Az exogén Wnt1 megakadályozza az akut vesekárosodást és annak későbbi krónikus vesebetegséggé való továbbfejlődését

Kapcsolatfelvétel: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Xue Hong^1†, Yanni Zhou^2†, Dedong Wang^3†, Fuping Lyu⁴, Tianjun Guan³, Youhua Liu^1,5és Liangxiang Xiao^3*

¹State Key Laboratory of Organ Failure Research, National Clinical Research Center of Kidney Disease, Division of Nephrology, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou, China,²A Pekingi Kínai Orvostudományi Egyetemhez kapcsolódó Xiamen Hospital Nephrology Department, Xiamen, Kína,³Nefrológiai Osztály, Zhongshan Hospital, a Xiamen Egyetemhez kapcsolt, Xiamen, Kína,⁴Endokrinológiai és Diabetes Osztály, a Xiamen Egyetem első társult kórháza, Xiamen, Kína,⁵Patológiai osztály, Pittsburgh Egyetem Orvostudományi Kar, Pittsburgh, PA, Egyesült Államok

Tanulmányok arra utalnak, hogy a Wnt/-catenin agonisták jótékony hatásúak a betegségek kezelésébenakut vese sérülés(AKI); azonban továbbra is megfoghatatlan az AKI megelőzésében és a krónikus vesebetegséggé (CKD) való progressziójában betöltött szerepe. Ebben a vizsgálatban a vese Wnt/-catenin jelátvitelt vagy aktiválta az exogén Wnt1 túlzott expressziója, vagy gátolta az ICG-001, a -catenin jelátvitel kis molekulájú inhibitorának a beadása, mielőtt az egereket ischaemia/reperfúziós sérülésnek (IRI) tették volna ki, hogy kiváltsák. AKI és az azt követőCKD. Eredményeink azt mutatták, hogy az exogén Wnt1 in vivo expressziója az IR-védelem előtt védte az egereket az AKI-val szemben, és gátolta az AKI CKD-vé történő progresszióját egerekben, amit mind a vér biokémiai, mind a vese szövettani analízise igazolt. Ezzel szemben az ICG-001 IR előtti előkezelése nem volt hatással a vese Wnt/-catenin jelátvitelére vagy az AKI CKD-vé való progressziójára. Mechanikailag az exogén Wnt1 in vivo expressziója az IR előtt elnyomta a proapoptotikus fehérjék expresszióját AKI egerekben, és csökkentette a gyulladásos válaszokat mind az AKI, mind a CKD egerekben. Ezenkívül az exogén Wnt1 gátolta a tubuláris sejtek apoptózisát, amelyet a hipoxia-reoxigenációs (H/R) kezelés indukált in vitro. Összefoglalva, a jelen tanulmány bizonyítékot szolgáltat a Wnt/-catenin aktiválásának IR-vel összefüggő AKI-re gyakorolt ​​megelőző hatásának és a CKD-vé való későbbi progressziójának alátámasztására.

Kulcsszavak: akut vesekárosodás, krónikus vesebetegség, Wnt1, -catenin, ischaemia-reperfúziós sérülés

A kezelés aakut vese sérülés(AKI): cistanche

BEVEZETÉS

Akut vesekárosodás (AKI)olyan klinikai állapot, amely a vesefunkció gyors elvesztésének köszönhető különféle sérülések, például gyógyszerek, ischaemia, szepszis és toxinok miatt (Chawla és Kimmel, 2012; Scholz és mtsai, 2021). Az AKI magas morbiditási és halálozás, amely évente körülbelül 2 millió halálesetért felelős világszerte (Belayev és Palevsky, 2014). Az AKI különösen jól elismert független előrejelzője a krónikus vesebetegség (CKD) vagy a végstádiumú vesebetegség (ESRD) kialakulásának, amelyek hatalmas gazdasági terhet rónak az egészségügyi rendszerre (Leung et al., 2013; Belajev és Palevszkij, 2014; Kurzhagenet al., 2020). Sajnos nincsenek hatékony gyógyszerek az AKI megelőzésére és kezelésére.

