UMOD-mutációk krónikus vesebetegségben Tajvanon

Absztrakt:UMODaz első azonosított és leggyakrabban mutált gén, amely autoszomális dominánst okoztubulointersticiális vesebetegség(ADTKD). A legújabb tanulmányok kimutatták, hogy az ADTKD-UMODviszonylag gyakori okakrónikus vesebetegség(CKD). Az ADTKD állapota azonbanUMODTajvanon továbbra is ismeretlen. Ebben a vizsgálatban három heterozigótát azonosítottunkUMODmissense variánsok, c.121T > C (p.Cys41Arg), c.179G >A (p.Gly60Asp) és c.817G >T (p.Val273Phe), összesen 221 kiválasztott CKD családban (1,36%). E missense variánsok közül kettőt, a p.Cys41Arg-t és a p.Gly60Asp-t korábban nem számoltak be. In vitro vizsgálatok kimutatták, hogy mindkét uromodulin variánsnak hiányosságai vannak a sejtmembrán forgalomban és a táptalajba való kiválasztódásban. A szerkezeti modell mindkét változatban megváltozott diszulfid kötés képződést jósolt, de csak a p.Gly60Asp okozta fehérje destabilizációját. Eredményeink kiterjesztik a mutációs spektrumot, és azt mutatják, hogy az ADTKD-UMODhozzájárult a CKD egy kicsi, de jelentős okához a tajvani lakosság körében.

Kulcsszavak: uromodulin;krónikus vesebetegség(CKD); autoszomális domináns tubulointersticiálisvesebetegség(ADTKD); veseelégtelenség (KF).

KATTINTSON IDE, HOGY VESEBETEGSÉGEKRE CISTANCHE GYÓGYNÖVÉNYKIEGÉSZÍTŐKET SZEREZZ

1. Bemutatkozás

Az ADTKD egy ritka domináns öröklődő betegség, amelyet az UMOD [1], MUC1 [2], HNF1B [3], REN [4] és SEC61A1 [5] heterozigóta mutációi okoznak. Az UMOD az ADTKD első azonosított és leggyakoribb oka, és kiterjedt vizsgálatnak vetették alá [1,6]. Bár ritka, az ADTKD a harmadik leggyakoribb monogénvesebetegségADPKD és IV típusú kollagén nephropathia után, de az ADTKD-UMOD prevalenciája továbbra sem tisztázott, és a legújabb tanulmányok azt mutatják, hogy a KF-ben szenvedő betegek 2%-át vagy a CKD-s betegek 0,3%-át teszi ki [7, 8]. Az UMOD az uromodulint kódolja, és az emberi vizeletben a legnagyobb mennyiségben előforduló fehérje [9]. Az uromodulin egy vesespecifikus fehérje, amelyet a Henle-hurok vastag felszálló végtagjának hámsejtjei és a disztális tekercses tubulus korai része termelnek [10], és zónáján keresztül nagy molekulatömegű polimerként képződik. pellucida domén [11]. Ezenkívül az uromodulin egy erősen glikozilált fehérje, hét N-glikozilációs hellyel, és a C-terminális végén a szerin proteáz hepszin hasítja, mielőtt kiválasztódik a tubuláris lumenbe [9,12,13]. Az uromodulin funkciói közé tartozik a kalcium-oxalát kristályosodás elleni védelem [14], az uropatogén baktériumok okozta húgyúti fertőzések elleni védelem [15–18], valamint a Ca2+-K+-ioncsatorna szabályozása [19]. Az UMOD-mutációk hatása a késleltetett érés, az endoplazmatikus retikulumban (ER) való retenció, a plazmamembránon való csökkent expresszió és a vizeletkiválasztás csökkenése, ami ER-stresszhez és kibontakozó fehérjeválaszhoz vezet [20–22].

Az ADTKD-UMOD klinikai fenotípusai nem specifikusak, és magukban foglalják a krónikus vesebetegséget, a köszvényt, a hyperurikémiát, a normálistól az enyhe proteinuriát, a családi anamnézis meglétét vagy hiányát, valamint a legtöbb érintett egyént, akik 30 és 50 éves kor között lépnek be KF-be [23]. A veseszövettan tubuláris tágulást vagy atrófiát, tubuláris bazális membrán kiürülését vagy megvastagodását, intersticiális fibrózist és mutált uromodulin felhalmozódását mutatja polimorf, strukturálatlan anyagként, amelyet PAS festés mutatott ki [24,25].

