A daganatsejtek nem képesek az onkogénekből származó MHC-II-korlátozott epitópokat a CD4+ T-sejtekké bemutatni

A CD4+ T-sejtek kritikus szerepet játszanak a daganatellenes immunitásban az MHC II. osztályon (MHC-II) bemutatott peptid antigének felismerése révén. Bár néhány szilárd rák MHC-II expressziójára indukálható, nem világos, hogy ez milyen mértékben teszi lehetővé a tumorspecifikus CD{4}} T-sejtek közvetlen felismerését. Fej-nyaki laphámsejtes karcinómában szenvedő betegek T-sejt-antigén-receptorait (TCR-eket) izoláltuk és jellemeztük 2 onkoproteinre, a HPV-16 E6-ra és az aktiváló KRASG12V mutációra specifikus, természetesen beindított CD4+ T-sejtekből. illetve a hasnyálmirigy ductalis adenokarcinómáját, és meghatározták, hogy képesek-e felismerni az autológ vagy humán leukocita antigénhez illeszkedő antigént expresszáló tumorsejteket. Mindkét esetben azt találtuk, hogy a TCR-ek képesek voltak felismerni a releváns MHC-II vagy B sejt antigén-prezentáló sejteket (APC) expresszáló peptiddel töltött célsejteket, amikor az antigének endogén expressziója és az endoszomális útvonal felé irányult, de nem ismerték fel a tumort. a forrásfehérjét expresszáló sejtek még azután is, hogy a felületi MHC-II expressziót IFN-val indukálták vagy transzdukció CIITA-val. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy mind a nukleáris (E6), mind a membránhoz kapcsolódó (KRAS) onkoprotein beindítása és funkcionális felismerése túlnyomórészt az APC-k keresztezésére korlátozódik, nem pedig az MHC-II expressziójára indukált tumorsejtek közvetlen felismerésére.

A cistanche tubulosa-Antitumor előnyei

Bevezetés

A szomatikus sejtek rosszindulatú átalakulását az aktivált onkogének működése indítja el, amelyek megzavarják a sejtnövekedési útvonalakat, és ellenőrizetlen proliferációhoz vezetnek (1). A HPV-vel összefüggő rákos megbetegedések esetében a HPV korai E6 és E7 gének expressziója hozzájárul az onkogenezishez azáltal, hogy gátolja a p53 és Rb tumorszuppresszor géneket (2). Alternatív megoldásként a konstitutív onkogén aktiváció a sejtnövekedési és proliferációs útvonalakat szabályozó génekben, például a RAS családban bekövetkező szomatikus mutációkon keresztül is létrejöhet. Valójában az aktiváló KRAS mutációkat, például a KRASG12V-t gyakran találják hasnyálmirigy-, vastagbél- és tüdőrákban szenvedő betegeknél (3). Bár az onkogének elősegítik a betegségeket, célpontokat is jelenthetnek a gazdaszervezet immunrendszere számára. Az elmúlt években széles körben elismertté vált az immunrendszer szerepe a HPV-vel összefüggő rákos megbetegedések leküzdésében. A HPV E6-ot és E7-et, valamint más HPV-fehérjéket felismerő CD8+ és CD4+ T-sejteket azonosítottak mind a perifériás vérben, mind a tumor-infiltráló limfocitákban (TIL-ekben) HPV-vel asszociált betegektől. rákos megbetegedések (4-6). Az ezeket az antigéneket célzó immunterápiák, beleértve a terápiás rákvakcinákat és a TIL-ekkel vagy TCR-módosított T-sejtekkel végzett adoptív celluláris terápiát (ACT), a preklinikai és klinikai vizsgálatok aktív területei (2). Az onkogén mutációk elleni T-sejtes válaszokat is széles körben leírták (7–9). Ezen túlmenően közvetlen klinikai bizonyítékok állnak rendelkezésre arra vonatkozóan, hogy a mutáns KRAS-t célzó TIL-ekkel rendelkező ACT elősegítheti az objektív válaszokat (10). Bár az onkogénekből származó epitópokat felismerő CD8+ T-sejtek közvetlen citotoxicitást közvetítenek a tumorsejtek ellen (11–13), a CD4+ T-sejtek daganatellenes immunitásban betöltött szerepe kevésbé ismert. A legújabb tanulmányok rávilágítottak a CD4+ T-sejtek egy alcsoportjára, amelyek citotoxikus markereket, például granzyme B-t (GrzmB) expresszálnak emberi rákos megbetegedések esetén (14, 15). Ezeknek a sejteknek az antigénspecifitása, és ezáltal terápiás potenciálja azonban nagyrészt ismeretlen. Továbbá ahhoz, hogy ezek a citotoxikus CD4+ T-sejtek felismerjék és elpusztítsák a daganatsejteket, nemcsak a tumorsejtnek kell MHC-II-t expresszálnia, hanem a megfelelő antigéneket is a megfelelő prezentációs útvonalra kell irányítani. Ebben a vizsgálatban a HPV4+ E6 és KRASG12V onkoproteinekre specifikus CD4+ T-sejtek azon képességét vizsgáltuk, hogy felismerik az antigént expresszáló daganatsejteket. Bár mindkét TCR képes volt közvetlenül felismerni az endogén módon feldolgozott és bemutatott, a HLA-val egyező B-sejtek endoszomális kompartmentjére irányított antigéneket, egyik sem volt képes felismerni az MHC-II indukált expressziójával rendelkező antigént expresszáló tumorsejteket. Eredményeink összességében azt sugallják, hogy csak bizonyos antigének jelennek meg közvetlenül az MHC-II+ tumorsejteken, ami korlátozhatja a tumorsejtek közvetlen felismerésére és eltávolítására képes CD4+ T-sejtek készletét.