A Wnt/-catenin jelátvitel alapvető szerepet játszik az inorganogenezisben, a szöveti homeosztázisban és különféle betegségek, köztük a vesebetegségek kialakulásában (Soni, 2021). - A katenin kettős szerepet tölt be, mivel strukturális fehérjeként és transzkripciós szabályozóként is szolgál (MacDonald et al., 2009). A membránhoz kötött -catenin az adherensjunction komplex része, és hozzájárul a sejt-sejt kölcsönhatáshoz, míg a citoszol -katenint a glikogénszintáz kináz -3 (GSK-3) foszforilezi, és az ubikvitinációt és a proteaszómális lebontást célozza. A -catenin ilyen degradációját azonban megmenthetik a Wnt ligandumok, a szekretált glikoproteinek családja, amelyek különböző biológiai aktivitásokkal rendelkeznek. A Wnt kötődése stabilizálja a -catenint, amely áthelyeződik a sejtmagba, és transzkripciós faktorként működik a génszabályozásban. Figyelemre méltó, hogy a Wnt/-catenin jelátvitel viszonylag csillapodik a nem sérült felnőtt vesékben, de akut és krónikus vesekárosodás során újra aktiválódik (Huffstater et al., 2020). A Wnt/-catenin aktiválása az AKI korai szakaszában csökkenti a vesekárosodást és elősegíti a gyógyulást veseműködésre, míg a tartós Wnt/-catenin aktiváció elősegítheti az AKI-ről a CKD-re való progressziót (Xiao et al., 2016; Huffstater és mtsai, 2020). Ezért a Wnt/-catenin jelátvitel kétélű fegyver a vesekárosodásban, és jobb megértést tesz szükségessé. Nevezetesen, továbbra is megfoghatatlan a Wnt/-cateninaktiváció szerepe az AKI és a későbbi AKI-CKD progresszió megelőzésében.

A vese ischaemia-reperfúziós sérülése (IRI) az AKI fő okának tekinthető. Ezért a renális IRI állatmodellt gyakran használják az AKI és az AKI-CKD progressziójának kutatására (Bonventre és Yang, 2011). Mind a farmakológiai, mind a genetikai megközelítést alkalmazták a Wnt/-catenin aktiváció szerepének tisztázására az AKI és a CKD IRI modelljében. A lítium- és GSK{4}}-gátlókat gyakran használják a Wnt/-cateninsignaling farmakológiai aktiválására preklinikai AKI-modellekben, de meg kell jegyezni a -katenin-független hatásukat (Bao et al., 2014). A GSK genetikai módosításai{{9 }} , -catenin vagy Wnt ligandumokat (Wnt1 és Wnt9a) használtak a Wnt/-catenin aktiváció AKI-ban és CKD-ben betöltött szerepének tisztázására (Bonventre és Yang, 2011; Bao és mtsai, 2014; Zhou et al., 2013, 2018; Liuet al., 2020). Mindazonáltal a Wnt/-cateninsignaling szerepével foglalkozó tanulmányok meglehetősen korlátozottak az AKI megelőzésében. Jelen tanulmány célja a Wnt/-catenin jelátvitel szerepének tisztázása volt az AKI megelőzésében és a későbbi CKD-vé való továbbfejlődésében.

1. ÁBRA|Az exogén Wnt1 in vivo expressziója az IR előtt megakadályozza az AKI-t és aktiválja a vese-katenint egerekben

(A)Egér kezelési csoportok. Az egereket pcDNA3 (IRI plusz pcDNA3) vagy PHA-Wnt1 (IRI plusz PHA-Wnt1) plazmiddal kezeltük hidrodinamikus farokvéna injekcióval a BIRI előtt 2 nappal. A szérum kreatinin szintje(B)és a vér karbamid-nitrogén (BUN) szintjét(C) megmérték. (D) A vese morfológiájának reprezentatív mikroképei a BIRI után 1 nappal. A vesemetszeteket Periodikus sav-Schiff festésnek vetettük alá. A dobozos területek megnagyobbodtak. A nyilak a vesetubulusokat jelzik. Skála, 200 µm.(E, F)Az aktív katenin Western blot elemzése egerek veséjében. *P < 0.05="" versus="" hamis="" vezérlők="" (n="5)." †p="">< 0,05,="" szemben="" a="" pcdna3="" plazmiddal="" injektált="" iri-vel="" (n="">

A Cistanche javítja a veseműködést

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Állattanulmány

Körülbelül 22–25 g tömegű hím C57BL/6 egereket a Vital River Laboratory Animal Technology-tól (Peking, Kína) vásároltunk, és állattartó létesítményben tartották őket (hőmérséklet: 22 ± 2 °C, páratartalom: 60 ± 5 százalék, 12 órás sötét/világos ciklus). ) a Déli Orvostudományi Egyetemen (Guangzhou, Kína) vízzel és élelmiszerrel ad libitum. Az állatkísérleteket a Southern Medical University állatetikai és jóléti bizottsága hagyta jóvá. Minden állatot a Laboratóriumi állatok gondozási és használati útmutatója szerint kezeltek.

