A hipoxia által indukálható faktor megkülönböztető megoszlása-1 tenyésztett vesetubuláris sejtekben, fedőlemez elhelyezésével szimulált hipoperfúzióval

Kapcsolatfelvétel: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Tomoko Honda¹| Yosuke Hirakawa¹ | Kiichi Mizukami²| Toshitada Yoshihara²| Tetsuhiro Tanaka¹| Seiji Tobita²| Masaomi Nangaku

Absztrakt

A vese tubulointerstitium krónikus hipoxiája kulcsszerepet játszik a krónikus betegségek progressziójábanvesebetegség(CKD). Ezért fontos a tubuláris hypoxia és a hipoxia-indukálható faktor (HIF)-1 aktivitásának vizsgálata a hipoxiára adott válaszként. A peritubuláris kapilláris ritkasága hypoperfúziót okoz CKD-ben; a hipoperfúzió HIF-ekre gyakorolt ​​hatását azonban ritkán vizsgálták. Emberben fedőlemez elhelyezése okozta hipoperfúziót indukáltukvese-2 sejtet, és oxigén gradienst figyeltek meg a fedőlemez alatt. A HIF-1 immuncitokémiája fánk alakú képződményt mutatott egy pimonidazol-pozitív terület szélén, amelyet "HIF-gyűrűnek" neveztünk el. A HIF-gyűrű oxigénfeszültségét körülbelül 4 Hgmm és 20 Hgmm közé becsülték. Ez az eredmény nem volt összeegyeztethető a korábbi kutatások eredményeivel, amelyek a HIF-1 felhalmozódását mutatták ki az anoxikus tartományban homogén oxigénfeszültség mellett. Megfigyeltük továbbá a pH-gradiens jelenlétét fedőlemez alatt, valamint a HIF gyűrű eltolódását a táptalaj pH-jának változásai miatt, ami arra utal, hogy a HIF gyűrű a HIF-1 elnyomásával jött létre. alacsony pH-ra. Ez a kutatás kimutatta, hogy a HIF{10}} aktiválása utánozza a fiziológiás állapotot hipoperfúzióval rendelkező tenyésztett sejtekben.

KULCSSZAVAKhipoperfúzió, hipoxia, hipoxia-indukálható faktor, oxigén gradiens, pH

Cistanche herbamegelőzi a vesebetegséget, kattintson ide a mintaért

1|BEVEZETÉS

A krónikus betegségek előfordulásavesebetegség(CKD) növekszik világszerte a társadalmak öregedésével (Tonelli és Riella, 2014). A CKD progressziója visszafordíthatatlan, ha a vesekárosodás elér egy bizonyos mértéket, és végül végstádiumú vesebetegséget (ESRD) eredményez, függetlenül az alapbetegségtől. Ez az eredmény egy „végső közös út” létezését jelzi. Korábbi patológiai elemzések szerint a vesefunkció csökkenése erősebben korrelál a tubulointerstitialis károsodással, mint a glomeruláris károsodással. Számos jelentés bizonyítja, hogy a vesefibrózis krónikus hipoxiát indukál a tubulointerstitiumban, és ez a tubulointerstitialis hipoxia súlyosbítja a CKD-t és ESRD-hez vezet. Ezek a bizonyítékok arra utalnak, hogy a tubulointersticiális hipoxia szerepet játszik a CKD végső közös útjában (Mimura és Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). Azvesenagyon érzékeny a hipoxiára, mivel nagy oxigénigénye van, és az intrarenális artériák és vénák között oxigénsönt van (Nangaku, 2006; Welch és mtsai, 2001; Zhang és mtsai, 2014). Ezért úgy gondoljuk, hogy elengedhetetlen a hypoxia és a hypoxiára adott válasz vizsgálata a vese tubulointerstitiumban.

