós képek kvantitatív morfometriai elemzése kimutatta, hogy a nefronkénti teljes cisztatérfogat különösen magas volt a CNT-ben (7a. ábra). Ezenkívül megfigyeltük, hogy a ciszta megnagyobbodása HL-ben és DCT-ben nagyobb volt a JN-ben, mint az SN-ben és az MN-ben (7a ábra; S12 kiegészítő film). Ezenkívül a ciszták előfordulása szignifikánsan magasabb volt a JN-ben, mint a többi típusbannefronok(7b. ábra). Azt is megfigyeltük, hogy az átlagos glomerulusok közötti távolság (a legközelebbi 5 glomerulusra számítva) különösen megnövekedett incystikus egerekre jellemző, különösen a felületesebb kéregben (S8 kiegészítő ábra).
4. ábra|Az erek határozzák meg a nefron alakját. (a)Háromdimenziósaz érarchitektúra rekonstrukciója az íves erektől a kortikális sugárerekig. Rúd ¼ 200 mm. (b) A "nem kényszerített" (felső panel) és a "korlátozott" (alsó panel) juxtamedulláris proximális tubulusok reprezentatív képei. Rúd ¼ 100 mm. (c, d) A "nem kényszerített" és "korlátozott" juxtamedulláris proximális tubulusok (c) hosszának és (d) egyenességének számszerűsítése. Az adatokat átlagban fejezzük ki±SEM. Mann-Whitney teszt: "korlátozott" versus "nem kényszerített":*P < 0.05,="" ***p=""><>
3D (Háromdimenziós) számos ciszta rekonstrukciója feltárta, hogy rendkívül változó alakúak és térfogatúak (6c ábra; S11 és S13 kiegészítő filmek). A HL felszálló végtagjában a ciszták kis átmérőjű fusiform alakúak voltak. A DCT-ben a ciszták meglehetősen gömb alakúak és nagyobbak voltak, és nem tágult tubulusok között helyezkedtek el. Érdekes módon a DCT és a CNT közötti átmenetet szisztematikusan normális, nem tágított szerkezet jellemezte. Ezzel szemben a CNT-ben szisztematikusan megfigyeltünk egy összefüggő kitágult cisztás struktúrát, amely közvetlenül érintkezik a CD-vel. Érdekes módon a CD-ben ez a struktúra fokozatosan normál tubulusméretre zsugorodott. A CD szomszédos részében további cisztákat nem lehetett kimutatni. Egy másik következetes jellemző volt a ciszták sajátos térbeli szerveződése a HL felszálló végtagban. Valójában, bár a ciszták mélyebbek és közelebb voltak a hurokhoz az SN-ekben, felületesebbek és közelebb voltak a DCT-hez a JN-ekben (6c. ábra). Ismét a ciszták köztes pozíciót foglaltak el az MN-ekben (6c. ábra).
5. ábra|A nefron tubulusok hajlamosak lapos szerkezetként fejlődni. (a) A nephron proximális tubulusának tipikus útja. Ez az útvonal szemlélteti annak hajlamát, hogy egy síkban feküdjön. Az út fejlődésének síkszerűsége jobban látható, ha megfelelően elforgatjuk és a megfigyelői nézőponthoz igazítjuk (lásd ugyanannak a csőszakasznak a jobb oldali ábrázolását, amely a bal oldalon egy másik szögben van ábrázolva) . (b) Egy 4 szegmensből álló csőalakú útvonal sematikus ábrázolása (egy adott cső alakú útvonalat meghatározó 5 pont között példaként). Az, hogy az utak milyen mértékben szoktak kimenni "síkjukból", az itt "béta"-ként jelzett szöggel ábrázolható. (Folytatás)
5. ábra|(Folytatás) Ezt a szöget a p3-p4 szakasz között mérjük a síkhoz képest (amelyet a közvetlenül megelőző p3, p2 és p1 pontok határoznak meg), és egy sötétszürke téglalap ábrázolja a sémában. A béta-szögek kiszámítását ezután rekurzív módon kiszámítottuk a cső alakú útvonal pontjaival együtt. Ezen béta-szögek torzításának mértékének értékeléséhez véletlenszerű sétát szimuláltunk (Monte Carlosimulation [MCs]) az egyes cső alakú útvonalak egymás utáni alfa-szögeinek ugyanazon halmazával (az összes egymást követő szegmens között mérve). Ez a véletlenszerű séta egy utat generált azonos alfa-szögekkel és véletlenszerű béta-szögekkel. (c) A béta-szögek globális eloszlását és az MC-k eredményét ábrázoló hegedűdiagramok a proximális tubulusban (PT), a Henle-hurok vékony végtagjában (TL), a Henle-hurok vastag felszálló végtagjában (TAL), a disztális csavart tubulusban (DCT) ), és a kötőtubulus (CNT). MCs, P <>
VITA
A hagyományos szövettani módszerek csak korlátozottan képesek kimutatni a patológiás változásokat, amelyek befolyásolják a globális alakotnefronok. Itt bemutatunk egy hatékony, a szövettisztításon alapuló megközelítést, amely képes megválaszolni a döntő kérdéseketvesearchitektúra soha nem látott térbeli részletekkel normál és kóros körülmények között. Eredményeink 3 féle nefron létezését igazolták, amelyek elhelyezkedésükben, alakjukban és méretükben különböznek egymástól, összhangban funkcionális sajátosságukkal. Ezenkívül kimutattuk, hogy a nephronstend síkban fekszik és alkalmazkodik az erek térbeli szerveződéséhez. Érdekes módon, amikor ezt a technikát a cisztás vesebetegség modelljére alkalmaztuk, azt tapasztaltuk, hogy a ciszták az összes nefronban fejlődnek ki, de csak bizonyos szegmensekben. Érdekes módon kimutattuk, hogy a ciszta alakja a nephronszegmenstől függően változik, és hogy ugyanazon a nefron mentén a ciszták interkalálódnak normál, nem kitágult tubulusokkal. Összességében ezek az eredmények adják az első 3D-t (Háromdimenziós) térbeli elrendezésének jellemzésenefronokés fontos alapot biztosítanak egy kóros folyamat, például az aszcisztogenezis megértéséhez.