Az AKI és a CKD egerekben történő indukcióját korábbi vizsgálatainkban írtuk le (Xiao és mtsai, 2016; Zhou és mtsai, 2018). A bilaterális vese ischaemia/reperfúziós károsodást (BIRI) széles körben alkalmazták AKI indukálására egerekben, míg ez növeli a mortalitást az AKI CKD-vé történő progressziója során. Ezért az egyoldalú vese ischaemia/reperfúziós sérülés (UIRI) módszert használják az AKI CKD-vé való progressziójának kutatására. Röviden összefoglalva, általános érzéstelenítés alatt középvonali hasi metszést végeztünk az egérben, és a kétoldali vagy bal vesepedikulákat mikroaneurizmabilincsekkel (cikkszám: 18051-35; Fine ScienceTools, Cambridge, Egyesült Királyság) 30 percig levágtuk. A műtét során a testhőmérsékletet körülbelül 37-38°C-on tartottuk hőmérséklet-szabályozott fűtési rendszerrel.

A Wnt/-catenin aktiváció AKI-ra gyakorolt ​​preventív hatásának értékelésére az egereket 1 mg/kg hemagglutinin(HA)-címkézett Wnt1 expressziós vektorral (PHA-Wnt1, UpstateBiotechnology) vagy üres vektorral (pcDNA3) injektáltuk 2 nappal a BIRI előtt a hidrodinamikus- alapú géntranszfer technika, amint arról korábban beszámoltak (Xiao et al., 2016). A vért és a veseszövetet 1 nappal a vese BIRI után vettük.

A korai Wnt/-catenin aktiválásnak az AKI CKD-vé való progressziójára gyakorolt ​​hatásának értékelésére az egereket vagy napi hidrodinamikus farokvéna injekciónak vetettük alá Wnt1 expressziós plazmidokkal 1 mg/kg dózisban, vagy napi intraperitoneális ICG injekciót-001({{4) }}, Chembest, Shanghai, Kína) 5 mg/kg 3 nappal az UIRI előtt. A vér- és veseszöveteket 11 nappal az UIRI után vettük. Előzetes vizsgálatunkban 2 napos Wnt1 injekció indukálhatja a Wnt1 expresszióját AKI egerekben (az adatok nem láthatók). Meg kell jegyezni, hogy 3 napos Wnt1 injekciót választottak a Wnt1 expressziójának biztosítására és meghosszabbítására az AKI CKD-vé való progressziója során.

Az akut vesekárosodás (AKI) a vesefunkció gyors elvesztése miatti klinikai állapot

Sejttenyésztés és kezelés

A humán proximális tubuláris epiteliális sejtvonalat (HKC-8) Dr. L. Racusen biztosította a Johns Hopkins Egyetemen (Baltimore, MD, Egyesült Államok). A sejttenyészeteket a korábban leírtak szerint végeztük (Zhou et al., 2013). A HKC-8 sejteket humán rekombináns Wnt1-gyel (SRP4754; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Egyesült Államok) kezeltük 100 ng/ml vagy ICG-001 koncentrációban (847591-62-2, Chembest, Shanghai). , Kína) 10 µM-on 4 órán át. A sejteket ezután hipoxiás munkaállomáson (X3-CK, Biospherix) 1 százalékos pO2-on 48 órán át inkubáltuk. Ezután a sejteket 2 órával az összegyűjtés előtt újraoxigenizáltuk különböző elemzésekhez.

2. ÁBRA|Az exogén Wnt1 in vivo expressziója IR előtt csökkenti a tubuláris sejt apoptózist és az NF-κB aktivációt AKI egerekben

(A) A reprezentatív mikrográfok a TUNEL-pozitív sejteket mutatják különböző csoportokban, a jelzett módon. A nyilak pozitív festést jeleznek. Skála, 100 µm.(B)A grafikus bemutató a TUNEL-pozitív cellákat nagy teljesítményű mezőben (HPF) mutatja különböző csoportokban, a jelzett módon.(C–F)Reprezentatív Western blot analízisek a FasL, p53 és Bax vese expresszióját mutatják a jelzett különböző csoportokban. *P < 0.05="" versus="" hamis="" vezérlők;="" †p="">< 0,05="" a="" pcdns-plazmidokkal="" injektált="" iri-vel="" szemben="" (n="">(G) Reprezentatív Western blot p65 és p-p65 fehérjék különböző csoportjaiban, ahogy jeleztük.

Apoptózis vizsgálat

A sejteket tripszinnel kezeltük, összegyűjtöttük és PBS-sel mostuk. Az Annexin V festést a gyártó protokollja szerint végeztük. A citometriás elemzést áramlási citométerrel (BD FACSCanto II, San Jose, CA, Egyesült Államok) végeztük az apoptózis sebességének mérésére a PE Annexin V pozitív és 7-AAD negatív sejtek relatív mennyiségének kimutatásával. Mindegyik vizsgálatot három párhuzamosban végeztük el.