A cistanche előnyei a férfiak számára – erősítik az immunrendszert

Kattintson ide a Cistanche Enhance Immunity termékek megtekintéséhez

【Kérjen többet】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Eredmények

A HPV-16 E6-specifikus CD4+ és CD8+ T-sejtes válaszok azonosítása fej-nyaki laphámsejtes karcinóma TIL-eiből. Egy HPV-16+ fej-nyaki laphámsejtes karcinómában (HNSCC) szenvedő beteg (Hu-56) 2-4 mm-es tumorfragmenseiből izolált egyedi TIL-tenyészetek sorozatát vizsgáltuk (1. kiegészítő táblázat; kiegészítő anyag elérhető online ebben a cikkben; https://doi.org/10.1172/jci.insight.165570DS1) IFN-ELISPOT vizsgálatokkal a HPV{14}} vírus E6 és E7 onkoproteinje elleni T-sejt-válaszok azonosítására, a következő peptidkészletek felhasználásával átfedő 15-merek az E6 és E7 fehérjék hosszán. Nevezetesen, a 12-es és 29-es TIL-fragmens jelentős számú foltot generált a háttér felett, amikor újrastimulálták az E6 peptidkészlettel, és CD4+ és CD8+ T-sejteket is tartalmaztak (1A. ábra és 1A. kiegészítő ábra). A releváns T-sejt-alcsoportok azonosítása érdekében ezeket a TIL-tenyészeteket citokinszekréciós vizsgálattal elemeztük. Ez feltárta, hogy a 29-es TIL-fragmens (F29) E6-reaktív CD8+ T-sejteket tartalmazott, míg a 12-es fragmentum (F12) egyaránt tartalmazott CD4+ és CD8+ T-sejteket, amelyek képesek az E6 peptidkészlet felismerése (1B. ábra). A CD4+ T-sejtek egyike sem termelt IL-5-t válaszként az E6 újrastimulációra, ami egy Th1-szerű fenotípust igazolt. Az E6-specifikus TIL-ek TCR-klonalitásának meghatározásához egyetlen IFN-szekretáló CD4+ T-sejteket válogattunk az F12-ből és CD8+ T-sejteket az F12-ből és F29-ből. A TCR szekvenálás egyetlen TCR-t tárt fel, amelyet IFN-t szekretáló CD4+ T-sejtek (31 sejtből n=31 szekvenáltak), valamint egyetlen TCR-klónt, amelyet az IFN-t szekretáló CD{53. }} T-sejtek mind az F12-ből, mind az F29-ből (n=40 41-ből, illetve 38 sejtből 37 szekvenálva) (2. kiegészítő táblázat). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az E6-ra reaktív monoklonális CD{61}} és CD8+ T-sejtek jelen vannak a beteg TIL-eiben. HLA-A*02:01 – korlátozott CD8+ A TIL-ekből származó T-sejtek felismerik a páciensből származó tumorsejtvonal által bemutatott E6-ot. Az F29-ből származó TIL-ek IFN-t termeltek, amikor az E629-38 peptiddel újrastimulálták, ami arra utal, hogy az F29 TCR felismerte ezt a korábban leírt HLA-A*02:01-re korlátozott epitópot (1B. kiegészítő ábra) (11). Ezt megerősítették tetramer-kötődési vizsgálatok, amelyekben E629-38/HLA-A*02:01-et használtak a TCR-hiányos, humán CD8-at expresszáló J76-sejtek jelölésére, és pozitívként egy korábban leírt E628-38-specifikus TCR-t használtak. vezérlő (2A. ábra) (11). Mindkét TCR hasonló szintű funkcionális aviditást mutatott, amint azt a J76-on lévő CD69 akut aktivációs marker felszabályozása bizonyítja autológ B-limfoblasztoid sejtvonalakkal (B-LCL) végzett stimuláció után, amelyet titrált koncentrációjú E{93}} peptiddel pulzáltak (2. B és C). Ezek az adatok igazolják az E6 ismert epitópjára specifikus CD8+ T-sejt klón jelenlétét, amely hasonló funkcionális jellemzőkkel rendelkezik a klinikai környezetben tesztelt TCR-hez (16). Ezt követően azt próbáltuk meghatározni, hogy az E6-specifikus CD8+ TCR képes-e felismerni az endogénen expresszált antigéneket, és ezáltal közvetíteni a tumorellenes citotoxicitást. Ehhez egy jól jellemzett HLA-A*02:01+ HPV-16+ tumorvonalat, a CaSki-t, valamint egy autológ tumorsejtvonalat, a HNSCC{105}} használtunk, amelyet a az elsődleges tumorszövet sejtes újraprogramozása a korábban leírtak szerint (17) az in vitro citotoxicitási vizsgálatokhoz. Az RNA-Seq analízis mind az elsődleges tumormintában, mind az autológ sejtvonalban validálta a HPV{108}} korai gének, köztük az E6 expresszióját (1C. kiegészítő ábra). Az F29 TCR-t expresszáló primer humán CD8+ T-sejtek a CaSki és a HNSCC-56 sejtpusztítását is közvetíthetik az effektor-célpont arányok tartományában in vitro (2. ábra, D és E). Ezek az adatok együttesen igazolják, hogy az F29 TCR felismeri az endogén E6 antigént. HLA-DQ-korlátozott, E{120}}specifikus CD4+ T-sejt azonosítása TIL-ekből. Az E6-specifikus TIL-ek további funkcionális elemzéshez való kiterjesztéséhez a korábban leírt gyors expanziós tenyésztési protokollt használtuk OKT{123}}-el és besugárzott allogén PBMC-kkel a TIL-ek kiterjesztésére az F12-ből. Bár az elsődleges F12-tenyészet eredetileg E6-reaktivitású CD8+ és CD4+ T-sejteket is tartalmazott, a végső sejttermék a gyors szaporodás után 99%-ban CD4+ T-sejteket tartalmazott, ebből körülbelül 38,33 %-a mutatott reaktivitást E6 ellen, amint azt az intracelluláris citokinfestés IFN-re mutatta (3A. ábra).

Kínai gyógynövény-cisztanche növény-Antitumor

Az IFN- mellett a stimulált E6-specifikus CD4+ TIL-ek TNF-et szekretálhatnak, IL-2-t azonban nem (2A. kiegészítő ábra). Bár a GrzmB+ sejtek összfrekvenciája nem nőtt az antigénstimuláció hatására, a TNF-kiválasztó sejtek kapuzása azt mutatta, hogy az E6-specifikus CD4+ TIL-ek több tárolt intracelluláris GrzmB-t tartalmaztak, mint a nem specifikus TIL-ek (2B. kiegészítő ábra). ). Az IFN-szekréciós CD4+ TIL-ek a koinhibitor marker programozott sejthalált 1-et (PD-1) is kifejezték, ami összhangban van a tumorreaktív CD4+ TIL-ek publikált aláírásaival (2C. kiegészítő ábra) ( 18, 19). Az E6-specifikus CD4+ TIL-ek nagy funkcionális aviditást mutattak, mivel ezek a sejtek 1 ug/ml-nél kisebb peptidkoncentrációban tudtak citokineket kiválasztani (3B. ábra). Az F12 TIL tenyészet specifitásának meghatározásához autológ B-LCL-eket pulzáltunk az eredeti E6-készletben található 37 peptid mindegyikének megfelelő egyedi peptidekkel (3. kiegészítő táblázat). Az F12-ből származó CD4+ TIL-ek IFN-t szekretáltak, amikor E61-15 és E65-19 peptidekkel stimulálták, amelyek 11 aminosavból álló magszekvenciával rendelkeznek (2D. kiegészítő ábra). A HLA-blokkoló Abs jelenlétében végzett kotenyésztési kísérletek szignifikánsan csökkent IFN-szekréciót mutattak ki a TIL-ek által, amikor a B-LCL-eket anti-HLA-DQ Abs-okkal blokkolták, de az anti-HLA-DR-t vagy az izotípus-kontroll Abs-t nem (3C. ábra). Annak meghatározására, hogy mely HLA-DQ allélek felelősek ennek az epitópnak a megjelenéséért, az ismert HLA-DQ alléleket expresszáló B-LCL-eket (4. kiegészítő táblázat) E61-15-vel pulzáltuk, és megállapítottuk, hogy a HLA-DQA1*01-et expresszáló KAS011 sejteket. :02 és DQB1*05:02, de a DQA1*05:05-öt és DQB1*03:01-et expresszáló Hu-195 B-LCL-ek az autológ Hu-hoz hasonló módon mutathatnak be antigént a TIL-eknek{{63} } B-LCL-ek (3D. ábra). Végül megpróbáltuk ellenőrizni, hogy a korábban azonosított TCR szekvencia valóban felelős az E6 felismerésért. Az F12 TCR expressziója elsődleges humán egészséges donor CD4+ T-sejtekben elegendő volt ahhoz, hogy elősegítse az E61-15 peptid felismerését, amint azt a CD69 és a PD-1 fokozott szabályozása bizonyítja (3E. ábra). ). Összességében ezek az eredmények azt mutatják, hogy az E6 HLA-DQ-korlátozott epitópját azonosították a monoklonális CD{75}} TIL-ek. Az E6-specifikus CD4+ T-sejtek nem ismerik fel és nem pusztítják el az MHC-II-t expresszáló autológ tumorsejteket. A közelmúltban végzett vizsgálatok a citotoxikus CD{79}} TIL-ek genetikai aláírását azonosították egyes emberi rákos megbetegedések esetén (14, 15). Nem ismert azonban, hogy a citotoxikus CD4+ T-sejtek szerepet játszanak-e a HPV által kiváltott rákos megbetegedésekben. Annak megállapítására, hogy a TIL-ekből származó E6-specifikus CD4+ T-sejtek képesek-e közvetlenül felismerni a HNSCC-t-56, először megvizsgáltuk az MHC-II expressziós állapotát. Bár a tumorsejtek nem expresszáltak kimutatható felületi MHC-II-t a tenyészetben, a 72 órás IFN-kezelés elegendő volt az MHC-II fokozódásának indukálásához (4A. ábra). Ezután a HNSCC-t{93}} tenyésztettük CD4+ F12 TIL-ekkel. Fontos, hogy az IFN-vel előkondicionált MHC-II+ tumorsejtek nem voltak képesek stimulálni a CD4+ TIL-eket az IFN-szekrécióval mérve (4B. ábra).

1. ábra: A HPV-16+ HNSCC-ből származó E6-reaktív CD4+ és CD8+ TIL-ek azonosítása. (A)

2. ábra: Hu-56 TIL-ekből származó HLA-A*02:01 – korlátozott, E6-specifikus TCR funkcionális jellemzői. (A)

Azonban az IFN-kezelt tumorsejtvonalak, amelyeket a TIL-ek hozzáadása előtt E61-15-el pulzáltak, képesek voltak T-sejt-választ stimulálni, ami azt jelzi, hogy a korlátozó HLA-DQ allélek felszíni expressziója olyan sejtvonalban, amely endogén módon expresszál. Az E6 nem volt elegendő a tumor felismeréséhez, de a célpeptid exogén terhelését igényelte. Ugyanezt az exogén célpeptid töltés követelményét figyelték meg a CIITA-transzdukált tumorsejtek (HNSCC-56 CIITA) esetében, amelyek konstitutívan magas szintű felszíni MHC-II-t expresszálnak (4B. ábra). Annak tesztelésére, hogy a CD4+ TIL-ek képesek-e felismerni az E6 epitóp endogén módon feldolgozott és bemutatott változatát egy APC-n, retrovírussal transzdukáltunk autológ B-LCL-eket olyan expressziós konstrukcióval, amely az E6 első 50 aminosavát kódolja az MHC-hez fuzionálva. I transzmembrán domén (E6-MITD), amely indukálja a fuzionált aminosavszekvencia lokalizációját a plazmamembránon, és támogatja az MHC-II-n való megjelenést az endoszomális forgalom révén (20). Az E6-MITD konstrukciót expresszáló B-LCL-ek stimulálhatják az E6-specifikus CD4+ TIL-eket, ami azt jelzi, hogy az ezen TIL-ek által felismert peptidepitóp természetesen feldolgozható és bemutatható MHC-II-n, amikor a megfelelő útvonalra irányítják (4C. ábra).