Az USRDS jelentés [26] nemzetközi összehasonlítása alapján Tajvanon a legmagasabb a krónikus vesebetegség és a szívelégtelenség előfordulása és prevalenciája. Azonban egyetlen tanulmány sem összpontosított az ADTKD-UMOD állapotára a tajvani CKD-populációban. Ebben a tanulmányban az ADTKD-UMOD mutációk prevalenciáját vizsgáltuk egy kiválasztott CKD kohorszban egyetlen tajvani tercier központban.

2. Anyagok és módszerek

2.1. CKD egyének és DNS-előkészítés

Ebben a tanulmányban 221 CKD családot (228 személyt) vettek fel a Kaohsiung Medical University Hospital CKD Care Programjából. A felvételi kritériumok közé tartozott a köszvényes epizódok vagy a hyperuricemia, ahol 90 ml/perc/1,73 m2-nél kisebb eGFR volt 40 éves kor előtt. Vérmintákat, törzskönyvi információkat és a laboratóriumi vizsgálatok eredményeihez való hozzáférést az egyénektől kapták, miután tájékoztatást adtak a hozzájárulásukról. A tanulmány a Helsinki Nyilatkozat alapján készült, és a KMUH Intézményi Felülvizsgáló Testülete (KMUHIRB-G(II)-20160024) ​​hagyta jóvá. A perifériás vérmintákból a DNS-t standard módszerrel extraháltuk.

2.2. Exome szekvenálás és bioinformatikai elemzés

A Nextera Flex for Enrichment and Exome panelt (CEX V2, Illumina, San Diego, CA, USA) használták az exome könyvtár létrehozásához. A méret kiválasztását, a szekvencia rögzítését, a dúsítást és az elúciót a gyártó utasításai szerint végeztük. A DNS-könyvtárak méretbeli eloszlását ezután TapeStation 4150 (Agilent, Santa Clara, CA, USA) segítségével mértük, majd Illumina NovaSeq 6000-en 150 bp páros végű leolvasással szekvenáltuk. A kapott fastq adatokat a referencia humán genom szekvenciához (GRCh37/hg19) igazítottuk, és a DRAGEN Bio-IT platform (Illumina) segítségével nukleotid variánshívást hajtottunk végre. A VCF-fájlt a CLC Genomics Workbenchben (Qiagen, Germantown, MD, USA) elemezték. Az azonosított variánsokat patogén/valószínű patogén, bizonytalan jelentőségű variánsként (VUS) vagy jóindulatúként jelöltük meg az American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) osztályozása szerint a VarSome szoftver segítségével, és összehasonlítottuk a ClinVarban létező változatokat. , HGMD és dbSNP adatbázisok. A kimutatott patogén, valószínű patogén és VUS variánsokat Sanger szekvenálás igazolta. A Sanger-szekvenáláshoz a PCR-termékeket garnélarák alkalikus foszfatáz/exonukleáz I-es (78390, USB Products, Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) kezeléssel tisztítottuk, majd a BigDye® terminátor 3.1 szekvenálást használó termociklusos szekvenálással mindkét végükről szekvenáltuk. kit (4337458, Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ABI 3730XL DNS Analyzer (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific) elemzését követően. Szegregációs analízist végeztünk, ha a családtagok DNS-e rendelkezésre állt. Az UMOD 2., 3., 4. és 5. exonjait Sanger szekvenálással szűrtük 221 CKD család próbájában, kivéve a DY5 családot, amely exome szekvenálást kapott. Az NM_003361.4 NCBI hivatkozási szekvencia az UMOD-hoz használatos. A nukleotidok számozására és a mutációk vagy változatok elnevezésére a Human Genome Variation Society által ajánlott standard nómenklatúrát (http//www.hgvs.org/; elérhető: 2022. július 18.) használták.