A vese optikai tisztítása kihívást jelent a magas szintű autofluoreszcencia és a sejtsűrűség miatt. Különböző elszámolási protokollok összehasonlításával a BABB-ben egy hatékony technikát azonosítottunk a legmélyebb részében található struktúrák megjelenítésére és rekonstrukciójára.vese, vagyis a medulla. Ezenkívül a BABB gyors és méretezhető, és a törlés után a minták hónapokig tárolhatók a képfelvétel előtt. Ennek a technikának egy másik fő előnye az alacsony költség. A tisztítószerek a struktúrák zsugorodását vagy megnagyobbodását eredményezhetik.9–17 Mivel azonban a vese méretének ezek a módosulásai izotrópok, a relatív méréseket várhatóan nem befolyásolja, és nem torzítja az értelmezésüket. Az egyik legfontosabb korlát a struktúrák megjegyzése, ami nagyon időigényes. Ennek ellenére egyre több olyan mélytanuláson alapuló technika létezik, amelyeknek gyorsan le kell küzdeniük ezt a korlátot.
A klasszikus technikákkal kapott eredményekkel összhangban vizsgálatunk kimutatta, hogy a nefronok alakjuk és hosszuk helyzetük szerint különbözik. Különösen azt figyeltük meg, hogy a JN-ekben fejlettebb, csavarodott PT-k és nagyobb glomerulusok vannak, és kétszer hosszabbak, mint az SN-ek. A hossznövekedés harmonikus folyamat eredménye, mivel a megnyúlás arányosan érinti az összes nefron szegmenst. Azt is megfigyeltük, hogy a JN-eknek nagyobb a HL-je. Összességében ezek az adatok egyértelműen azt mutatják, hogy az SN-ek és JN-ek mikroanatómiája jelentősen eltér, és hogy az MN-ek köztes jellemzőket mutatnak. Érdekes módon fiziológiai vizsgálatok kimutattáknefronokfunkcionálisan is különböznek egymástól.2 A különbségek hátterében álló morfogenetikai események még nem ismertek. Így csábító az a feltételezés, hogy a JN-k sajátos szerkezete magyarázhatja funkcióik sajátosságát.
Érdekes módon azáltal, hogy először biztosítjuk a 3D-t (Háromdimenziós) rekonstrukciójanefronokés az őket körülvevő erek, felfedeztünk egy térbeli korlátot az íves erek és a nefronok egy alcsoportja között. Így elképzelhető, hogy az erek megszabhatják a nefronok meghosszabbodását a fejlődés során.34,35 A nefronok 3D-s alakjának vizsgálata számítási szimulációkkal kombinálva azt is feltárta, hogy a nefronok soha nem keverednek össze, és minden nefron hajlamos egy síkban feküdni. Ennek a megfigyelésnek a funkcionális jelentőségét még tisztázni kell.