Az élő szervezetekben a hipoxiára adott elsődleges biológiai válasz a hipoxia-indukálható faktor (HIF) útvonalon keresztül történik (Hypoxia, 2011; Semenza és Wang, 1992; Zhou és mtsai, 2003). A HIF - és -alegységekből áll. Bár az -alegység konstitutívan aktív, az -alegység oxigén jelenlétében lebomlik. Normoxikus körülmények között a HIF-t a prolil-hidroxiláz domén (Ph.D.) hidroxilezi, így a von Hippel–Lindau tumorszuppresszor (VHL) felismeri. Ez a felismerés a hidroxilált HIF- ubikvitinációját és lebomlását eredményezi a proteaszómában. Hipoxiás körülmények között a HIF- felhalmozódik a citoszolban, mivel a nem hidroxilált HIF- elkerüli a lebomlást. Az akkumulált HIF- a citoszolból a sejtmagba transzlokálódik, ahol a HIF-vel dimerizálódik, és transzkripciós faktorként működik, elősegítve a downstream gének expresszióját. A HIF-alegységek három azonosított izoformája közül – HIF-1, HIF-2 és HIF-3 – ismert, hogy a vese tubuláris epiteliális sejtjei expresszálják a HIF-1-ot (Tanaka et al. ., 2016). Korábbi tanulmányok a HIF átmeneti vagy regionális felhalmozódását mutatták kiveseCKD-vel (Goldfarb és mtsai, 2006; Yu és mtsai, 2012), és ez a HIF a CKD-környezetben a csökkent oxigénfeszültségben aktiválódik. A CKD-ben a hipoxiához való helytelen alkalmazkodást a HIF-pályákat elnyomó tényezők jelenléte okozhatja (Asai et al., 2016; Tanaka et al., 2013; Thangarajah et al., 2009). A HIF aktiválásának védő hatásait számos állatmodellben számolták be, beleértve a streptozotocinnal indukált diabéteszes patkányokat és az 5/6-os nefrektómiás patkányokat (Deng et al., 2010; Nordquist és mtsai, 2015). Ph.D. Az inhibitorok a közelmúltban felkeltették a figyelmet a vese anémiájának új terápiás megközelítéseiként krónikus vesebetegségben szenvedő betegeknél (Akizawa et al., 2019; Chen et al., 2017, 2019; Coyne és mtsai, 2017; Miyata és mtsai, 2011; Pergola et al. ., 2016; Provenzano et al., 2016). Azonban a vese hipoxia progressziójának részletei és a HIF felhalmozódás módja aveseCKD esetén homályos marad. A HIF- oxigénfüggő hidroxilációja a citoszolban megy végbe, ezért fontos az intracelluláris és extracelluláris oxigénfeszültség mérése. Az oxigénfeszültség mérésére számos módszert alkalmaznak, beleértve a mikroelektródák vagy a vér oxigénszint-függő mágneses rezonancia képalkotását (BOLD-MRI). Az intracelluláris oxigénállapot kvantitatív mérésére foszforeszcens élettartam képalkotó mikroszkópiát (PLIM) alkalmaztunk (Hirakawa és mtsai, 2017; Yoshihara és mtsai, 2015). A BTPDM1 egy foszforeszkáló festék, amely az irídium (III) komplex BTP, (bp)2Ir(acc) (bp=benzoát-piridin, aac=acetil-aceton) alapú kationos dimetil-amino-csoporttal, amely passzív. intracelluláris lizoszómákban oszlik el. Foszfo-új szondaként szintetizálták az intracelluláris oxigénnyomás mérésére (Yoshihara et al., 2015). A BTPDM1-gyel ellátott PLIM lehetővé tette a normál egerek vesefelületén lévő vesetubuláris sejtekben lévő oxigén parciális nyomásának nagy felbontású képeinek beszerzését, amelyek oxigéngradiens jelenlétére utalnak még normál vesékben is (Hirakawa et al., 2018). ).

