Transzponálható elem RNS szabályozási zavara mutáns KRAS(G12C) 3D tüdőrák szferoidokban
Oct 27, 2023
ABSZTRAKT
A mutáns KRAS szabályozza a transzponálható elem (TE) RNS-t és az interferon-stimulált gén (ISG) expresszióját, de továbbra sem világos, hogy a KRAS változatos mutációi hatással vannak-e a különböző TE RNS-ekre a genomban. Elemeztük a KRAS(G12C) mutációkat tartalmazó 3D humán tüdőrák szferoidok transzkriptómáit, hogy meghatározzuk a mutáns KRAS(G12C) által szabályozott TE RNS-ek tájképét. Azt találtuk, hogy a KRAS(G12C) jelátvitel szükséges a LINE- és LTR-eredetű TE RNS-ek expressziójához, amelyek különböznek azoktól a TE RNS-ektől, amelyekről korábban kimutatták, hogy a mutáns KRAS(G12D) vagy KRAS(G12V) szabályozza őket. Ezen túlmenően, a KRAS(G12C) gátlása specifikusan felszabályozza a SINE-eredetű TE RNS-eket a legfiatalabb Alu Alu alcsaládból. Eredményeink azt mutatják, hogy a KRAS által vezérelt tüdőráksejtekben a TE RNS szabályozási zavara mutációfüggő, ugyanakkor kiemeli a fiatal, Alu-eredetű TE RNS-ek egy részhalmazát, amelyek a KRAS(G12C) gátlása esetén a veleszületett immunitásgénekkel koordináltan aktiválódnak.
A cistanche tubulosa-Antitumor előnyei
BEVEZETÉS
A transzponálható elem (TE) RNS-ek a rák összefüggésében ismétlődően szabályozatlanok 1. A mutáns KRAS tüdőráksejtekben a KRAB cink-ujj (KZNF) gének nagymértékben lefelé szabályozottak, ami a LINE, SINE és SINE-ből származó TE RNS-ek rendellenes felszabályozásához vezet. LTR elemek 2,3. A TE RNS-ek mellett a hosszú, nem kódoló RNS-ek (lncRNS-ek) is koordináltan szabályozottak a RAS jelátviteli génekkel 4, és expressziós mintázataik hasonlóképpen módosulnak számos rák esetében 5-8. A TE RNS-ek esetében a rákban fellépő felszabályozásuk vírusmimikri állapotot vált ki, ami a veleszületett immunitásgének, például az interferon-stimulált gének (ISG-k) 3,9,10 belső aktiválásához vezet. Különösen a SINE-k Alu családja az immunogén TE RNS-ek 11 túlnyomó forrása, amelyeket a DNS-metiltranszferáz inhibitorok (DNMTi) vagy a mutáns KRAS által közvetített KZNF-gátlás (3,9,10) okozta epigenetikai változások indukálnak.
Annak vizsgálatára, hogy a KRAS-ban előforduló gyakori mutáció hogyan befolyásolja a TE RNS-t a tüdőrák sejtekben, jellemeztük a KRAS(G12C) mutációkat tartalmazó 3D tüdőrák szferoidok transzkriptómáit mutáns KRAS(G12C) inhibitor 12 jelenlétében vagy hiányában. hogy a KRAS(G12C) jelátvitel szükséges a LINE és LTR eredetű TE RNS expressziójához, míg a KRAS(G12C) gátlás specifikusan felszabályozza mind a SINE-eredetű TE RNS-eket, mind az interferonnal (IFN) rokon gének egy részhalmazát. Eredményeink feltárják a mutáns KRAS jelátvitel és a TE diszreguláció közötti összetett kölcsönhatást tüdőráksejtekben, ahol a fiatal AluY elemek meghatározott csoportja mutációfüggő módon felszabályozott.