Ciszta kialakulása policisztás alattveseA betegség még mindig izgalmas folyamat. Az NPHP, a ciszta kialakulásával jellemezhető kóros állapot, a leggyakoribb genetikai betegség, amely végstádiumú vesebetegséget okoz gyermekeknél és serdülőknél. Eddig húsz NPHP gént azonosítottak.36 Közülük a NEK8 a soha nem inmitózis A-val rokon kinázcsalád egy tagját kódolja, amely szerepet játszik a csillóműködésben és a sejtciklus progressziójában.37 A Nek8-at eredetileg jck egerekben mutált génként jellemezték.32 Nevezetesen, ugyanazon fehérjedoménben az amutációról kimutatták, hogy NPHP9-hez vezet emberben.{8}}D tanulmányok azt sugallták, hogy a cisztafejlődés drámai mértékben eltér a policisztás vesebetegség különböző formái között.27,29 Különösen az NPHP-ben a ciszták származnak. kizárólag a CD-ből és a DCT-ből.31 Bár informatívak, ezek az immunhisztokémiai vizsgálatok nem vitatják azt a lehetőséget, hogy a specifikus tubuláris markerek elvesztése39 mesterségesen magyarázza ezt a megfigyelést. Így a mi 3D (Háromdimenziós) tanulmány szolgáltatja az első egyértelmű bizonyítékot arra, hogy a ciszta kialakulása olyan folyamat, amely csak meghatározott nephronszegmenseket foglalhat magában. Érdekes módon bár a NIMA (Never In mitosisgene A)-Related Kinase 8 (NEK8) az összes nefronszegmens citoplazmájában expresszálódik, a csillókban kifejeződése a DCT-re és a CD-re korlátozódik. Mivel csak ezek a szegmensek hajlamosak ciszták kialakulására,31 feltételezhetjük, hogy a NEK8 ciliáris funkciójának megzavarása a cisztaképződés döntő eseménye. Érdekes módon azt is megfigyeltük, hogy a fusiform ciszta a normál, nem tágított tubulusokkal folytonosan alakul ki. Az a tény, hogy a recesszív csíravonal-mutáció csak a sejtek egy részében vezet kóros fenotípushoz, arra utal, hogy egy második esemény ciszta kialakulását válthatja ki ezekben a sejtekben, amint azt az autoszomális domináns policiszta esetében javasolják.vesebetegség.40,41
6. ábra |HáromdimenziósA (3D) nephron rekonstrukció azt mutatja, hogy a ciszták csak meghatározott nefronszegmensekben fejlődnek ki. (a) Reprezentatív 3D képek egy teljes nefron (bal oldali panelek) cisztatérfogatú renderelésével a glomerulusoktól a gyűjtőcsatornáig a felületes kéregben (kék), a középső kéregben (zöld) és a juxtamedulláris régióban (piros) jack egerekben. Nephron szegmentálás (jobb oldali panelek) a 3 különböző típushoznefronok. Bar=150 mm. (b) Ciszták kialakulásának valószínűsége a különböző nefronszegmensekben jack egerekben. (Folytatás)
6. ábra|(Folytatás) A vízszintes tengely a nefronok normalizált hossza, amely 50 tartálynak felel meg (proximális tubulus [PT], türkiz; Henleloop [HL], fehér; disztális tekercses tubulus [DCT], rózsaszín; összekötő tubulus [CNT], sárga). (c) Reprezentatív 3D ciszták rekonstrukciós képek a HL (bal oldali panelek), a DCT-k (középső panelek) és a CNT-k, valamint a kérgi gyűjtőcsatornák (CCD-k) (jobb oldali panelek) felszálló végtagjának cisztatérfogatú renderelésével felületes (felső panelek), középső (középső panelek) panelek) és juxtamedulláris (alsó panelek) nefronok jack egerekben. Bar= 50 mm.
7. ábra|A ciszta eloszlásának és térfogatának jellemzése a nefronban. (a) A teljes cisztatérfogat (a nefrononkénti ciszták összege) számszerűsítése minden egyes nefronszegmensre (Henle-hurok [HL], fehér; disztális csavart tubulus [DCT], rózsaszín; összekötő tubulus [CNT], sárga) és (b) a ciszták által elfoglalt tubulus hossza az egyes nefrontípusok esetében (felületi: kék; középső: zöld; juxtamedullaris: piros) jackegerekben. Az adatokat átlagban fejezzük ki±SEM. Varianciaanalízis, majd a Tukey-Kramer teszt: juxtamedulláris nefron [JN] versus felületi nephron [SN]: #P < 0.05;="" jn="" versus="" középső="" nefron="" [mn]:="" *p="">< 0,05,="" **p=""><>
Azt is megfigyeltük, hogy a ciszta-megnagyobbodás dominánsabb JN-ben, mint SN-ben, legalábbis figyelembe véve a PT és CNT között elhelyezkedő cisztákat. Következetesen arról számoltak be, hogy a glomerulosclerosis összefüggésében a glomeruláris elváltozások gyakrabban fordulnak elő JN-ekben, mint az inSN-ekben.1,21,42 A megnövekedett egyetlen nephron glomeruláris filtrációs rátája és a transzport/enzimatikus aktivitások miatti túlmunka okozza-e a JN-k fokozott érzékenységét. a romlás érdekes hipotézis, amely további vizsgálatot érdemel.