Kreatinin és vér karbamid-nitrogénvizsgálat

A kreatininszintet a szérumban és a vizeletben, valamint a vér ureanitrogén (BUN) szintjét automatikus biokémiai analizátorral (AU480, Beckman-Coulter Inc., Brea, CA, Egyesült Államok) mértük.

Szövettan és immunhisztokémiai festés

A vesemetszeteket és az immunhisztokémiai festést a korábban leírtak szerint végeztük (Liu et al., 2020). Az elsődleges antitestek közé tartozott a nyúl poliklonális anti-Wnt1 (ab15251; Abcam, Inc.), nyúl poliklonális anti- -katenin (ab15180; Abcam, Inc.). .) és nyúl poliklonális anti-fibronektin (F3648; Sigma-Aldrich).

Western Blot analízis

A Western blot analízist a korábban leírtak szerint végeztük (Zhou et al., 2019). Az elsődleges antitestek közé tartozott a nyúl poliklonális anti-fibronektin (F3648; Sigma-Aldrich), egérmonoklonális anti- -katenin antitest (610154; BD TransductionLaboratories), egér monoklonális anti- -SMA antitest (A2547; Sigma-Aldrich) poliklonális anti-Wnt1 (ab15251; Abcam), egér anti- -tubulin (T9026; Sigma-Aldrich), egér anti-PAI-1 antitest (AF3828;R&D Systems), antiaktív -catenin (#05) –665; EMD Millipore), anti-Fas ligand (FasL) (SC -6237; Santa Cruz, CA, Egyesült Államok), p53 (#2524S; CST), Bax (SC 20067; Santa Cruz), p65 ( #8242S; CST), p-p65 (#3033S; CST), PCNA (#2586S; CST).

RNS-kivonás és qPCR-elemzés

A teljes RNS izolálást és a qPCR-t a korábban leírtak szerint végeztük. A különböző gének mRNS szintjét -aktinnal normalizáltuk. A gének primer szekvenciáit az 1. kiegészítő táblázat tartalmazza.

3. ÁBRA|Az exogén Wnt1 in vivo expressziója az IR előtt megakadályozza az AKI CKD-vé történő progresszióját egerekben

(A)Egér kezelési csoportok. Az egereket 1 mg/kg pcDNA3 (IRI plusz pcDNA3) vagy PHA-Wnt1 (IRI plusz PHA-Wnt1) plazmid hidrodinamikus farokvéna injekciója, vagy 5 mg/kg ICG-001 intraperitoneális injekciója adtuk be 3 nappal az UIRI előtt. . A vért és a szöveteket 11 nappal az UIRI után vettük. A szérum kreatinin szintje(B) és a vér karbamid-nitrogén (BUN) szintje(C) megmérték.(D) A vese morfológiájának reprezentatív mikroképei az UIRI után 11 nappal. A vesemetszeteket Periodic sav-Schiff festésnek vetettük alá. A dobozos területek megnagyobbodtak. A nyilak a vesetubulusokat jelzik. Skálasáv, 100 µm. *P < 0,05;="" **p="">< 0,01.="" n="">

Statisztikai analízis

Minden adatot átlag ± SEM-ben fejeztünk ki. Az adatokat statisztikailag elemeztük a Sigma Stat szoftverrel (Jandel ScientificSoftware, San Rafael, CA, Egyesült Államok). A csoportok közötti összehasonlítást egyutas ANOVA-val végeztük, amelyet a Student–Newman–Keuls teszt követett. P < 0,05="" szignifikánsnak="">

CISTANCHE GYÓGYNÖVÉNY HASZNÁLAT VESE

EREDMÉNYEK

Az exogén Wnt1 in vivo expressziója az IR előtt megakadályozza az akut vesekárosodást, és aktiválja a vese-katenint egerekben

A Wnt/-catenin aktiváció AKI-prevencióban betöltött szerepének meghatározására az egereket HA-címkézett Wnt1 expressziós vektorral (PHA-Wnt1) vagy üres vektorral (pcDNA3) adtuk be hidrodinamikus farokvéna injekcióval 2 nappal a BIRI előtt.(1A. ábra). A vesekárosodás két biomarkere, a kreatinin és a BUN szérumszintje szignifikánsan megemelkedett egerekben 1 nappal a BIRI után, ami az AKI létezésére utal (1B. és C. ábra). Következetesen a prominens vesemorfológiai léziók, például a corticedullaris junctióban tapasztalt lépes sérülések előfordultak. AKI egerekben figyelték meg(1D. ábra). Nevezetesen, hogy az AKI egerek szérumvese sérülésének biomarkereiben és morfológiai elváltozásaiban bekövetkezett változásokat az exogén Wnt1 jelentősen gyengítette. Western blotanalysisek kimutatták, hogy az exogén Wnt1 elősegítette a renális katenin expresszióját AKI egerekben(1E, F ábra). Összességében ezek az eredmények arra utalnak, hogy az exogén Wnt1 előkezelése aktiválja a renális katenint, és megakadályozza az AKI-t egerekben.