A cistanche tubulosa-Antitumor előnyei
EREDMÉNYEK
A KRAS(G12C) gátlás megváltoztatja a kódoló és nem kódoló transzkriptumot
Annak meghatározására, hogy az onkogén KRAS(G12C) jelátvitel hogyan szabályozza a kódoló és nem kódoló transzkriptumot, RNS-szekvenálást (RNA-seq) végeztünk 3D mutáns KRAS(G12C) tüdőrák szferoidokon. Az RNA-seq esetében teljes hosszúságú protokollt használtunk 5' egyedi molekuláris azonosítókkal (UMI-k), hogy lehetővé tegyük a pontos RNS-számlálást, miközben csökkentjük a PCR-amplifikációs torzításokat 13 (1A. ábra). Összehasonlítottuk a KRAS(G12C) gátló ARS-1620 (ARS)-vel kezelt H358 tüdőrák szferoidok transzkriptómáit a kontroll szferoidokkal (DMSO-val kezelt) (S1A ábra), és azt láttuk, hogy az ARS-kezelés jelentősen csökkentette a foszforilált ERK szintjét. (p-ERK) (S1B ábra), ami azt jelzi, hogy az ARS-kezelés gátolta a downstream KRAS(G12C) jelátvitelt. A KRAS(G12C) jelátvitel ARS-kezelés általi elnyomását a szferoidok méretének és a sejtek életképességének csökkenése is igazolta (S1C és S1D ábra).
RNS szinten felmértük a különböző biotípusok és TE szupercsaládok relatív abundanciáját ARS-sel vagy DMSO-val kezelt 3D tüdőrák szferoidokban, ami a KRAS(G12C) gátlás hatására dinamikus változásokat mutatott ki a TE RNS összetételében (1B. ábra). Míg a GENCODE-annotált fehérjekódoló gének mindössze 32%-át és az lncRNS gének 15%-át észleltük, a TE szupercsaládok 92-96%-a (92% LTR, 95% SINE, 96% LINE) volt képviselve az UMI-címkével ellátott génünkben. RNS-seq adatok, amelyek feltárják a TE RNS-ek széles körű szabályozási zavarát a KRAS(G12C) által vezérelt transzkriptomban. Az ARS-sel kezelt tüdőrák szferoidokban kimutatott RNS-molekulák legfeljebb egynegyede TE-ből származott, ami azt jelzi, hogy a TE RNS-ek a mutáns KRAS(G12C) tüdőráksejtek transzkripciós teljesítményének jelentős részét képviselik.
A cistanche előnyei a férfiak számára – erősítik az immunrendszert
Kattintson ide a Cistanche Enhance Immunity termékek megtekintéséhez
【Kérjen többet】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Ezt követően meghatároztuk az ARS-sel és DMSO-val kezelt 3D tüdőrák szferoidok szignifikánsan eltérően expresszálódó génjeit, hogy azonosítsuk azokat a biológiai folyamatokat, amelyeket az onkogén KRAS(G12C) jelátvitel szabályozott. Az érintetlen KRAS(G12C) jelátvitellel rendelkező tüdőrák szferoidok szignifikánsan feldúsultak a G2M ellenőrzőpontban, az E2F célpontokban, a MYC célpontokban és a mitotikus orsóban részt vevő gének tekintetében (1C. ábra). A KRAS(G12C) gátlásával azonban a tüdőrák szferoidjai szignifikánsan magasabb szintű oxidációs foszforilációban, komplementben, valamint az IFN alfa- és gamma-válaszokban részt vevő géneket fejezték ki (1C. ábra), ami további alátámasztó bizonyítékot szolgáltat a KRAS jelátvitelnek a szabályozásban való részvételére. IFN-rokon gének 2,3.
A KRAS(G12C) gátlás összehangoltan indukálja az ISG-ket és a fiatal AluY elemeket
Az ISG-k KRAS(G12C) gátlása során bekövetkezett intrinsic upregulációjának további tisztázása érdekében azonosítottuk, hogy mely gének és TE-k expresszálódnak szignifikánsan az egyes génkészletekben és TE szupercsaládokban. Mind az IFN alfa, mind az IFN gamma válasz gének között a tüdőrák szferoidokban a KRAS(G12C) gátlására legerősebben indukált gén az RTP4 volt (2A ábra), egy receptor transzporter fehérje, amely negatívan szabályozza a TBK1 jelátvitelt 14. Ezenkívül az MHC I. osztályú komplex A béta{6}}mikroglobulin (B2M) génje, amely ismétlődően inaktiválódik tüdőrákban 15, szintén szignifikánsan felszabályozott mindkét IFN-hez kapcsolódó génkészletben ARS-sel kezelt tüdőrák szferoidokban (2A. ábra).