Összefoglalva egy új technikát írunk le a képalkotáshozvese3D-ben (Háromdimenziós) megfelelő molekuláris specifitással és felbontással ahhoz, hogy közvetlenül rögzítse a speciálisan jelölt belső struktúrák térbeli és mennyiségi eloszlását (nefronokerek és ciszták). Tekintettel a kényelemre, a gyorsaságra és a közvetlen számszerűsítés lehetőségére, arra számítunk, hogy ez a technika hatékony eszközzé válik a vese patofiziológiájának megértésében.
MÓD
Állatok
Minden állatkísérletet jóváhagyott a "Services Vétérinairesde la Préfecture de Police de Paris" és a Paris Descartes Egyetem etikai bizottsága. Két hónapos FVB/N egereket (n=20) használtunk a kísérleti feltételek beállításáhozveseA vizsgálatot ezután 2-hetes jack hím egereken (n=4) és kontroll alomtársakon (n=3) végezték.
A veseszövetek előkészítése
Leölés előtt az egereket intrakardiális katéterezéssel perfundáltuk 25 ml heparinizált sóoldattal (1000 NE/l), majd 75 ml 4%-os paraformaldehiddel foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS). A kísérleteket xilazin (Rompun 2%, Bayer, Leverkusen, Németország, 6 mg/g testtömeg) és ketamin (Clorketam 1000, Vetoquinol SA, Lure, Franciaország, 120 mg/g testtömeg) érzéstelenítésben végezték.
Az elszámolási tanulmányokhozvese4%-os paraformaldehidben fixáltuk 4 órán át, majd 4%-os agarózba és 1.{4}}mm vastagságú metszeteket vettünk fel, amelyek körülveszik a vesecsontot, és PBS-ben 4°C-on tárolták.fokozat. A vese szakaszokat először megfestették, majd kitisztították.
A vékony metszeteken végzett immunhisztokémiai vizsgálatokhoz a veséket 4 százalékos paraformaldehidben rögzítettük egy éjszakán át, majd paraffinba ágyazott és 4-mm-es metszeteket vágtunk.
Festés
Periodikus sav-Schiff festés. Az 1.{1}}mmveseA metszeteket tiszta vagy 1:100 arányban PBS-sel hígított periodikus sav-Schiff-ben inkubáltuk 5 percig szobahőmérsékleten, mielőtt megtisztítottuk.
Immunhisztokémia vékony paraffinba ágyazott metszeteken. A paraffinba ágyazott vesék négy mikrométeres metszeteit felmelegítettük az antigén kinyeréséhez, és egy éjszakán át 4 °C-on inkubáltuk.4 fokflfluorokróm-kapcsolt lektinekkel a tubulusok nyomon követésére (rodamin-földimogyoró-agglutinin [RL-1072-5] és rodamin-búzacsíra-agglutinin [RL-1022-5], Vector Laboratories, Burlingame, CA, 1:200 arányban hígítva) és szegmens- specifikus elsődleges antitest a különböző tubuláris szegmensek ábrázolására (biotinilált Lotus tetragonolobus lektin [B-1325], Vector Laboratories, 1:100 arányban hígítva; egér anti-Calbindin D28K[D-4], Santa Cruz, Heidelberg, Németország, 1:200 arányban hígítva; kecske anti-AQP2 [C-17], Santa Cruz, 1:200 hígítás). Másnap a metszeteket a másodlagos antitesttel 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk (Alexa Fluor 488 konjugátum [S32354], Invitrogen; kecske elleni Alexa Fluor 488 [A-11055], Invitrogen; egér elleni AlexaFluor 488 [A-21202], Invitrogen, Carlsbad, CA; mind 1:500 arányban hígítva), mielőtt 40,6-diamidino-2-fenil-indollal színeznék. Az összes képet Nikon Eclipse E800 mikroszkóppal (Champignysur Marne, Franciaország) készítettük, és Fidzsi-szigeteki szoftverrel (1.50-es verzió) készítettük el. Lektinfestés vastag metszeteken. Az 1.{37}}mm vastagveseszakaszokat 4-en inkubáltuk4 fok1 hónapig Texas Red vagy flfluoreszcein izotiocianát kapcsolt lektinekben: földimogyoró-agglutinin (RL-1072-5) és búzacsíra-agglutinin (RL-1022-5), 1:1 arányban hígítva00 0,1% PBS-azidban és 0,1% Triton-X-ben. A metszeteket ezután minden nap 2 héten át PBS-sel mostuk tisztítás előtt.
Cisztanche-vese funkció
Optikai törlés
Skála törléséhez 1.5-mmvesea metszeteket ScaleA2-ben (4 M karbamid, 0,1 százalék Triton X-100, 10 százalék glicerin) vagy ScaleB4-ben (8 Murea, 0,1 százalék Triton X{10}} inkubáltuk ) 2 hétig, legfeljebb 1 évig, 4-korfokozat.
A BABB-tisztításhoz 1,{1}} mm-es vesemetszeteket dehidratáltunk szobahőmérsékleten, egymást követő etanolos öblítésekkel. A mintákat ezután BABB-ben (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO) 1:2 arányban inkubáltuk legalább 2 napig 4 °C-on.
Kétfotonos mikroszkópos képfelvétel
A szöveteket vizes géllel leképeztük fordított multifotonmikroszkópon (LaVision BioTec), amely Mai Tai HP Titanium-Sapphire lézerrel (Spectra-Physics, Santa Clara, CA) volt felszerelve (kiegészítő S1A ábra). A gerjesztési hullámhossz 815 nm volt a teljesítmény 8 százalékánál. 20-ast használtunk.Xvízbe merülő objektív (XLUMPLFL20XW, Olympus [Tokió, Japán]; numerikus rekesz, 0.95; munkatávolság, 2,0 mm). A fluoreszcencia felvételéhez nem deszkennelt detektort használtunk 80 százalékon, 593/40 nm-es sávszűrővel.
Az első lépés a 2D mozaikkép gyűjtése a középső z kötegnél szuboptimális felvételi paraméterek (400 mm x 400 mm és 1011 x 1011 pixel, 10 százalékos átfedéssel és 2-es lineáris átlagolás) felhasználásával a legrelevánsabb központi mezők kiválasztásához (S9A kiegészítő ábra). ). Miután meghatároztuk az XY rácsot és a z érdeklődési területet, a paramétereket beállítottuk, hogy kiváló minőségű képeket kapjunk. Egy ilyen megközelítés az érdeklődési területet 5-re csökkentetteX12 mező z veremenként. Ezután 850 z-es kötegeket/optikai szeleteket (1- mm-es lépésméret) szereztünk a vese középső részén.veseszakasz.
Képek összefűzése, feldolgozása és nyomon követése Minden egyes köteg a Preibischet al.43 által kifejlesztett módszer szerint lett csempézett, amely lehetővé teszi nagy képgyűjtemény összefűzését a Fidzsi-szigeteki szoftver „Rács/Gyűjtés összefűzése” beépülő moduljával (HTTP://Fiji. sc/Fidzsi). Mivel az összeillesztés után fontos eltolódást figyeltünk meg a két szomszédos kép között, Pythonban írtunk egy egyedi illesztő programot. Ez a program kompenzálja a képeltolódást, lehetővé téve a képek helyes igazítását (S9B kiegészítő ábra). Az összefűzött-javított képeket az Imaris 8.4.2-es verziójával elemeztük (Bitplane, Zürich, Svájc). Tubulusok és erek nyomon követték az Imaris filamentum-nyomkövető csomag kézi üzemmódját, és csatlakoztak hozzájuk egy Imaris Xtension, amelyet a MATLAB-bal fejlesztettünk (https://www.dropbox.com/s/sm9u5em3orjrpmc/Standalone_Csatlakozás{12}} Filament_Tool.zip?dl=0) (S9C kiegészítő ábra). A glomerulus és ciszták 3D-s rekonstrukcióját az Imaris felületi csomagjának manuális módszerével végeztük. A 3D (Háromdimenziós) a glomerulusok térbeli szerveződését az Imaris foltcsomagjának kézi üzemmódjával jelenítettük meg.
Morphometry
A csőszegmens hosszát, a nefron hosszát és az egyenességet az Imaris filamentum nyomkövető csomagjával határoztuk meg. Az Imaris szoftver szerint az egyenességet a 2 pont távolságának és a nefron szegmensútjának hosszának arányaként határoztuk meg. Harmincegy PT és 12 egésznefronok3 vad típusú egérben rekonstruáltuk és megmértük, míg 37 PT-t és 17 fullnefront rekonstruáltunk és mértünk 4 jack egérben. A ciszta és a glomeruláris térfogatot az Imaris "felszíni csomagjával" határoztuk meg. Vad típusú egerekben harmincegy, illetve 34 glomerulust mértünk. Összesen hetvennégy cisztát mértek.
A csőszerű fordulatok "síkon kívüli" szögeit ("béta"-ként jelölve) megmértük a sík (3 egymást követő pont által meghatározott) és a következő, egymást követő negyedik pont térbeli iránya között (5b. ábra). A megfigyelt torzítás statisztikai szignifikanciájának értékeléséhez a béta szögek eloszlását szimuláltuk a béta szögek véletlenszerű elforgatásával (Monte Carlo szimuláció) olyan struktúrákban, amelyek ugyanazon szegmensekből álltak azonos alfa-szögkészlettel.
A cisztás elváltozás és a nefronszegmensek kialakulásának valószínűségének kiszámításához az egyes nefronokat térbeli pontkészlettel ábrázoltuk. Mindegyik pontot a ciszta jelenléte és a normál szerkezet és a szegmens típusa tekintetében annotáltuk. A valószínűséget minden egyes szabványos hosszúságnál (50 rekeszre állítva) a cisztás annotációval ellátott pontok száma és a tárolóban lévő pontok teljes száma közötti arányként számítottuk ki.