Az exogén Wnt1 in vivo expressziója az IR előtt csökkenti a tubuláris sejtapoptózist és gátolja a Nuclear Factor-Kappa B aktiválódását

Annak felderítésére, hogy az apoptózis szabályozása az exogén Wnt1 AKI-ra gyakorolt ​​védő hatásának hátterében álló mechanizmus, TUNEL festést végeztünk az AKI egerek veseszövetében az apoptózis azonosítására. A Sham egerekkel összehasonlítva az IRI jelentősen megnövelte az apoptózis arányát, valamint az apoptózissal kapcsolatos fehérjék, például a FasL, p53 és Bax, az egerek tintaveséinek szintjét.(2A–F. ábra). Az AKI egerek veséjében az ilyen változásokat jelentősen csökkentette az exogén Wnt1 in vivo expressziója IR előtt. A nukleáris faktor-kappa B (NF κB), különösen annak heterodimer formája, a p65/p50, kritikus szerepet játszik az AKI egerek veséjében a gyulladásos válasz szabályozásában. A Western blot analízis azt mutatta, hogy mind a p65, mind a foszforilált formája (p-p65) jelentősen megnövelte az egerek veséjét IRI után, míg az ilyen változásokat az exogén Wnt1 megakadályozta.(2G. ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az exogén Wnt1 in vivo expressziója az IR előtt megakadályozza az apoptózist és gátolja az AKI egerek NF-κB aktiváló veséjét.

4. ÁBRA|Az exogén Wnt1 in vivo expressziója az IR előtt leszabályozza az endogén Wnt1 és -catenint egér veséjében az AKI-CKD progresszióját követően

(A)A reprezentatív mikrográfok a Wnt és -catenin fehérje expresszióját mutatják különböző csoportokban, ahogy jeleztük. Skála, 50 µm.(B–E)A Wnt1, a -catenin és az aktív -catenin fehérje szintjének reprezentatív Western blotanalízise különböző csoportokban, a jelzett módon.(F) A TGF- mRNS expressziója különböző csoportokban, ahogy jeleztük.*P < 0.05;="" **p="">< 0,01.="" n="">

Az exogén Wnt1 in vivo expressziója az IR előtt megakadályozza az akut vesekárosodás krónikus vesebetegséggé történő továbbfejlődését

Ezt követően megvizsgáltuk, hogy a Wnt/-catenin aktiválása az IR előtt megakadályozhatja-e az AKI CKD-vé való progresszióját. Ahogy látható3A. ábra, az egerek Wnt1 expressziós plazmid (PHA-Wnt1) hidrodinamikus farokvéna injekciója, vagy ICG-001 intraperitoneális injekciója esett át 3 nappal az UIRI előtt. Mind a szérum kreatinin, mind a BUN szint megemelkedett egerekben az UIRI után 11 nappal(3B., C. ábra). Ezenkívül a Masson trikróm festés kiemelkedő kollagénlerakódást és fibrotikus elváltozásokat tárt fel egerekben 11 nappal az UIRI után(3D. ábra). Ezek a megfigyelések az AKI CKD-vé való progresszióját jelzik egerekben az UIRI után. Nevezetesen, a szérum vesekárosodás biomarkereinek és a vesefibrózisnak megfigyelt változásait CKD egerekben szinte teljesen kivédték az exogén Wnt1 előkezelése, de nem az ICG-001. Ezért az exogén Wnt1 in vivo expressziója az IR előtt megakadályozza az AKI CKD-vé történő progresszióját egerekben.

Az exogén Wnt1 in vivo expressziója az IR előtt - leszabályozza az endogén Wnt1 és -catenint a vesékben

Tovább vizsgáltuk az exogén Wnt1 onendogén Wnt/-catenin jelátvitel hatását CKD egerek veséjében. A 4A. ábrán látható módon az immunhisztokémiai festés kimutatta, hogy mind az endogén Wnt1, mind a -catenin jelentősen felszabályozott egerek veséjében az IRI után 11 nappal. Fehérjeszintjüket nagymértékben csökkentette az exogén Wnt1 előkezelése, de nem az ICG-001. A Western blot elemzések megerősítették az exogén Wnt1 gátló hatását, de nem az ICG-001, a Wnt1, a -catenin és az aktív -cateninin veséjének gátló hatását (4B–E. ábra). A Wnt/-catenin és a TGF- jelátviteli útvonalak áthalnak vesefibrózisban. A TGF- mRNS expressziója CKD egerek veséjében indukálódott, és ezt az indukciót az exogén Wnt1 csökkentette, de az ICG-001 nem (4F. ábra). Ezért az exogén Wnt1 előkezelése gátolja az endogén renális Wnt/ -cateninsignalingot CKD egerekben.