2.3. Sejtkultúra és tranziens transzfekció

A HEK293 sejteket (CRL-1573, ATCC, Manassas, VA, USA) a Ham-féle F-12 táptalaj Kaighn-módosításával (F-12K) (N3520, Merck/Millipore Sigma, Burlington) tenyésztettük. 10% hővel inaktivált magzati szarvasmarha szérummal (10437028, Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), 100 egység/ml penicillinnel, 100 µg/ml sztreptomicinnel (10378016, Thermo Fisher) kiegészítve ) és 10 egység/ml -interferon (IF002, Merck/Millipore Sigma). A sejteket 37 °C-on tartottuk párásított, 5% CO2 atmoszférában.

A HEK293 sejtek átmeneti transzfekcióját Lipofectamine 2000 (11668027, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) alkalmazásával végeztük. Röviden, 2,5 µl Lipofectamine 2000-t adtunk közvetlenül 100 µl Optimum táptalajhoz (31985062, Gibco, Thermo Fisher Scientific), és 5 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk. Összesen 1 µg DNS-t adtunk a Lipofectamine 2000–Optimum keverékhez, és további 20 percig inkubáltuk. A DNS-keveréket szérummentes tápközeggel sejttenyésztő lemezekre adtuk cseppenként az inkubáció végén. A sejtek tranziens transzfekció utáni egészségi állapotának meghatározásához a LUNA-II™ Automated Cell Counter (Aligned Genetics, Anyang-si, Gyeonggi-do, Korea) segítségével detektáltuk a tripánkékkel festő sejt életképességét egy másik időpontban, és a legtöbb A transzfektált sejtek életben maradtak különböző uromodulin-túlexpresszió hatására (az adatokat nem mutatjuk be).

2.4. Site-Directed Mutagenesis

A HA-jelölésű vad típusú uromodulin vektort Dr. Rampolditól szereztük be [27]. A p.Cys41Arg és p.Gly60Asp mutációs konstrukcióit a QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit (200523, Agilent) segítségével hoztuk létre a gyártó utasításai szerint. A mutációkat Sanger szekvenálás igazolta

2.5. ELISA és frakcionálás

Üres vektort, vad típusú uromodulint, p.Cys41Arg uromodulint és p.Gly60Asp uromodulin expressziós konstrukciókat átmenetileg transzfektáltunk HEK293 sejtekbe. Átmeneti transzfekció után a táptalajt 8, 24 és 32 órában összegyűjtöttük, majd mérés előtt -80 ◦C-on tároltuk. Az immunoblothoz a tápközeget Centri con (YM3, ikon, Merck/Millipore Sigma) segítségével SDS-PAGE elektroforézis előtt kondenzáltuk. ELISA-t használtunk az uromodulin mérésére a tápközegben a gyártó utasításai szerint (EHUMOD, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific). Röviden, a tenyésztőközeget és a standardokat a kitben lévő vizsgálati hígítóval hígítottuk, és két párhuzamosban adtuk a mérőhelyekhez. 2,5 órás szobahőmérsékleten végzett inkubálás után a lyukakat PBS-sel mostuk, és hozzáadtuk a biotinilált uromodulin antitestet. 1 órás szobahőmérsékleten végzett inkubálás után a lyukakat újra mostuk, és sztreptavidin-torma-peroxidáz másodlagos antitestet adtunk hozzá. 45 perces szobahőmérsékleten végzett inkubálás után a lyukakat újra mostuk, és a színt TMB szubsztrát oldat hozzáadásával és sötétben, szobahőmérsékleten 30 percig történő inkubálással alakítottuk ki. A reakciót a készletben lévő leállító oldat hozzáadásával állítottuk le, majd azonnal lemértük az OD450 és OD550 értékeket. A táptalaj uromodulin koncentrációját a standard görbe interpolációjával határoztuk meg.