Az élő szervekben oxigéngradiensek vannak, beleértvevese, még normál körülmények között is (Hirakawa et al., 2018; Kietzmann, 2017; Zhdanov et al., 2015), és ezért ilyen gradiensekre lehet számítani a CKD-ben is. A hypoperfúziót a mikrovaszkulatúra megritkulása okozza CKD-ben, amelyben a progresszív glomeruláris károsodás a peritubuláris kapilláris véráramlás csökkenését eredményezi, súlyosbítva az intersticiális fibrózist. Az intersticiális fibrózis rontja a tubuláris sejtek diffúzióját és oxigénellátását, és a mikrovaszkulatúra megritkulásához vezet, tovább súlyosbítva a tubulointerstitialis hipoxiát (Mimura és Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). A hipoperfúzió biológiai hatásai azonban továbbra is homályosak, mivel a legtöbb tanulmány a hipoxia és a HIF-1 tenyésztett sejtekre gyakorolt ​​hatásait vizsgálta homogén perfúzió és oxigénfeszültség mellett (Rexius-Hall et al., 2017). Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a fedőlemezzel borított egyrétegű tenyésztett sejtek jó modellt adnak a tápközegben a diffúzió gátja által kiváltott hipoperfúziónak. A modellezett hipoperfúzió oxigéngradienshez kapcsolódik, mivel a fedőlemez megakadályozza az oxigén diffúzióját a táptalaj tetejéről a sejtek felé (Pitts & Toombs, 2004; Takahashi és Sato, 2010; Yoshihara és mtsai, 2015). A tenyésztett sejtek fedőlemezzel borított monorétegében az intracelluláris oxigénfeszültség a fedőlemez szélétől mért távolsággal csökken a tenyésztett sejtekbe történő korlátozott oxigén diffúzió miatt. Ennek eredményeként oxigéngradiens alakul ki a fedőlemez szélétől a közepéig, és az intracelluláris oxigénfeszültség a fedőlemez közepén egy anoxikus tartományba csökkenhet (Takahashi és Sato, 2010; Yoshihara et al., 2015) . Jelen tanulmányunkban a HIF aktivációra összpontosítottunk, és azt vizsgáltuk, hogy van-e oxigénfüggetlen változás a HIF-expresszióban oxigéngradienses hipoperfúzió jelenlétében. Mivel a vesetubulusokban in vivo oxigéngradienses hipoperfúzió létezik, a HIF-expresszióra gyakorolt ​​oxigén-független hatások megfigyelése a fedőlemez-modellben betekintést nyújthat a krónikus vesebetegségben a HIF-felhalmozódás elégtelenségének hátterében álló mechanizmusba.

cistanche kivonatvesére

2|ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

2.1|Sejttenyésztés

A tenyésztett sejteket párásított inkubátorban inkubáltuk 5% CO2-tartalommal. A hipoxiás inkubációt egy személyes CO2/multi-gas APM-30D (Astec) inkubátorban végeztük. Az anoxiát anoxiazsákkal, AnaeroPack-kel és #A-13 (Mitsubishi Gas Chemical) anaerob tenyésztőkészlettel váltottuk ki.

HK-2 sejtek (Homo sapiens, emberivese, hím, CRL- 2190, ATCC, RRID: CVCL_0302), egy normális felnőtt emberi veséből származó, immortalizált proximális tubulus epiteliális sejtvonalat, Dulbecco módosított Eagle táptalaj/tápanyag keverékében, F{{2} tenyésztettük. } Sonka (DMEM/F12) (D8062, Sigma Aldrich), amely 10% borjúmagzati szérumot (FBS) (F7524, Sigma Aldrich) és penicillin-sztreptomicin oldatot (15070063, Thermo Fisher Scientific) tartalmaz egy 10 cm-es tenyészedényben. Az átoltáshoz a HK-2 sejteket tripszinnel (204-16935, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) disszociáltuk, és 300 g-vel 5 percig centrifugáltuk.

HeLa méhnyakrák sejtek és emberi embrionálisveseA 293-as sejteket (HEK293) DMEM-ben tenyésztettük alacsony (1000 mg/l) glükózzal (D6046, Sigma Aldrich), amely 5% FBS-t tartalmazott, 10 cm-es tenyésztőedényben. Ezeket a sejteket HK-2 sejtként passzáltuk.