3. ábra: Klónosan kiterjesztett, HLA-DQ-korlátozott, E6-specifikus CD4+ TIL-ek funkcionális jellemzői. (A)

Ezt követően azt próbáltuk meghatározni, hogy az F12 E6-specifikus CD4+ TIL-ek képesek-e közvetlen tumor citotoxicitásra. A felismerési vizsgálatainkból származó adatokkal összhangban az E6-specifikus CD4+ TIL-ek nem tudták korlátozni az MHC-II-t nem expresszáló HNSCC-56 tumorsejtek növekedését (4D. ábra). . Ezenkívül a HNSCC-56 CIITA tumorsejtek is gátlástalanul növekedtek CD4+ TIL-ek jelenlétében. Az E61-15 peptiddel pulzált HNSCC{10}} CIITA tumorsejtek növekedése azonban effektorsejt-dózisfüggő módon gátolt. Összességében ezek az adatok azt sugallják, hogy bár a HNSCC-56 képes bemutatni E6 epitópokat a CD8+ T-sejteknek, az E6-specifikus CD4+ TIL-ek nem képesek közvetlenül felismerni és lizálni az MHC- II+ autológ tumorsejtek. Az antigénprezentációban részt vevő gének gyakran mutációt mutatnak rákos megbetegedések esetén, ami megakadályozhatja a T-sejtek felismerését (21). Annak megállapítására, hogy a HNSCC-56 tumorsejtek tartalmaznak-e olyan szomatikus mutációt, amely kizárja az antigénprezentációt az MHC-II-n, referenciamintaként elvégeztük a Hu-56-ból származó tumorsejtek és PBMC-k teljes exome szekvenálását. A 104 azonosított, nem szinonim szomatikus mutáció közül nem volt látható mutáció az MHC-II prezentációs útvonal komponenseiben, beleértve a HLADMA-t, a HLADMB-t és a CD74-et (5. kiegészítő táblázat). HLA-DRB5*01:01 – korlátozott, KRASG12V-specifikus TCR azonosítása egy hasnyálmirigy ductalis adenocarcinomában szenvedő beteg véréből. Ezeket az eredményeket követően megvizsgáltuk, hogy a tumorsejtek képtelenek az MHC-II-n antigént prezentálni más onkogénekre is. Tekintettel arra, hogy keringő tumorspecifikus T-sejteket azonosítottak rákos humán betegekben (8, 22), peptidkészlettel stimuláltuk a PBMC-ket egy hasnyálmirigy-ductalis adenokarcinómában szenvedő betegből (Hu-66) (1. kiegészítő táblázat). megfelelnek a gyakori onkogén mutációknak (6. kiegészítő táblázat) 14 napig az egyedi peptidekkel történő újrastimuláció előtt, hogy ELISPOT segítségével azonosítsák a releváns T-sejt-válaszokat. Ezek az eredmények a KRASG12V elleni T-sejtes válasz jelenlétét jelezték, amit a háttérben megnövekedett IFN-foltok bizonyítanak a KRASG12V 1–15. aminosavaira válaszul (5A. ábra). Az ehhez a válaszhoz kapcsolódó releváns TCR-ek azonosításához ismét a citokinszekréciós vizsgálatot alkalmaztuk az IFN-szekretáló sejtek válogatására. A citokin szekréciós vizsgálat specifikus IFN-termelést mutatott ki a CD4+ T-sejtek által a KRASG12V-vel végzett újrastimuláció hatására (5B. ábra). Összehasonlítva a rendezett IFN---szekretáló sejtekből származó TCR-láncokat az ettől a pácienstől származó, nem tágított PBMC-ben lévőkkel, kiderült, hogy mindkét populációban egyetlen TCR-klonotípus van jelen a legnagyobb gyakorisággal (5C. ábra és 2. kiegészítő táblázat). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy ennek a T-sejt-klónnak a gyakorisága az alapvonalon megnövekedett a PBMC-kben, ami inkább természetes in vivo válaszreakcióra utal, semmint in vitro primingre expanziós tenyészetünkben. Ennek a TCR-nek az antigénspecifitásának igazolására primer humán CD{60}} T-sejtekben expresszáltuk retrovírus-transzdukcióval, és ezeket a sejteket autológ B-LCL-ekkel tenyésztettük, amelyeket vagy a mutáns KRASG12V-vel vagy a megfelelő WT-peptiddel pulzáltak. A módosított T-sejtek IFN-t szekretáltak, amikor a mutánssal stimulálták, de nem a WT, KRAS peptiddel, igazolva, hogy ez a TCR specifikus a KRASG12V-re (5D. ábra). Az E6 TCR-ből származó eredményeinkkel összhangban a KRASG12V-specifikus TCR-t expresszáló génsebészeti T-sejtek is képesek voltak felismerni a KRASG12V egy fragmensét expresszáló B-LCL-eket, de nem a WT KRAS-t, amelyek egy MITD beépítésével az endoszómára irányultak, ami arra utal, hogy ez A TCR felismeri az endogén módon feldolgozott és bemutatott antigént (5D. ábra).

4. ábra. Az autológ tumorsejtek nem mutatnak be endogén E61-15-t az MHC-II-n a CD4+ T-sejteken. (A)

5. ábra: HLA-DRB5*01:01-korlátozott, KRASG12V-specifikus TCR azonosítása egy hasnyálmirigy ductalis adenocarcinomában szenvedő beteg véréből. (A)