5. ÁBRA|Az exogén Wnt1 in vivo expressziója az IR előtt leszabályozza a vese Wnt/-catenin célgénjeit egerekben az AKI-CKD progresszióját követően

(A, B) A PAI-1 és MMP-7 mRNS-expressziója különböző csoportokban, a jelzett módon.(C–E)Reprezentatív Western blot analízis a PAI{0}} és a Klotho fehérje szintjéről.(F)Klotho mRNS-expressziója. *P < {{0}}.05;="" **p="">< 0,01.="" n="">

Az exogén Wnt1 in vivo expressziója, mielőtt az IR leszabályozza a vese-Wnt/-catenin célgéneket egerekben

A Sham egerekkel összehasonlítva a Wnt/-cateninsignaling két közvetlen downstream célpontja, a PAI-1és MMP-7 mRNS expressziója szignifikánsan felszabályozott egerek veséjében 11 nappal az UIRI után.(5A., B. ábra). Az exogén Wnt1 előkezelése, de az ICG-001 nem, gátolta a PAI-1 és MMP-7 mRNS expresszióját CKD egerekben. A Western blot analízis kimutatta, hogy a PAI{5}} fehérjeszint emelkedett CKD egerek veséjében, ahol az exogén Wnt1 előkezelése megszüntette, de az ICG-001 nem.(5C., D. ábra). A Klotho anendogén Wnt antagonista a Wnt ligandumok megkötése és elkülönítése révén. A Sham egerekkel összehasonlítva a Klotho mRNS és fehérje szintje egyaránt csökkent az egerek veséjében az UIR után 11 nappal(5E, F ábra). Az exogén Wnt1 előkezelése, de az ICG-001 nem, szinte teljesen helyreállította a Klotho mRNS és fehérje expresszióját CKD egerek veséjében. Ezek az eredmények továbbá arra utalnak, hogy az exogén Wnt1 gátló hatást gyakorol a CKD egerek endogén Wnt/-catenin jeladó veséire.

Az exogén Wnt1 in vivo expressziója az IR előtt csökkenti a vesefibrózist egerekben akut vesekárosodás - krónikus vesebetegség progressziója után

Ezt követően megvizsgáltuk a Wnt/-catenin aktiválásának IR előtti hatását a vese mátrix génjére és a fibrotikus elváltozásokra CKD egerekben. A Sham egerekkel összehasonlítva a fibronektin (FN), kollagén I, kollagén III és -SMA mRNS expressziója jelentősen indukálódott a az egerek veséjében az UIR után 11 nappal(6A–D. ábra).Az ilyen változásokat az exogenousWnt1 előkezelése csökkentette, de az ICG-001 nem. A Western blot analízis kimutatta, hogy az FN és -SMA fehérjeszintje jelentősen megemelkedett a CKD egerek veséjében, és ezeket a változásokat az exogén Wnt1 előkezelése megszüntette, de az ICG nem{6}}(6E–G. ábra). Az exogén Wnt1 és ICG-001 hatását az FNprotein expressziójára CKD egerekben FN antitesttel végzett veseimmunfestéssel validáltuk.(6H. ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az exogén Wnt1 előkezelése megakadályozza a renalfibrogenezist az IR-indukált CKD egerekben.

6. ÁBRA|Az exogén Wnt1 in vivo expressziója az IR előtt csökkenti a vesefibrózist egerekben az AKI-CKD progressziója után

(A–D)A fibronektin, kollagén I, kollagén III és -SMA mRNS expressziója.(E–G)Reprezentatív Western blot analízis a fibronektin és az -SMA-SMA fehérje szintjéről.(H)A fibronektin vese szakaszok immunfestése. *P < {{0}}.05;="" **p="">< 0,01;="" †p="">< 0,05.="" n="5." skála,="" 50="">

Az exogén Wnt1 in vivo expressziója, mielőtt az IR csillapítja a vesegyulladást akut vesekárosodás-krónikus vesebetegség progressziója után

A Sham egerekkel összehasonlítva a gyulladásos gének, például az IL-1, IL-6 és a TNF- mRNS expressziója szignifikánsan megnövekedett az egerek veséjében az UIR után 11 nappal.(7A–C. ábra). Az ilyen változásokat az exogén Wnt1 előkezelése szinte teljesen megszüntette, de az ICG-001 nem. A Western blot analízis azt mutatta, hogy mind a P65, mind a foszforilált formája (p-p65) fehérjeszintje jelentősen megemelkedett az egerek veséjében 11 nap után. UIRI után, ami az NF-κB jelátvitel aktiválását jelzi CKD egerekben(7D–F. ábra). Az exogén Wnt1 előkezelése, de az ICG-001 nem, jelentősen csökkentette a p65 és p-p65 fehérjeszinteket CKD egerek veséjében. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az exogén Wnt1 előkezelése megakadályozza a vesegyulladásos válaszokat CKD egerekben.