A vese proximális tubulus epiteliális sejtjeit (RPTEC) (CC- 2553, Cambrex) RenaLifeTM Comp kittel (LRC-LL0025, Lonza Ltd.) tartottuk fenn. Az átoltáshoz az RPTEC-eket tripszinnel disszociáltuk, tripszin neutralizáló oldattal (CC-5002, Lonza Ltd.) semlegesítettük, és 200 g-vel 5 percig centrifugáltuk.

2.2|Hipoperfúziós modell felállítása fedőlemez elhelyezéssel

A kerek alakú, 15 mm átmérőjű fedőlemezeket (C015001, Matsunami) ultrahanggal tisztítottuk, és használat előtt 99,5 százalékos etanolban tároltuk. Két módszert alkalmaztunk a fedőlemezen kívüli sejtek megfigyelésén alapulva.

Az egyrétegű tenyésztett sejteket egy fedőlemez és egy edény alja közé helyeztük (S1a, b ábra), vagy egy alternatív módszert (S1c ábra), az alábbiakban leírtak szerint. Akár a hagyományos, akár az alternatív módszert választottuk az élőképalkotás fedőlemez-modelljének elkészítéséhez, legyen az oxigén vagy PH képalkotás. Az immuncitokémiához (ICC) az alternatív módszert választottuk, mivel a hagyományos módszer alkalmazásakor a sejtek többsége gyakran levált az edény aljáról a fedőlemez eltávolításakor a sejtrögzítés céljából (S2a ábra).

2.2.1|Hagyományos módszer

Az 1. napon a sejteket egy 27 mm-es üvegalapú edény (3910-035, Iwaki) aljára helyeztük 100 százalékos összefolyással* (körülbelül 5,0 × 105/tál). Egy éjszakán át 10% FBS-t tartalmazó DMEM/F12-ben tenyésztettük antibiotikum-oldat nélkül. A 2. napon fedőlemezt helyeztünk a tenyésztett sejtekre a jelzett időtartamra (S1b ábra).

2.2.2|Alternatív módszer

A sejteket fedőlemezre oltottuk egy 35 mm-es tenyésztőedénybe 100 százalékos összefolyás mellett (körülbelül 5,0 × 105/tál) a napon.

1. Egy éjszakán át 10% FBS-t tartalmazó DMEM/F12-ben tenyésztettük antibiotikumos oldat nélkül. A 2. napon a fedőlemezt megfordították, hogy sejtjei felületét egy új, 27 mm-es üvegalapú edény aljához erősítsék egy meghatározott ideig (S1c ábra).

Létrehoztunk egy fedőlemez-modellt is kerek alakú, 10 mm átmérőjű fedőlemezek felhasználásával (CS01005, Matsunami) (S2b ábra).

2,3|Élő oxigén képalkotás BTPDM1-gyel

A tenyésztett sejteket az 1. napon készítettük elő a fent leírtak szerint. A 2. napon a sejteket kétszer öblítettük Hanks kiegyensúlyozott sóoldattal (HBSS) (H8264, Sigma Aldrich), és inkubáltuk 500 nM BTPDM1-gyel, egy irídium alapú kationos lipofil festékkel, amelyet intracelluláris foszforeszkáló szondaként használnak (Yoshihara et al. 2015), DMEM/F12-ben fenolvörös nélkül (21041-025, Thermo Fisher Scientific) 30 percig. Miután a sejteket kétszer mostuk HBSS-sel, a fedőlemez és az edény alja közé helyeztük őket a fent leírtak szerint. A fedőlemezzel letakart tenyésztett sejtekben a BTPDM1 foszforeszcenciájának intenzitását gerjesztő és emissziós szűrővel, a BTPDM1 foszforeszcenciáját (Hirakawa et al., 2015) pedig BZ-X710 (Keyence Corporation) fluoreszcens mikroszkóppal detektáltuk. Az invertált fluoreszcens mikroszkópból kapott képeket a BZ-X elemzőszoftver segítségével beállítottuk a fényerő és a kontraszt tekintetében.