A korlátozó HLA allél azonosítására megismételtük ezeket a peptidstimulációs kísérleteket HLA gének különböző kombinációit expresszáló B-LCL-ekkel. A közös HLA-B7-DR15-DQ6 haplotípust expresszáló B-LCL-ek stimulálhatják a módosított T-sejteket, míg az ezen allélok nélküli B-LCL-ek nem (5E. ábra). Végül ezeknek a sejteknek a peptiddel pulzált IHW03304-gyel, egy humán HLA-DRB5*01:01-gyel transzfektált egér DAP3 sejtvonallal történő stimulálása igazolta, hogy ez a restrikciós HLA-molekula (5F. ábra). Az MHC-II+ NCI-H2444 és a DAN-G tumorsejtek nem mutatnak KRASG12V-eredetű epitópot a CD4+ T-sejteknek. Ezt követően megvizsgáltuk a tumorsejtek azon képességét, hogy közvetlenül mutassanak be KRASG12V-eredetű epitópokat MHC-II-n. Ahhoz, hogy ezekhez a vizsgálatokhoz HLA-egyeztetett MHC-II+ sejtvonalakat hozzunk létre, transzdukáltuk a humán tüdő- és hasnyálmirigyrákból származó KRASG12V+ sejtvonalakat, az NCI-H2444 és DAN-G sejtvonalakat CIITA-val és egy HLA-DRB5*01-et kódoló konstrukcióval: 01 csonka CD34 riportergénnel (6A. ábra). Korábbi eredményeinknek megfelelően a restrikciós HLA allélt expresszáló MHC-II+ tumorsejtek nem voltak képesek stimulálni a TCR-vel módosított T-sejteket, hacsak a célsejteket először exogén peptiddel nem pulzáltattuk (6B. ábra). Fontos, hogy a nyilvánosan elérhető szekvenálási adatokban sem az NCI-H2444, sem a DAN-G MHC-II prezentációs génjeiben (nevezetesen a HLADMA, HLADMB, CD74) nem szerepeltek szomatikus mutációk (23). Az NCI-H2444 CIITA sejtek gátlás nélkül növekedtek a TCR által módosított T-sejtek jelenlétében, míg a KRASG12V peptiddel pulzált NCI-H2444 CIITA sejtek késleltetett tumornövekedést tapasztaltak (6C. ábra). A HNSCC-56 esetében kapott eredményekkel összhangban a HLA-A*03:01-korlátozott, KRASG12V-specifikus TCR-t (24) expresszáló CD8+ T-sejtek képesek voltak felismerni az NCI-H2444 sejteket, de nem CaSki-sejtek, amelyek HLA-A*03:01-et expresszálnak, de nem KRASG12V-t (6D. ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a citoszolban jelenlévő külön onkogént az MHC-II+ tumorsejtek sem képesek bemutatni annak ellenére, hogy az MHC-I-en hatékonyan prezentálja. A koinhibitor ligandumok, például a programozott sejthalál ligand 1 (PD-L1) tumorsejtek általi expressziója korlátozza a TCR-jelátvitelt a T-sejtekben (25). Annak megállapítására, hogy ez a mechanizmus megakadályozhatja-e az MHC-II+ tumorsejtek felismerését a CD4+ T-sejtek által, CD4+ T-sejteket tenyésztettünk, amelyek expresszálják a KRASG12V-specifikus TCR-ünket vagy az E{86}}-specifikus T-sejteket. F12 TCR NCI-H2444 CIITA-val és HNSCC{90}} CIITA-val, PD-L1-blokkoló Abs-okkal vagy anélkül. A PD-L1/PD{95}} kölcsönhatások blokkolása nem volt elegendő a tumorsejtek felismeréséhez (3. kiegészítő ábra). Hasonlóképpen, az anti-CD28 agonista Ab hozzáadása nem modulálta a tumorsejtek felismerését. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy ezért a fenotípusért az antigénprezentáció hiánya, nem pedig a koinhibitor vagy kostimuláló jelek jelenléte vagy hiánya felelős. Egyes tanulmányok azt sugallják, hogy a plazmamembránból internalizált endogén fehérjéket más szubcelluláris kompartmentekkel összehasonlítva előszeretettel töltik fel az MHC-II-re prezentáció céljából (26). Bár a KRAS fehérjék gyakran lipidmódosításokon keresztül kapcsolódnak a membránokhoz, nem expresszálnak transzmembrán domént, és ezek a kölcsönhatások nem stabilak (3, 27). Ezért úgy gondoltuk, hogy a KRASG12V immunogén fragmentumának a tumorsejtek plazmamembránjához való rögzítése lehetővé teheti a CD4+ T-sejtek közvetlen antigénfelismerését. Azonban a KRASG12V-MITD konstrukciót expresszáló daganatsejtek, amint azt egy P2A-kapcsolt EGFP riporter expressziója bizonyítja, hasonlóan képtelenek voltak stimulálni a TCR-vel módosított CD{109}} T-sejteket (4. kiegészítő ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a szubcelluláris onkogén lokalizációja nem az egyedüli meghatározója az MHC-II tumorsejtek általi közvetlen bemutatásának. Ezen túlmenően ezek az eredmények arra utalnak, hogy az antigén túlzott expressziója nem elegendő az MHC-II megjelenésének elősegítéséhez. Eddigi eredményeink arra utalnak, hogy a tumorspecifikus CD{114}} T-sejtek nagyobb valószínűséggel ismerik fel az APC-k által prezentált antigéneket, mint maguk a tumorsejtek. Ezért felmértük a HLADRB5*01:{117}} DC-k azon képességét, hogy exogén fehérjékből származó antigéneket mutassanak be. Az in vitro előállított HLA-egyeztetett DC-k képesek voltak stimulálni a TCR-módosított CD{120}} T-sejteket, amelyek a KRASG12V-specifikus TCR-t expresszálják, amikor az éretlen DC-ket vagy a KRASG12V 20-mer peptiddel pulzálták, vagy KRASG12V teljes fehérjét tápláltak be, de nem KRAS WT fehérje (6E ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy bár a TCR nem ismeri fel a tumorsejtek által prezentált endogén antigéneket, képes felismerni a keresztezett exogén antigéneket a DC-k összefüggésében.

cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert

Vita

Ennek a vizsgálatnak a célja annak meghatározása volt, hogy a rákos betegekből származó, természetesen primer T-sejtekből izolált TCR-ek képesek-e felismerni az onkogéneket expresszáló daganatsejteket. Az I. osztályú (HLA-A*02:01) – korlátozott, HNSCC TIL-ekből nyert HPV-16 E629-38 TCR tekintetében, talán nem meglepő módon mindkét autológ tumorsejtvonal esetében megerősítették a felismerést. és egy jól jellemzett HLA-egyeztetett és E6-expresszáló daganatsejt, a CaSki (ami fontos, lásd a 2. ábrát). Ugyanezek a TIL-ek (1. ábra) jelentős számú IFN-termelő E6-specifikus CD4+ T-sejtet is tartalmaztak (3. ábra), amelyek ezzel ellentétben nem ismerték fel az E6- expresszáló tumorsejteket, még akkor is, ha IFN-kezeléssel vagy CIITA-transzdukcióval a megfelelő prezentációs allél (DQA1*01:02/DQB1*05:02) felszíni MHC II. osztályának bőséges expressziójára késztették őket (4. ábra). A CIITA expresszió nemcsak az MHC-II fehérjék felszíni expresszióját indukálja, hanem a HLA-DM és az invariáns láncmolekulákat is, amelyek szükségesek az antigén feldolgozásához és bemutatásához (28). Ezzel szemben a HLA-val egyező B-sejteket ez a TCR felismerte, amikor az antigént az MHC-II útvonalra irányították. Hasonló helyzet volt megfigyelhető a KRASG12V-specifikus, HLA-DRB5*01:01-restricted TCR esetében, amely képes volt felismerni a HLA-egyező B-sejteket, de nem tudta felismerni az MHC-II-t expresszáló tumorsejteket, amikor az antigént a MHC-II prezentációs útvonal. Mindkét TCR elegendő funkcionális aviditással rendelkezett ahhoz, hogy közvetítse az endogénen expresszált antigének felismerését a fent leírt körülmények között, és mindkettő közvetítheti a peptiddel töltött célsejtek citotoxicitását. Ez utóbbi megfigyelés tükrözi a citotoxikus CD4+ T-sejtekről szóló számos jelentésben bemutatott körülményt, bár adataink kiterjesztik ennek a megfigyelésnek a kontextusát azáltal, hogy kimutatják, hogy a forrásantigén endogén expressziója és az MHC-II indukálása IFN- által nem valószínű. fiziológiás célpont létrehozása az epiteliális eredetű tumorsejteken a TCR-ekhez a nukleáris vagy membránhoz kapcsolódó antigének ellen. A humán húgyhólyagrákról és melanomáról szóló legújabb tanulmányok a citotoxikus CD4+ T-sejteknek megfelelő genetikai jeleket azonosítottak a TIL-ek között (14, 15). Funkcionálisan ezek a citotoxikus CD4+ TIL-ek képesek közvetlen MHC-II-függő daganatfelismerésre, ami végső soron a granzimek célponti líziséhez vezet, hasonlóan CD8+ megfelelőikhez. Azonban ezen eredmények terápiás transzlációját korlátozhatja az a tény, hogy kevés szilárd tumor expresszál MHC-II-t. Valójában 2 független tanulmány eredményei azt sugallták, hogy a melanómás betegek csak körülbelül egyharmadában található MHC-II+ tumorsejt, és ezeknek a sejteknek a gyakorisága a daganaton belül gyakran kevesebb, mint 10% (15, 29). Ehelyett a tumor mikrokörnyezetében az MHC-II domináns sejtforrása a beszűrődő leukociták (26).

6. ábra. Az MHC-II+ KRASG12V+ tumorsejtek nem mutatnak be KRASG12V-eredetű epitópokat a CD4+ T-sejteknek. (A)

