A Cistanche Salsából származó tubulozid B megmenti a PC12 idegsejteket a 1-metil-4-fenilpiridinium-ionok által kiváltott apoptózistól és az oxidatív stressztől

Bevezetés

Patológiailag a sporadikus Parkinson-kórt (PD) jellemzően a katecholaminerg neuronok, különösen a substantia nigra pars compacta (SNc) dopaminerg neuronjainak elvesztése és a jellegzetes intraneuronák jelenléte jellemzi. Lewy-testeknek nevezett zárványok az érintett agyi régiókban. Annak ellenére, hogy számos tényező szerepet játszik a PD patogenezisében, a PD kialakulásában és progressziójában szerepet játszó mechanizmusok továbbra is bizonytalanok. Bár a PD oka továbbra is megválaszolatlan, számos bizonyíték arra utal, hogy az oxidatív stressz szerepet játszik, ami végül vezet neuronhalálhoz vagy apoptózishoz a szabad gyökök túlzott képződése miatt. Az a tény, hogy a nigrális dopaminerg rendszer nagy mennyiségű szabad gyököt képes termelni, és viszonylag alacsony szintű oxidatív védekező rendszere van, tovább erősíti ezt a hipotézist. Mind in vivo, mind in vitro vizsgálatok az l-metil-4-fenil-l,2,3,6-tetrahidropiridin (MPTP) aktív metabolitja, az MPP ＋ oxidatív stressz által közvetített neurotoxicitását mutatták ki a dopaminerg neuronokon. Az oxidatív stressz által túlzottan termelt szabad gyökök részvétele a neurodegeneratív rendellenességek, például a PD közvetlen okaként, az antioxidánsok kulcsfontosságú szerepére utal. A tubulozid B (l. ábra) a Cistanche salsa szárából izolált feniletanoid vegyületek egyike volt. Korábbi vizsgálatok azt találták, hogy sok feniletanoid, köztük a tubulozid B erős szabadgyökfogó aktivitást mutatott.

Ezeket az eredményeket figyelembe véve jelen tanulmányban a tubu]nsid B hatását vizsgáltuk az MPP+-indukált neurotoxicitásra in vitro, a PC12 szimpatikus idegi feochromocytoma sejtvonal segítségével, amelyet az évek során sikeresen alkalmaztak a neuronális funkciók tanulmányozására.

TERMÉSZETES CISTANCHE TUBULOSA A PARKINSON-BETEGSÉG MEGELŐZÉSÉRE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Anyagok és metódusok

Anyagok

A Cistanche Salsa tubulozid B-t Dr. Li Lei (Természetes Termékek Tanszék, Gyógyszertudományi Iskola, Pekingi Egyetem, Peking, Kína) szállította. A vegyület tisztasága HPLC analízis szerint több mint 98%. A Dulbecco módosított Eagle táptalajt (DMEM), a lószérumot és a magzati borjúszérumot a GIBCO BRL-től vásároltuk, 1-metil~-fenilpiridionium-ion (MPP+), poli-L-lizin, 3-(4,{) {8}}dimetil-tiazol-2 -il)-2,5- difenil-tetrazólium-bromid (MTT), propidium-jodid (PI), RNáz A, proteináz K és 2; A 7'-diklór-fluoreszcein-diacetátot (DCFH-DA) a Sigmától vásároltuk.

Sejttenyésztés

A PCI2 sejteket DMEM-ben tartottuk fenn, kiegészítve 1% lószérummal, 5% borjúmagzatszérummal, 100 U/ml penicillinnel és 100 ug/ml sztreptomicinnel. A sejteket 95% levegővel és 5% CO2-vel levegőztetett, párásított inkubátorban tenyésztettük 37 °C-on. Minden kísérletet a sejtek beoltása után 24-48 órával végeztünk. A sejteket rutinszerűen 0,25%-os tripszinezéssel gyűjtöttük be, amikor a sejtek megközelítették a szubkonfluens stádiumot, és 25 cm-es, 1:8 arányban megosztott tenyésztőlombikba szélesztettük.

A sejtek életképességének elemzése

A sejtek életképességét módosított MTT vizsgálattal határoztuk meg a korábban leírtak szerint [10]. Röviden, a PC12 sejteket 96-lyuklemezekre oltottuk 1 × 104 sejt/lyuk sűrűséggel. A tenyészeteket 48 órán át növesztettük, majd a táptalajt olyanra cseréltük, amely különböző koncentrációjú égőoldali B-t vagy MPP-t tartalmazott. Legfeljebb 48 és 72 órás inkubálás után MTr-oldatot (5 mg/ml DMEM-ben) adtunk a 96-lyukú lemezekhez, és a sejteket 4 órán át 37 °C-on inkubáltuk. A táptalaj eltávolítása után a sejt- és színezékkristályokat 200 μl DMSO hozzáadásával oldható betáplálásnak vetették alá, és az abszorpciót 570 nm-en (referenciaként 540 nm) mértük egy Model 550 mikrolemez-leolvasóval (Bio-Rad). A sejtek életképességét tripánkék kizárási módszerrel is elemeztük. A sejteket összegyűjtöttük, óvatosan pelletizáltuk, és 0,6%-os tripánkék oldattal festettük 3 esőig. A nem színezett sejtek százalékos arányát ezt követően tíz véletlenszerűen kiválasztott mikroszkópmezőben értékeltük. Pozitív gyógyszerként 100 ng／ml epidermális növekedési faktort (EGF) használtunk.

TERMÉSZETES CISTANCHE TUBULOSA A SZABAD GYÖKKÖLTŐ AKTIVITÁSHOZ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Apoptózis kimutatása áramlási citometriával

Az apoptotikus sejteket áramlási citometriával detektáltuk propidium-jodid (PI) alkalmazásával [11••]. Röviden, körülbelül 1 × 106 sejtet, amelyeket a vizsgált anyagokkal inkubáltunk, centrifugálással gyűjtöttünk össze, és egyszer mostuk PBS-sel. A sejteket 70%-os etanollal fixáltuk 24 órán át - 20 fokon, majd egyszer mostuk PBS-sel. A sejteket ezután újraszuszpendáltuk 300 µl PBS-ben, amely 0,5 mg/ml RNázA-t és 0,5 mg/ml PI-t tartalmazott. Sötétben 30 percig tartó további inkubálás után áramlási citometriát végeztünk FACScan készülékkel (Becton Dickinson, Heidelberg, Németország).

A DNS fragmentáció elemzése elektroforézissel

A Moore-féle protokollt [12] alkalmaztuk, amely csak fragmentált DNS-t izolált, és a kísérleteket minden tesztcsoportból azonos számú tenyészet felhasználásával normalizáltuk. Röviden összefoglalva, mindegyik kezelt mintából 3 × 106 neuront Hank-féle kiegyensúlyozott sóoldatban mostuk (1000g 10 percig), és a cső alján képződött pelleteket homogenizáltuk. 1 ml lízispufferrel (10 mM Tris, pH 7,4, 5 mM EDTA, 1% Triton X{11}}) 20 percig jégen. 11, 000 g 20 esőig 4 fokos centrifugálás után a fragmentált DNS-t tartalmazó felülúszót eltávolítottuk, és 20 mg/ml RNáz A-val 37 fokon 1 órán át, és 0,1 mg/ml proteináz K-val 56 fokon emésztettük. további 1 óráig. A fragmentált DNS-t fenollal és kloroformmal extraháltuk, és 10, 000g-vel centrifugáltuk 1 esőig 4 C-on. A vizes fázist egy új Eppendorf-csőbe vittük át, 2 térfogat jéghideg etanollal összekevertük, majd 20 fokon legalább 1 órára a DNS kicsapása érdekében. 15, 000g 20 perces, 4 fokos centrifugálás után a felülúszót eltávolítottuk, és a DNS-pelleteket egyszer mostuk 80%-os etanollal (15 000 g 15 percig 4 fokon), levegőn szárítottuk és 20 μl-ben feloldottuk. TE puffer pH 7,6-on. A teljes mintát ezután 1,5%-os agaróz gélen 1 órán át 85 V-on elektroforézisnek vetjük alá. A gélt Ultra Violet Products Gel Documentation System (GELDOC-2000, Bio-Rad, USA) segítségével megvizsgáltuk és lefényképeztük.

Az intracelluláris ROS képződés mérése

Az intracelluláris peroxidok képződését konfokális pásztázó lézermikroszkóppal detektáltuk egy nem fluoreszcens vegyület, a 2"7"-diklór-fluoreszcein-diacetát (DCFH-DA) [13] segítségével, amelyet a sejten belül endogén észterázok ionizált szabaddá észtereznek. sav, 2,7"-diklórfluoreszcein. 2",7-A diklórfluoreszceint hidroantioxidánsok segítségével fluoreszcens 2"7"-diklórfluoreszceinné (DCF) oxidálják. A sejteket 10 μM DCFH-DA-val inkubáltuk 30 percig 37 °C-on. A tenyészeteket kétszer mostuk Hank-féle kiegyensúlyozott sóoldattal, és ugyanabban a tápközegben leképeztük. A leképezést konfokális pásztázó lézermikroszkóppal végeztük, a DCF-et 488 nm-en gerjesztették, az emissziós szűrőt pedig egy 510 nm-es gátszűrővel végeztük. A cellák közepén beállítottuk az optimális függőleges helyzetet, majd a mezőt gyorsan pásztáztuk. Mivel a 488 nm-es gerjesztési hullámhosszú megvilágítás a festék oxidációja miatt megnövekedett fluoreszcenciát okozott, mindegyik mezőt ugyanannyi ideig tették ki Iight-nak. A nem stimulált sejtekből származó kiindulási értékeket használtuk kontrollértékként az MPP+-kezelt sejtekkel való összehasonlításhoz, a sejtek jelenlétében vagy hiányában.tubulozid B. A szkennelés után az átlagos relatív fluoreszcencia intenzitást 15-20 idegsejttestben mikroszkópmezőnként számszerűsítettük négy külön tenyészetben kezelési körülményenként.

Statisztikai analízis

Az összes kapott értéket átlag ±SD-ben fejeztük ki. A csoportok közötti különbségek statisztikai szignifikanciáját Student-féle t-próbával határoztuk meg; A 0,05-nél kisebb számított p-értékeket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük.

Eredmények

Amint a 2. ábrán látható, az MPP+ dózisfüggő csökkenést idézett elő a PCI2 sejtek életképességében. Ezzel szemben az EGF, egy jól ismert neurotróf faktor, 100 ng/ml MPP mellett jelentős védelmet nyújtott a sejtek életképességében. A citotoxikus hatások a tubulozid B (5, 10, 50 vagy 100 ug-ml) jelenlétében is gyengültek.{12} }), bár a referencianál kisebb hatékonysággal

gyógyszer (3. ábra). A tubulozid B ezekben a koncentrációkban dózisfüggő módon citoprotektív hatást fejtett ki, és a vegyület önmagában nem okozott semmilyen látszólagos citotoxicitást (az adatokat nem mutatjuk be). A 200 µM MPP+-szal 48 órán keresztül kezelt PCI 2 sejtekből származó DNS-kivonat gélelektroforézise DNS-létra emelkedést mutatott. az apoptózis klasszikus ismertetőjele, a tubulozid B, 10 és 100 μg·ml-es dózisokban,{8}}a DNS-létra kialakulását eredményezte (4. ábra). Az 5. ábra az MPP+ által kiváltott apoptotikus sejthalál áramlási citometriás analízisének tipikus hisztogramjait mutatja PC12 sejtekben tubulozid B jelenlétében vagy hiányában. A sejtciklus-profil PI-vel történő mennyiségi meghatározása feltárta a szubdiploid jellemzőkkel rendelkező sejtek számát (M1 régió) apoptotikus DNS fragmentációra utal. A kezeletlen sejtekben az apoptotikus szubdiploid frakció az összes 10 000 sejt 5%-áig minimális volt (5A ábra). 48 órás MPP-nek való kitettség után az apoptózis százalékos aránya 43°02;j-re nőtt (5B. ábra). A sejttenyészethez hozzáadva a tubulozid Bgátolta az MPP{0}}indukált apoptózistdózisfüggő módon. 10 ug·ml-1koncentrációnál a tubulozid B által nyújtott védelem nem volt statisztikailag szignifikáns, de 50 és 1 00ug·ml-1 koncentrációnál 45, illetve 63%-os csökkenés. megfigyelték. a túlélő sejtek százalékos arányának növelése (5D, E ábra).

Az intracelluláris ROS felhalmozódása kimutatható a 200 uM MPP-vel 48 órán keresztül kezelt DCFH-DA．PC12 sejtek használatával, amelyek intenzív fluoreszcenciát mutattak a sejten belül a DCFH-DA festékkel való festést követően (6. ábra). A tubulozid B-vel való egyidejű kezelés (10 és 100 ug·ml-es dózisokban) gátolta az MPP-indukált ROS-termelést (a csökkent százalékos arány 24,52, illetve 55,63 százalék volt).

TERMÉSZETES CISTANCHE TUBULOSA PARKINSON-BETEGSÉG KEZELÉSÉRE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Vita

A PD patogenezise magában foglalja az erős oxidatív stresszt, a csökkent antioxidáns szintet és a mitokondriális hibákat. mindegyikről ismert, hogy számos sejtrendszerben apoptózist indukálnak. A szabad gyökökről kimutatták, hogy aktív sejthalált váltanak ki az idegsejtekben[14]. Az MPTP irreverzibilis és súlyos Parkinson-kórhoz hasonló szindrómát okoz, amely a nigrostriatális dopaminerg neuronok szelektív degenerációját okozza emberben. Ezt a neurotoxint felhasználták a létrehozására. A PD[15] állatmodelljei az MPTP-t a monoamin-oxidáz B hatására Mpp-vé alakítják, amely a mitokondriumokban halmozódik fel. ahol gátolja az I. mitokondriális komplexet és a mitokondriális diszfunkciót. funkció apoptózist okoz[16]. Ezért a dopaminerg neuronokban az MPP+ 一 által kiváltott neurotoxicitást széles körben alkalmazták a PD etiológiai modelljeként a neuroprotektív szerek szűrésére.

Jelen tanulmányunkban kimutattuk, hogy a PC12 sejtekben az oxidatív stressz által kiváltott MPP+-sejthalált a tubulozid B csökkentette. Továbbá kimutattuk, hogy a tubulozid B dózisfüggő módon védelmet nyújt az MPP{{ 3}} indukált DNS létra és apoptózis, DNS gélelektroforézissel és áramlási citometriás analízissel mérve. Ezenkívül a tubulozid B magasabb koncentrációival történő egyidejű kezelés gátolta az MPP-indukált ROS-termelést. Így a tubulozid B multifunkcionális neuroprotektív hatást mutatott. A tubulozid B hatásában több mechanizmus is szerepet játszhat, külön-külön vagy társulva. Az antioxidáns hatás a tubulozid B által közvetített neuroprotekció egyik lehetséges mechanizmusa. Xiong Q azt találta, hogy a tubulozid B erős szabadgyökfogó aktivitást mutatott az 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil gyökön és a xantin]xantin-oxidáz által generált szuperoxid-anion gyökön.

A közelmúltban számos feniletanoidról számoltak be, amelyek szabad gyökfogó tulajdonságokkal rendelkeznek, és megvédik az oxidatív stressz okozta toxikus sérüléseket. Az MPP+ által termelt ROS, mint a hidrogén-peroxid, szuperoxid anion és hidroxilgyök könnyen károsítja a biológiai molekulákat, ami végső soron apoptotikus vagy nekrotikus sejthalálhoz vezethet. Így a tubulozid B-nek közvetlen megkötő hatása lehet a ROS ellen. Bár adataink nem határozzák meg pontosan azt a helyet, ahol a tubulozid B gátolja a ROS felhalmozódását, azt sugallják, hogy a neuroprotektív mechanizmus magában foglalja az antioxidáns útvonalak stimulálását. A tubulozid B molekuláris szerkezetének vizsgálata azt is jelzi, hogy a tubulozid B hatásos képességgel rendelkezikszabad gyökök megkötése(személyes kommunikáció).

Más mechanizmusok is helytállóak lehetnek. Például a tubulozid B képes ellensúlyozni az MPP toxicitását azáltal, hogy gátolja a mitokondriális permeabilitás átmeneti pórusainak kinyílását és a diszfunkciót. Ezenkívül azt is mérlegelni kell, hogy a tubulozid B-nek van-e közvetlen növekedésserkentő hatása az idegsejtekre. A tubulozid B neuroprotektív hatásának pontos mechanizmusa továbbra sem tisztázott. További vizsgálatok szükségesek a neuroprotektív hatás teljes képének tisztázásához.

Végeredményben a tubulozid B innenCistanche salsa kivonatnyilvánvaló védőhatással rendelkezik az MPP{0}}indukált apoptózissal és az oxidatív stresszel szemben. Az MPP ＋ toxicitással szembeni neuroprotektív hatásai fontosak lehetnek, és arra utalnak, hogy terápiás potenciállal bírhat a PD megelőzésében és kezelésében.

TERMÉSZETES CISTANCHE TUBULOSA PARKINSON-BETEGSÉG KEZELÉSÉRE PHGS75% ECH 30% ACT 12%