Tekintettel az onkogén KRAS jelátvitel közvetlen szerepére a TE RNS szabályozásban 3, megvizsgáltuk, hogy a TE RNS-ek mely alcsaládjai függenek a mutáns KRAS(G12C)-től. Az érintetlen KRAS(G12C) jelátvitellel rendelkező tüdőrák szferoidokban azt találtuk, hogy az L1M6B és L1PA12 LINE alcsaládok erősen expresszálódnak, és a KRAS(G12C)-től függenek, amit az ARS-sel kezelt tüdőrák szferoidokban mutatott leszabályozásuk bizonyít (2B. ábra). Sőt, míg csak egyetlen DNS-alcsalád, a MER44D függött a KRAS(G12C) jelátviteltől, több mint egy tucat LTR alcsaládot szabályozott a mutáns KRAS(G12C), köztük az MLT1A0-int, LTR51, MER50B. és LTR1B0 (2B. ábra). Ezzel szemben a SINE alcsaládok mindegyike szignifikánsan felszabályozott volt a KRAS(G12C) gátlás hatására, és specifikus ISG génekkel koordináltan indukálódott (2A ábra) tüdőrák szferoidokban. Ezek a SINE TE RNS-ek mind az AluY alcsaládból származnak (2B. ábra), ami azt jelzi, hogy a KRAS(G12C) gátlása a fiatal AluY elemek egy specifikus alcsoportját diszregulálja.
A KRAS(G12C) gátlása leszabályozza a hosszú, nem kódoló RNS-eket
A KRAS(G12C) gátlás transzkriptomra gyakorolt hatásának további tisztázása érdekében megvizsgáltuk az összes szignifikánsan eltérően expresszálódó lncRNS-t ARS-sel vagy DMSO-val kezelt tüdőrák szferoidokban. Azt találtuk, hogy nagyszámú lncRNS expressziója a KRAS(G12C) jelátviteltől függött, mivel ezen lncRNS-ek közül sok szignifikánsan lecsökkent a KRAS(G12C) gátlás hatására (3A. ábra). A csökkentett lncRNS-ek közül háromnak, az AC114546.3-nak, az NCMAP-DT-nek és az AC073575.2-nek nincs ismert funkciója, de antiszensz orientációban átfedik egymást a ZNF770, RCAN3 és ERP29 kódoló génekkel. A nem kódoló RNS osztályaként az lncRNS-ek széles körű leszabályozását figyeltük meg ARS-kezelés hatására tüdőrák szferoidokban (3B. ábra), ami azt jelzi, hogy sok lncRNS expressziója a KRAS(G12C) jelátviteltől függ.
A cistanche előnyei a férfiak számára – erősítik az immunrendszert
VITA
Itt megmutatjuk, hogy az onkogén KRAS(G12C) jelátvitel specifikus TE szupercsaládok, nevezetesen LINE és LTR elemek, valamint az lncRNS-ek egy részhalmazának expressziójához szükséges, tovább bizonyítva, hogy a RAS jelátvitel hogyan szabályozza a nem kódoló transzkriptumot 2-4. A KRAS(G12C) inhibitor kísérleteinkhez 3D tüdőrák szferoid modellt is alkalmaztunk, mivel a 3D modellekről bebizonyosodott, hogy a 2D tenyésztési modellekhez képest pontosabban összefoglalják az in vivo gyógyszerválaszt 16. Ezen túlmenően egy UMI-alapú teljes körű alkalmazásunk. -Length RNA-seq technika 13 lehetővé tette számunkra, hogy pontosabban rögzítsük a TE RNS összetételét és dinamikáját tüdőrák szferoidjainkban azáltal, hogy eltávolítottuk a PCR duplikátumokat az RNS-seq adatainkból.
Eredményeink összhangban vannak a KRAS(G12C) gátlásra vonatkozó korábbi tanulmányokkal, ahol az IFN alfa- és gamma-válasz gének felszabályozottak voltak ARS-sel kezelt H358 tüdőráksejtekben 17. Az alumíniumból származó RNS-ek 11 ismert immunogén tulajdonságai alapján eredményeink arra utalnak, hogy A fiatal AluY elemek specifikus felszabályozása a KRAS(G12C) gátlása során legalábbis részben felelős az ISG-k erős felszabályozásáért ARS-kezelt tüdőrák szferoidokban. Nevezetesen, az IFN-hez kapcsolódó gének jelentős feldúsulása a KRAS(G12C)-gátló kezelés hatására nem foglalja magában az RNS-érzékelő ISG-k, például az MDA{10}}, a RIG-I vagy a PKR további felszabályozását, amelyek kezdetben a tüdősejtek válaszként az onkogén KRAS jelátvitelre 2,3.