7. ÁBRA|Az exogén Wnt1 in vivo expressziója az IR előtt gyengíti a vesegyulladást egerekben az AKI-CKD progressziója után

(A–C) IL-1, IL-6 és TNF- mRNS expressziója egerek veséjében. (D–F)A p65 és p-p65 fehérjeszintek reprezentatív Western blot analízise. *P < 0.05;="" **p="">< 0,01.="" n="">

Az exogén Wnt1 in vitro megvédi a tubuláris sejteket a hipoxia-reoxigenációs sérülés által kiváltott apoptózissal szemben

A Wnt1 AKI-ban betöltött szerepének további pontosítása érdekében hipoxia-reoxigenációs (H/R) kezelést alkalmazva létrehoztuk az AKI HKC-8 tubuláris sejtmodelljét. Áramlási citometriát alkalmaztak az apoptózis kimutatására, és kimutatták az apoptózis arányának emelkedését HCK 8 sejtekben H/R kezelés után.(8A, B ábra). Az exogén Wnt1 jelentősen csökkentette az apoptózist a HCK-8 sejtekben a H/R kezelés után. A Western blot elemzések kimutatták, hogy a H/R kezelés jelentősen megnövelte az apoptózissal kapcsolatos fehérjék, például a FasL, p54, Bax és Parp{{4} szintjét. } a HCK-8 cellában(8C–G. ábra). Az ilyen elváltozásokat az exogén Wnt1 csökkentette. Ezek az adatok azt sugallják, hogy az exogén Wnt1 védelmet nyújt a H / R által kiváltott apoptózis ellen a tubuláris sejtekben.

8. ÁBRA|Az exogén Wnt1 megvédi a tubuláris sejteket az in vitro hipoxia-reoxigenációs (H/R) sérülés által kiváltott apoptózistól

(A)A FACS reprezentatív elemzései azt mutatják, hogy a Wnt1 gátolta a hipoxia/reoxigenáció (H/R) által kiváltott sejtapoptózist. A HKC-8 sejteket exogén Wnt1-gyel előzetesen expresszáltuk, majd 48 órán át inhipoxiás körülmények között inkubáltuk, majd 2 órán keresztül újraoxigenizáltuk.(B) A grafikaA bemutatás az apoptotikus sejtek százalékos arányát mutatja a különböző csoportokban, ahogy jeleztük. A PE-vel jelölt Annexin V-pozitív sejteket áramlási citometriával megszámoltuk. *P < 0.05="" versus="" vezérlők;="" †p="">< 0,05="" versus="" h/r="" (n="">(C) Reprezentatív Western blotanalysis a FasL, p53, Bax és Parp-1 fehérje expresszióját mutatja HKC-8 sejtekben.(D–G)A grafikus bemutatók a FasL, p53, Bax és Parp-1 relatív mennyiségét mutatják be a HKC-8 sejtekben. *P < 0.05="" versus="" vezérlők;="" †p="">< 0,05="" versus="" h/r="" (n="">

VITA

Noha az AKI előfordulási gyakorisága növekszik, és ez a CKD-vé való progresszió fő kockázati tényezője, nincsenek hatékony terápiák az AKI megelőzésére és kezelésére. Számos helyzet, például szívműtét, intratubuláris lerakódások és nefrotoxikus gyógyszerek alkalmazása vezethet az AKI kialakulásához (Mas-Font et al., 2017). Ez rávilágít az AKI megelőző intézkedéseinek szükségességére.

Bár számos tanulmány alátámasztja a Wnt/-catenin aktiváció jótékony hatását az AKI patogenezisében, továbbra is bizonytalan a Wnt/-catenin agonista AKI megelőző hatása. A jelen tanulmány egyik újszerű megállapítása, hogy az exogén Wnt1 in vivo expressziója az IR előtt megvédheti az egereket az AKI ellen, és megakadályozhatja az AKI CKD-vé történő progresszióját. Az exogén Wnt1 in vivo expressziója 2 nappal a vese kétoldali IR előtt képes volt aktiválni a vese-katenint, ami csökkent vese apoptózishoz és gyulladáshoz vezetett AKI egerekben (1 nappal az IR után). Ezenkívül az exogén Wnt1 in vivo expressziója 3 nappal a vese egyoldali IR előtt gátolt endogén Wnt/ -cateninsignaling, és megakadályozta a vesefibrózis kialakulását CKD egerekben (11 nappal az IR után). Ezzel szemben az exogén Wnt1 in vivo expressziója 5 nappal a vese IR után kimutatták, hogy -catenin aktivációt indukál, és felgyorsítja az AKI-t a CKD progressziójáig (Xiao et al., 2016). Ezek a tanulmányok arra utalnak, hogy a Wnt/-catenin agonisták időzítése fontos tényező az AKI megelőzésében és kezelésében.