A táptalaj összegyűjtése után a tenyészedényhez csatolt sejteket frakcionáltuk egy szubcelluláris fehérjefrakcionáló kit (78840, Thermo Fisher Scientific) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint. Röviden, egyenlő mennyiségben gyűjtöttünk össze három különböző típusú uromodulin sejtlizátumot, és eltávolítottuk az összes felülúszót, amíg a lehető legszáradtabb volt. A sejtpellethez jéghideg, proteáz inhibitorokat tartalmazó citoplazma extrakciós puffert adtunk, 4 ◦C-on 10 percig enyhe keverés mellett inkubáltuk, majd 500×g-vel 5 percig centrifugáltuk. Azonnal eltávolítottuk a felülúszót (citoplazmakivonatot) egy tiszta, előhűtött kémcsőbe, és jéghideg, proteázgátlókat tartalmazó membrán extrakciós puffert adtunk a pellethez. A membránrészt 5 másodpercig vortexeltük a legmagasabb fokozaton, majd 4 ◦C-on 10 percig enyhe keverés mellett inkubáltuk. A felülúszót (membránkivonat) tiszta, előhűtött csőbe vittük át jégen, miután 3000 × g-vel 5 percig centrifugáltuk. A szubcelluláris membránt és a citoplazmatikus fehérjét Western blottal elemeztük.

2.6. Immunblot elemzés

A fehérjemintákat RIPA pufferrel (R0278, Merck/Millipore Sigma) vagy frakcionálási lépéssel vettük a sejtekből. Ezt követően meghatároztuk a fehérjekoncentrációt egy fehérjevizsgálati festék (5000006, BIO-RAD, Hercules, CA, USA) és azonos mennyiségű fehérjéhez való hozzáférés segítségével, majd elektroforézissel SDS-PAGE-n választottuk el. Miután a fehérjéket polivinilidén-difluorid (PVDF) membránokra (1620177, BIO-RAD) vittük át, a PVDF membránt 5%-os sovány tejbe merítettük 1X TBST mellett, 1 órán át szobahőmérsékleten blokkoltuk, majd háromszor mostuk 1X TBST-vel. 5 perc. Ezt követően a PVDF membránt a primer antitesttel inkubáltuk 4 ◦ C-on egy éjszakán át, háromszor mostuk 1X TBST-vel 5 percig, majd inkubáltuk a másodlagos antitesttel 1 órán át szobahőmérsékleten. Háromszor mostuk 1X TBST-vel 5 percig a másodlagos antitest inkubáció után, majd hozzáadtuk az ECL-szubsztrát készletet (GERPN2134, Merck/Millipore Sigma), és röntgenprocesszor segítségével detektáltuk a fehérje jelet (MXP{{). 19}}, KODAK, Rochester, NY, USA) röntgenfilmen (Super RX, FUJIFILM, Minato-ku, TKY, JPN). Az elsődleges és másodlagos antitesteket 5%-os sovány tejjel hígítottuk 1X TBST-ben, és a részletes információ a következő: 1:2000 az uromodulin (sc-20631, Santa Cruz, Dallas, TX, USA) és 1:20 000 a nyúl esetében. HRP 2. antitest (GTX213110-01, GeneTex, Irvine, CA, USA).

2.7. A fehérjeszerkezet előrejelzése

A dinamitot a vad típusú és mutáns uromodulin (http://biosig.unimelb.edu.au/dynamut/; elérhető: 2022. június 15.) 3D szerkezetének előrejelzésére alkalmazták a natív humán uromodulin (Protein) teljes hosszúságú szerkezetének felhasználásával. Adatbank: 7PFP) [28]. A DiANNA-t használták a vad típusú és mutáns uromodulin diszulfidkötésének előrejelzésére (http://clavius.bc.edu/~clotelab/DiANNA/; hozzáférhető: 2022. június 16.) [29–31].

2.8. Statisztikai elemzés

Az ImageJ elemző szoftver elemezte és számszerűsítette a Western blot sávokat. A statisztikai elemzéseket és grafikonokat GraphPad Prism8 szoftverrel (GraphPad Software Incorporation, San Diego, CA, USA) végeztük és készítettük el, és bemutattuk az átlag ± SEM értéket. Páratlan t-próbát alkalmaztunk a kétcsoportos összehasonlításhoz. A statisztikai eredményeket a következőképpen jelöltük: * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001. Minden kísérletet legalább háromszor megismételtek.

Támogató szolgáltatás:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel.:+86 15292862950

Üzlet:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop