A Zika-vírus nem strukturális fehérje 4B kölcsönhatásba lép a DHCR7-tel, hogy megkönnyítse a vírusfertőzést

ABSZTRAKT

A Zika vírus (ZIKV) nem strukturális fehérjéket fejleszt ki, hogy elkerülje az immunválaszt és biztosítsa a hatékony replikációt a gazdasejtekben. A koleszterin metabolikus enzim 7-dehidrokoleszterin-reduktáz (DHCR7) a közelmúltban arról számoltak be, hogy befolyásolja a veleszületett immunválaszokat a ZIKV fertőzésben. A létfontosságú, nem strukturális fehérje és a DHCR7- által közvetített víruselkerülésben szerepet játszó mechanizmusok azonban nem teljesen tisztázottak. Ebben a vizsgálatban kimutattuk, hogy a ZIKV fertőzés elősegítette a DHCR7 expresszióját. Nevezetesen, a felszabályozott DHCR7 elősegítette a ZIKV fertőzést, a DHCR7 blokkolása pedig elnyomta a ZIKV fertőzést. Mechanikusan a ZIKV nem strukturális fehérje 4B (NS4B) kölcsönhatásba lép a DHCR7-tel, hogy kiváltsa a DHCR7 expresszióját. Ezenkívül a DHCR7 gátolta a TANK-kötő kináz 1 (TBK1) és az interferon szabályozó faktor 3 (IRF3) foszforilációját, ami csökkentette a béta-interferon (IFN-) és az interferon-stimulált gének (ISG) termelődését. Ezért azt javasoljuk, hogy a ZIKV NS4B kötődjön a DHCR7-hez, hogy elnyomja a TBK1 és IRF3 aktivációt, ami viszont gátolja az IFN- és ISG-ket, ezáltal elősegítve a ZIKV elkerülését. Ez a tanulmány kibővíti azt a betekintést, hogy a vírusos nem strukturális fehérjék hogyan antagonizálják a veleszületett immunitást, hogy elősegítsék a vírusfertőzést a koleszterin metabolikus enzimeken és intermediereken keresztül.

cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert

1. Bemutatkozás

Mint szúnyogok által terjesztett flavivírus, a Zika vírust (ZIKV) eredetileg 1947-ben azonosították a rhesus makákókból Ugandában. Világszerte számos járványon ment keresztül, a ZIKV-járvány halmozott globális egészségügyi fenyegetéssé vált a szúnyogutakon keresztül történő robbanásszerű terjeszkedés és a világméretű utazás miatt. tünetmentes transzporterek és szexuális átvitel. A legtöbb ZIKV-fertőzés a korábbi járványok során tünetmentes vagy enyhe volt (Wang et al., 2016), azonban az elmúlt több járványban a ZIKV-fertőzés pusztító betegségekhez vezetett, beleértve a terhesség alatti neurológiai következményeket (mikrokefália és magzati pusztulás) és neurológiai rendellenességeket. (Guillain-Barre szindróma) felnőtteknél (Cao-Lormeau et al., 2016; Pierson és Diamond, 2020; Rasmussen és mtsai, 2016). A veleszületett immunrendszer a gazdaszervezet vírusfertőzés elleni védekezésének első és kritikus vonala. A ZIKV fertőzés után a vírus RNS-t az intracelluláris retinsavval indukálható gén I (RIG-I) ismerte fel (Chazal és mtsai, 2018; Hertzog és mtsai, 2018; Kato és mtsai, 2006), amely elindította a downstream veleszületett immunrendszert. válaszok, beleértve a TANK-kötő kináz 1 (TBK1) aktiválását, az interferon szabályozó faktor 3 (IRF3) foszforilációját, majd az I. típusú interferonok (IFN-I) termelődését (Fitzgerald et al., 2003; Grant és mtsai, 2016; Xia és mtsai, 2018) és több tucat interferon-stimulált gén (ISG) expressziója, amelyek különféle antivirális hatással rendelkeznek (Savidis és mtsai, 2016; Schneider és mtsai, 2014). A gazdaszervezet immunrendszere IFN-eket és ISG-ket termel a vírusfertőzés korlátozása érdekében, azonban maga a ZIKV számos menekülési mechanizmust fejlesztett ki, hogy biztosítsa a sikeres túlélést és replikációt a gazdasejtben, például specifikus nem strukturális (NS) fehérjéket kódol. A ZIKV genomiális RNS hét nem strukturális fehérjét termel, köztük az NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B és NS5 fehérjét (Berthoux, 2020). A ZIKV NS1 az USP8 deubiquitináz gazdaszervezetet toborozza a kaszpáz-1 stabilizálására, és gyengíti az I-es típusú IFN jelátvitelt a ZIKV-fertőzés javára (Zheng et al., 2018). Egy mutáns NS1-ről beszámoltak arról, hogy kötődik a TBK1-hez és csökkenti a TBK1 foszforilációját, ami csökkent IFN-termeléshez vezet (Xia és mtsai, 2018). A ZIKV NS3 kötődik és megköti a humán vázfehérjéket (14-3-3ε és 14-3-3η) (Riedl et al., 2019), míg az NS4A kölcsönhatásba lép a MAVS-szel, hogy gyengítse a RIG-I- és MDA-t{50} }közvetített veleszületett immunválaszok (Ma et al., 2018). Nevezetesen, a ZIKV NS5 megköti és lebontja a jelátalakítót és a 2. transzkripció aktivátorát (STAT2), hogy gyengítse az I. típusú IFN jelátvitelt (Grant és mtsai, 2016; Kumar et al., 2016). Ezenkívül az NS5-ről bebizonyosodott, hogy kölcsönhatásba lép a RIG-I-vel, és elnyomja a RIG-I K{59}}-hez kapcsolódó poliubiquitinációját, ezáltal elnyomja az IFN-termelést (Li et al., 2020). Ezenkívül a ZIKV NS2A, NS2B, NS4A és NS4B is kimutatták, hogy felülmúlja az IFN-termelést azáltal, hogy a RIG-I útvonal diszkrét elemeit célozza meg (Xia et al., 2018). Az emlőssejtekben történő hatékony replikáció elérése érdekében a ZIKV a gazdasejt lipid metabolikus komponenseire is támaszkodik, hogy egy burkot és teljes vírusrészecske-összeállítást hozzon létre (Chen és mtsai, 2020; Leier és mtsai, 2020). A koleszterin a sejtmembránok egyik lipid komponense, és számos biológiai funkcióban vesz részt (Ikonen, 2008). A sejtek koleszterin homeosztázisát szorosan modulálja a koleszterinszintézis, beleértve a lipoprotein részecskékből történő felszívódását és az extracelluláris akceptorokhoz való felszabadulást. Gyakorlatilag minden emlős sejt a koleszterin-anyagcserétől függ (Luo et al., 2020). A felhalmozódó bizonyítékok azt mutatják, hogy a koleszterin-anyagcsere részt vesz a vírusfertőzés elleni veleszületett immunválaszban (Blanc és mtsai, 2013; Petersen és mtsai, 2014; York és mtsai, 2015). Vírusfertőzés esetén a koleszterinszintézis jelentősen megváltozott, és az IFN-I és az ISG-k fokozott expressziója kísérte a makrofágokban (Li és mtsai, 2017; Liu és mtsai, 2008; York és mtsai, 2015). A koleszterin-metabolizmus kulcsfontosságú enzimjeként a koleszterin{81}}hidroxiláz (CH25H) a koleszterint 25-hidroxikoleszterinné (25HC) alakítja, amelyről úgy azonosították, mint a biológiai termék, amely hozzájárul a veleszületett immunválaszhoz a nagy többség ellen. vírusok, köztük a humán immunhiány vírus 1 (HIV-1), hólyagos szájgyulladás vírus (VSV), herpes simplex vírus 1 (HSV-1), Ebola vírus (EBOV), ZIKV, egér gamma herpesz vírus ( MHV68), Rift-völgyi láz vírus (RVFV) és orosz tavaszi-nyári agyvelőgyulladás vírus (RSSEV) (Blanc és mtsai, 2013; Li és mtsai, 2017; Liu et al., 2013). A jelenlegi tanulmányok korlátozottak annak vizsgálatára, hogy a koleszterin metabolikus termékek (pl. 25HC) hogyan befolyásolhatják a jelátvitelt és hogyan vehetnek részt a veleszületett immunitásban. A mai napig a koleszterin-bioszintézis előtti enzimek vagy intermedierek még mindig nem teljesen tisztázottak. A létfontosságú koleszterin metabolikus enzim, a 7-dehidrokoleszterin-reduktáz (DHCR7) eltörölheti a C (7–8) kettős kötést a szterolok B gyűrűjében, és katalizálhatja a koleszterint a 7-dehidrokoleszterinből ({{100} }DHC) (Luu et al., 2015). 7-A DHC a D-vitamin előfutára is, és a DHCR7 mutációk a magasabb D-vitaminhoz kapcsolódnak, ami arra utal, hogy a DHCR7 bonyolult biológiai hatásokat fejt ki a koleszterin és D-vitamin átalakulásában (Kuan et al., 2013; Prabhu et al. , 2016a). Egy jól bemutatott tanulmány kimutatta, hogy a DHCR7 csend aktiválhatja a PI3K-AKT3 útvonalat, ami az IRF3 Ser385 foszforilációjához vezet, és elősegíti az IFN-termelést, hogy gátolja a többszörös vírusfertőzést in vitro és in vivo (Xiao et al., 2020). A DHCR{116}}mediált koleszterin-metabolizmus megértése azonban a ZIKV NS-fehérje által közvetített immuncsalás során rosszul definiált. Itt megvilágítunk egy különálló mechanizmust, amelyet a ZIKV NS4B a DHCR7-re, a koleszterinszintézis kulcsfontosságú enzimére céloz, hogy gyengítse az IFN-I választ és megkönnyítse a ZIKV fertőzést. Azt találtuk, hogy a ZIKV fertőzés növelte a DHCR7 expresszióját. Érdekes módon a fokozott DHCR7 elősegíti a ZIKV fertőzést, míg a DHCR7 leütése vagy gátlókkal való megcélzása elnyomhatja a ZIKV fertőzést. Ezenkívül a ZIKV NS4B képes megkötni a DHCR7-et, és ezáltal indukálni a DHCR7 expresszióját, ami gátolta a TBK1 és IRF3 aktivációt, és csökkent IFN- és ISG termeléshez vezetett. Ezért azt javasoljuk, hogy a ZIKV NS4B kötődése a DHCR7-hez csökkentse az IRF3 aktiválását, ami viszont gátolja az IFN- és ISG-ket, hogy megkönnyítse a ZIKV-elkerülést. Ez a tanulmány új betekintést nyújt arra vonatkozóan, hogy a ZIKV nem strukturális fehérje hogyan szünteti meg a veleszületett immunitást, hogy elősegítse a vírusfertőzést a koleszterin metabolikus enzimekkel való kölcsönhatás révén.

cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert

Kattintson ide a Cistanche Enhance Immunity termékek megtekintéséhez

【Kérjen többet】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2. Anyagok és módszerek

2.1. Sejtvonalak

Az U251 sejteket a China Center for Type Culture Collection-től (CCTCC) (Wuhan, Kína) vásároltuk. A Cercopithecus aethiops vese (Vero) sejteket, a humán embrionális vese (HEK 293T) sejteket és a humán tüdő adenokarcinóma (A549) sejteket az American Tissue Culture Collection-től (ATCC) vásároltuk. A sejteket Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Gibco) táptalajban tartottuk, amelyet 10% magzati szarvasmarha szérummal (FBS) (Gibco), penicillinnel (100 U/ml) és sztreptomicin-szulfáttal (100 ug/ml) egészítettünk ki 37 °C-on és 5 °C-on. % CO2. Az Aedes albopictus (C6/36) sejteket 10% FBS-sel, penicillinnel (100 U/ml) és sztreptomicin-szulfáttal (100 ug/ml) kiegészített Minimum Essential Medium (MEM) tápközegben tenyésztettük 28 C-on 5% CO2 mellett.

2.2. ZIKV amplifikáció, titrálás és fertőzés

A z16006 ZIKV-izolátumot (GenBank hozzáférési szám, KU955589.1) C6/36 sejtekben tenyésztettük, és a ZIKV-t fagyasztó fiolákba osztották, és 80 C-on tároltuk. A ZIKV-titereket plakk vizsgálattal mértük. A sejteket ZIKV-vel fertőztük a jelzett fertőzési többszörösen (MOI) 2 órán át, majd foszfátpuffer sóoldattal (PBS) mostuk, majd tenyésztettük, begyűjtöttük és megvizsgáltuk.

2.3. Plazmidok és reagensek

A pcDNA3.1(þ)-3 expressziós plazmidot Flag segítségével klónoztuk az egyes ZIKV-gének a ZIKV cDNS megfelelő fragmenseiből. A pGEX6p-1-NS4B létrehozásához a ZIKV NS4B-t pGEX6p-1 vektorba szubklónoztuk ClonExpress II One Step Cloning Kit (Vazyme Biotech, Nanjing, Kína) segítségével. A pCAGGS-HA vektorba vagy pcDNA3.1 (þ)-3 Flag vektorba klónozott, humán DHCR7-et, RIG-I-et, TBK1-et és IRF3-at kódoló cDNS-eket standard molekuláris klónozási módszerrel állítottuk elő. A DHCR7 G410S missense mutációját helyspecifikus mutagenezis módszerrel állítottuk elő. A monoklonális nyúl anti-ZIKV borítékot (GTX133314) a GeneTex-től (Irvine, CA, USA) vásároltuk. Nyúl poliklonális anti-DHCR7 (A8049), nyúl monoklonális anti-ISG15 (A2416), nyúl monoklonális anti-TBK1 (A3458), nyúl monoklonális anti-P-TBK1 a Ser172-nél (AP1026), nyúl poliklonális anti-IRF3 (A1118), -nyúl IgG-t (ac005) és anti-egér IgG-t (ac011) az ABclonal Technology-tól (Wuhan, Kína) vásároltunk. Az antiegér FITC és az anti-nyúl Cy3 másodlagos antitesteket az Abbkine-tól (Wuhan, Kína) vásároltuk. A nyúl monoklonális anti-P-IRF3-at a Ser396-nál (29047S) és a nyúl monoklonális anti-ISG56-ot (14769S) a Cell Signaling Technology-tól (CST, Boston, MA, USA) vásároltuk. Az egér monoklonális anti-Flag (F3165), a nyúl monoklonális anti-HA (H6908) és az egér monoklonális anti-GAPDH (G9295) a Sigmától (St Louis, MO, USA) vásároltuk. Az egér monoklonális antiFlavivirus csoport antigén-antitestét (MAB10216) a Millipore-tól (Mass, USA) vásároltuk. A Lipofectamine 2000-et (11668-027) és a Trizolt (15596018) az Invitrogen Corporation-től (Carlsbad, CA, USA) vásároltuk. A Poly(I:C)-t az InvivoGen-től (San Diego, CA, USA) vásároltuk.

2.4. Plakk vizsgálat

A ZIKV-t tartalmazó felülúszót szérummentes DMEM-mel hígítottuk, és Vero sejteket fertőztünk egy 12-lyukú lemezen 2 órán át, majd kétszer 1 ml PBS-sel mostuk. A 2% FBS-t és 2% alacsony olvadáspontú agarózt tartalmazó DMEM-et jól összekevertük 1:1 térfogatarányban, és mindegyik lyukba 1 ml keveréket adtunk. A fertőzött sejteket 37 C-on tenyésztettük 5% CO2 mellett 5-7 napig. A sejteket 4%-os paraformaldehiddel fixáltuk 1 órán át, majd 30 percig 0,5%-os kristályibolyával festettük. A 12-lyuklemezt vízzel mostuk, és kiszámoltuk a plakkokat.

2.5. Lentivírus termelés és fertőzés

A humán DHCR7 shRNS-ek célszekvenciája a következő volt: sh-DHCR7-1: 50 -ATTGCCAGCACAGACGGATTT-30, sh-DHCR7-2: 50 -CGTGATTGACTTCTTCTGGAA{ {8}}. A negatív kontrollhoz kódolt shRNS-t hordozó pLKO.1 vektort (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) vagy a specifikus célszekvenciát HEK293T sejtekbe transzfektáltuk psPAX2-vel és pMD2.G-vel együtt Lipofectamine 2-vel{19} }00. A felülúszót tartalmazó vírusrészecskéket a transzfekció után 36 órával összegyűjtöttük, majd 210 g-vel 10 percig centrifugáltuk. A sejtmentes felülúszó fázist 0,45 μm-es szűrőn átszűrtük, hogy eltávolítsuk a sejttörmeléket. Az U251 sejteket lentivírus részecskékkel fertőztük meg 8 ug/ml polibrén jelenlétében. 48 órás tenyésztés után az U251 sejteket puromicinnel (2 ug/ml, Sigma) szelektáltuk. Az sh-DHCR7 leütési hatékonyságát RT-PCR és Western blot analízissel határoztuk meg.

cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert

2.6. Western blot

A sejteket proteáz inhibitorokkal és foszfatáz inhibitorokkal kiegészített RIPA pufferrel lizáltuk jégen 1 órán át, majd 4 C-on, 13, 000 g-vel centrifugáltuk 1{{10}} percig, hogy összegyűjtsük a sejtet. lizátum. A sejtlizátum fehérjekoncentrációját bicinkoninsav (BCA) fehérjevizsgálattal mértük. A fehérjét SDS-PAGE-val választottuk el, majd polivinil-difluorid (PVDF) membránra vittük át. A PVDF membránt TBST immunoblot blokkoló pufferrel (10 mmol/l Tris-HCl, pH 7,4, 0,15 mol/l NaCl és 0,05% Tween-20) blokkoltuk, amely 5% BSA-t tartalmazott 1 órán át. TBST-vel történő mosás után a membránt elsődleges antitestekkel és második antitestekkel inkubáltuk, majd ezt követően kemilumineszcens képalkotó rendszerrel (Bio-Rad) detektáltuk.

2.7. Teljes koleszterin vizsgálat

A sejtekben a teljes koleszterin mennyiségét az Applygen Technologies Inc. (Peking, Kína) Tissue összkoleszterin assay kit segítségével határoztuk meg. Az 5 mmol/l koleszterin standardot vízmentes etanollal sorozathígításnak vetettük alá a standard görbe megrajzolásához, és a celluláris összkoleszterin mennyiségét a standard görbék alapján számítottuk ki. A kísérletet a gyártó által megadott eljárás szerint végeztük.

2.8. Ko-immunprecipitációs vizsgálatok

A HEK293T sejteket a jelzett plazmidokkal transzfektáltuk. A sejteket összegyűjtöttük és proteáz inhibitorokkal kiegészített RIPA lízispufferrel lizáltuk. 18, 000 g-vel, 15 percig 4 C-on végzett centrifugálás után a sejtlizátumokat összegyűjtöttük, és Flag-Trap ProteinG Sepharose-val (GE Healthcare, Milwaukee, WI, USA) 4 órán át 4 C-on immunprecipitáltuk. A kötött fehérjék 2 ul töltőpufferrel eluáltuk, és immunblottal analizáltuk.

2.9. Valós idejű PCR

A teljes RNS-t TRIzol reagenssel (Invitrogen Life Technologies) extraháltuk a sejtekből, és a cDNS-t M-MLV reverz transzkriptáz kittel (Promega, Madison, WI, USA) állítottuk elő. Az RT-PCR-t SYBR RT-PCR Kits (DBI Bio-science) segítségével végeztük Roche LC480 készüléken. A gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz (GAPDH) mRNS-t endogén referenciaként állítottuk be az mRNS-ek normalizálására, és a génexpressziós szinteket a 2 ΔΔCT módszerrel számítottuk ki. Az RT-PCR primerek szekvenciáját az S1 kiegészítő táblázat mutatja. 2.10. Konfokális mikroszkópia

Az U251 sejteket plazmiddal transzfektáltuk, és 3 0 órán át tenyésztettük, majd háromszor mostuk PBS-sel. A sejteket 4%-os paraformaldehiddel fixáltuk 15 percig, majd 0,1% TritonX-100-ot tartalmazó PBS-sel 5 percig permeáltuk. PBS-sel történő mosás után a sejteket 5% BSA-t tartalmazó PBS-sel lezártuk 30 percig. A sejteket háromszor mostuk PBS-sel, és anti-HA, anti-FLAG és anti-flavivírussal inkubáltuk, majd anti-egér FITC és anti-nyúl Cy3 másodlagos antitestekkel inkubáltuk. A sejteket 40 6-diamidino-2-fenil-indol-dihidrokloriddal (DAPI) festettük, és Olympus konfokális mikroszkóppal végeztük.

2.11. GST legördülő tesztek

A pGEX6p-1-NS4B plazmidot Escherichia coli (E. coli) BL21 törzsbe transzfektáltuk. A GST-t és a GST-NS4B-t IPTG-vel indukáltuk 0,5 mmol/L végső koncentrációban, és a tenyészeteket további 6-8 órán át 37 C-on növesztettük. Ezután a GST fehérje és a GST- Az NS4B fehérjét E. coli baktériumokból tisztítottuk. A GST vagy GST-NS4B fehérjét glutation Sepharose gyöngyökkel (Novagen) inkubáltuk, és háromszor mostuk PBS-sel. A GST-t és a GST-NS4B fehérjét a HA-DHCR7 eukarióta fúziós fehérjével inkubáltuk, amely HA-DHCR7-expresszált HEK293T sejtlizátumokat kódoló plazmidokból származott 4 órán át 4 C-on. A csapadékot ötször mostuk, felforraltuk. 2 SDS betöltő puffer, és Western blot-tal kimutatható anti-GST és anti-HA antitestekkel.

2.12. HA-DHCR7 helyspecifikus mutagenezis

Megfelelő mutagén primerpárokat (S1 kiegészítő táblázat) szintetizáltunk, és felhasználtuk a mutált konstrukció PCR-rel történő előállításához. A HA-DHCR7-et használtuk a PrimeSTAR® HS Premix (Takara) sablonjaként. A PCR után a PCR-termékben maradt vad típusú plazmidot DpnI-vel (New England Biolabs) szelektíven emésztettük. Az emésztett PCR-terméket E. coli DH5 törzsbe transzfektáltuk. A kívánt mutánst Sanger szekvenciaanalízissel igazoltuk.

cistanche növény-növelő immunrendszer

2.13. Statisztikai analízis

Minden kísérletet legalább háromszor megismételtek hasonló eredménnyel. Az adatokat átlagos szórással (SD) fejezzük ki. A variabilitás jelentőségét a Student-féle kétirányú páratlan t-teszttel határozták meg kétcsoportos vagy egyirányú ANOVA-nál Dunnett többszörös összehasonlítás tesztjével vagy kétirányú ANOVA-val Sidak többszörös összehasonlítás tesztjével több csoportos összehasonlításhoz a GraphPad Prism szoftver segítségével. (8-as verzió.{6}}.1). A P < 0.{{10}}5 értéket statisztikailag szignifikánsnak, a P > 0.05 értéket pedig statisztikailag nem szignifikánsnak tekintettük. Az összes adat esetében a szignifikancia: *P < 0,05, **P < 0,01 és ***P < 0,001.

3. Eredmények

3.1. A ZIKV fertőzés DHCR7 expressziót indukál

A felhalmozódó bizonyítékok azt mutatják, hogy a koleszterin-metabolizmus befolyásolja a gazdaszervezet veleszületett immunválaszát a flavivírus-fertőzéssel, például a ZIKV-vel és a Dengue-vírussal (DENV) szemben (Leier et al., 2020; Randall, 2018). A DHCR7 egy enzimet kódol, amely a 7-DHC-t koleszterinné alakítja, ami a koleszterin bioszintézisének utolsó lépése (Moebius és mtsai, 1998). A DHCR7 expresszióját először ZIKV fertőzéskor észleltük. Az U251 humán asztrocitát ZIKV-vel fertőzték meg, amely dózisfüggően növelte a DHCR7 expresszióját mind az mRNS-ben, mind a fehérjében (1A-C. ábra). A jelenség megerősítésére ezután megvizsgáltuk a DHCR7 expresszióját a Vero sejtekben, és azt találtuk, hogy a ZIKV fertőzés lényegesen indukálta a DHCR7 expressziót (1D-F ábra), ami összhangban volt az U251 sejtekben elért eredményekkel.

A cistanche jótékony hatású – erősíti az immunrendszert

3.2. A DHCR7 megcélzása kritikus ZIKV-ellenes aktivitást vált ki

A DHCR7 ZIKV-fertőzéssel szembeni hatásának értékelésére az U251 és A549 sejteket HA-DHCR7-et kódoló plazmiddal transzfektáltuk, majd ZIKV-vel fertőztük (MOI ¼ 1). Az eredmények azt mutatták, hogy a DHCR7 túlzott expressziója jelentősen fokozta a ZIKV mRNS expresszióját (2A és B ábra). Nevezetesen, a DHCR7 fehérje felhalmozódásával a ZIKV strukturális fehérje E expressziója is megnövekedett (2C és D ábra). Ezenkívül a 2C. ábrán látható felülúszó felhasználásával plakk-vizsgálatot is végeztünk, és azt találtuk, hogy a DHCR7 túlzott expressziója jelentősen megnövelte a plakkképző egységeket, összehasonlítva a kontrollcsoporttal (2E és F ábra). A DHCR7 G410S missense mutációjáról beszámoltak arról, hogy megszünteti az enzimaktivitást (Fitzky et al., 1998; Shim és mtsai, 2004; Witsch-Baumgartner és mtsai, 2000). A DHCR7 ZIKV fertőzésre gyakorolt ​​hatásának további meghatározásához ezután megszerkesztettük a DHCR7 inaktív mutánsát (G410S). A vad típusú DHCR7-hez képest a G410S mutáns jelentősen gátolja a ZIKV fertőzést (2G. ábra). A megfigyelés megerősítésére konfokális mikroszkópos vizsgálatot is végeztünk. Amint a 2H. ábrán látható, a DHCR7 túlzott expressziója növelte a ZIKV fertőzést. Annak megállapítására, hogy az endogén DHCR7 enzimaktivitás kritikus fontosságú-e a ZIKV-fertőzés szempontjából, két rövid hajtű RNS-t terveztünk (shDHCR7-1 és sh-DHCR7-2), amelyek kifejezetten a DHCR7-et célozzák meg, és létrehoztunk DHCR7-csendezett U251 sejtet. vonalak shRNS rendszerrel (3A. ábra). Végül egy sh-DHCR-t{38}} választottunk a nagyobb hangtompítási hatékonyság miatt. A sejtvonallal transzdukált kontroll shRNS-hez képest ezek a DHCR7 knockdown sejtek alacsonyabb érzékenységet mutattak a ZIKV fertőzéssel szemben (3B. és C. ábra). Ezt követően a szelektív DHCR7 inhibitort, az AY9944-et használtuk, amely megakadályozza, hogy a 7-DHC koleszterinné alakuljon (Xu és mtsai, 2011), amelyről kimutatták, hogy gátolja a DHCR7 enzimaktivitást (Horlick, 1966; Moebius és mtsai, 1998). A kontrollhoz képest az AY9944 adagolása dózisfüggően gátolta a ZIKV fertőzést az U251 sejtekben (3D-F ábra). A plakk vizsgálatot Vero sejtekben is elvégezték a DHCR7 hatásának további értékelésére, és kimutatták, hogy az AY9944 jelentősen elnyomja a ZIKV fertőzést (3G és H ábra). A konfokális mikroszkópia azt mutatta, hogy a ZIKV E fehérje lényegesen csökkent AY9944 jelenlétében (31. ábra). Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a DHCR7 megcélzása gátolhatja a ZIKV fertőzést.