Az átlagos glomerulusok közötti távolság kiszámításához minden egyes glomerulusra a legközelebbi 5 glomerulusra számított átlagos glomeruláris távolságot vettük figyelembe.
Adatelemzések és statisztikák
Az adatokat átlag±SEM formában fejezzük ki. A kísérleti csoportok közötti különbségeket varianciaanalízissel értékeltük, majd ha szignifikáns (P < {0}}.05),="" tukey-kramer="" teszttel.="" amikor="" csak="" 2="" csoportot="" hasonlítottunk="" össze,="" a="" mann-whitney="" tesztet="" alkalmaztuk.="" a="" statisztikai="" elemzéseket="" graph="" prism="" szoftverrel="" (sandiego,="" ca,="" 9.0.0="" verzió)="">
KÖZZÉTÉTEL
Egyik szerző sem nyilatkozott egymással versengő érdekekről.
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
Köszönjük a Laboratoire Experimentation Animale et Transgenese (LEAT), a Szövetségi deRecherche Necker Szövettani és Képalkotó Platformjainak a technikai segítségét. Köszönjük Pierre Isnardnak, Marie-Claire Gublernek és Nicolas Kuperwassernek a kézirat kritikus elolvasását. Ezt a munkát az Institut National de laSanté et de la Recherche Médicale, Université Paris Descartes, Assistance Publique – Hôpitaux de Paris, Agence Nationale de laRecherche, Whoami Laboratoire d'Excellence Ki vagyok én, RochePharma Research and Early Development (Bázel, Svájc) támogatta. és Institut Roche de Recherche et de Médecine Translationnelle (Párizs, Franciaország).
A SZERZŐ HOZZÁJÁRULÁSAI
TB, NG és MZ tervezte és végezte el a kísérleteket, és elemezte az adatokat. FB, LT, MGT és SG is végzett néhány kísérletet és elemezte az adatokat. Az MB és a CN végezte az egérkísérleteket. TB és MZ is közreműködött a kézirat megírásában.GF átdolgozta a kéziratot. FT és MP biztosította a koncepcionális keretet és megtervezte a tanulmányt, felügyelte a projektet és megírta a dolgozatot.
Cistanche-Nephrons vese háromdimenziós architektúrája
KIEGÉSZÍTŐ ANYAG
Kiegészítő fájl (PDF)
S1 ábra. Kísérleti beállítás, gyűjtési eljárás és képfeldolgozás.
S2 ábra. Az autofluoreszcens jel határai XY és z felbontásban.
S3 ábra. A PT és a TL közötti átmenet kétdimenziós képe 4-mm paraffinba ágyazottveseszakaszok.
S4 ábra. A TAL és a DCT közötti átmenet kétdimenziós képe 4- mm-es paraffinba ágyazott vesemetszeteken.
S5 ábra. A DCT és a CNT közötti átmenet kétdimenziós képe 4- mm-es paraffinba ágyazott vesemetszeteken.
S6 ábra. A háromdimenziós rekonstrukció a proximális tubulusok 3 különböző formáját tárja fel.
S7 ábra.Háromdimenziósrekonstrukcióból kiderül, hogy a hossza és szegmentációjanefronoknem érintik a ciszták.
S8 ábra. A glomerulusok sűrűsége a kontrollban és a cisztásbanvese.
S9 ábra. Beszerzési eljárás és utókezelési képfeldolgozás.S1 táblázat. Az elszámolási módszerek összehasonlítása. Kiegészítő fájl (filmek)
S1 film. A lektinfestés jelentősen javítja a felbontást és a jel-háttér arányt.
S2 film. Egy tubulus útjának nyomon követése.
S3 film. Egy kitisztult vese háromdimenziós rekonstrukciója, amely a proximális tubulus és a Henle-hurok vékony végtagja közötti csatlakozást mutatja.
S4 film. Egy kitisztult vese háromdimenziós rekonstrukciója, amely a Henleloop vastag felszálló végtagja és a disztális, csavarodott tubulus közötti találkozást mutatja.
S5 film.Háromdimenziósegy tisztázott rekonstrukciójavesea distalis csavart tubulus és az összekötő tubulus találkozását mutatja.
S6 film. A proximális tubulusok alakja és mérete mélységüktől függően eltérő.
S7 film. Háromdimenziós nephron rekonstrukció kontroll egerekben.
S8 film. Egy ér útvonalának nyomon követése egy íves értől az akortikális sugárzó ér felé.
S9 film. Az íves erek modellezik a juxtamedulláris proximális tubulusok alakját.
S10 film.Nefronokhajlamosak egy síkban feküdni.
