13-hetes szubkrónikus toxicitási vizsgálat 2-(l-mentoxi)etanol F344 patkányokon

Absztrakt: Az 2-(l-mentoxi)etanolt gyakran alkalmazzák ízesítőszerként; az 2-(l-mentoxi)etanol toxicitására vonatkozó adatok azonban továbbra is korlátozottak. Egy 13-hetet teljesítettünkszubkrónikus toxicitás{{0}}(l-mentoxi)etanol vizsgálata hím és nőstény F344 patkányokon, 0, 15, 60 vagy 250 mg/ttkg/nap dózisokkal, szájon át, szondán keresztül beadva. kukoricaolaj, mint jármű. Egyik csoportban sem figyeltek meg jelentős toxikológiai változásokat az általános állapotban, a testtömegben vagy a táplálékfelvételben. A hematológiai vizsgálat kimutattacsökkent hemoglobin,hematokrit, az átlagos corpuscularis térfogat, valamint az átlagos corpuscularis hemoglobin és a megnövekedett vérlemezkeszám a 250 mg/kg-os férfi csoportban.Szérum biokémiakiderültemelkedett összkoleszterinszinta 250 mg/kg-os hím és nőstény patkányok csoportjában csökkent a triglicerid a nőstény 250 mg/kg-os csoportban, és megnövekedett összfehérje a hím 250 mg/kg-os csoportban, ami alipid anyagcsereésprotein szintézis. A szervek súlyát tekintve a máj és a mellékvesék abszolút és relatív tömege mindkét nemnél megemelkedett a 250 mg/kg-os csoportban, a férfi 250 mg/kg-os csoportban. A kórszövettani elemzés kimutattakrónikus nephropathiaa férfiaknál 15 mg/kg vagy nagyobb csoportokban, megnövekedett abszolút és relatív vesetömeggel, valamint emelkedett szérum kreatininszinttel, a férfiak 60 és 250 mg/kg-os csoportjaiban. A proximális tubulusokban azonban 2u-globulint tartalmazó eozinofil granulátumokat azonosítottak, ami a hím patkányokra specifikus, toxikológiai jelentőséggel nem rendelkező 2u-globulin nephropathiára utal. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy az 2-(l-metoxi)-etanol megfigyelhető káros hatású szintje 60 mg/ttkg/nap volt mindkét nemnél. (DOI: 10.1293/tox.{15}}; J Toxicol Pathol 2021; 34:309–317)

Kulcsszavak: 2-(l-mentoxi)etanol, 2-l-mentoxietanol, élelmiszer-adalékanyag, aroma, Fischer-patkány, mentol

Cistanche kiegészítő vesefunkciót támogató kiegészítő PhGs75% Ech 30% Act 12%

Bevezetés

Az {{0}}(l-mentoxi)etanol (CAS-szám: 38618-23-4) tiszta és színtelen folyadék, jellegzetes szaggal, és széles körben használják ízesítőszerként. A FAO/WHO Élelmiszer-adalékanyagokkal foglalkozó Közös Szakértői Bizottsága (JECFA) az 2-(l-mentoxi)etanolt ízesítőanyagként értékelte, amely a mentollal szerkezetileg rokon anyagok közé sorolható1. Az aromaanyagok szerkezeti osztálya alapján az 2-(l-mentoxi)etanolt az I. osztályba sorolták be. Az Egyesült Államokban és Európában az 2-(l-mentoxi)etanol ember általi beviteli szintje becslések szerint 12 ug/fő/nap, illetve 0,01 ug/fő/nap, mindkettő az 1.800 ug/fő/nap I. osztályú küszöbérték alatt volt. E becslések alapján úgy ítélték meg, hogy az 2-(l-mentoxi)etanol nem jelenthet biztonsági aggályokat ízesítőszerként történő rutinhasználat során.

As part of the risk assessment, it has been revealed that 2-(l-menthoxy)ethanol was not mutagenic in the Ames test, and the only in vivo study performed to date was an oral acute toxicity study in male and female rats (LD50: >2,000 mg/testtömeg-kg [BW])1. Annak ellenére, hogy az 2-(l-men thoxi)-etanolt ízesítőszerként használják, korlátozott mennyiségű adat áll rendelkezésre ennek a vegyületnek az ismételt dózisú toxicitásával kapcsolatban. Laboratóriumunk számos élelmiszer-adalékanyag toxicitását vizsgálta, beleértve az egyes kategóriákból reprezentatív ízesítőanyagokat is, rágcsálómodelleken2–7. A toxikológiai profil tisztázása és a nem megfigyelhető káros hatások szintje (NOAEL) megállapítása érdekében 13-hetes szubkrónikus toxicitási vizsgálatot végeztünk az 2-(l-mentoxi)etanollal, amelyet szájon át adtunk be F344 patkányok szondával.

Anyagok és metódusok

Vizsgálati vegyszer

2-(l-mentoxi)etanol (5I0002. tételszám, tisztaság 99,9%), a Takasago Int. A Corp.-t (Tokió, Japán) a Japán Egészségügyi, Munkaügyi és Jóléti Minisztérium Élelmiszerbiztonsági Minisztériumának Szabványügyi és Értékelési Osztálya biztosította a Japan Flavor & Fragrance Materials Association (Tokió, Japán) támogatásával. Bár a vizsgált anyagot optikai izomerek keverékeként szállították (CAS-szám: 38618-23-4), a gyártó l-enantiomerként (CAS-szám: 75443-64-0) ​​erősítette meg. A beadás módjaként kukoricaolajjal (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japán) használt orális szondát választották az 2-(l-mentoxi)-etanol vízben való oldhatatlansága és illékonysága miatt. Az 2-(l-mentoxi)etanol oldatait naponta, közvetlenül a beadás előtt készítettük el. 2 órás szobahőmérsékleten történő tárolás után az 2-(l-mentoxi)-etanol 4, 40 és 400 mg/ml oldatában 96,8%, 99,8% és 96,5% 96,5% volt. gázkromatográfiával (Japan Inspection Association of Food and Food Industry Environment, Tokió, Japán).

Kísérleti állatok

Összesen 40 hím és 40 nőstény specifikus kórokozómentes patkányt (F344/DuCrlCrlj, 5-hetesek) vásároltunk a Charles River Laboratories Japantól (Yokohama, Japán), és egy hétig alkalmaztuk őket akklimatizálás után. A vizsgálat során az állatokat polikarbonát ketrecekben helyezték el puha forgácsalmával, és olyan helyiségben tartották, ahol akadályrendszerrel szabályozták a fény/sötét ciklust (12 óra), szellőztetést (18-szoros/óra levegőcsere sebesség), hőmérsékletet ( 24 ± 1 fok), és a relatív páratartalom (55 ± 5%). Hetente kétszer cserélték a ketreceket és a chips ágyneműt. Minden állat szabadon hozzáférhetett a csapvízhez és az alaptakarmányhoz (CRF-1; Oriental Yeast, Tokió, Japán). A kísérlet elején az állatokat véletlenszerűen négy, egyenként 10 hím és nőstény patkányból álló csoportba osztották, közvetlenül a vizsgált vegyi anyaggal való kezelés megkezdése előtt mért testtömeg alapján.

Dizájnt tanulni

Egy előzetes {{0}}napos vizsgálatban, amelyben az 2-(l-mentoxi)-etanolt 0, 200, 400 és 800 mg/ttkg/nap dózisban értékelték, abszolút és a máj relatív súlya szignifikánsan megnőtt mindkét nem valamennyi kezelt csoportjában (az adatokat nem mutatjuk be). Ezen eredmények alapján a jelenlegi 13- hím és nőstény patkányoknak egyaránt 0, 15, 60 és 250 mg/ttkg/nap 2-(l-mentoxi)-etanolt választottunk. heti toxicitási vizsgálat

Az általános állapotokat és a mortalitást naponta értékelték. A testtömegeket, valamint a bevitt és a maradék étrend mennyiségét a kísérleti időszakban hetente egyszer mértük. Valamennyi patkányt egy éjszakán át éheztettünk a kezelés befejezése után, és vérmintákat vettünk hematológiai és szérumbiokémia céljából a hasi aortából mély inhalációs érzéstelenítésben, izoflurán alkalmazásával. A vizsgálat terve összhangban volt a japán élelmiszer-adalékanyagok kijelölésére és az élelmiszer-adalékanyagok használatára vonatkozó szabványok felülvizsgálatára vonatkozó iránymutatásokkal (1996), és jóváhagyta a japán Nemzeti Egészségtudományi Intézet Állatgondozási és Felhasználási Bizottsága.

Hematológia és szérumbiokémia

A következő hematológiai paramétereket elemeztük ProCyte Dx automatikus hematológiai analizátorokkal (IDEXX Laboratories, Westbrook, ME, USA): fehérvérsejtszám (WBC), vörösvérsejtszám (RBC), hemoglobin koncentráció (HGB), hematokrit (HCT), átlagos corpuscularis térfogat (MCV), átlagos corpuscularis hemoglobin (MCH), átlagos corpuscularis hemoglobin-koncentráció (MCHC), vérlemezkeszám (PLT) és differenciális leukocitasejtek, beleértve a neutrofileket (Neut), limfocitákat (limfát), monocitákat (Mono), eozinofileket (Eozino) és bazofilek (Baso). A szérum biokémiai analízisét Oriental Yeast végezte a következő paraméterekre: összfehérje (TP), albumin (Alb), albumin/globulin arány (A/G), összbilirubin (Bil), glükóz, összkoleszterin (T-Chol), triglicerid (TG), karbamid-nitrogén (BUN), kreatinin (Cre), kalcium (Ca), szervetlen foszfor (IP), nátrium (Na), kálium (K), klór (Cl), aszpartát aminotranszferáz (AST), alanin aminotranszferáz (ALT), alkalikus foszfatáz (ALP) és -glutamil-transzpeptidáz (-GTP).

A szervek súlya és kórszövettani értékelése

Minden állaton teljes boncolást végeztünk, és lemértük az agyat, a csecsemőmirigyet, a tüdőt, a szívet, a lépet, a májat, a mellékveséket, a veséket, a heréket és a petefészkeket. Ezek a szervek, valamint a gerincvelő, a trigeminus, az agyalapi mirigy, az orrüreg, a nyálmirigyek, a nyelv, a nyelőcső, a légcső, az aorta, a pajzsmirigy, a mellékpajzsmirigy, a hasnyálmirigy, a gyomor, a vékony- és vastagbél, a submandibularis és a mesenterialis szövetek a nyirokcsomókat, a hüvelyt, a méhet, a húgyhólyagot, a prosztata mirigyet, az ondóhólyagokat, a mellékhereet, a combcsontot és a szegycsontot csontvelővel, csigolyákat, vázizmokat, ülőidegeket, bőrt és emlőmirigyet 10%-os semleges pufferolt formalinban rögzítettük; majd paraffinba ágyazott metszeteket készítettünk és hematoxilinnel és eozinnal megfestettük a kórszövettani vizsgálathoz. A heréket és a Harder-féle mirigyekkel ellátott szemeket Bouin fixálójában, illetve Davidson oldatában rögzítettük. A csontszöveteket, beleértve az orrüreget, a csigolyákat, a szegycsontot és a combcsontot, vízkőtelenítettük 10% hangyasav és 10% pufferolt formalin keverékével legfeljebb 2 hétig. A kórszövettani értékelést a kontrollcsoport állataiból nyert összes szövet esetében elvégezték, és a csoport kapta a legmagasabb dózist, kivéve, ha kezeléssel összefüggő elváltozásokat észleltek.

A 2u-globulin immunhisztokémiája

Hím patkányokban a 2u-globulin vesében való felhalmozódását paraffinba ágyazott metszetek immunhisztokémiai elemzésével vizsgáltuk. Az antigén-kinyeréshez az egyes csoportokban 5 patkányból nyert metszeteket proteináz K-val (DAKO, Glostrup, Dánia) inkubáltuk 1 percig szobahőmérsékleten. Minden metszetet 3%-os H2O2/metanol oldatba merítettünk 10 percre szobahőmérsékleten, hogy inaktiváljuk az endogén peroxidáz aktivitást. A nem specifikus reakciók 10%-os normál nyúlszérummal való blokkolása után a metszeteket 2u-globulin primer antitesttel (1:400 arányban hígítva; anti-patkány 2u-globulin antitest; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) egy éjszakán át 4 fokon inkubáltuk. 8. Az antitest kötődés vizualizálását Vecta Stain Elite ABC Kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) és 3,3'-diaminobenzidin segítségével végeztük. Minden metszetet hematoxilinnel ellenfestünk.

Statisztikai analízis

A kísérleti időszak során a testtömegre, valamint a hematológiára, a szérum biokémiára és a szervek tömegére vonatkozó adatértékek eltéréseit a homogenitás szempontjából Bartlett-teszttel értékelték. A homogén és heterogén adatokhoz egyirányú varianciaanalízist, illetve Kruskal-Wallis tesztet alkalmaztunk. A statisztikailag szignifikáns különbségek meghatározásához Dunnett többszörös összehasonlító tesztjét alkalmaztuk a kontroll és a kezelt csoportok összehasonlítására. A kórszövettani előfordulások és fokozatok összehasonlítását Fisher pontos valószínűségi teszttel, illetve Mann-Whitney U-teszttel elemeztük. P értékei<0.05 were considered statistically significant.