2,4|Immuncitokémia

A fedőlemezen lévő sejteket 200 µM pimonidazol-HCl-lel (HP3-100, Hypoxyprobe, Inc.) DMEM/F12-ben fenolvörös nélkül tenyésztettük 1 órán át, majd a fedőlemezt megforgattuk és egy fedőüveg edényhez rögzítettük. korábban leírták. A sejteket ezután DMEM/F12-ben tenyésztettük fenolvörös nélkül egy meghatározott ideig. Ha nem alkalmaztunk pimonidazol ellenfestést, a pimonidazollal végzett előkezelést elhagytuk.

A tenyésztési periódus befejeztével minden fedőlemezt összegyűjtöttünk, és a sejteket azonnal fixáltuk metanol/aceton (1:1) eleggyel jégen, ahol 30 percig maradtak. Dulbecco foszfátpufferes sóoldattal (PBS) (D5652, Sigma Aldrich) történő kétszeri mosás után a sejtmembránt 30 percig permeabilizáltuk, 5 százalékos szarvasmarha szérumalbuminnal (BSA) (A3059, Sigma Aldrich) 30 percig inkubáltuk, majd ezt követően. szérummentes protein blokkal (X0909, DAKO) 10 percig. A sejteket egy első antitesttel, majd egy második, fluoreszcens antitesttel festettük. Az első antitestek listája az S1 táblázatban található. FITC-sertés poliklonális anti-nyúl immunglobulint (F0205, 1:20 hígítás, DAKO) alkalmaztunk első antitestként, ha a gazda nyúl volt. Az Alexa Fluor 594 sztreptavidin fluoreszcens antitestet (S11227, 1:500 hígítás, Thermo Fisher Scientific) használták első antitestként, ha a gazdaszervezet egér volt, ezt követte a biotinilált anti-egér IgG (H plus L) (BA{{23} }, 1:1000 hígítás, Vector Laboratories), mint második antitest. A magfestést minden mintánál biszBenzimide H 33342 trihidrokloriddal (B2261, Sigma Aldrich) végeztük.

A fluoreszcens jeleket fordított fluoreszcens mikroszkóp, BZ-X710 (Keyence Corporation) segítségével figyeltük meg a következő szűrőkkel: Texas Red 560/40 nm gerjesztési hullámhosszal (Ex), emissziós hullámhossz (Em) 630/75 nm, GFP ( Például: 470/40 nm, Em: 525/50 nm) és DAPI (pl.: 360/40 nm, Em: 460/50 nm). A képek fényerejét és kontrasztját BZ-X elemző szoftverrel állítottuk be.

2,5|Kobalt-kloriddal kezelt HK-2 sejtek HIF-jének ICC-je

Az alternatív módszert módosították a kobalt-kloriddal kezelt HK-2 sejtek fedőlemez-modelljének előállítására. A HK-2 sejteket félig összefolyó sűrűséggel (2,5 × 105/tál) fedőlemezre oltottuk az 1. napon, és 300 µM kobalt-klorid-hexahidráttal (C 8661, Sigma Aldrich) kezeltük 16 órán keresztül. 2. nap. A 3. napon a fedőlemezt megfordítottuk, hogy a sejtfelületeket egy új, 27 mm-es üvegalapú edény aljához erősítsék 3 órára, és elvégezzük a HIF ICC-t.

2,6|Western blot

A HIF{{0}} felhalmozódásának vizsgálatához különböző oxigénfeszültségek és különböző pH-értékek mellett 1.0 × 106 HK-2 sejt 10 cm-es tenyészedényenként Normoxia, 2% oxigén, 1% oxigén vagy anoxia alatt 5 órán át, vagy DMEM/F12-ben 7,4, pH 6,0 vagy pH 5,0 mellett 5 órán át inkubáltuk.

