A Cistanche Salsából származó tubulozid B megmenti a PC12 idegsejteket a 1-metil-4-fenilpiridinium-ionok által kiváltott apoptózistól és az oxidatív stressztől

Kapcsolatfelvétel: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Guoqing Zheng, Xiaoping Pu, Li Lei, Pengfei Tu, Changling Li

Absztrakt:

A neuroprotektíva tubulozid B hatásai a cistanche-ból, a kínaiakból izolált feniletanoidok egyikegyógynövényes gyógyszer Cistanche salsa, a 1-metil-4-fenilpiridinium-ion (MPP plusz ) által kiváltott apoptózist és oxidatív stresszt vizsgálták PC12 idegsejtekben. Az MPP-vel kezelt PC12 sejtek apoptózisos halált szenvedtek MTF vizsgálattal, áramlási citometriával és DNS agaróz gél elektroforézissel meghatározottak szerint; A reaktív oxigénfajták (ROS) intracelluláris felhalmozódását DCFH-DA festéssel mértük lézeres pásztázó konfokális mikroszkóppal (LSCM). A tuhulosid B-vel történő egyidejű kezelés jelentősen gyengítette az MPP＋ által kiváltott citotoxicitást, a DNS fragmentációt és a ROS intracelluláris felhalmozódását. Ezek az eredmények erősen azt mutatják, hogy a tubulozid B megakadályozza az MPP által kiváltott apoptózist és az oxidatív stresszt. A tubulozid B alkalmazhatóParkinson-kór elleni küzdelemügynökök.

Bevezetés

Patológiailag a szórványos Parkinson-kórt (PD) jellemzően a katecholaminerg neuronok, különösen a substantia nigra pars compacta (SNc) dopaminerg neuronjainak elvesztése és jellegzetes intraneuronák jelenléte jellemzi. Lewy-testeknek nevezett zárványok az érintett agyi régiókban. Annak ellenére, hogy számos tényező szerepet játszik a PD patogenezisében, a PD kifejlődésében és progressziójában szerepet játszó mechanizmusok továbbra is bizonytalanok. Bár a PD oka továbbra is megválaszolatlan, számos bizonyíték arra utal, hogy az oxidatív stressz szerepet játszik, végül neuronhalálhoz vagy apoptózishoz a szabad gyökök túlzott képződése miatt [1], [2], [3]. Az a tény, hogy a nigrális dopaminerg rendszer nagy mennyiségű szabad gyököt képes termelni, és viszonylag alacsony szintű antioxidáns védelmi rendszere van, tovább erősíti ezt a hipotézist. Mind in vivo, mind in vitro vizsgálatok kimutatták az l-metil-4-fenil-l,2,3,6-tetrahidropiridin (MPTP) aktív metabolitja, az MPP＋ oxidatív stressz által közvetített neurotoxicitását a dopaminerg neuronokon [4 ], [5]. Az oxidatív stressz által túlzottan termelt szabad gyökök részvétele a neurodegeneratív rendellenességek, például a PD közvetlen okaként, az antioxidánsok kulcsfontosságú szerepére utal. A tubulozid B (l. ábra) az egyik feniletanoid vegyület volt, amelyet a szárból izoláltak.Cistanche salsa. Korábbi tanulmányok azt találták, hogy számos feniletanoid, köztük a tubulozid B, erős szabad gyökfogó aktivitást mutatott[6], [7].

Ezeket az eredményeket figyelembe véve jelen tanulmányban a tubu]nside B hatását vizsgáltuk az MPP plusz által kiváltott neurotoxicitásra in vitro, a PC12 szimpatikus idegi feochromocytoma sejtvonal segítségével, amelyet évek óta sikeresen alkalmaztak a neuronális funkciók tanulmányozására [8]. [9].

Parkinson-kór elleni szerek:cistanche

Anyagok és metódusok

Anyagok

Tubulozid B -tőlCistanche salsaDr. Li Lei (Peking Egyetem, Pekingi Egyetem, Gyógyszertudományi Iskola Természeti Termékek Tanszéke) kedveskedett. A vegyület tisztasága HPLC analízis szerint több mint 98%. A Dulbecco módosított Eagle táptalajt (DMEM), a lószérumot és a borjúmagzatszérumot a GIBCO BRL-től vásároltuk, 1-metil~-fenilpiridinium-ion (MPP plusz), poli-L-lizin, 3-(4, 5 -dimetil-tiazol-2 -il)-2,5- difenil-tetrazólium-bromid (MTT), propidium-jodid (PI), RNáz A, proteináz K és 2,7'-diklór-fluoreszcein-diacetát (DCFH-DA) a Sigmától vásároltuk.