Korábban kimutattuk, hogy a mutáns KRAS jelátvitel önmagában elegendő a TE RNS-upreguláció indukálásához in vitro transzformált humán tüdősejtekben 2,3, és az itt leírt eredményeink kiterjesztik ezeket a megfigyeléseket a különböző aktiváló KRAS-mutációval rendelkező tüdőráksejtekre. A KRAS(G12D) vagy KRAS(G12V) mutációk egyaránt az LTR12C alcsalád szignifikáns felszabályozását indukálják transzformált tüdősejtekben 3, de nem tapasztaltuk az LTR12C eredetű TE RNS-ek jelentős feldúsulását a KRAS(G12C) tüdőrák szferoidjainkban. Ehelyett az LTR51, LTR1B0, LTR14B és LTR28B felszabályozását láttuk, ami arra utal, hogy a KRAS-ban a különböző funkciójavító mutációk szabályozzák a TE RNS-transzkriptom különböző aspektusait.
Munkánk átfogó értékelést nyújt arról, hogy a nem kódoló/TE RNS transzkriptom hogyan reagál dinamikusan a KRAS(G12C) gátlására. A jövőbeli tanulmányok új betekintést nyújthatnak a nem kódoló/TE RNS-ek lehetséges szerepébe a KRAS(G12C) inhibitor rezisztencia mechanizmusaiban. Ezenkívül a rákos sejtekből a KRAS-gátlás hatására szekretált TE RNS-ek extracelluláris RNS-biomarkerekként 2, 3, 5, 18, 19 szolgálhatnak a KRAS-gátló terápiákkal szembeni válaszre és/vagy rezisztenciára 20 .
ANYAGOK ÉS METÓDUSOK
Sejtvonalak
A KRAS(G12C) mutációt tartalmazó H358 tüdőrák sejtvonalakat RPMI 1640 tápközegben (Invitrogen) tenyésztettük 10% borjúmagzati szérummal (Sigma) kiegészítve, 37 fokos hőmérsékleten, 5% CO2 mellett, párásított inkubátorban. Minden sejtvonal mikoplazmára negatívnak bizonyult. A sejtvonalakat az American Type Culture Collection-től (ATCC) vásároltuk.
Sejtéletképességi vizsgálatok
A szferoid életképességi vizsgálatokhoz lyukanként 10,000 sejtet alacsony adhéziós, kerek fenekű 96-lyukú lemezekre oltottunk, és 24 órán keresztül 37 °C-on, 5% CO2 mellett inkubáltuk. Ezután sorozathígítású ARS- 1620-ot vagy DMSO-t adtunk a sejtekhez, és a lemezeket standard tenyésztési körülmények között inkubáltuk 72 órán keresztül, naponta cserélve friss ARS-t és DMSO-t. A sejtek életképességét Cell Titer-Glo® Luminescent Cell Viability Assay készlettel (Promega) mértük a gyártó protokollja szerint. Az ARS-sel kezelt minták lumineszcencia jelét DMSO kontrollra normalizáltuk. A lumineszcenciát SpectraMax iD3 molekuláris eszközzel mértük.
RNS izolálás
A teljes ömlesztett RNS-t körülbelül 100 H358 szferoidból izoláltuk (állapotonként) Quick-RNA Mini-Prep készlettel (Zymogen) a gyártó protokollja szerint. Az RNS mennyiségi meghatározása NanoDrop{4}} spektrofotométerrel történt.