Ezeket a sejteket 50 mM Tris-puffert (pH 8.{5}}), 150 mM NaCl-t, 0,5 tömeg/térfogat% nátriumot tartalmazó RIPA pufferben lizáltuk. dezoxi-kolát, 0,1 tömeg/térfogat százalék SDS és 1,0 tömeg/térfogat százalék NP40.

Western-blothoz SDS mintapuffer, amely {{0}},35 M Tris-HCl-t (pH 6,8), 10% SDS-t, 36% glicerint, 0,012% brómfenolkéket és 0,1 M ditiotreitot tartalmaz. (DTT) adtuk a fehérjékhez. Az SDS mintapuffert tartalmazó fehérjéket 95 fokos forralással 5 percig eluáltuk.

A fehérjéket elektroforézissel választottuk el 10 százalékos SDS poliakrilamid gélen. A fehérjéket ezután AmershamTM HybondTM PVDF membránra (10600023, GE Healthcare) vittük át transzferpufferben (48 mM Tris-bázis puffer, 39 mM glicin, 0,04% SDS és 20 v/v% metanol) Trans-Blot® segítségével. TurboTM átviteli rendszer (Bio-Rad). A membránokat szobahőmérsékleten elsődleges antitestekkel, anti-HIF1 antitesttel (NB100-134, 1:500 hígítás, Novus Biologicals, RRID: AB_350071) és anti-aktin antitesttel (A2066) inkubáltuk. , 1:2000 hígítás, Sigma Aldrich, RRID: AB_476693), majd a másodlagos antitestben poliklonális kecske anti-nyúl immunglobulin/HRP (P0448, 1:10000 hígítás, DAKO, RRID: AB{26) }}). A kimutatáshoz PierceTM ECL Plus Western-blot szubsztrátot (32132, ThermoFisher Scientific) használtunk. A kemilumineszcenciát Luminoimage Analyzer ImageQuantLAS4000mini (GE Healthcare) segítségével figyeltük meg. A reprodukálhatóságot legalább három független kísérlet elvégzésével igazoltuk. A sávok intenzitását a National Institutes of Health ImageJ szoftverrel (Schneider et al., 2012) számszerűsítettük.

2,7|Luciferáz riporter vizsgálat

Luciferáz riporter vizsgálatot végeztünk a HIF1 felhalmozódásának mérésére homogén hipoxiás tenyészet inkubációjában. Korábban létrehoztunk egy jelölt luciferáz gént, amelyet egy hipoxiára reagáló elem (HRE) hajtott, és kifejlesztettük a hipoxiára reagáló riporter vektort (Transgénkonstrukció). Ezt az am CMV-promoter-luciferáz transzkripciós egység (pre-Luc) 5'-régiójába szubklónozott patkány vaszkuláris endoteliális növekedési faktor gén HRE tandem másolataiból állítottuk elő (Chiang et al., 2011; Tanaka et al. al., 2004).

A HK{{0}} sejteket lyukanként 1,0 × 105 koncentrációban készítettük elő 12-lyukú tenyésztőlemezeken (150628, Thermo Fisher Scientific). A sejteket 500 ng pGL{8}}Basic HRE-luciferáz vektorral és 30 ng pRL-SV40 Renilla luciferáz kontrollvektorral (Promega) kotranszfektáltuk, 2 µl FuGENE® HD transzfekciós reagens (E2311, Promega) felhasználásával. jól. Negatív kontrollként 500 ng ofpGL3-Basic szentjánosbogár luciferáz vektorral és 30 ng ofpRL-SV40 Renilla luciferáz kontroll vektorral (Promega) kotranszfektált HK-2 sejteket használtunk.