Bár egyes szilárd tumorsejtek konstitutív vagy indukálható MHC-II-t expresszálnak, eredményeink azt mutatják, hogy annak ellenére, hogy a TIL-ek és PBMC-k között vannak onkogén-specifikus CD4+ T-sejtek, ezek a sejtek nem képesek közvetlenül felismerni és lizálni az antigént expresszáló sejteket. MHC-II+ tumorsejtek, míg ugyanabból a fehérjéből származó epitópok hatékonyan prezentálhatók az MHC-I-en lévő CD8+ T-sejteknek (13). Ez arra utal, hogy egy célantigén egyszerű expresszálása nem biztos, hogy elegendő ahhoz, hogy a CD4+ T-sejtek felismerjék az MHC-II-t expresszáló daganatok alcsoportját. Ezenkívül ezek az eredmények konzisztensnek tűnnek több daganattípus esetében is, mivel a vizsgálatban lekérdezett sejtvonalak közé tartoznak a HNSCC-ből, a tüdő adenokarcinómából és a hasnyálmirigyrákból származó sejtvonalak. Az MHC-II-t természetesen vagy CIITA transzdukciót követően expresszáló melanoma sejtvonalak közvetlen CD4+ T-sejt-felismeréséről 2 tanulmány számolt be (30, 31). Azonban mindkét vizsgálatban a vizsgált TCR-ek jelentős része nem ismerte fel közvetlenül a tumorsejteket. Nem világos, hogy ezek a TCR-ek „bystander” klonotípusokat képviselnek-e, amelyek nem ismerik fel a tumorantigéneket, vagy olyan tumorspecifikus TCR-eket, amelyek nem képesek felismerni rokon antigénjüket az antigénprezentációs hiányosságok miatt, mint amilyeneket ebben a tanulmányban kiemeltünk. Oliveira et al. (31) kimutatták, hogy a CD4+ T-sejtek közvetlen felismerése két olyan melanomára korlátozódott, amelyek rendkívül nagy tumormutációs terhekkel rendelkeznek, ami arra utal, hogy ez a fenotípus további szükséges változásokat eredményezhet, amelyek lehetővé teszik a tumorantigének MHC-II bemutatását. Noha egy MITD-nek a KRASG12V immunogén fragmenséhez való kapcsolódása nem eredményezte a tumorsejtek közvetlen felismerését a CD4+ T-sejtek által, a vizsgálatok feltehetően az MHC-II-ből eluált membránhoz kötött fehérjékből származó endogén peptidek torzítását írták le. membrán-újrahasznosítás miatt (26, 32). A Trp1 melanoma antigén a plazmamembránban található, ami elősegítheti a B16 tumorsejtek CD4+ T-sejteknek való közvetlen megjelenését (33). Egy másik melanómához kapcsolódó antigént, a gp100-at a tumorsejtek prezentálják a CD4+ T-sejteknek a gp100 transzmembrán doménjétől függő módon (34). A közelmúltban a neoantigén-specifikus CD4+ T-sejtek szerepét vizsgáló egér szarkóma modellben a mutált integrin alegységből származó epitópokat, amely szintén membránhoz kötött fehérje, eluálták az MHC-II-ből CIITA-transzdukált tumoron. cellák (35). Eredményeink arra utalnak, hogy bár a membránhoz kötött fehérjék előnyösen az endoszómákba kerülhetnek MHC-II-n való közvetlen prezentáció céljából, egy immunogén membránfehérje jelenléte önmagában nem elegendő ennek a prezentációnak a elősegítéséhez. Más, nem klasszikus prezentációs utakat is leírtak, amelyek lehetővé tehetik a citoszolikus vagy nukleáris fehérjék számára az MHC-II-hez való hozzáférést, beleértve az intracelluláris fehérjék és transzporterek autofágiával összefüggő prezentációját, amely az antigénfeldolgozástól függő prezentációhoz kapcsolódik a CD4+ T-sejteknek, ezáltal antigén hatású. A peptidek feltehetően az MHC-I-ből az MHC-II-be kerülnek át a membrán-újrahasznosítás során (36, 37). Beszámoltak az autológ tumorsejtek közvetlen MHC-II-függő felismeréséről az E7 epitópokra specifikus CD{54}} T-sejtek által (38, 39); mindazonáltal ezek a vizsgálatok a méhnyakráksejtek által HLA-DR molekulákon bemutatott, kevésbé elterjedt onkogén HPV altípusok (nevezetesen a HPV-33 és a HPV-59) által expresszált E7 fehérjékre vonatkoztak. Ezért lehetséges, hogy a HPV altípusa, a tumor szövettana és a korlátozó HLA allélok szintén releváns tényezők lehetnek a nukleáris HPV antigének MHC-II+ tumorsejteken történő eltérő bemutatásában. Bár adataink arra utalnak, hogy a közvetlen tumor citotoxicitás nem valószínű mechanizmusa az E6- és KRASG12V-specifikus CD4+ T-sejteknek, a CD4+ T-sejtek más daganatellenes mechanizmusait is leírták, és daganatspecifikus CD4+ T-sejtek adoptív átvitele rákos betegekben daganatellenes aktivitást mutatott (7, 40, 41). Ezért az MHC-II-korlátozott TCR-ek, mint amilyeneket ebben a tanulmányban azonosítottak, hasznosak lehetnek az ACT esetében humán betegeknél, mivel az ilyen TCR-ek a HLA haplotípusokra korlátozódó vezető onkoproteinekből származó epitópokat célozzák meg, amelyek becslések szerint az amerikai fehér 1,27%-a és 16,10%-a. populáció a HLADQA1*01:02/DQB1*05:02 és a HLA-DRB5*01:01 esetében (42). Nevezetesen, a CD4+ T-sejtek elősegítik a tumorspecifikus CD8+ T-sejtek beindítását azáltal, hogy CD40L-függő módon engedélyezik az antigént hordozó DC-ket (43–45). Kimutattuk, hogy az ebben a tanulmányban azonosított KRASG12V-specifikus TCR felismeri a keresztezett antigéneket a DC-k összefüggésében, ami arra utal, hogy ezek a sejtek ezen a funkción keresztül hozzájárulhatnak a daganatellenes immunitáshoz. A CD4+ T-sejtek helyi segítséget is nyújthatnak a daganatokban lévő CD8+ T-sejtek számára azáltal, hogy citokineket, például IL{102}} és IFN-t választanak ki, támogatva a CD8+ T-sejtek túlélését és a daganathoz való toborzás (46). Ezenkívül a CD{106}} TIL-ek antigéneket ismerhetnek fel a tumor mikrokörnyezetében a mieloid sejteken, például a makrofágokon. Valójában a preklinikai vizsgálatok kimutatták, hogy MHC-II hiányában a tumorsejteken az örökbefogadóan átvitt Trp1 CD4+ T-sejtek továbbra is képesek az IFN-től függő daganatellenes immunitást kifejteni, és korrelálni a makrofágok fokozott citotoxikus aktivitásával (47). Úgy tűnik azonban, hogy ez a jelenség a tumor antigén szekréciójától függ, amelyről azt is feltételezzük, hogy a legtöbb onkogén esetében minimális. Összességében tanulmányunk kiemeli az endogén antigének MHC-II+ tumorsejtek általi közvetlen bemutatásának szelektivitását, és azt bizonyítja, hogy sem a CIITA expressziója, sem a membránhoz kötött antigén jelenléte önmagában nem elegendő a tumorsejtek CD általi közvetlen felismeréséhez{115} } T-sejtek. További vizsgálatokra van szükség annak jellemzésére, hogy az MHC-II+ tumorsejtek mely antigéneket, milyen körülmények között prezentálhatják közvetlenül, hogy teljes mértékben megértsük a CD4+ T-sejtek kontextusfüggő szerepét a rákban.