1. ábra: A ZIKV fertőzés DHCR7 expressziót indukál. Az A–F U251 és Vero sejteket 24 órán keresztül fertőztük ZIKV-vel (MOI ¼ 0, 1 és 2), és a ZIKV (A, D) és DHCR7 (B, E) intracelluláris RNS-szintjét a következő módszerrel határoztuk meg. RT-PCR belső kontrollként GAPDH-val. A DHCR7 és ZIKV borítékok relatív fehérjeszintjét Western blot (C, F) segítségével detektáltuk. Az adatok legalább három független kísérletből (átlag SD) vagy reprezentatív adatokból (C, F) származnak. A statisztikai szignifikanciát egyutas ANOVA-val, Dunnett többszörös összehasonlító teszttel (A, B, D, E) számítottuk ki. **P < 0.01, ***P < 0,001. SD, szórás.

3.3. A DHCR7 gátolja a TBK1 és IRF3 aktiválását, hogy csökkentse az IFN- és ISG-termelést

Mivel a DHCR7 a létfontosságú enzim a 7-DHC koleszterinné alakításában (Moebius et al., 1998), és a ZIKV-fertőzés növelheti a DHCR7 expresszióját, ezért megmértük a koleszterinszintet ZIKV-fertőzéskor. Felfedtük, hogy a ZIKV fertőzés csekély hatással van a koleszterinszintézisre az U251 és Vero sejtekben (4A és B ábra), bár a DHCR7 megnövekedett (1A-D ábra). Tekintettel a ZIKV fertőzés hatására megnövekedett DHCR7-re és az IFN-ek kulcsszerepére a ZIKV-fertőzéssel szembeni küzdelemben, a következő lépésben meghatároztuk a DHCR7 hatását az IFN-I jelátviteli útvonalra. Kontroll és DHCR{11}}csendesítő U251 sejteket fertőztünk ZIKV-vel vagy transzfektáltunk poli(I:C)-vel, és vizsgáltuk az IFN-expressziót. A kontrollcsoporthoz képest a ZIKV-fertőzés vagy a poli(I:C)-kezelés jelentősen fokozta az IFN-expressziót a DHCR{15}}csendesítő U251 sejtekben (4C. és D. ábra). Az ISG-k az interferon hatások effektorai, és fontos szerepet játszanak a ZIKV fertőzés elleni veleszületett immunvédelemben. Azt is kimutattuk, hogy a DHCR7 blokkolása jelentősen megerősítheti az ISG15 és ISG56 expresszióját mind mRNS, mind fehérje szinten (4E-J ábra). Következetesen a DHCR7 inhibitor AY9944 kezelés indukálhatja az IFN-, ISG15 és ISG56 expressziót (4K. ábra, L). Fontos, hogy az inaktív mutáns G410S részben megfordíthatja a DHCR7 IFN- és ISG expresszióra gyakorolt ​​gátló hatásait (4M. ábra, N). A TBK1 és IRF3 aktiválása nélkülözhetetlen az IFNs-ISG-k indukciójához, ezért a következőkben a DHCR7 hatását vizsgáltuk a TBK1 és IRF3 expressziójára és aktiválódására. Kimutattuk, hogy a DHCR7 nemcsak dózisfüggően gátolta a fehérjeszintet, hanem elnyomta a TBK1 és IRF3 foszforiláció szintjét is (5A-C. ábra). Ezenkívül az inaktív G410S mutáns nem teljesen fordította meg a DHCR7 IRF3 és TBK1 foszforilációt gátló hatásait (5D. ábra). A DHCR7 túlzott expressziójának megállapításaival ellentétben az AY9944 kezelés IRF3 és TBK1 aktivációt válthat ki az U251 sejtben (5E. ábra).

3.4. A ZIKV NS4B kölcsönhatásba lép a DHCR7-tel, hogy gátolja a TBK1 és IRF3 foszforilációját

Egyre több bizonyíték tárta fel, hogy a ZIKV specifikus NS fehérjéket fejlesztett ki, hogy elősegítse a hatékony replikációt a gazdasejtekben azáltal, hogy számos különálló mechanizmuson keresztül közvetlenül elkerülte a gazda veleszületett és adaptív immunitását. Ko-IP vizsgálatot végeztünk, hogy kiszűrjük az egyedi ZIKV NS fehérjét, amely kölcsönhatásba léphet a DHCR7-tel. A HEK293T sejteket pCMV-DHCR7-HA-val és az egyedi NS fehérjét expresszáló plazmiddal együtt transzfektáltuk Flag-címkével fuzionálva. Amint a 6A. ábrán látható, a DHCR7 csak az NS4B-hez kötődik, de nem lép kölcsönhatásba más NS-fehérjékkel. Reciprok ko-IP vizsgálatokat folytattunk tovább, és kimutatták, hogy az NS4B fehérje kölcsönhatásba lép a DHCR7-tel a HEK293T sejtekben (6B. és C. ábra). Az NS4B és a DHCR7 kölcsönhatásának megerősítésére ezután konfokális mikroszkópot végeztünk, és megállapítottuk, hogy az NS4B fehérje és a DHCR7 fehérje kolokalizálódott a citoplazmában (6D. ábra). A GST lehúzó vizsgálat tovább demonstrálta az NS4B és a DHCR7 kölcsönhatását (6E. ábra). Ezenkívül az NS4B átmeneti transzfekciója U251 sejtekben drámai módon indukálhatja a DHCR7 expresszióját (6F. ábra). Fontos, hogy az NS4B dózisfüggően blokkolhatja mind a TBK1, mind az IRF3 foszforilációját, ami pozitívan korrelált a TBK1 és IRF3 fokozott aktiválásával a DHCR7-re adott válaszként (6G és H ábra). Azonban az NS4B túlzott expressziója a HEK293T sejtekben szignifikánsan csökkentette a TBK1 fehérjeszintjét, de csekély hatással volt az IRF3 fehérjére (6G és H ábra). E megfigyelések további megerősítésére az NS4B-t DHCR7 knockdown U251 sejtekbe transzfektáltuk, és gátló hatást mutatott a TBK1 és IRF3 endogén fehérje- és foszforilációs szintjére (61. ábra). Összességében ezek az eredmények azt mutatták, hogy a ZIKV NS4B kölcsönhatásba lép a DHCR7-tel, és fokozta a DHCR7 expresszióját, hogy blokkolja a TBK1 és IRF3 aktiválását, majd elősegítse a ZIKV fertőzést.

2. ábra: A DHCR7 túlzott expressziója elősegíti a ZIKV replikációját. Az A–D U251 és A549 sejteket HA-vektorral vagy HA-DHCR7-tel transzfektáltuk a jelzett koncentrációkban 12 órán át, majd további 36 órán át ZIKV-vel fertőztük. A ZIKV RNS szinteket RT-PCR-rel detektáltuk belső kontrollként GAPDH-val (A, B), a ZIKV-burok fehérjeszintjét, a HA-DHCR7-et és a GAPDH-t Western-blottal (C, D). Az E, F Vero sejteket a 2C. ábra ZIKV-tartalmú felülúszójával fertőztük 48 órán át, hogy meghatározzuk a ZIKV-kópiákat plakk-vizsgálattal. A G U251 sejteket HA-vektorral, HA-DHCR7-tel vagy HA-DHCR7-tel (G410S) 12 órán át transzfektáltuk, majd 36 órán át ZIKV-vel fertőztük, valamint a ZIKV-burok fehérjeszintjét, a HA-DHCR7-et és A GAPDH-t Western-blottal detektáltuk. A H U251 sejteket HA-vektorral vagy HA-DHCR7-tel (1 ug) transzfektáltuk 12 órán át, ZIKV-vel fertőztük 36 órán át, majd egér anti-flavivírus és nyúl anti-HA antitestekkel inkubáltuk, majd FITC-konjugált antiegérrel és Cy3-konjugált nyúl elleni másodlagos antitestek. A sejtmagokat DAPI-val festették meg. A képeket konfokális mikroszkóppal tettük láthatóvá. Skála ¼ 100 μm. Az adatok legalább három független kísérletből (átlag SD) vagy reprezentatív adatokból (C, D, E, G, H) származnak. A statisztikai szignifikanciát Student-féle kétoldali páratlan t-próbával (F) vagy egyutas ANOVA-val és Dunnett többszörös összehasonlító tesztjével (A, B) számítottuk. *P < 0,05, ***P < 0,001. SD, szórás.