S11 film. A háromdimenziós nephron rekonstrukció a ciszta fejlődésének aspecifikus mintáját mutatja.
S12 film.HáromdimenziósA nefronszegmentáció azt mutatja, hogy a ciszták meghatározott nefronszegmensekben fejlődnek ki.
S13 film. Térbeli elrendezése és összefüggéseinefronokés erek egy policisztábanvese.
IRODALOM
1. Gazdag AR. A juxtamedullaryglomerulusok eddig nem leírt sebezhetősége lipoid nephrosisban. Bull Johns Hopkins Hosp. 1957;100:173–186.
2. Bankir L, Bouby N, Trinh-Trang-Tan MM. A nephronanatómia heterogenitása. Kidney Int Suppl. 1987;20:S25–S39.
3. Christensen EI, Grann B, Kristoffersen IB, et al.Háromdimenziósa patkány nefron rekonstrukciója. Am J Physiol Physiol. 2014;306:F664–F671.
4. Zhai XY, Birn H, Jensen KB és mtsai. Az egér proximális tubulusának digitális háromdimenziós rekonstrukciója és ultrastruktúrája. J Am Soc Nephrol.2003;14:611–619.
5. Zhai XY, Thomsen JS, Birn H, et al. Az egér nefron háromdimenziós rekonstrukciója. J Am Soc Nephrol. 2006;17:77–88.
6. Puelles VG, Moeller MJ, Bertram JF. Most már tisztán látjuk: optikai tisztítás ésvesemorfometria. Curr Opin Nephrol Hypertens.2017;26:179–186.
7. Seo J, Choe M, Kim SY. Tisztítási és címkézési technikák nagyméretű biológiai szövetekhez. Mol Cells. 2016;39:439–446.
8. Spalteholz W. Über das Durchsichtigmachen von menschlichen undtierischen Präparaten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang:Über Knochenfärbung. Lipcse, Németország: S. Hierzel; 1914.
9. Hama H., Kurokawa H., Kawano H. és munkatársai. Skála: kémiai megközelítés az átlátszó egéragy fluoreszcens képalkotásához és rekonstrukciójához.Nat Neurosci. 2011;14:1481–1488.
10. Ertürk A, Becker K, Jährling N, et al.Háromdimenziósoldószerrel tisztított szervek képalkotása 3DISCO segítségével. Nat Protoc. 2012;7:1983–1995.
11. Kuwajima T, Sitko AA, Bhansali P és munkatársai. ClearT: mosószer- és oldószermentes tisztító módszer idegi és nem idegi szövetek számára.Fejlesztés. 2013;140:1364–1368.
12. Ke MT, Imai T. Rögzített agyminták optikai tisztítása SeeDB segítségével. CurrProtoc Neurosci. 2014;66:2.22.1–2.22.19.
13. Chung K, Deisseroth K. CLARITY az idegrendszer feltérképezéséhez. NatMethods. 2013;10:508–513.
14. Tomer R, Ye L, Hsueh B, Deisseroth K. Advanced CLARITY az ép szövetek gyors és nagy felbontású képalkotásához. Nat Protoc. 2014;9:1682–1697.
15. Yang B, Treweek JB, Kulkarni RP és mtsai. Egysejtes fenotipizálás az átlátszó ép szöveten belül az egész test tisztításával. Sejt. 2014;158:945–958.
16. Susaki EA, Tainaka K, Perrin D és mtsai. Teljes agy képalkotás egysejtű felbontással kémiai koktélok és számítógépes elemzés segítségével. Cell.2014;157:726–739.
17. Alanentalo T, Asayesh A, Morrison H és mtsai. Tomografikus molekuláris képalkotás és 3D-s kvantifikáció felnőtt egér szerveiben. Nat Methods.2007;4:31–33.
18. Parra SG, Chia TH, Zinter JP és munkatársai. Megtisztított egérszervek többfoton mikroszkópja. J Biomed Opt. 2010;15:036017.
19. Renier N, Wu Z, Simon DJ és társai. iDISCO: egyszerű, gyors módszer nagy szövetminták immunjelölésére volumenképalkotáshoz. Sejt. 2014;159:896–910.
20. Lee H, Park JH, Seo I és mtsai. Az elektroforetikus szövettisztító technológia, a CLARITY továbbfejlesztett alkalmazása ép szilárd szervekre, beleértve az agyat, hasnyálmirigyet, májat,vese, tüdő és bél. BMC Dev Biol. 2014;14:1–7.
21. Iversen BM, Amann K, Kvam FI, et al. A megnövekedett glomeruláris kapillárisnyomás és méret közvetíti a glomerulosclerosis kialakulását az SHR juxtamedullarycortexben. Am J Physiol Physiol. 1998;274:F365–F373.
22. Angelotti ML, Antonelli G, Conte C, Romagnani P. Imaging the vese: from light to super-resolution microscopy. Nephrol Dial Transplant.2021;36:19–28.