cistanche növény-növelő immunrendszer

Mód

Sejttenyésztés. A TIL-eket a korábban leírtak szerint gyűjtöttük be és tenyésztettük (48). Röviden, az elsődleges daganatszövetet 2-3 mm-es fragmentumokra bontottuk, amelyeket egy 24-lyuklemezre helyeztünk, és RPMI-ben-1640 tenyésztettük, kiegészítve 1{{102}}%-kal. humán AB szérum, penicillin-sztreptomicin, HEPES, gentamicin és 6,000 NE/mL IL-2. Az extravazált TIL-eket 2-3 naponta féltápközeg-cserével tenyésztettük. A perifériás vérből származó elsődleges humán T-sejteket 50:50 arányú tápközegben tenyésztettük, amely 50% AIM V-t és 50% RPMI-t{17}} tartalmazott, kiegészítve 10% humán AB szérummal, penicillin-sztreptomicinnel (100 U/). egyenként ml; Gibco, Thermo Fisher Scientific), 300 NE/mL IL-2, 5 ng/ml IL-7 és 5 ng/ml IL-15. A betegektől származó tumorsejtvonalakat állítottuk elő és tenyésztettük a korábban leírtak szerint (17). Röviden, a primer tumorszövetet 2 mm-nél kisebb fragmensekre vágtuk, és GentleMACS Octo Disssociator (Miltenyi Biotec) segítségével disszociáltuk. A daganatsejteket 5 μM Rho kináz inhibitort tartalmazó F-Media-ban újraszuszpendáltuk, és besugárzott 3T3 fibroblasztok (30 Gy) ágyára szélesztettük. A kezdeti tenyésztés után a tumorsejteket besugárzott 3T3-kondicionált tápközeg és 5 µM Rho kináz inhibitort tartalmazó F-Media 3:1 arányú keverékében szaporítottuk. A CaSki (ATCC), NCI-H2444 (ATCC), DAN-G (ATCC), J76 Jurkat (ATCC), 3T3-CD40L és B-LCL-eket l-glutaminnal és HEPES-sel kiegészített RPMI tápközegben tartottuk. 10 mM, Gibco, Thermo Fisher Scientific, 10% FBS, 1 mM nátrium-piruvát (Gibco, Thermo Fisher Scientific), 1× MEM nem esszenciális aminosavak (Gibco, Thermo Fisher Scientific) és penicillin-sztreptomicin (100 U/ egyenként ml; Gibco). A 293GP-t (ATCC) DMEM tápközeg-kiegészítőben tartottuk fenn 10% FBS-sel és penicillin-sztreptomicinnel (egyenként 100 U/ml; Gibco, Thermo Fisher Scientific). Az IHW03304, GM3107, KAS011, D8 és D66 sejteket Alessandro Sette (La Jolla Immunológiai Intézet) ajándékozta. ELISPOT vizsgálatok. TIL-eket vagy PBMC-ket 100,000 sejt/lyuk arányban szélesztettünk antiIFN–Ab-kkel (1-D1K, Mabtech) bevont ELISPOT lemezekre. A sejteket újrastimuláltuk HPV-16 E6 és E7 PepMix (JPT) peptidkészletekkel, kiválasztott onkogén mutációkat képviselő peptidkészletekkel, vagy egyedi peptidekkel 5 ug/ml koncentrációban poolok esetén vagy 10 ug/ml koncentrációban peptidek esetében 22 órán keresztül, mielőtt kifejlődött. ELISPOT lemezek a gyártó utasításai szerint (Mabtech). Pozitív kontrollként 5 ug/ml fitohemagglutinin-L-t használtunk. Ex vivo expanziós kultúra. A PBMC-ket kiválasztott onkogén mutációkat képviselő peptidkészlettel szélesztettük 5 ug/ml koncentrációban. A 4., 7. és 10. napon 10 NE/ml IL{80}}-t tartalmazó friss tápközeget adtunk hozzá. A 14. napon a PBMC-ket újrastimuláltuk az ELISPOT vagy citokin szekréciós vizsgálatokhoz való felhasználáshoz. TCR szekvenálás. A TIL-eket vagy PBMC-ket 5 ug/ml HPV-16 E6 PepMix (JPT) vagy KRASG12V peptiddel újrastimuláltuk, és az IFN-szekréciós sejteket fluoreszcensen jelöltük a Human IFN-Secretion Assay kit segítségével a gyártó utasításai szerint (Miltenyi Biotec). . Az egyes IFN- + sejteket FACSAria (BD Biosciences) segítségével egy 96-lyuk lemezre válogattuk, és az RNA-Seq-et Illumina Miseq segítségével végeztük el a páros TCR és láncok azonosítására. Az E6-specifikus CD4+ TCR klón azonosításához az IFN-szekretáló sejteket a fentiek szerint válogattuk, és a TCR és TCR szekvenciákat egymásba ágyazott, multiplex PCR-rel amplifikáltuk, a korábban leírtak szerint (49). A PCR termékeket Sanger szekvenálásra (ETON Biosciences) nyújtottuk be. A TCR gyakoriság elemzéséhez a PBMC-ket 14-napos ex vivo expanzió előtt és után a jelzett peptidekkel elküldtük az Adaptive Biotechnologies-nek. HPV expressziós elemzés. Az RNS-t Hu-56 primer tumorsejtekből és tumorsejtvonalból izoláltuk, és bulk RNS-Seq-nek vetették alá. A páros végű szekvenálási leolvasásokat BWA (v0.7.12) (50) segítségével leképeztük a teljes HPV genomra (GenBank letéti szám: NC_001526.2) és a megfelelő transzkriptomára. Az eredményül kapott szekvencia-illesztési térképfájlt rendezett bináris igazítási térképpé konvertáltuk, és indexeltük, majd a leképezett leolvasásokat megszámoltuk a SAMtools (v1.2) segítségével (50). Teljes exome szekvenálás. A teljes exóm szekvenálást és az RNA-Seq-et a La Jolla Institute for Immunology Sequence Core-ban végezték el, Agilent teljes exóma rögzítő és Illumina készletekkel. Az FFPE biomintákat a Moores Cancer Center kiosztotta a Tempusnak a következő generációs szekvenálás céljából, a megfelelő referencia-DNS-sel együtt perifériás vérminták felhasználásával. A tumor exome szekvenálásából leolvasott szekvenciákat és a normál mintákat SpeedSeq Align (v0.1.0) segítségével igazítottuk a GRCh38 referenciagenomhoz (51). Az exome variánsokat a SpeedSeq Somatic segítségével azonosítottuk, a változatokat pedig az SNPeff (v4.3i) segítségével annotáltuk (52). Ennek a kéziratnak az RNA-Seq és a teljes exome szekvenálási adatait feltöltötték az NCBI BioProjectbe, regisztrációs szám: PRJNA924789. T-sejt retrovírus transzdukció. A TCR nukleotid szekvenciákat BioXP 3200 (Codex) segítségével szintetizáltuk és klónoztuk az MSGV1 retrovírus gerincébe. A szekvencia humán sejtekben történő expresszióra optimalizált kodon volt. A humán TCR konstans régiókat egér TCR konstans régiókra cseréltük, szubsztitúciókkal a felszíni expresszió fokozása és a preferenciális párosítás elősegítése érdekében (53, 54). A humán PBMC-ket buffy coat-ból izoláltuk. A CD4+ vagy CD8+ T-sejteket mágneses szelekcióval eltávolítottuk, és az összes megmaradt limfocitát tartalmazó negatív frakciót 50 ng/ml anti-CD3 Ab-t (OKT3) tartalmazó T-sejt táptalajban tenyésztettük 2 percig. napok.