Sejttenyésztés

A PCI2 sejteket DMEM-ben tartottuk fenn, kiegészítve 1% lószérummal, 5% borjúmagzatszérummal, 100 U/ml penicillinnel és 100 ug/ml sztreptomicinnel. A sejteket 95% levegővel és 5% CO2-vel levegőztetett, párásított inkubátorban tenyésztettük 37 °C-on. Minden kísérletet a sejtek beoltása után 24-48 órával végeztünk. A sejteket rutinszerűen 0,25%-os tripszinezéssel gyűjtöttük be, amikor a sejtek megközelítették a szubkonfluens stádiumot, és 25 cm-es, 1:8 arányban megosztott tenyésztő lombikba szélesztettük.

A sejtek életképességének elemzése

A sejtek életképességét módosított MTT vizsgálattal határoztuk meg a korábban leírtak szerint [10]. Röviden, PC12 sejteket oltottunk be 96-lyuklemezekre 1 × 104 cel/lyuk sűrűséggel. A tenyészeteket 48 órán át növesztettük, majd a tápközeget olyanra cseréltük, amely különböző koncentrációjú tubulnside B-t vagy MPP-t tartalmazott. Legfeljebb 48 és 72 órás inkubálás után MTr-oldatot (5 mg/ml DMEM-ben) adtunk a 96-lyukú lemezekhez, és a sejteket 4 órán át 37 °C-on inkubáltuk. A táptalaj eltávolítása után a sejt- és festékkristályokat 200 μl DMSO hozzáadásával szolubilizáltuk, és az abszorpciót 570 nm-en (referenciaként 540 nm) mértük egy 550-es modell mikrolemez-leolvasóval (Bio-Rad). A sejtek életképességét tripánkék kizárási módszerrel is elemeztük. A sejteket összegyűjtöttük, óvatosan pelletizáltuk, és 0,6%-os tripánkék oldattal festettük 3 esőig. A nem színezett sejtek százalékos arányát ezt követően tíz véletlenszerűen kiválasztott mikroszkópmezőben értékeltük. Pozitív gyógyszerként 100 ng／ml epidermális növekedési faktort (EGF) használtunk.

Apoptózis kimutatása áramlási citometriával

Az apoptotikus sejteket áramlási citometriával detektáltuk propidium-jodid (PI) alkalmazásával [11••]. Röviden, körülbelül 1 × 106 sejtet, amelyeket a vizsgált anyagokkal inkubáltunk, centrifugálással gyűjtöttünk össze, és egyszer mostuk PBS-sel. A sejteket 70 százalékos etanollal fixáltuk 24 órán át - 20 fokon, és egyszer mostuk PBS-sel. A sejteket ezután újraszuszpendáltuk 300 µl PBS-ben, amely 0,5 mg/ml RNázt és 0,5 mg/ml PI-t tartalmazott. Sötétben 30 percig tartó további inkubálás után áramlási citometriát végeztünk FACScan készülékkel (Becton Dickinson, Heidelberg, Németország).