RNS-seq könyvtár előkészítése
A teljes hosszúságú RNS-molekulák megszámlálásához és értékeléséhez egy adaptált Smart-seq3 protokollt 13 használtunk az RNS-seq könyvtárak létrehozására a teljes RNS-ből. Röviden, 10 ng össz-RNS-t fordított átírással végeztünk vonalkódos oligoDT primerrel (125 nM), majd templátváltással vonalkódolt templátkapcsoló oligo-val (125 nM). Ezek az oligoszekvenciák primerként szolgáltak a PCR-amplifikációhoz. A Nextera HT készletet (Illumina) használták a cDNS-könyvtárak szekvenáló könyvtárakká történő átalakítására egy UMI-specifikus primer hozzáadásával a molekuláris vonalkódokat tartalmazó cDNS-végek amplifikálására, a Smart-seq3 protokollban leírtak szerint. A cDNS és a könyvtár minőségét egy Agilent bioanalyzer DNS nagy érzékenységű chip segítségével értékeltük, és kvantifikáltuk a Qubit 3.0 nagy érzékenységű DNS-teszttel.
Western blot
Körülbelül 100 H358 szferoidot (állapotonként) izoláltunk ARS- vagy DMSO-kezelést követően. A szferoidokat ezután jégen inkubáltuk proteáz inhibitorral kiegészített RIPA pufferben 15 percig. A lizátumokat ezután 10,000 RCF-en centrifugáltuk 10 percig. A felülúszót ezután egy új csőbe vittük át a következő SDS-PAGE minta-előkészítéshez Laemmli pufferben, és 5 percig 95 °C-on forraltuk 1 mg/ml végső koncentrációig. SDS PAGE-t végeztünk a fehérje méret szerinti elválasztására, majd ezt követően PVDF membránra vittük. A membránokat primer p-ERK (CST) és HSP90 (CST) antitestekkel inkubáltuk egy éjszakán át 4 °C-on. A másodlagos antitesteket (Abcam) ezután háromszor TBST-vel mosott membránokon inkubáltuk blokkoló pufferben a következő képalkotáshoz.
A cistanche előnyei a férfiak számára – erősítik az immunrendszert
UMI deduplikáció
A párosított végű megvilágító jelzéseket az adapter a FastP 21 használatával, alapértelmezett beállításokkal vágta le. Az UMI-ket a 22-es UMI-tools csomag umi_tools_kivonat segítségével kinyerték ki az olvasásból, és áthelyezték az olvasási névbe, a vonalkód-mintázat "NNNNNNNN" értékre állította be. Az UMI által eltávolított leolvasásokat a HG38-hoz igazították a STAR igazítóval a GENCODE v38 megjegyzéskészlettel. Az igazított olvasmányok duplikációja az „UMI-tools dedup” használatával, alapértelmezett beállításokkal történt.
RNS-seq elemzés
Az összes fastq fájlt Trimmomatic 2 (0.38) 23 programmal vágtuk le, az eredményül kapott vágott fájlokat pedig FastQC 24-gyel értékeltük, majd a következő analitikai folyamattal dolgoztuk fel: Salmon (1.3.0): RNS pszeudoillesztése -seq beolvasása Salmon 25-tel a következő argumentumokkal: {{1{{20}}}}validateMappings –gcBias --seqBias --recoverOrphans --rangeFactorizationBins 4 segítségével egy index, amelyet a GENCODE 35-ös verziójú transcriptome fasta fájlból hoztak létre csaliszekvenciák segítségével a szelektív igazítás érdekében. Egy további, TE-tudatos indexet hoztak létre hasonló módon, de kiegészítve az UCSC Repeat Masker sávból generált szekvenciákkal. DESeq2 (1.32.0): A lazac kimenetét a tximport 26 segítségével importáltuk egy DESeq objektumba, és a differenciális kifejezés elemzést standard argumentumokkal 27 végeztük. Minden eredményt úgy szűrtünk, hogy padj < 0,05 legyen. Ahol számlálási adatokat használtunk, azokat a minták között normalizáltuk a DESeq segítségével.
Génkészlet-dúsítási elemzés
A differenciálisan expresszált géneket a DESeq2 által generált zsugorított log2FoldChange értékek alapján rangsoroltuk. A génkészleteket az msigdbr (7.4.1) R csomaggal szereztük be, és szűrtük, hogy csak a „Hallmark” állapotú génkészleteket tartalmazzák. Az fgsea (1.18.0) R csomagot használták a Gene Set Enrichment becslések generálására, amelyeket a rendszer a < 0.05 korrigált pértékekkel rendelkező eredményekre szűrt.