A cistanche tubulosa-Antitumor előnyei

A TCR retrovírus felülúszókat 293GP sejtek kotranszfektálásával állítottuk elő a megfelelő TCR szekvenciát és RD113 plazmidot tartalmazó MSGV1 vektorral. Két nappal a transzfekció után a retrovírus felülúszót összegyűjtöttük, és frissen vagy –8{71}} fokon lefagyasztottuk. A transzdukciókat RetroNectin-bevonatú lemezeken (Takara) végeztük, a korábban leírtak szerint (5). Az egér TCR konstans régió expresszióját áramlási citometriával értékeltük a transzdukció hatékonyságának meghatározására. A TCR-módosított T-sejteket legkorábban a kezdeti stimulációt követő 7. napon alkalmaztuk. T-sejt funkcionális vizsgálatok. 5 × 104 TIL-t, transzdukált T-sejteket vagy J76 Jurkat sejteket tenyésztettünk együtt 1 × 105 B-LCL-lel, egy éjszakán át pulzálva a megadott koncentrációjú peptidet, vagy 5 × 103 tumorsejtet oltottunk be előző nap {{16} }kút U-fenekű vagy lapos fenekű lemezek, ill. Ahol jeleztük, anti-CD28 agonistát (CD28.2 klón, BioLegend) vagy anti-PD-L1 blokkoló (29E.2A3 klón, BioLegend) Abs-t adtunk a T-sejt- és tumorsejt-kokultúrákhoz 5, illetve 10 ug/ml mennyiségben. A citokin és aktivációs marker vizsgálatokhoz PMA-t és ionomicint tartalmazó 1× Cell Activation Cocktail-t (BioLegend) használtunk pozitív kontrollként. A HLA-blokkoló vizsgálatokhoz 20 ug/ml mennyiségben a következő Abs-t adták a peptiddel pulzált B-LCL-ekhez legalább 2 órával a T-sejtek hozzáadása előtt: anti-HLA-DQ (Tü169, BioLegend), anti-HLA-DR (L243, BioLegend), vagy egér IgG2a izotípus kontroll (MOPC-173, BioLegend). Ahol jeleztük, a tumorsejteket 72 órán keresztül tenyésztettük 10 ng/ml rekombináns IFN-vel a T-sejtek hozzáadása előtt. A felülúszókat 18-24 óra múlva gyűjtöttük össze, az IFN-t ELISA-val (Thermo Fisher Scientific) mértük, és a sejtpelleteket áramlási citometriához festettük. A citotoxicitási vizsgálatokat T-sejtek és tumorsejtek együttes tenyésztésével végeztük, a jelzett effektor-cél arány mellett. Röviden, 5 × 103 tumorsejtet oltottunk be és tenyésztettünk egy éjszakán át, mielőtt T-sejteket adtunk a jelzett arányokban. A célsejtek lízisét az xCELLigence Real-Time Cell Analyzer (ACEA Biosciences) segítségével határoztuk meg, amely a kísérlet végéig 30 percenként értékelte a sejtek adherenciája miatti elektromos impedanciát. Az adatokat az xCELLigence RTCA szoftvercsomag segítségével elemeztük, és az eredményeket a T-sejtek hozzáadásakor 1-re normalizált sejtindexként jelentették. MHC-II prezentációs vizsgálat. A következőket kódoló szintetikus DNS-konstrukciókat állítottuk elő és klónoztuk MSGV1-be BioXP 3200 (Codex) segítségével: a humán HLA-B gén N-terminális 25 aminosavát, majd a HPV-16 E6 első 50 aminosavát. vagy a KRASG12V 25 aminosava fuzionált a humán HLA-B C-terminális 55 aminosavával, egy T2A önhasító elemmel és az EGFP kódoló szekvenciájával. A vírus felülúszóit a fent leírtak szerint állítottuk elő, és az autológ B-LCL-eket RetroNectinnel bevont lemezeken transzdukáltuk, miután egy éjszakán át stimuláltuk humán CD40L-t (3T3-CD40L) expresszáló besugárzott (0,5 Gy) 3T3 sejteket. A transzdukció hatékonyságát az EGFP expresszió áramlási citometriás mennyiségi meghatározásával értékeltük. A transzdukált B-LCL-eket 3T3-CD40L-lel stimuláltuk 200 NE/ml rekombináns humán IL-4 (PeproTech) jelenlétében 2 egymást követő, 2-3 napos körben az autológ TIL-ekkel történő együtttenyésztés előtt. DC-k előállítása antigénprezentációs vizsgálatokhoz. A DC-ket műanyag tapadásos módszerrel állítottuk elő. A fagyasztott PBMC-ket felengedtük, és DC táptalajba (RPMI{88}} kiegészítve l-glutaminnal, 5% hővel inaktivált humán AB szérummal és 100 U/ml penicillin-sztreptomicinnel) szélesztettük 2 órán át 37 fokon. A nem tapadó sejteket meleg PBS-sel történő mosással távolítottuk el, és a megtapadt sejteket 800 U/ml GM-CSF-fel (Tonbo, Cytek Biosciences) és 500 U/ml IL-4 (PeproTech) kiegészített DC tápközegben tenyésztettük 6 napig. . 1 ug/ml KRASG12V peptidet vagy 20 ug/ml KRASG12V vagy WT KRAS fehérjét (Abcam) adtunk közvetlenül az éretlen DC-khez egy éjszakán át. A következő napon a DC-ket összegyűjtöttük, és TCR-vel módosított T-sejtekkel együtt tenyésztettük 1:1 arányban egy éjszakán át, mielőtt áramlási citometriával értékeltük a CD137 felszabályozását. A tumorsejtek retrovírus transzdukciója. A humán CIITA kódoló szekvenciáját a Gibson Assembly szintetizálta (Integrated DNA Technologies) és klónozta MSGV1-be. A HLADRB5*01:01 kódoló szekvenciákat és a P2A szekvenciával elválasztott láncokat szintetizáltuk (Integrated DNA Technologies), és egy módosított pHAGE lentivírus vektorba klónoztuk a T2A szekvenciától 5'-irányban, majd egy csonkolt CD34 riporterszekvenciát a Gibson Assembly. A retrovírus felülúszókat MSGV1-gyel hoztuk létre a fent leírtak szerint. A lentivirális felülúszókat 293T-sejtek pHAGE, tat, rev, gag/pol és vsv-g plazmidokkal történő kotranszfektálásával hoztuk létre. A vírus felülúszóit 24 órával később összegyűjtöttük, és centrifugálással betöményítettük Amicon Ultra 5 csövekben (MilliporeSigma). A tumorsejteket szélesztettük, és 1 nappal később a tápközeget 10 ug/ml polibrénnel kiegészített retrovirális vagy lentivírus felülúszóra cseréltük. Négy órával később a vírust tartalmazó felülúszót leszívtuk, és tápközeggel helyettesítettük. Az MHC-II+ és a CD{126}} tumorsejteket FACS Fusion sejtválogató (BD Biosciences) segítségével válogattuk szét. Áramlási citometria. A sejteket fluorokrómmal konjugált monoklonális Abs-okkal jelöltük a következő antigénekre: anti-humán CD3–PE (OKT3, Tonbo, Cytek Biosciences), CD4–PE–Cyanine7 (SK3, Tonbo, Cytek Biosciences), CD8–APC (Hit8a, Tonbo). , Cytek Biosciences), CD34–Alexa Fluor 647 (581, BioLegend), CD69–PerCP– Cyanine5.5 (FN50, BioLegend), CD137–PE (4B4-1, Miltenyi Biotec), PD-1 –BV650 (EH12.2H7, BioLegend), HLA-II–APC (Tü39, BioLegend) és egér elleni TCR -APC (H57-597, Tonbo, Cytek Biosciences). Az elhalt sejteket DAPI-val vagy LIVE/DEAD Fixable Aqua-val (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) festettük. E629-38– A HLA-A*02:01–PE tetramert a NIH Tetramer Core Facility állította össze és címkézte fel. A sejteket 1 ug/ml tetramerrel festettük 1 órán át jégen. A felületi antigénekre vonatkozó Ab-festést 15 percig jégen végeztük. Az intracelluláris citokinfestéshez (ICS) a T-sejteket peptiddel pulzált APC-kkel együtt tenyésztettük 4-6 órán keresztül Brefeldin A jelenlétében. A sejteket permeabilizáltuk és intracelluláris citokinekre festettük a Cytofix/Cytoperm Kit-tel (BD Biosciences) felületfestés után. , a gyártó utasításai szerint. A következő fluorokróm-konjugált Abs-okat használtuk a citokinfestéshez: IFN- –APC (4S.B3, BioLegend), IL-2-FITC (MQ1- 17H12, BioLegend), TNF- –BV785 (Mab11) , BioLegend) és Granzyme B–PE (QA16A02, BioLegend). Az adatokat FACSCelesta áramlási citométerrel (BD Biosciences) gyűjtöttük, és FlowJo v10.7 szoftverrel elemeztük. Statisztika. A statisztikai elemzéseket Prism 8-cal (GraphPad Software) végeztük. Az ICS-összehasonlításokhoz egy páratlan 2-farok t-tesztet használtunk. A HLA-blokkoló Ab–Ab által közvetített T-sejtjel-szuppresszió összehasonlítására egy 2-ANOVA-módszert használtak. P < 0,05 statisztikailag szignifikánsnak tekinthető. Tanulmányi jóváhagyás. Az ebben a vizsgálatban felhasznált, azonosítatlan emberi mintákat az UCSD 101391CX IRB-protokoll ("Tumor Environment Phenotyping and Cell Isolation") alapján tájékozott beleegyezéssel szereztük be. A vizsgálatban részt vevő személyek írásos beleegyezését adták.

Hivatkozások

1. Hanahan D, Weinberg RA. A rák jellemzői: a következő generáció. Sejt. 2011;144(5):646–674.

2. Shamseddine AA, et al. Tumorimmunitás és immunterápia HPV-vel kapcsolatos rákos megbetegedések esetén. Cancer Discov. 2021;11(8):1896–1912.

3. Simanshu DK, et al. Élvonalbeli áttekintés a RAS fehérjékről és szabályozóikról az emberi betegségekben. Sejt. 2017;170(1):17–33. 4. De Vos Van Steenwijk PJ, et al. A HPV-specifikus T-sejtek váratlanul nagy poliklonális repertoárja készen áll a méhnyakrákos betegek kezelésére. Cancer Res. 2010;70(7):2707–2717.

5. Stevanović S, et al. Az immunogén tumorantigének tájképe a vírus által kiváltott epiteliális rák sikeres immunterápiájában. Tudomány. 2017;356(6334):200–205.

6. Bhatt KH, et al. A HPV-16-specifikus T-sejtes válaszok profilozása széles körű antigénreaktivitást tár fel oropharyngealis rákos betegeknél. J Exp Med. 2020;217(10):e20200389.

7. Veatch JR, et al. A daganatba beszűrődő BRAF V600E-specifikus CD4 + T-sejtek korrelációt mutattak a melanoma teljes klinikai válaszával. J Clin Invest. 2018;128(4):1563–1568.

8. Veatch JR, et al. Az endogén CD4+ T-sejtek felismerik a neoantigéneket tüdőrákos betegekben, beleértve a visszatérő onkogén KRAS és ERBB2 (Her2) meghajtó mutációkat. Cancer Immunol Res. 2019;2(13):910–922.

9. Cafri G, et al. Hámrákos betegek perifériás vérében kimutatott onkogén mutációkat célzó memória T-sejtek. Nat Commun. 2019;10(1):449.

10. Tran E és mtsai. A mutáns KRAS-t célzó T-sejt transzfer terápia rákban. N Engl J Med. 2016;375(23):2255–2262.

11. Draper LM, et al. HPV-16+ hámráksejtek megcélzása TCR génmanipulált T-sejtekkel, amelyek E6 ellen irányulnak. Clin Cancer Res. 2015;21(19):4431–4439.

12. Jin BY, et al. Az E7-et megcélzó mérnöki T-sejtek a humán papillomavírus rákos megbetegedések regresszióját közvetítik egérmodellben. JCI Insight. 2018;3(8):e99488.

13. Bear AS, et al. A mutáns KRAS epitópok biokémiai és funkcionális jellemzése validálja ezt az onkoproteint az immunológiai célzáshoz. Nat Commun. 2021;12(1):4365.

14. Oh DY et al. Az intratumorális CD4+ T-sejtek daganatellenes citotoxicitást közvetítenek humán hólyagrákban. Sejt. 2020;181(7):1612–1625.