4. Megbeszélés

Az I-es típusú IFN-ek és a lefelé irányuló ISG-k számos kórokozóval szembesülnek, és döntő szerepet játszanak a gazdaszervezet ZIKV elleni immunvédelmében (Lazear et al., 2016). Az IFN által közvetített felügyelet elkerülése és a megfelelő replikáció elérése érdekében a ZIKV olyan NS fehérjéket fejleszt ki, amelyek az IFN jelátviteli útvonalának különböző pontjait célozzák meg, hogy elmeneküljenek a celluláris veleszületett immunrendszerből (Lee et al., 2021). A szerelési vizsgálatok azt mutatták, hogy a ZIKV NS1, NS3, NS4A és NS5 gátolja a RIG-I/IFN-I útvonal különálló moduljait, és független és változatos mechanizmusok segítségével megkönnyíti a vírusfertőzést (Grant és mtsai, 2016; Kumar et al., 2016). Ma és mtsai, 2018; Riedl és mtsai, 2019; Xia és mtsai, 2018; Zheng és mtsai, 2018). A ZIKV NS4B immunrestrikciót ellensúlyozó specifikus mechanizmusa azonban rosszul definiált. A ZIKV NS4B egy rendkívül hidrofób fehérje, amely 251 aminosavból áll, és az endoplazmatikus retikulum membránjában található N-terminálissal (Zou et al., 2014). Az IFN-I jelátviteli útvonal NS4B gátlását különböző flavivírusokban azonosították (Ding et al., 2013; Munoz-Jordan és mtsai, 2003, 2005; Shan és mtsai, 2021; Yi et al., 2016; Zhang et al. al., 2021). Egy nemrégiben készült tanulmány arról számolt be, hogy a Brazíliában izolált ZIKV INMI1 törzs az NS4B-t használja fel az IFN-I jelátviteli útvonal lefelé irányuló antagonizálására a STAT1 foszforilációjának összetörésével és ennek következtében a STAT1 nukleáris transzportjának megszakításával (Fanunza et al., 2021). Ebben a tanulmányban egy különálló mechanizmust találtunk, amelyben a ZIKV NS4B megszüntette az IFN-termelést a TBK1 és IRF3 foszforilációjának elnyomásával, amely az IFN-I jelátviteli útvonal upstream komponense. Nevezetesen, aminosav szubsztitúciót (G18R) fedeztek fel a ZIKV NS4B-ben, ami hozzájárult a csökkent IFN-termeléshez és gyengítette az ISG expressziót, és ennek következtében elősegítette az egerek vírusfertőzését, jelezve az NS4B jelentőségét a patogenezis meghatározó tényezőjeként (Gorman et al. ., 2018). Az újonnan felbukkanó bizonyítékok azt mutatják, hogy a koleszterin-anyagcsere kulcsfontosságú szerepet játszik a veleszületett immunválaszban (Akula et al., 2016; Dang és mtsai, 2017; Reboldi és mtsai, 2014; York és mtsai, 2015). Bár a koleszterin-anyagcsere számos köztes termékéről dokumentáltak széleskörű vírusellenes hatást (Blanc és mtsai, 2013; Li et al., 2017; Liu és mtsai, 2013; Xiao és mtsai, 2020), tanulmányunk egy új mechanizmust illusztrált. hogy a DHCR7 koleszterin metabolikus enzim részt vett a ZIKV fertőzésben azáltal, hogy gyengítette a TBK1 és IRF3 aktivációt a vírusfertőzés elősegítése érdekében. A dezmoszterin- és koleszterin-anyagcserében részt vevő kulcsenzimként a DHCR7 a 7-DHC D-vitaminná történő átalakítását jelenti az UVB-sugárzásnak kitett bőrsejtekben (Prabhu et al., 2016b). Sőt, a DHCR7 nemcsak a Bloch útvonal átjárójában helyezkedik el, hanem a Kandutsch-Russell útvonal végén is (Prabhu et al., 2016a, 2016b), amely létfontosságú szerepet játszik a koleszterinszintézis szabályozásában. A DHCR7 áthallása és más enzimekkel való kölcsönhatása számos útvonalon több funkciót is felhatalmazhat a különböző sejttípusokban vagy szervekben. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a DHCR7 blokkolása csökkentheti a dezmoszterint, a koleszterin-bioszintézis közvetlen előfutárát, ezáltal megfelelő védelmet nyújt a HCV-fertőzéssel szemben (Luu et al., 2015; Rodgers et al., 2012). Fontos, hogy Xiao et al. kimutatták, hogy a VSV-fertőzés csökkenti a DHCR7 expresszióját, ami csökkenti a koleszterinszintet, de sokkal több 7-DHC-felhalmozódást okoz a makrofágokban és a májban (Xiao et al., 2020). A 7-DHC-vel kezelt makrofágok fokozott vírusellenes választ adtak; míg a koleszterin hozzáadása csekély védelmet mutatott. A DHCR7-gátlók és a 7-DHC beadása hasznos megközelítések lehetnek a vírusfertőzések, például a HIN1, a HSV és a VSV elleni küzdelemben. Ebben a vizsgálatban azt találtuk, hogy az AY9944 DHCR7 inhibitor elnyomhatja a ZIKV fertőzést. Vizsgálatunk azonban feltárta, hogy a ZIKV fertőzés DHCR7 expressziót indukált, de csekély hatással volt a koleszterin bioszintézisére a gliasejtekben. Nem vizsgáltuk a 7-DHC expresszió szintjét a ZIKV fertőzés után, ennek ellenére érdemes tovább vizsgálni, hogy a 7-DHC és az AY9944 szinergikus terápiás hatékonysággal rendelkezik-e a ZIKV-fertőzött betegek kezelésében fertőzés az agyban. A DHCR7 túlzott expressziója elősegítette a ZIKV fertőzést, míg a DHCR7 szelektív inhibitor (AY9944) kezelés erősen növelte az IFN-termelést a ZIKV fertőzéssel szemben. A TBK1 és IRF3 aktiválása létfontosságú az IFN-I jelátvitel elindításához. Korábbi vizsgálatok kimutatták, hogy a DHCR7-elnémítás vagy a 7-DHC-kezelés aktiválta a PI3K-AKT3 útvonalat az IRF3 foszforilálására, a TBK1-et azonban nem a makrofágokban (Xiao et al., 2020). Ennek ellenére eredményeink azt mutatták, hogy a DHCR7 dózisfüggően csökkentette mind az IRF3, mind a TBK1 expresszióját, valamint az IRF3 és a TBK1 foszforilációját. Ezek a vizsgálatok arra utaltak, hogy a DHCR7 hozzájárulhat a ZIKV-fertőzéshez egy koleszterin-anyagcsere-független mechanizmusban az agyban. Jól tisztázott, hogy a ZIKV NS fehérjéket használt fel a RIG-I/IFN-I útvonal különböző komponenseivel való közvetlen kölcsönhatásra, hogy elkerülje az immunválaszt és elősegítse a vírus replikációját. Korábban már beszámoltunk a ZIKV NS5 és a RIG-I kölcsönhatásáról az IFN-termelés gyengítése érdekében (Li et al., 2020). Mások kimutatták, hogy a ZIKV NS1 és NS2B a TBK1-et, az NS3 pedig a RIG-I-t és az MDA5-öt célozta meg, hogy csökkentse az IFN-I és ISG-termelést (Lee és mtsai, 2021; Riedl és mtsai, 2019). A ZIKV NS fehérjék koleszterin-anyagcserét célzó funkciója azonban továbbra is nagyrészt megfoghatatlan. Ebben a tanulmányban bemutattuk a DHCR7 koleszterin metabolikus enzim és a ZIKV NS fehérjék közötti, nem bejelentett kölcsönhatást is. Kimutattuk, hogy a DHCR7 specifikusan az NS4B-hez kötődik, más NS fehérjékhez nem. Megadtuk a kritikus bizonyítékot arra vonatkozóan, hogy a ZIKV NS4B kölcsönhatásba lép a DHCR7-tel, és jelentősen indukálta expresszióját, ami összhangban volt a ZIKV-fertőzés utáni U251 sejtekben elért eredményekkel. Fontos, hogy a DHCR7 és a ZIKV NS4B kapcsolatának közvetlen bizonyítása mellett azt is megállapítottuk, hogy a ZIKV NS4B növelte a DHCR7 expresszióját, hogy gátolja a TBK1 és IRF3 foszforilációját és megkönnyítse a ZIKV fertőzést. Eredményeinkkel összhangban egy közelmúltbeli tanulmány kimutatta, hogy a DHCR7 hiánya aktiválhatja az IRF3- és IFN-jelátvitelt, hogy gátolja a VSV-t és más vírusokat a makrofágokban.