IRODALOM
1. Burns, KH (2017). Transzponálható elemek a rákban. Nat Rev Cancer 17, 415-424. 10.1038/nrc.2017.35.
2. Reggiardo, RE, Maroli, SV, Halasz, H., Ozen, M., Carrillo, D., LaMontagne, E., Whitehead, L., Kim, E., Malik, S., Fernandes, J., et al. (2020). Ismétlődő, nem kódoló RNS-ek és IFN-stimulált gének epigenomikus újraprogramozása mutáns KRAS segítségével. bioRxiv, 2020.2011.2004.367771. 10.1101/2020.11.04.367771.
3. Reggiardo, RE, Maroli, SV, Halasz, H., Ozen, M., Hrabeta-Robinson, E., Behera, A., Peddu, V., Carrillo, D., LaMontagne, E., Whitehead, L ., et al. (2022). A mutáns KRAS szabályozza a transzponálható elem RNS-t és a veleszületett immunitást a KRAB cink-ujj génjein keresztül. Cell Reports 40. 10.1016/j.celrep.2022.111104.
4. Kim, DH, Marinov, GK, Pepke, S., Singer, ZS, He, P., Williams, B., Schroth, GP, Elowitz, MB és Wold, BJ (2015). Az egysejtű transzkriptom elemzés az lncRNS expressziójának dinamikus változásait tárja fel az újraprogramozás során. Sejt őssejt 16, 88-101. 10.1016/j.stem.2014.11.005.
5. Reggiardo, RE, Maroli, SV és Kim, DH (2022). A gyulladás és a rák LncRNS biomarkerei. Adv Exp Med Biol 1363, 121-145. 10.1007/978-3-030-92034-0_7.
6. Schmitt, AM és Chang, HY (2016). Hosszú, nem kódoló RNS-ek a rák útvonalában. 29. rákos sejt, 452-463. 10.1016/j.ccell.2016.03.010.
7. Rinn, JL és Chang, HY (2020). Hosszú, nem kódoló RNS-ek: A szervezeti funkciók molekuláris modalitásai. Annu Rev Biochem 89, 283-308. 10.1146/annurev-biochem- 062917-012708.
8. Slack, FJ és Chinnaiyan, AM (2019). A nem kódoló RNS-ek szerepe az onkológiában. 179. cella, 1033-1055. 10.1016/j.cell.2019.10.017.
9. Chiappinelli, Katherine B., Strissel, Pamela L., Desrichard, A., Li, H., Henke, C., Akman, B., Hein, A., Rote, Neal S., Cope, Leslie M. , Snyder, A., et al. (2015). A DNS-metiláció gátlása interferonválaszt okoz rákban a dsRNS-en keresztül, beleértve az endogén retrovírusokat is. 162. cella, 974-986. 10.1016/j.cell.2015.07.011.
10. Roulois, D., Loo Yau, H., Singhania, R., Wang, Y., Danesh, A., Shen, Shu Y., Han, H., Liang, G., Jones, Peter A., Pugh, Trevor J. és mtsai. (2015). A DNS-demetiláló szerek a vastag- és végbélrák sejteket célozzák meg azáltal, hogy endogén transzkriptumokkal vírusmimikrát indukálnak. 162. cella, 961-973. 10.1016/j.cell.2015.07.056.
11. Mehdipour, P., Marhon, SA, Ettayebi, I., Chakravarthy, A., Hosseini, A., Wang, Y., de Castro, FA, Loo Yau, H., Ishak, C., Abelson, S ., et al. (2020). Az epigenetikai terápia invertált SINE-ek transzkripcióját és ADAR1-függőséget vált ki. Nature 588, 169-173. 10,1038/s41586-020-2844-1.
12. Ostrem, JM, Peters, U., Sos, ML, Wells, JA és Shokat, KM (2013). A K-Ras(G12C) inhibitorok allosztérikusan szabályozzák a GTP affinitást és az effektor kölcsönhatásokat. Nature 503, 548- 551. 10.1038/természet12796.
13. Hagemann-Jensen, M., Ziegenhain, C., Chen, P., Ramskold, D., Hendriks, GJ, Larsson, AJM, Faridani, OR és Sandberg, R. (2020). Egysejtű RNS számlálás allél- és izoforma felbontásban Smart-seq3 segítségével. Nat Biotechnol 38, 708-714. 10,1038/s{10}}.