Moore protokollját [12] alkalmaztuk, amely csak fragmentált DNS-t izolált, és a kísérleteket minden tesztcsoportból azonos számú tenyészet felhasználásával normalizáltuk. Röviden összefoglalva, mindegyik kezelt mintából 3 × 106 neuront Hank-féle kiegyensúlyozott sóoldatban mostuk (1000g 10 percig), és a cső alján képződött pelleteket homogenizáltuk. 1 ml lízispufferrel (10 mM Tris, pH 7,4, 5 mM EDTA, 1% Triton X{11}}) 20 percig jégen. 11, 000 g 20 esőig 4 fokos centrifugálás után a fragmentált DNS-t tartalmazó felülúszót eltávolítottuk, és 20 mg/ml RNáz A-val 37 fokon 1 órán át, és 0,1 mg/ml proteináz K-val 56 fokon emésztettük. további 1 óráig. A fragmentált DNS-t fenollal és kloroformmal extraháltuk, és 10, 000g-vel centrifugáltuk 1 esőig 4 C-on. A vizes fázist egy új Eppendorf-csőbe vittük át, 2 térfogat jéghideg etanollal összekevertük, majd legalább 1 órára -20 fokra helyezzük a DNS kicsapása érdekében. 15, 000g 20 perces 4 fokos centrifugálás után a felülúszót eltávolítottuk, és a DNS-pelleteket egyszer mostuk 80%-os etanollal (15 000 g 15 percig 4 fokon), levegőn szárítottuk, és 20 μl TE-ben feloldottuk. puffer pH 7,6-on. A teljes mintát ezután 1,5%-os agaróz gélen 1 órán át 85 V-on elektroforézisnek vetjük alá. A gélt Ultra Violet Products Gel Documentation System (GELDOC-2000, Bio-Rad, USA) segítségével megvizsgáltuk és lefényképeztük.

Intracelluláris ROS képződés mérése

Az intracelluláris peroxidok képződését konfokális pásztázó lézermikroszkóppal detektáltuk egy nem fluoreszcens vegyület, a 2"7"-diklorofluoreszcein-diacetát (DCFH-DA) [13] segítségével, amelyet a sejten belül endogén észterázok észtereznek ionizált szabad savvá, 2 ;7"-diklórfluoreszcein. 2",7-A diklór-fluoreszcin hidroantioxidánsok hatására fluoreszcens 2"7"-diklórfluoreszceinné (DCF) oxidálható. A sejteket 10 μM DCFH-DA-val inkubáltuk 30 percig 37 °C-on. A tenyészeteket kétszer mostuk Hank-féle kiegyensúlyozott sóoldattal, és ugyanabban a tápközegben leképeztük. A képalkotást konfokális pásztázó lézermikroszkóppal végeztük, a DCF-et 488 nm-en gerjesztették, az emissziós szűrőt pedig egy 510 nm-es gátszűrő volt. Az érvényes összehasonlítás érdekében minden megfigyelésnél ugyanazokat a felvételi paramétereket használtuk. A cellák közepén beállítottuk az optimális függőleges helyzetet, majd a mezőt gyorsan pásztáztuk. Mivel a 488 nm-es gerjesztési hullámhosszú megvilágítás a festék oxidációja miatt megnövekedett fluoreszcenciát okozott, minden mezőt pontosan ugyanannyi ideig volt kitéve a fény. A nem stimulált sejtekből származó kiindulási értékeket használtuk kontrollértékként az MPP-vel kezelt sejtekkel való összehasonlításhoz tubulozid B jelenlétében vagy hiányában. A szkennelés után az átlagos relatív fluoreszcencia intenzitást 15-20 neuronális sejttestekben mikroszkópmezőnként négyben számszerűsítettük. külön tenyészet kezelési körülményenként.

cistanche

Statisztikai analízis

Az összes kapott értéket átlag ±SD-ben fejeztük ki. A csoportok közötti különbségek statisztikai szignifikanciáját Student-féle t-próbával határoztuk meg; A 0,05-nél kisebb számított p értékeket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük.