3. ábra: A DHCR7 leütése csökkenti a ZIKV fertőzést az U251 sejtekben. Az U251 sejteket a DHCR7 (shDHCR7-1 és sh-DHCR7-2) vagy egy nem célszekvenciával (sh-NTC) szembeni shRNS-t tartalmazó lentivírus részecskékkel transzdukáltuk, majd 14 napig puromicinszelekciót végeztünk. A leütési hatékonyságot RT-PCR-rel határoztuk meg. B, C DHCR{11}}csendesítő U251 (sh-DHCR7) és sh-NTC U251 sejteket álfertőzött vagy ZIKV fertőzött (MOI ¼ 1) 36 órán keresztül. Az intracelluláris ZIKV RNS szintet RT-PCR-rel detektáltuk belső kontrollként GAPDH-val (B), a ZIKV-burok fehérjeszintjét, a DHCR7-et és a GAPDH-t Western-blottal (C). A D, E U251 sejteket AY9944 DHCR7 inhibitorral kezeltük a jelzett koncentrációban 2 órán át, majd 48 órán át ZIKV-vel (MOI ¼ 1) fertőztük. A sejteket RT-PCR-nek vetettük alá a ZIKV RNS (D) kimutatására. A ZIKV-burok fehérjeszintjét, a DHCR7-et és a GAPDH-t Western-blot (E) segítségével detektáltuk. F U251 sejteket kezeltünk DHCR7 gátlóval AY9944 a jelzett koncentrációban 36 órán át, és a DHCR7 és GAPDH Western blot segítségével detektáltuk. A G, H Vero sejteket a 3E. ábra ZIKV-tartalmú felülúszójával fertőztük 48 órán át, hogy meghatározzuk a ZIKV-kópiákat plakk-vizsgálattal. I U251 sejteket kezeltünk AY9944-gyel a jelzett koncentrációban 2 órán át, majd ZIKV-vel fertőztük MOI ¼ 1 értékkel 36 órán át. A képeket konfokális mikroszkóppal tettük láthatóvá. Skála ¼ 100 μm. Az adatok legalább három független kísérletből (átlag SD) vagy reprezentatív adatokból (C, E, F, G és I) származnak. A statisztikai szignifikancia kiszámítása egytényezős ANOVA-val Dunnett többszörös összehasonlítási tesztjével (A, D, H) vagy kétutas ANOVA-val Sidak többszörös összehasonlítási tesztjével (B) történik. ***P < 0,001. SD, szórás.

4. ábra: A DHCR7 gátolja az IFN- és ISG-termelést. Az A, B U251 és Vero sejteket ZIKV-vel (MOI ¼ 0, 0,5 és 1) fertőztük 24 órán át, és a sejtkoleszterint mértük a szöveti összkoleszterin-mérőkészlettel. C-H DHCR7-csendesítő U251 (sh-DHCR7) és sh-NTC U251 sejteket ZIKV-vel (MOI ¼ 1) fertőztünk, vagy Poly(I:C)-vel (1 ug/ml) kezeltük 6 órán keresztül. A teljes sejt-RNS-t extraháltuk, és RT-PCR-nek vetettük alá az mRNS expresszióját, belső kontrollként GAPDH-val. Az IFN- és ISG-k relatív expresszióját normalizáltuk az sh-NTC mintákéval a hamis csoportban, és a hajtásváltozások mértéktelennek bizonyultak. IFN- (C, D), ISG15 (E, F) és ISG56 (G, H). Az I, J DHCR7-csendesítő U251 (sh-DHCR7) és sh-NTC U251 sejteket ZIKV-vel (MOI ¼ 1) vagy Poly(I:C)-vel (1 ug/ml) fertőztük 24 órán keresztül, és az ISG15, ISG56 és GAPDH fehérjeszintjét Western blottal detektáltuk. A K U251 sejteket az AY9944 jelzett dózisával kezeltük 2 órán át, majd 6 órán át ZIKV-vel (MOI ¼ 1) fertőztük. Az IFN-RNS szintet RT-PCR-rel detektáltuk belső kontrollként GAPDH-val. Az L U251 sejteket 2 órán át kezeltük az AY9944 jelzett dózisával, majd 24 órán át ZIKV-vel (MOI ¼ 1) fertőztük. Az ISG15, ISG56 és GAPDH fehérjeszintjét Western-blottal detektáltuk. M U251 sejteket HA-vektorral, HA-DHCR7-tel vagy HA-DHCR7-tel (G410S) transzfektáltunk 24 órán át, és 6 órán át ZIKV-vel (MOI ¼ 1) fertőztük. Az IFN-RNS szinteket RT-PCR-rel detektáltuk, belső kontrollként GAPDH-t használva. N U251 sejtet transzfektáltunk HA-vektorral, HA-DHCR7-tel vagy HA-DHCR7-tel (G410S) 24 órán át, majd ZIKV-vel (MOI ¼ 1) fertőztük 24 órán át. Az ISG15, ISG56 és GAPDH fehérjeszintjét Western-blottal detektáltuk. Az adatok legalább három független kísérletből (átlag SD) vagy reprezentatív adatokból (I, J, L, N) származnak. A statisztikai szignifikancia kiszámítása egytényezős ANOVA-val és Dunnett többszörös összehasonlítási tesztjével (A, B, K, M) vagy kétutas ANOVA-val Sidak többszörös összehasonlítási tesztjével (C–H) történik. ns, P > 0,05, ***P < 0,001. SD, szórás.

5. ábra: A DHCR7 gátolja a TBK1 és IRF3 aktiválását. Az A, B HEK293T sejteket TBK1- kódoló plazmiddal együtt transzfektáltuk DHCR7- expresszáló plazmiddal vagy üres vektorral (A). A HEK293T sejteket IRF{10}}kódoló plazmiddal, RIG-I-et kódoló plazmiddal, valamint DHCR{12}} expresszáló plazmiddal vagy üres vektorral (B) együtt transzfektáltuk. A sejteket a transzfekció után 24 órával összegyűjtöttük, és Western blot-nak vetettük alá a jelzett antitestekkel [anti-TBK1, anti-P-TBK1 (S172), anti-IRF3, anti-PIRF3 (S396), anti-HA és anti-GAPDH ]. C U251 sejteket transzfektáltunk a jelzett dózisú DHCR7-et expresszáló plazmiddal vagy üres vektorral 24 órán keresztül. A sejteket ezután ZIKV-vel (MOI ¼ 1) fertőztük, 6 órával a fertőzés után gyűjtöttük össze, és Western blot-nak vetettük alá a jelzett antitestekkel [anti-TBK1, anti-P-TBK1(S172), anti-IRF3, anti-P-IRF3 ( S396), anti-HA és anti-GAPDH]. D U251 sejteket HA-vektorral, HA-DHCR7-tel vagy HA-DHCR7-tel (G410S) transzfektáltunk 24 órán át. A sejteket ezután ZIKV-vel (MOI ¼ 1) fertőztük, 6 órával a fertőzés után gyűjtöttük össze, és Western blot-nak vetették alá a jelzett antitestekkel [anti-TBK1, anti-P-TBK1 (S172), anti-IRF3, anti-PIRF3 (S396) , anti-HA és anti-GAPDH]. Az E U251 sejteket az AY9944 jelzett dózisával kezeltük 2 órán át, majd 6 órán át ZIKV-vel (MOI ¼ 1) fertőztük, majd Western blot-nak vetettük alá a jelzett antitestekkel [anti-TBK1, anti-P-TBK1 (S172), anti. -IRF3, anti-P-IRF3(S396) és anti-GAPDH]. Az adatok legalább három független kísérletből származnak, és reprezentatív adatként (A–E) szerepelnek.

6. ábra: A ZIKV NS4B kölcsönhatásba lép a DHCR7-tel, hogy gátolja a TBK1 és IRF3 foszforilációját. A HEK293T sejteket kotranszfektáltuk HA-DHCR7-et kódoló plazmidokkal és ZIKV nem strukturális fehérjéket kódoló plazmidokkal (FLAG-NS1, FLAG-NS3, FLAG-NS4A, FLAG-NS4B és FLAG-NS5) vagy üres kontrollplazmiddal a 3. 0 h. A sejtlizátumokat anti-Flag antitestekkel immunprecipitáltuk, majd immunblottal elemeztük a jelzett antitestekkel. B, C HEK293T sejteket kotranszfektáltunk HA-DHCR7-et, FLAG-NS4B-t kódoló plazmidokkal vagy üres kontrollplazmiddal 30 órán át. A sejtlizátumokat anti-HA antitesttel (B) vagy anti-FLAG antitesttel (C) immunprecipitáltuk, majd immunblottal analizáltuk a jelzett antitestekkel. D U251 sejteket FLAG-NS4B plazmiddal és HA-DHCR7-et kódoló plazmidokkal együtt transzfektáltunk. Konfokális mikroszkóppal elemeztük a FLAG-NS4B (zöld), HA-DHCR7 (piros), DAPI nucleus marker (kék) és egyesítés lokalizációját. Skála ¼ 10 μm. A HA-DHCR7-tel transzfektált HEK293T sejtekből származó E sejtlizátumokat GST fehérjével vagy GST-NS4B fehérjével inkubáltuk, amelyet glutation-Sepharose gyöngyökkel inkubáltunk. A keverékeket Western blottal mutattuk ki anti-HA és anti-GST antitestekkel (felül). A transzfektált HEK293T sejtekből származó lizátumokat és a tisztított fehérjéket Western-blottal detektáltuk anti-HA és anti-GST antitestekkel (alul). F U251 sejteket transzfektáltunk FLAG-NS4B-t kódoló plazmiddal (0, 1, 2 ug). A DHCR7, a FLAG-NS4B és a GAPDH relatív fehérjeszintjét Western-blottal detektáltuk. G, H HEK293T sejteket kotranszfektáltunk NS4B-t expresszáló plazmiddal vagy üres vektorral, a TBK1-kódoló plazmiddal (F), az IRF3- expresszáló plazmiddal és a RIG-I-t kódoló plazmidokkal (G) együtt. . A sejteket a transzfekció után 24 órával összegyűjtöttük, és Western blot-nak vetettük alá a jelzett antitestekkel [anti-TBK1, anti-P-TBK1 (S172), anti-IRF3, anti-P-IRF3 (S396), anti-FLAG és antiGAPDH ]. I DHCR{83}}csendesítő U251 (sh-DHCR7) és sh-NTC U251 sejteket NS4B-t expresszáló plazmiddal vagy üres vektorral transzfektáltunk. A sejteket a transzfekció után 6 órával összegyűjtöttük, és Western blot-nak vetettük alá a jelzett antitestekkel [anti-TBK1, anti-P-TBK1 (S172), anti-IRF3, anti-P-IRF3 (S396), anti-FLAG és antiGAPDH ]. Az adatok három független kísérletet reprezentálnak.

5. Következtetések

Összefoglalva, egy korábbi tanulmány feltárta, hogy a DHCR7 koleszterin-anyagcsere enzim részt vesz a veleszületett immunválaszban különböző vírusfertőzések ellen. Tanulmányunk bemutatta, hogy a ZIKV NS4B kölcsönhatásba lép a DHCR7-tel, és indukálta a DHCR7 expresszióját. A megnövekedett DHCR7 nagymértékben gátolja a TBK1 és IRF3 aktivációt, és csökkent IFN- és ISG termelést eredményez, ami megkönnyíti a ZIKV fertőzést a gliasejtekben. Ezek az eredmények egy új vírus immunszökési mechanizmust tártak fel, amely szerint a ZIKV legyőzi az immunválaszt azáltal, hogy közvetlenül megcélozza a DHCR7-et az NS4B-vel.

Hivatkozások

Akula, MK, Shi, M., Jiang, Z., Foster, CE, Miao, D., Li, AS, Zhang, X., Gavin, RM, Forde, SD, Germain, G., Carpenter, S., Rosadini, CV, Gritsman, K., Chae, JJ, Hampton, R., Silverman, N., Gravallese, EM, Kagan, JC, Fitzgerald, KA, Kastner, DL, Golenbock, DT, Bergo, MO, Wang, D ., 2016. A veleszületett immunválasz szabályozása a mevalonát útvonalon. Nat. Immunol. 17, 922–929.

Berthoud, L., 2020. A flavivírusok korlátozása. Virol. Bűn. 35, 363–377.

Blanc, M., Hsieh, WY, Robertson, KA, Kropp, KA, Forster, T., Shui, G., Lacaze, P., Watterson, S., Griffiths, SJ, Spann, NJ, Meljon, A., Talbot, S., Krishnan, K., Covey, DF, Wenk, MR, Craigon, M., Ruzsics, Z., Haas, J., Angulo, A., Griffiths, WJ, Glass, CK, Wang, Y. , Ghazal, P., 2013. A STAT-1 transzkripciós faktor összekapcsolja a 25-hidroxikoleszterin makrofág-szintézisét az interferon antivirális válaszával. Immunity 38, 106–118.

Cao-Lormeau, V.-M., Blake, A., Mons, S., Lastere, S., Roche, C., Vanhomwegen, J., Dub, T., Baudouin, L., Teissier, A., Larre, P., Vial, A.-L., Decam, C., Choumet, V., Halstead, SK, Willison, HJ, Musset, L., Manuguerra, J.-C., Despres, P., Fournier , E., Mallet, H.-P., Musso, D., Fontanet, A., Neil, J., Ghawche, F., 2016. Guillain-Barre-szindróma járvány a Zika-vírus fertőzéssel kapcsolatban Francia Polinéziában: eset -kontroll vizsgálat. Lancet 387, 1531–1539.

Chazal, M., Beauclair, G., Gracias, S., Najburg, V., Simon-Loriere, E., Tangy, F., Komarova, AV, Jouvenet, N., 2018. A RIG-I felismeri az 5'-t dengue- és Zika-vírus genomjának régiója. Cell Rep. 24, 320–328.

Chen, Q., Gouilly, J., Ferrat, YJ, Espino, A., Glaziou, Q., Cartron, G., El Costa, H., AlDaccak, R., Jabrane-Ferrat, N., 2020. Metabolic a Zika vírus általi újraprogramozás gyulladást vált ki az emberi méhlepényben. Nat. Commun. 11, 2967. Dang, EV, McDonald, JG, Russell, DW, Cyster, JG, 2017. A koleszterinszintézis oxiszterol visszatartása megakadályozza az AIM2 gyulladásos aktiválódását. 171. cella, 1057–1071 e1011.

Ding, Q., Cao, X., Lu, J., Huang, B., Liu, YJ, Kato, N., Shu, HB, Zhong, J., 2013. Hepatitis C vírus NS4B blokkolja a STING és a kölcsönhatást TBK1, hogy elkerülje a gazdaszervezet veleszületett immunitását. J. Hepatol. 59, 52–58.

Fanunza, E., Grandi, N., Quartu, M., Carletti, F., Ermellino, L., Milia, J., Corona, A., Capobianchi, MR, Ippolito, G., Tramontano, E., 2021 Az INMI1 Zika vírus NS4B antagonizálja az interferon jelátvitelt a STAT1 foszforilációjának elnyomásával. Vírusok 13, 2448.

Fitzgerald, KA, McWhirter, SM, Faia, KL, Rowe, DC, Latz, E., Golenbock, DT, Coyle, AJ, Liao, SM, Maniatis, T., 2003. Az IKKε és a TBK1 az IRF3 jelzés alapvető összetevői útvonalat. Nat. Immunol. 4, 491–496.

Fitzky, BU, Witsch-Baumgartner, M., Erdel, M., Lee, JN, Paik, Y.-K., Glossmann, H., Utermann, G., Moebius, FF, 1998. Mutations in the Δ{{ 3}}szterol reduktáz gén Smith–Lemli–Opitz-szindrómás betegekben. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 8181–8186.

Gorman, MJ, Caine, EA, Zaitsev, K., Begley, MC, Weger-Lucarelli, J., Uccellini, MB, Tripathi, S., Morrison, J., Yount, BL, Dinnon 3., KH, Ruckert, C ., Young, MC, Zhu, Z., Robertson, SJ, McNally, KL, Ye, J., Cao, B., Mysorekar, IU, Ebel, GD, Baric, RS, Best, SM, Artyomov, MN, Garcia -Sastre, A., Diamond, MS, 2018. A Zika-vírus fertőzés immunkompetens egérmodellje. Cell Host Microbe 23, 672-685.e6.

Grant, A., Ponia, SS, Tripathi, S., Balasubramaniam, V., Miorin, L., Sourisseau, M., Schwarz, MC, Sanchez-Seco, MP, Evans, MJ, Best, SM, Garcia-Sastre , A., 2016. A Zika vírus a humán STAT2-t célozza meg az I. típusú interferon jelátvitel gátlására. Cell Host Microbe 19, 882–890.

Hertzog, J., Dias Junior, AG, Rigby, RE, Donald, CL, Mayer, A., Sezgin, E., Song, C., Jin, B., Hublitz, P., Eggeling, C., Kohl, A., Rehwinkel, J., 2018. A Zika vírus brazil izolátumával való fertőzés RIG-I stimuláló RNS-t generál, és a vírus NS5 fehérje blokkolja az I. típusú IFN indukciót és jelátvitelt. Eur. J. Immunol. 48, 1120–1136.