23. Puelles VG, van der Wolde JW, Schulze KE, et al. Háromdimenziós módszer validálása podociták számlálására és méretezésére teljes glomerulusokban. J Am Soc Nephrol. 2016;27:3093–3104.
24. Pannabecker TL, Dantzler WH, Layton HE, Layton AT. Szerepeháromdimenziósfelépítése a vese belső velőjének vizeletkoncentráló mechanizmusában. Am J Physiol Physiol. 2008;295:F1271–F1285.
25. Saritas T, Puelles VG, Su XT et al. A vesében végzett optikai tisztulás a kálium által közvetített tubulusok átalakulását mutatja. Cell Rep. 2018;25:2668–2675.e3.
26. Schuh CD, Polesel M, Platonova E, et al. A vese kombinált szerkezeti és funkcionális képalkotása jelentős axiális különbségeket tár fel a tubulusok proximális endocitózisában. J Am Soc Nephrol. 2018;29:2696–2712.
27. Braun DA, Hildebrandt F. Ciliopathies. Cold Spring Harb Perspect Biol.2017;9:a028191.
28. Bergmann C, Guay-Woodford LM, Harris PC, et al. Policisztásvesebetegség. Nat Rev Dis Prim. 2018; 4:50.
29. Wilson PD. Policisztás vesebetegség. N Engl J Med. 2004;350:151–164.
30. Laitinen L, Virtanen I, Saxén L. Változások a glikozilációs mintázatban az egérvese embrionális fejlődésében, ahogy azt a lektinkonjugátumok kimutatták. J Histochem Cytochem. 1987;35:55–65.
31. Smith LA, Bukanov NO, Husson H, et al. A policisztás betegség kialakulása fiatalkori cisztás vese egerekben: betekintés a patogenezisbe, a ciliáris rendellenességekbe és az emberi betegség közös jellemzőibe. J AmSoc Nephrol. 2006;17:2821–2831.
32. Liu S, Lu W, Obara T et al. Egy új Nek-családba tartozó kináz hibája cisztás vesebetegséget okoz egérben és zebrahalban. Fejlesztés.2002;129:5839–5846.
33. Franke M, Baeßler B, Bechtel J et al. Mágneses rezonancia T2 térképezés és diffúziós súlyozott képalkotás a cisztogenezis és a terápiára adott válasz korai kimutatására policisztás vesebetegség egérmodelljében.VeseInt. 2017;92:1544–1554.
34. Barry DM, McMillan EA, Kunar B és mtsai. A nephron vascularis specializáció molekuláris meghatározói avese. Nat Commun. 2019;10:5705.
35. Perretta-Tejedor N, Jafree DJ, Long DA. Endothel-epiteliális kommunikáció policisztábanvesebetegség: vaszkuláris endothel növekedési faktor jelátvitel szerepe. Cell Signal. 2020;72:109624.
36. Srivastava S, Molinari E, Raman S, Sayer JA. Sok gén-egy betegség?A nephronophthisis (NPHP) és az NPHP-vel összefüggő rendellenességek genetikája.Front Pediatr. 2017;5:287.
37. Fry AM, O'Regan L, Sabir SR, Bayliss R. Sejtciklus szabályozása a proteinkinázok NEK-családja által. J Cell Sci. 2012;125:4423–4433.
38. Otto EA, Trapp ML, Schultheiss UT, et al. A NEK8 mutációk befolyásolják a ciliáris és centroszómális lokalizációt, és nephronophthisist okozhatnak. J Am SocNephrol. 2008;19:587–592.
39. Wilson PD. Apiko-bazális polaritás policisztás vesebetegség epitheliában.Biochim Biophys Acta. 2011;1812:1239–1248.
40. Happé H, Leonhard WN, van der Wal A, et al. A Pkd1-deléciós egerekből származó toxikus tubuláris sérülés a vesékben felgyorsítja a cisztogenezist, amelyet diszregulált planáris sejtpolaritás és kanonikus Wnt jelátviteli útvonalak kísérnek. Hum Mol Genet. 2009;18:2532–2542.
41. Piontek K, Menezes LF, Garcia-Gonzalez MA, et al. Egy kritikus fejlődési kapcsoló határozza meg a vese ciszta képződésének kinetikáját a Pkd1 elvesztése után. Nat Med. 2007;13:1490–1495.
42. Ikoma M, Yoshioka T, Ichikawa I, Fogo A. Mechanism of the uniquesuceptibility of deep cortical glomerulus of maturingvesesúlyos fokális glomeruláris szklerózisra. Pediatr Res. 1990;28:270–276.
43. Preibisch S, Saalfeld S, Tomancak P. Globálisan optimális varrás, 3D csempézett (Háromdimenziós) mikroszkopikus képfelvételek. Bioinformatika. 2009;25:1463–1465.