Eredmények

Amint a 2. ábrán látható, az MPP plusz dózisfüggő csökkenést okozott a PCI2 sejtek életképességében. Ezzel szemben az EGF, egy jól ismert neurotróf faktor, 100 ng/ml MPP mellett jelentős védelmet nyújtott a sejtek életképességében. A citotoxikus hatások a tubulozid B (5, 10, 50 vagy 100 ug-ml) jelenlétében is gyengültek{11}} ), bár kisebb hatékonysággal, mint a referencia gyógyszeré (3. ábra). A tubulozid B ilyen koncentrációkban dózisfüggő módon citoprotektív hatást fejtett ki, és a vegyület önmagában nem okozott nyilvánvaló citotoxicitást (az adatokat nem mutatjuk be). A 200 µM MPP plusz 48 órán keresztül kezelt PCI 2 sejtekből származó DNS-kivonat gélelektroforézise DNS létrát mutatott. az apoptózis klasszikus ismertetőjele, a tubulozid B 10 és 100 µg·ml-es dózisok mellett a DNS-létra kialakulását eredményezte (4. ábra). Az 5. ábra a PC12 sejtekben kiváltott apoptotikus sejthalál áramlási citometriás analízisének tipikus hisztogramjait mutatja be. tubulozid B jelenlétében vagy hiányában. A sejtciklus-profil PI-vel történő mennyiségi meghatározása feltárta az apoptotikus DNS fragmentációra utaló szubdiploid jellemzőkkel (M1 régió) rendelkező sejteket. A kezeletlen sejtekben az apoptotikus szubdiploid frakció minimális volt az összes 10 000 sejt 5-94%-áig (5A ábra). 48 órás MPP-nek való kitettség után az apoptózis százalékos aránya 43°02;j-re nőtt (5B. ábra). A sejttenyészethez hozzáadva a tubulozid B dózisfüggő módon gátolta az MPP-indukált apoptózist. 10 ug·ml-1koncentrációnál a tubulozid B által kifejtett védelem nem volt statisztikailag szignifikáns, de 50 és 1 00ug·ml-1 mellett 45, illetve 63%-os csökkenést jelent. megfigyelték, ami a túlélő sejtek százalékos arányának növekedését eredményezte (5D, E ábra).

Az intracelluláris ROS felhalmozódása kimutatható a 200 uM MPP-vel 48 órán keresztül kezelt DCFH-DA．PC12 sejtek használatával, amelyek intenzív fluoreszcenciát mutattak a sejten belül a DCFH-DA festékkel való festést követően (6. ábra). A tubulozid B-vel való egyidejű kezelés (10 és 100 ug·ml-es dózisokban) gátolta az MPP-indukált ROS-termelést (a csökkent százalékos arány 24,52, illetve 55,63 százalék volt).

Vita

A PD patogenezise magában foglalja az erős oxidatív stresszt, a csökkent antioxidáns szintet és a mitokondriális hibákat. mindegyikről ismert, hogy számos sejtrendszerben apoptózist indukálnak. A szabad gyökökről kimutatták, hogy aktív sejthalált váltanak ki az idegsejtekben[14]. Az MPTP irreverzibilis és súlyos parkinson-szerű szindrómát okoz, amely a nigrostriatális dopaminerg neuronok szelektív degenerációját okozza emberben. Ezt a neurotoxint a PD[15] állati modelljeinek létrehozására használták. Az MPTP-t a monoamin-oxidáz B MPP-vé alakítja, amely a mitokondriumokban halmozódik fel. ahol gátolja az I. mitokondriális komplexet és azokat a mitokondriális napokat. funkció apoptózist okoz[16]. Ezért az MPP plusz 一 által kiváltott neurotoxicitást a dopaminerg neuronokban széles körben alkalmazták a PD etiológiai modelljeként a neuroprotektív szerek szűrésére.

Jelen tanulmányban kimutattuk, hogy a PC12 sejtekben az oxidatív stressz által kiváltott MPP plusz által kiváltott sejthalált a tubulozid B csökkentette. Továbbá kimutattuk, hogy a tubulozid B dózisfüggő módon védett az MPP plusz által indukált DNS létra ellen is. és az apoptózis, DNS-gélelektroforézissel és áramlási citometriás analízissel mérve. Ezenkívül a tubulozid B magasabb koncentrációival történő egyidejű kezelés gátolta az MPP-indukált ROS-termelést. Így a tubulozid B többfunkciós neuroprotektív hatást mutatott. A tubulozid B hatásában több mechanizmus is szerepet játszhat, külön-külön vagy társulva. Az antioxidáns hatás a tubulozid B által közvetített neuroprotekció egyik lehetséges mechanizmusa. Xiong Q azt találta, hogy a tubulozid B erős szabadgyökfogó aktivitást mutatott az 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil gyökön és a xantin]xantin-oxidáz által generált szuperoxid anion gyökön [6].