Horlick, L., 1966. A koleszterin bioszintézis új inhibitorának (AY 9944) hatása a szérum- és szöveti szterolokra patkányban. J. Lipid Res. 7, 116–121.

Ikonen, E., 2008. Celluláris koleszterin-kereskedelem és kompartmentalizáció. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 125–138.

Kato, H., Takeuchi, O., Sato, S., Yoneyama, M., Yamamoto, M., Matsui, K., Uematsu, S., Jung, A., Kawai, T., Ishii, KJ, Yamaguchi , O., Otsu, K., Tsujimura, T., Koh, CS, Reis e Sousa, C., Matsuura, Y., Fujita, T., Akira, S., 2006. Differential roles of MDA5 and RIG-I helikázok az RNS-vírusok felismerésében. Természet 441, 101–105.

Kuan, V., Martineau, AR, Griffiths, CJ, Hypp€onen, E., Walton, R., 2013. A magasabb D-vitamin státuszhoz kapcsolódó DHCR7 mutációk lehetővé tették az ember korai migrációját az északi szélességi körökre. BMC Evol. Biol. 13, 144.

Kumar, A., Hou, S., Airo, AM, Limonta, D., Mancinelli, V., Branton, W., Power, C., Hobman, TC, 2016. A Zika-vírus gátolja az I-es típusú interferontermelést és a downstream jelzés. EMBO Rep. 17, 1766–1775.

Lazear, HM, Govero, J., Smith, AM, Platt, DJ, Fernandez, E., Miner, JJ, Diamond, MS, 2016. A Zika virus pathogenesisének egérmodellje. Cell Host Microbe 19, 720–730. Lee, LJ, Komarasamy, TV, Adnan, NAA, James, W., Rmt Balasubramaniam, V., 2021. Bújócska: a Zika-vírus és a gazdaszervezet immunválaszának kölcsönhatása. Elülső. Immunol. 12, 750365.

Leier, HC, Weinstein, JB, Kyle, JE, Lee, JY, Bramer, LM, Stratton, KG, Kempthorne, D., Navratil, AR, Tafesse, EG, Hornemann, T., Messer, WB, Dennis, EA, Metz, TO, Barklis, E., Tafesse, FG, 2020. A globális lipidtérkép meghatározza a Zika-vírus replikációjához nélkülözhetetlen hálózatot. Nat. Commun. 11, 3652.

Li, A., Wang, W., Wang, Y., Chen, K., Xiao, F., Hu, D., Hui, L., Liu, W., Feng, Y., Li, G., Tan, Q., Liu, Y., Wu, K., Wu, J., 2020. NS5 konzervatív hely szükséges ahhoz, hogy a Zika vírus korlátozza a RIG-I jelátvitelt. Elülső. Immunol. 11, 51.

Li, C., Deng, YQ, Wang, S., Ma, F., Aliyari, R., Huang, XY, Zhang, NN, Watanabe, M., Dong, HL, Liu, P., Li, XF, Ye, Q., Tian, ​​M., Hong, S., Fan, J., Zhao, H., Li, L., Vishlaghi, N., Buth, JE, Au, C., Liu, Y., Lu , N., Du, P., Qin, FX, Zhang, B., Gong, D., Dai, X., Sun, R., Novitch, BG, Xu, Z., Qin, CF, Cheng, G. , 2017. 25- A hidroxikoleszterin egérmodellben védi a gazdaszervezetet a Zika-vírus fertőzéssel és a kapcsolódó mikrokefáliával szemben. Immunity 46, 446–456.

Liu, CI, Liu, GY, Song, Y., Yin, F., Hensler, ME, Jeng, WY, Nizet, V., Wang, AH, Oldfield, E., 2008. A koleszterin bioszintézis-gátló blokkolja a Staphylococcus aureus virulenciáját . Tudomány 319, 1391–1394.

Liu, SY, Aliyari, R., Chikere, K., Li, G., Marsden, MD, Smith, JK, Pernet, O., Guo, H., Nusbaum, R., Zack, JA, Freiberg, AN, Su, L., Lee, B., Cheng, G., 2013. Interferonnal indukálható koleszterin-25-hidroxiláz széles körben gátolja a vírus bejutását a 25- 25-hidroxikoleszterin termelésével. Immunity 38, 92–105.

Luo, J., Yang, H., Song, BL, 2020. A koleszterin homeosztázis mechanizmusai és szabályozása. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 21, 225–245.

Luu, W., Hart-Smith, G., Sharpe, LJ, Brown, AJ, 2015. A koleszterinszintézis terminális enzimei, a DHCR24 és a DHCR7 fizikailag és funkcionálisan kölcsönhatásba lépnek. J. Lipid Res. 56, 888–897.

Ma, J., Ketkar, H., Geng, T., Lo, E., Wang, L., Xi, J., Sun, Q., Zhu, Z., Cui, Y., Yang, L., Wang, P., 2018. A Zika vírus nem strukturális fehérje 4A blokkolja az RLR-MAVS jelátvitelt. Elülső. Microbiol. 9, 1350. Moebius, FF, Fitzky, BU, Lee, JN, Paik, YK, Glossmann, H., 1998.

Az emberi delta{0}}szterin-reduktáz molekuláris klónozása és expressziója. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 1899–1902.

Munoz-Jordan, JL, Laurent-Rolle, M., Ashour, J., Martinez-Sobrido, L., Ashok, M., Lipkin, WI, Garcia-Sastre, A., 2005. Inhibition of alfa/beta interferon signaling a flavivírusok NS4B fehérjéje által. J. Virol. 79, 8004–8013.

Munoz-Jordan, JL, Sanchez-Burgos, GG, Laurent-Rolle, M., Garcia-Sastre, A., 2003. Inhibition of interferon signaling by dengue virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 14333–14338.

Petersen, J., Drake, MJ, Bruce, EA, Riblett, AM, Didigu, CA, Wilen, CB, Malani, N., Male, F., Lee, FH, Bushman, FD, Cherry, S., Doms, RW, Bates, P., Briley Jr., K., 2014. Az Andok vírusfertőzéséhez a fő celluláris szterol szabályozó útvonalra van szükség. PLoS Pathog. 10, e1003911.

Pierson, TC, Diamond, MS, 2020. A feltörekvő flavivírusok folyamatos veszélye. Nat. Microbiol. 5, 796–812. Prabhu, AV, Luu, W., Li, D., Sharpe, LJ, Brown, AJ, 2016a. DHCR7: létfontosságú enzimváltás a koleszterin és a D-vitamin termelése között. Prog. Lipid Res. 64, 138–151.

Prabhu, AV, Luu, W., Sharpe, LJ, Brown, AJ, 2016b. A 7-dehidrokoleszterin-reduktáz koleszterin által közvetített lebomlása átállítja az egyensúlyt a koleszterinről a D-vitamin szintézisére. J. Biol. Chem. 291, 8363–8373. Randall, G., 2018. Lipidcseppek metabolizmusa dengue-vírus fertőzés során. Trends Microbiol. 26, 640–642.

Rasmussen, SA, Jamieson, DJ, Honein, MA, Petersen, LR, 2016. Zika-vírus és születési rendellenességek – az ok-okozati összefüggésre vonatkozó bizonyítékok áttekintése. N. Engl. J. Med. 374, 1981–1987.

Reboldi, A., Dang, EV, McDonald, JG, Liang, G., Russell, DW, Cyster, JG, 2014. Gyulladás. 25-A hidroxikoleszterin elnyomja az interleukin-1-vezérelt gyulladást az I. típusú interferon után. Tudomány 345, 679–684.

Riedl, W., Acharya, D., Lee, JH, Liu, G., Sherman, T., Chiang, C., Chan, YK, Diamond, MS, Gack, MU, 2019. Zika virus NS3 utánozza a sejtet { {2}}kötő motívum a RIG-I- és MDA-{5}}közvetített veleszületett immunitás antagonizálására. Cell Host Microbe 26, 493–503 e496.

Rodgers, MA, Villareal, VA, Schaefer, EA, Peng, LF, Corey, KE, Chung, RT, Yang, PL, 2012. A lipid metabolit profilalkotás a dezmoszterol metabolizmust azonosítja a hepatitis C vírus új antivirális célpontjaként. J. Am. Chem. Soc. 134, 6896–6899. Savidis, G., Perreira, JM, Portmann, JM, Meraner, P., Guo, Z., Green, S., Brass, AL, 2016. Az IFITM-ek gátolják a Zika-vírus replikációját. Cell Rep. 15, 2323–2330.

Schneider, WM, Chevillotte, MD, Rice, CM, 2014. Interferon-stimulált gének: a gazdaszervezetek védelmének összetett hálója. Annu. Rev. Immunol. 32, 513–545.