A transzfektált sejteket normoxiában, 2 százalékos hipoxiában, 1 százalékos hipoxiában vagy anoxiás zsákban inkubáltuk 5 órán át. A sejteket ezután 100 µl passzív fehérje lízis pufferrel összegyűjtöttük a kettős luciferáz vizsgálathoz. A mérésekhez LB9507 luminométert (EG és Berthold) használtunk. A transzfekció hatékonyságának korrigálása érdekében a szentjánosbogár-luciferáz fényegység relatív értékét elosztottuk a Renilla luciferázéval.

cistanche a szerk

2,8|Az apoptózis elemzése

A tenyésztett sejteket fedőlemezzel fedtük le 0 percre, 15 percre, 30 percre, 1 órára, 3 órára, 6 órára és 24 órára, majd tripszin segítségével összegyűjtöttük. Apoptózis kontrollként 30 percig 3 százalékos hidrogén-peroxiddal (081- 04215, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) kezelt sejteket készítettünk. Az apoptózis kvantitatív analízisét Muse Annexin V és Dead Cell Kits (MCH100105, Millipore) alkalmazásával végeztük Muse™ Cell Analyzerben (Millipore), a gyártó utasításai szerint.

2,9|Kvantitatív valós idejű PCR (qRT-PCR)

A teljes RNS extrakciót és a cDNS szintézist az RNAiso Plus (9109, Takara) és a PrimeScript™ RT Master Mix (RR036B, Perfect Real Time) (Takara) gyártói utasításai szerint végeztük. A valós idejű PCR-t a THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (QPS- 201, Toyobo) segítségével végeztük a CFX Connect Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad) rendszerben. A transzkriptumszinteket az -aktin mRNS expressziójának szintjére normalizáltuk. A qRT-PCR-t három párhuzamosban hajtottuk végre génspecifikus primerek felhasználásával. A HIF-1 amplifikálása előre, 5′-CCATTAGAAAGCAGTTCCGC-3′ és fordított, 5′-TGGGTAGGAGATGGAGATGC-3′ primerekkel történt. -aktint amplifikáltunk forward, 5′-TCCCCCAACTTGA GATGTATGAAG-3′ és fordított 5′-AACTGGTCTCAAG TCAGTGTACAGG-3′ primerekkel.

2.10|Transzfekció siRNS-sel

Az RNSi által indukált HIF-1 knockdown HK-2 sejtekben történő vizsgálatához lyukanként 50 × 104 HK-2 sejtet készítettünk hatlyukú lemezeken. Kétféle RNSi – HIF-1 siRNS (siHIF-1 #1 [HSS104774, Thermo Fisher Scientific] és siHIF-1 #2 [HSS104775, ThermoFisher Scientific]) – került felhasználásra a Lipofectamine RNAiMAX-szal Transzfekciós reagens (Thermo Fisher Scientific). Negatív kontrollként Stealth RNAi™ siRNA Negative Control Med GC Duplex #3 (12935-113) használtunk; Mindegyik siRNS-ből 1,5 µl-t és 5 µl RNAiMAX-ot összekevertünk. Az siRNS-sel transzfektált sejteket normoxikus vagy hipoxiás (1% O2) körülmények között inkubáltuk 48 órán át, és az RNS-t extraháltuk. A-HIF-1 knockdown hatékonyságát qRT-PCR segítségével vizsgáltuk.

2,11|A PH gradiens hatásainak élő képalkotása

Az élő sejtek intracelluláris pH-gradiensét fedőlemez alatt tettük láthatóvá. A sejteket pHrodo Green AM intracelluláris pH indikátorral (p35373, ThermoFisher Scientific) kezeltük a gyártó utasításai szerint, a fedőlemez-modell bevezetése előtt. Egy fordított fluoreszcens mikroszkóp, BZ-X710 (Keyence Corporation) GFP szűrővel figyeltük meg a fluoreszcencia intenzitás gradiens időbeli átmenetét fedőlemez alatt.

2,12|A HIF gyűrű kvantitatív elemzése

2.12.1|A HIF-gyűrű helye

Megmértük a HIF gyűrűk és a pimonidazol-pozitív területek távolságát a fedőlemez éleitől ImageJ segítségével, az alábbiak szerint. Meghatároztuk a HIF gyűrű és a pimonidazol-pozitív kör külső és belső köreinek területét, és kiszámítottuk az egyes körök sugarát. Minden értéket kivontunk 7,5 mm-ből, ami egy 15 mm-es fedőlemez sugara, hogy kiszámítsuk a fedőlemez szélétől való távolságát. Három független kísérletet végeztünk a HIF ICC-jével minden körülmények között.