A közelmúltban számos feniletanoidról számoltak be, amelyek szabad gyökfogó tulajdonságokkal rendelkeznek, és megvédik az oxidatív stressz okozta toxikus sérüléseket. Az MPP plusz által termelt ROS, például hidrogén-peroxid, szuperoxid anion és hidroxilgyök könnyen károsítja a biológiai molekulákat, ami végső soron apoptotikus vagy nekrotikus sejthalálhoz vezethet. Így a tubulozid B-nek közvetlen megkötő hatása lehet a ROS ellen. Bár adataink nem határozzák meg pontosan azt a helyet, ahol a tubulozid B gátolja a ROS felhalmozódását, azt sugallják, hogy a neuroprotektív mechanizmus magában foglalja az antioxidáns-útvonalak stimulálását. A tubulozid B molekuláris szerkezetének tanulmányozása azt is jelzi, hogy hatékony szabadgyök-megkötő képességgel rendelkezik (személyes kommunikáció).

Más mechanizmusok is helytállóak lehetnek. Például a tubulozid B képes ellensúlyozni az MPP toxicitását azáltal, hogy gátolja a mitokondriális permeabilitási átmeneti pórusok megnyitását és a diszfunkciót. Ezenkívül azt is mérlegelni kell, hogy a tubulozid B-nek van-e közvetlen növekedésserkentő hatása az idegsejtekre. A tubulozid B neuroprotektív hatásának pontos mechanizmusa továbbra sem tisztázott. További vizsgálatok szükségesek a neuroprotektív hatás teljes képének tisztázásához.

Megállapítható, hogy a Cistanche salsa kivonatból származó tubulozid B nyilvánvaló védő hatást fejt ki az MPP plusz által kiváltott apoptózisra és az oxidatív stresszre. Az MPP ＋ toxicitással szembeni neuroprotektív hatásai fontosak lehetnek, és arra utalnak, hogy terápiás potenciállal rendelkezik a PD megelőzésében és kezelésében.

PD kezelése: cistanche

Hivatkozások

7. Xiong Q, Tezuka Y, Kaneko 1", Li H, Tran LQ Hase K, Namba T, Kadota S. Nitrogén-monoxid gátlása feniletanoidokkal aktivált makrofágokban. Eur J Pharmaco12000; 400:137–44

8. Greene LA, Tischler AS. Az idegnövekedési faktorra reagáló mellékvese feochromocytoma sejtek noradrenerg klonális vonalának létrehozása. Proc Nat Acad Sci 1976; 73:2424-8

9. Yao Z, Drieu K, Szweda LI, Papadopoulos V. A szabad gyökök és a lipidperoxidáció nem közvetít -amiloid által kiváltott neuronális sejthalált. Brain Res 1999; 847: 203- 10

10. Yamamoto T, Yuyama K, Nakamura K, Kato T, Yamamoto H. A nitrogén-monoxid toxicitásának kinetikai jellemzése PC12 sejtekre: NO-felszabadulás felezési idejének hatása. Eur J Pharmacol 2000; 397:25-33

11. Nicoletti l, Migliorati G, Pagliacci MC, Grignani E Riccardi C. Gyors és egyszerű módszer a timociták apoptózisának mérésére propidium-jodidos festéssel és áramlási citometriával. J Immunol Methods 1991; 139: 271-9

12. Moore KJ, Matlashewski C. A Leishmania do nova által okozott intracelluláris fertőzés gátolja a makrofág apoptózist. J Immunol 1994; 152: 2930- 7

13. Mark RJ, Keller JN, Kruman I, Mattson képviselő. Az alap FGF gyengíti az amiloid peptid által kiváltott oxidatív stresszt, a mitokondriális diszfunkciót és a Na ＋-K ＋-ATPáz aktivitás károsodását a hippocampalis neuronokban. Agykutatás 1997; 756: 205-14

14. Merad-Boudia M, Nicole A, Santiard-Baron D, Saille C, CeballosPicot L Mitokondriális károsodás mint korai esemény az apoptózis folyamatában, amelyet a glutation kimerülése indukált idegsejtekben: jelentősége a Parkinson-kór szempontjából. Biochem Pharmaco 11998; 56: 645-55

15. Langston JW, Ballard P, Tetrud JW, Irwin I. Krónikus parkinsonizmus emberekben a meperidin-analóg szintézis terméke miatt. Tudomány 1983; 219:979-80

16. Mizuno Y, Sone N, Suzuki K, Saitoh T. Tanulmányok a 1-me-etil-4-fenilpiridinium-ion (MPP＋) toxicitásáról az egér agy mitokondriumai ellen. J Neurol Sci 1988; 86: 97-110