14. Ő, X., Ashbrook, AW, Du, Y., Wu, J., Hoffmann, HH, Zhang, C., Xia, L., Peng, YC, Tumas, KC, Singh, BK és társai. (2020). Az RTP4 gátolja az IFN-I választ, és fokozza a kísérleti agyi maláriát és a neuropatológiát. Proc Natl Acad Sci USA 117, 19465- 19474. 10.1073/pnas.2006492117.
15. Pereira, C., Gimenez-Xavier, P., Pros, E., Pajares, MJ, Moro, M., Gomez, A., Navarro, A., Condom, E., Moran, S., Gomez- Lopez, G. és mtsai. (2017). A tüdőrák betegből származó xenograftok genomiális profilja azonosítja az immunfelismerést rontó B2M inaktivációt. Clin Cancer Res 23, 3203-3213. 10.1158/1078-0432.CCR-16-1946.
16. Sen, C., Freund, D. és Gomperts, BN (2022). A tüdő háromdimenziós modelljei: múlt, jelen és jövő: mini áttekintés. Biochem Soc Trans 50, 1045-1056. 10.1042/BST20190569. 17. Mugarza, E., van Maldegem, F., Boumelha, J., Moore, C., Rana, S., Llorian Sopena, M., East, P., Ambler, R., Anastasiou, P., Romero -Clavijo, P. et al. (2022). A terápiás KRAS(G12C) gátlás hatékony interferon-mediált daganatellenes immunitást eredményez immunogén tüdőrákokban. Sci Adv 8, eabm8780. 10.1126/sciadv.abm8780.
18. Khojah, R., Reggiardo, RE, Ozen, M., Maroli, SV, Carrillo, D., Demirci, U. és Kim, DH (2022). A mutáns KRAS(G12C) tüdő adenokarcinóma sejtek extracelluláris RNS aláírásai. bioRxiv, 2022.2002.2023.481574. 10.1101/2022.02.23.481574.
19. Wang, J., Ma, P., Kim, DH, Liu, BF és Demirci, U. (2021). A mikrofluidikus alapú exoszóma izolálás és kimutatás felé a tumorterápiához. Nano Today 37. 10.1016/j.nantod.2020.101066.
20. Moore, AR, Rosenberg, SC, McCormick, F. és Malek, S. (2021). RAS-célzott terápiák. Nat Rev Drug Discov. 10,1038/s41573-021-00220-6.
21. Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y. és Gu, J. (2018). fastp: ultragyors minden az egyben FASTQ előfeldolgozó. Bioinformatika 34, i884-i890. 10.1093/bioinformatika/bty560.
22. Smith, T., Heger, A. és Sudbery, I. (2017). UMI-tools: szekvenálási hibák modellezése az egyedi molekuláris azonosítókban a számszerűsítési pontosság javítása érdekében. Genome Res 27, 491- 499. 10.1101/gr.209601.116.
23. Bolger, AM, Lohse, M. és Usadel, B. (2014). Trimmomatic: rugalmas trimmer az Illumina szekvenciaadatokhoz. Bioinformatika 30, 2114-2120. 10.1093/bioinformatika/btu170.
24. Brown, J., Pirrung, M. és McCue, LA (2017). FQC Dashboard: integrálja a FastQC eredményeket egy webalapú, interaktív és bővíthető FASTQ minőségellenőrző eszközbe. Bioinformatika. 10.1093/bioinformatika/btx373.
25. Patro, R., Duggal, G., Love, MI, Irizarry, RA és Kingsford, C. (2017). A Salmon gyors és torzítástudatos számszerűsítést biztosít az átirat-kifejezéshez. Nat Methods 14, 417-419. 10.1038/nmeth.4197.
26. Soneson, C., Love, MI és Robinson, MD (2015). Az RNS-seq differenciálanalízise: a transzkriptumszintű becslések javítják a génszintű következtetéseket. F1000Res 4, 1521. 10.12688/f1000research.7563.2.
27. Love, MI, Huber, W. és Anders, S. (2014). Az RNS-seq adatok szeres változásának és diszperziójának mérsékelt becslése DESeq2-vel. Genome Biol 15, 550. 10,1186/s13059-014- 0550-8.