A vizsgálatok azt sugallják, hogy a Wnt/-cateninsignaling tartós aktiválása elősegítheti az AKI CKD-vé való progresszióját. Az ICG 001 szelektíven gátolja a Wnt/-catenin/CREB-kötő fehérje (CBP) jelátvitelét, és jelenleg klinikai vizsgálat alatt áll különféle daganatos megbetegedések ellen. Korábban kimutattuk, hogy az ICG-0115 nappal az IR után történő beadása helyreállította a veseműködést, és gátolta az AKI CKD-vé való progresszióját, amit a csökkent vesefibrózis bizonyít (Xiao és mtsai, 2016). Ezen túlmenően, az egyoldali ureterelzáródás (UUO) után 3 nappal kezdődő ICG-001 beadása képes volt enyhíteni a vese fibrotikus elváltozásait a CKD egerek UUO modelljében (Hao et al., 2011). A jelen tanulmány azonban azt mutatta, hogy az ICG{10}} 3 nappal az IR előtti előkezelése nem volt hatással a vese Wnt/-catenin jelátvitelére vagy az AKI CKD-vé történő progressziójára. Ez nem meglepő, mert a Wnt/-catenin jelátvitel nagyon alacsony szinten expresszálódik a sértetlen felnőtt vesékben (Tanet al., 2014). Mindazonáltal eredményeink azt sugallják, hogy az ICG-001 beadásának időzítése és időtartama kritikus fontosságú a terápiás eredmény meghatározása szempontjából.

A Wnt/-catenin védőhatásának hátterében álló mechanizmusok magukban foglalhatják az apoptózis és a túlélési utak modulálását. A tubulus -catenin genetikai ablációja elősegíti a tubuláris apoptózist IRI vagy folsav kezelés után, míg a Wnt/ -catenin aktiválása elnyomja a pro-apoptotikus fehérjéket (Wang et al. ,2009; Zhou et al., 2012). Jelen tanulmányban az exogén Wnt1 jelentősen gátolta a tubuláris sejt apoptózist mind az AKI IRI-egér modelljében, mind az AKI H/R-indukált sejtmodelljében. Ez arra utal, hogy az apoptózis potenciális mechanizmus lehet az exogén Wnt1 AKI és AKI CKD progresszióra gyakorolt ​​megelőző hatásában. A jelen tanulmány azt is kimutatta, hogy az exogén Wnt1 gátló hatást gyakorol az NF-κB aktivációra mind az AKI-ban, mind a CKD-ben, ami a gyulladásos válasz elnyomását jelzi. Meg kell azonban jegyezni, hogy a csökkent gyulladás a védelem másodlagos hatása, vagy az exogén Wnt1 által közvetített védekezési mechanizmusok továbbra is meghatározandók. További vizsgálatokra van szükség az exogén Wnt{12}}közvetített AKI elleni védelem és az AKI CKD-vé történő progresszió megelőzésének pontos mechanizmusának tisztázásához.

Használjon Wnt/ -catenin modulátorokat az AKI és a CKD megelőzésére és kezelésére

KÖVETKEZTETÉS

Összefoglalva, a jelen tanulmány bizonyítékot szolgáltat a Wnt/-catenin aktiváció megelőző hatásának alátámasztására az IR-hez kapcsolódó AKI-ra és CKD-re, bár további munkára van szükség annak tisztázásához, hogy milyen pontos mechanizmusok révén véd az exogén Wnt1 az AKI és a CKD ellen. Tekintettel a Wnt/-catenin jelátvitel kettős szerepére az AKI-ban és a CKD-ben, a jelen tanulmány rávilágít az időzítés fontosságára, amikor Wnt/-catenin modulátorokat használnak az AKI megelőzésében és kezelésében. A jövőben több farmakológiai és genetikai megközelítést, valamint a kezelés optimális időzítését és időtartamát alkalmazó tanulmányok indokolttá teszik a Wnt/-kateninagonisták hatásának vizsgálatát az AKI megelőzésében és kezelésében.

FROM: Az exogén Wnt1 megakadályozza az akut vesekárosodást és annak későbbi előrehaladását krónikus vesebetegséggé, Xue Hong^1†, Yanni Zhou^2†, Dedong Wang^3†, Fuping Lyu⁴, Tianjun Guan³, Youhua Liu^1,5és Liangxiang Xiao^{3 *}

Elülső. Physiol., 2021. november 8.|https://doi.org/10.3389/fphys.2021.745816