15. Cachot A, et al. A tumorspecifikus citolitikus CD4 T-sejtek védő immunitást közvetítenek az emberi rák ellen. Sci Adv. 2021;7(9):eabe3348.

16. Doran SL, et al. T-sejt-receptor génterápia humán papillomavírussal összefüggő hámrákok esetén: első emberben végzett, I/II fázisú vizsgálat. J Clin Oncol. 2019;37(30):2759–2768.

17. Liu X et al. Normális és daganatos sejtek feltételes újraprogramozása és hosszú távú expanziója emberi biopéldányokból. Nat Protoc. 2017;12(2):439–451.

18. Veatch JR, et al. A humán melanóma neoantigén-specifikus CD4+ T-sejtjei változatos differenciálódási állapotúak, és korrelálnak a CD8+ T-sejt-, makrofág- és B-sejtek funkciójával. Rákos sejt. 2022;40(4):393–409.

19. Lowery FJ et al. A metasztatikus emberi rákos megbetegedések daganatellenes neoantigén-reaktív T-sejtek molekuláris aláírásai. Tudomány. 2022;375(6583):877–884.

20. Kreiter S, et al. Megnövelt antigénprezentációs hatékonyság az antigéneknek az MHC I. osztályú forgalmi jelekhez való kapcsolásával. J Immunol. 2008;180(1):309–318.

21. Zaretsky JM, et al. A PD-1 blokáddal szembeni szerzett rezisztenciával kapcsolatos mutációk melanomában. N Engl J Med. 2016;375(9):819–829.

22. Gros A, et al. Humán gyomor-bélrendszeri rák neoantigének felismerése keringő PD-1+ limfociták által. J Clin Invest. 2019;129(11):4992–5004.

23. Scholtalbers J, et al. TCLP: egy online rákos sejtvonal katalógus, amely integrálja a HLA-típust, a megjósolt neoepitópokat, a vírust és a génexpressziót. Genome Med. 2015;7(1):118.

24. Juneja V, Choi J, feltalálók; BioNTech US Inc., engedményes. T-sejt-receptor konstrukciók és felhasználásaik. US202103040215A1 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom. 2021. november 4.

25. Sharpe AH, Pauken KE. A PD1 gátló útvonal változatos funkciói. Nat Rev Immunol. 2018;18(3):153–167.

26. Abelin JG, et al. A HLA-II ligandum feldolgozásának és kötési szabályainak tömegspektrometriával történő meghatározása javítja a rák epitóp előrejelzését. Immunitás. 2019;51(4):766–779.

27. Silvius JR, et al. A K-ras4B és a „második jeleket” nem tartalmazó prenilált fehérjék dinamikusan asszociálnak a sejtmembránokhoz. Mol Biol Cell. 2006;17(1):192–202.

28. Chang CH, Flavell RA. A II. osztályú transzaktivátor az antigénprezentációban részt vevő több gén expresszióját szabályozza. J Exp Med. 1995;181(2):765–767.

29. Rodig SJ és mtsai. Az MHC fehérjék eltérő érzékenységet biztosítanak a CTLA-4 és a PD-1 blokádra kezeletlen áttétes melanomában. Sci Transl Med. 2018;10(450):eaar3342.

30. Ahmadzadeh M, et al. A daganatba beszűrődő humán CD4+ szabályozó T-sejtek eltérő TCR-repertoárral rendelkeznek, és tumor- és neoantigénreaktivitást mutatnak. Sci Immunol. 2019;4(31):eaao4310.

31. Oliveira G, et al. A segítő és szabályozó tumorellenes CD4+ T-sejtek tájképe melanomában. Természet. 2022;605(7910):532–538.

32. Rock KL, et al. Mutasd be magad! MHC I. és MHC II. osztályú molekulák szerint. Trends Immunol. 2016;37(11):724–737.

33. Takechi Y és mtsai. A melanoszomális membránfehérje a melanomaterápia sejtfelszíni célpontja. Clin Cancer Res. 1996;2(11):1837–1842.

34. Lepage S, Lapointe R. A gp100-ból származó melanoszomális célzó szekvenciák nélkülözhetetlenek az MHC II. osztályú korlátozott endogén epitóp bemutatásához és az endoszomális kompartmentekbe történő mobilizációhoz. Cancer Res. 2006;66(4):2423–2432.

35. Alspach E, et al. Az MHC-II neoantigének alakítják a tumor immunitását és az immunterápiára adott választ. Természet. 2019;574(7780):696–701.

36. Dengjel J et al. Az autofágia elősegíti az intracelluláris forrásfehérjékből származó peptidek MHC II osztályú bemutatását. Proc Natl Acad Sci US A. 2005;102(22):7922–7927.

37. Matsuzaki J, et al. A NY-ESO-1- specifikus CD4+ T-sejtek MHC-II-korlátozott közvetlen daganatfelismeréséhez nem klasszikus antigén-feldolgozási útvonalak szükségesek. Cancer Immunol Res. 2009;2(4):341–350.

38. Höhn H, et al. A CD4+ tumorba infiltráló limfociták méhnyakrákban felismerik a humán papillomavírus-E7 által biztosított HLA-DR-korlátozott peptideket. J Immunol. 1999;163(10):5715–5722.

39. Höhn H, et al. A 33-as típusú humán papillomavírus E7 peptidek, amelyeket a HLA-DR*0402 prezentált méhnyakrákban daganatba infiltráló T-sejteknek. J Virol. 2000;74(14):6632–6636.

40. Lu YC et al. Áttétes rákban szenvedő betegek kezelése fő hisztokompatibilitási komplex, II. osztályú korlátozott T-sejt receptor alkalmazásával, amely a MAGE-A3 rákos csíravonal antigént célozza meg. J Clin Oncol. 2017;35(29):3322–3329.

41. Tran E és mtsai. Mutáció-specifikus CD4+ T-sejteken alapuló rák immunterápia epiteliális rákos betegeknél. Tudomány. 2014;344(6184):641–645.

42. Gonzalez-Galarza FF, et al. Allélfrekvenciás hálózati adatbázis (AFND) 2020-as frissítés: aranystandard adatosztályozás, nyílt hozzáférésű genotípus adatok és új lekérdező eszközök. Nucleic Acids Res. 2020; 48(d1): D783–D788.

43. Schoenberger SP, et al. A citotoxikus T-limfociták T-sejtjeit a CD40-CD40L kölcsönhatások közvetítik. Természet. 1998;393(6684):480–483.

44. Ahrends T, et al. A CD4+ T-sejtek segítik a citotoxikus T-sejt-effektor programot, beleértve a koinhibitor receptorok leszabályozását és a szöveti invazivitást. Immunitás. 2017;47(5):848–861.

45. Ferris ST et al. A cDC1 beindul, és a CD4+ T-sejtek engedélyezték, hogy daganatellenes immunitást váltsanak ki. Természet. 2020;584(7822):624–629.

46. ​​Bos R, Sherman LA. A CD4+ T-sejt-segítség a daganatos környezetben szükséges a CD8+ T-limfociták toborzásához és citolitikus működéséhez. Cancer Res. 2010;70(21):8368–8377.

47. Haabeth OAW et al. CD4+ T-sejt – az MHC II. osztályú pozitív tumorsejtek közvetített kilökődése az antigénszekréciótól és a gazda APC-ken való közvetett prezentációjától függ. Cancer Res. 2018;78(16):4573–4585.

48. Dudley ME, et al. Tumorba beszűrődő limfocita tenyészetek előállítása melanómás betegek adoptív transzferterápiájában történő felhasználásra. J Immunother. 2003;26(4):332–342.

49. Dash P, et al. A T-sejt receptor repertoár egysejtes elemzése. Módszerek Mol Biol. 2015;1343:181–197.

50. Li H, et al. A sorozat-igazítás/térképformátum és a SAM-eszközök. Bioinformatika. 2009;25(16):2078–2079.

51. Chiang C, et al. SpeedSeq: ultragyors személyes genom elemzés és értelmezés. Nat Methods. 2015;12(10):966–968.

52. Cingolani P, et al. Egyetlen nukleotid polimorfizmusok hatásainak annotálására és előrejelzésére szolgáló program, SnpEff: SNP-k a Drosophila melanogaster w1118 törzs genomjában; iso-2; iso-3. Repülj (Austin). 2012;6(2):80–92.

53. Haga-Friedman A, et al. A transzmembrán hidrofób mutációk beépülése a TCR-be fokozza annak felszíni expresszióját és a T-sejt funkcionális aviditását. J Immunol. 2012;188(11):5538–5546.

54. Cohen CJ és mtsai. A T-sejtek fokozott tumorellenes aktivitása, amely úgy lett kialakítva, hogy egy második diszulfidkötéssel expresszálja a T-sejt-receptorokat. Cancer Res. 2007;67(8):3898–3903.