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
Köszönjük a Kim Lab tagjainak a hasznos beszélgetéseket. Ezt a munkát a Baskin School of Engineering (a DHK-nak) finanszírozta. A DC-t a Dohányzáshoz kapcsolódó Betegségek Kutatási Programja Predoktori Ösztöndíjjal (T30DT0997), a RER-t pedig az F99/K00 NIDDK KUH Predoktor-Posztdoktori Ösztöndíjjal támogatta a National Institutes of Health (1F99DK{) {7}}), az alelnököt pedig a Dohányzáshoz kapcsolódó Betegségek Kutatási Programja Predoktori Ösztöndíjjal (T32DT4904) támogatta.
A SZERZŐ HOZZÁJÁRULÁSAI
A DHK konceptualizálta a kutatást, a DC és a DHK tervezte a kutatást, a DC, a JL és a GM kísérleteket végzett, a RER és a VP elemezte az adatokat, a DC és a DHK pedig a szerzők közreműködésével írta meg a tanulmányt.
ÁBRÁK
1. ábra. A KRAS(G12C) gátlás megváltoztatja a kódoló és nem kódoló A transzkriptomot. Kísérleti vázlat. B. A GENCODE kódoló, lncRNS és TE/ismétlődő szupercsaládokhoz rendelt számok megoszlása ARS-sel kezelt (ars) vagy DMSO-val kezelt (dmso) tüdőrák szferoid RNS-seq könyvtárakban, ahol minden oszlop egy biológiai replikációt jelent. C. A DMSO-val kezelt (jobb, pozitív NES) vagy ARS-kezelt (bal oldali, negatív NES) tüdőrák szferoidokon megfigyelt szignifikáns génkészlet-dúsítási analízis eredményei differenciálisan expresszált gének alkalmazásával, normalizált dúsítási pontszám (NES) szerint rangsorolva.
2. ábra: A KRAS(G12C) gátlása koordináltan indukálja az ISG-ket és a fiatal AluY elemeket
A. Vulkán diagramok, amelyek a kulcsgénkészletekben megfigyelt szignifikáns különbségi expressziót ábrázolják a DMSO-val kezelt (jobb oldali, pozitív hajtásváltozás) vagy ARS-kezelt (bal oldali, negatív hajtásváltozás) tüdőrák szferoidok között. B. Vulkán diagramok, amelyek a TE szupercsaládokban megfigyelt szignifikáns különbségi expressziót ábrázolják a DMSO-val kezelt (jobb oldali, pozitív hajtásváltozás) vagy ARS-kezelt (bal oldali, negatív hajtásváltozás) tüdőrák szferoidok között.
3. ábra. A KRAS(G12C) gátlása leszabályozza a hosszú, nem kódoló RNS-eket
A. A GENCODE fehérjét kódoló RNS-ek és lncRNS-ek szignifikáns differenciált expressziójának vulkándiagramja DMSO-val kezelt (jobb oldali, pozitív hajtásváltozás) vagy ARS-kezelt (bal oldali, negatív hajtásváltozás) tüdőrák szferoidok között. B. Box diagram a GENCODE fehérjét kódoló RNS-ek és lncRNS-ek szignifikáns differenciált expressziójáról DMSO-val kezelt (felső, pozitív hajtásváltozás) vagy ARS-kezelt (alsó, negatív fold-változás) tüdőrák szferoidok (Wilcoxon) között.
KIEGÉSZÍTŐ ÁBRA
S1 ábra.
A. H358 3D tüdőrák szferoidok ARS-sel vagy DMSO-val kezelve. B. Western blot p-ERK és HSP90 kimutatására ARS-sel vagy DMSO-val kezelt H358 3D tüdőrák szferoidokkal. C. ARS-sel vagy DMSO-val kezelt H358 3D tüdőrák szferoidok átmérőjének mérése (mikrométerben) (bal oldali diagram) és sejtéletképessége (Cell Titer-Glo® lumineszcens sejtek életképessége relatív fluoreszcencia egységekben) (jobb oldali diagram) 3 vagy 5 napos kezelés (500 nM ARS-1620 vagy DMSO). D. H358 3D tüdőrák szferoidok átmérőjének mérése (mikrométerben) különböző koncentrációjú ARS-1620 (nM) 7 napon keresztül.