2.12.2|A HIF gyűrű definíciója

Normoxia és semleges pH mellett inkubált fedőlemez-modellből nyert fluoreszcens képeket használtunk. A HIF gyűrű helyét és a külső és belső oldalát 2,5–3.0 skála (0,22–0,45 mm), 0,5 –1.{11}} skála (1,12–1,35 mm), illetve 5.0–5,5 skála (2,24–2,47 mm) a fedőlemez szélétől az ImageJ használatával. Öt helyen mértünk HIF{24}} jelet mintánként, és kiszámítottuk az átlagot. Három független kísérletet végeztünk a HIF ICC-vel.

cistanche kivonat por

2,13|Oxigénnyomás mérése PLIM képpel

2.13.1|Kalibráló vezeték építése oxigénnyomás mérésére

A HK{0}} sejtek kalibrációs görbéjét a korábbi jelentésünkben leírt módszer alapján készítettük el (Yoshihara et al., 2015). Az 500 nM BTPDM1-gyel 30 percig feltöltött HK-2 sejteket az élettartammérő rendszerhez csatlakoztatott fordított fluoreszcens mikroszkóppal felszerelt, változtatható oxigénkoncentrációjú többgázos inkubátorban tenyésztettük. Stern-Volmer analíziseken alapuló kalibrációs vonalat állítottunk össze a HK-2 sejtek foszforeszcencia élettartama (PL) felhasználásával több különböző oxigénfeszültség mellett.

(1) egyenlet

ahol τp jelenti a PL-t pO2-ban, τ0 jelenti a PL-t deoxigénezésben, kq a kioltási sebességi állandót, pO2 pedig az oxigén parciális nyomását. Ezzel a kalibrációs vonallal az oxigénnyomást a PL-ből lehetett kiszámítani.

2.13.2|Egy fedőlemez-modell PLIM képe

HK-2 sejteket készítettünk elő, amelyeket 30 percig 500 nM BTPDM1-gyel töltöttünk fel. Egy fedőlemez-modellt készítettem és tenyésztettem egy változtatható O2 koncentrációjú többgázos inkubátorban, amely fordított fluoreszcens mikroszkóppal volt felszerelve, és az élettartammérő rendszerhez csatlakozik.

A foszforeszcens élettartam képalkotó mikroszkópos (PLIM) képeket konfokális pásztázó rendszerrel felszerelt fordított fluoreszcens mikroszkóp segítségével rögzítettük (Hirakawa et al., 2018). A PLIM képeket 30 perces, 21 százalékos oxigénben vagy 4 százalékos oxigénben történő inkubálás után kaptuk. Mintánként négy PLIM-kép készült a fedőlemez széléhez közeli felső, alsó, bal és jobb oldali régiókból, hogy meghatározzuk az átlagos PL-t, figyelembe véve a fedőlemez PL-inek változását.

2.13.3|A HIF gyűrű azonosítása PLIM képen

A pimonidazol pozitív volt 10 Hgmm oxigénnyomás alatt. A 10 Hgmm oxigénnyomás PL egyenértéke 4034,6 ns volt a kalibrációs vonal szerint, így a PLIM képen a pimonidazol kör külső vonala azonosítható volt. Ezt követően a PLIM képen a külső és belső HIF gyűrűk helyét távolság-kvantitatív elemzéssel meg lehetett találni. Megmértük a HIF gyűrűvel egyenértékű átlagos PL-ek tartományát 21 százalék O2 és 4 százalék O2 esetén.

2.13.4|A HIF gyűrű oxigénnyomásának mérése

A PL-kből kiszámítottuk a HIF gyűrű oxigénnyomás-tartományát a kalibrációs vonal segítségével. A PLIM képeket az SPCImage 5.0 (Becker & Hickl GmbH) segítségével elemeztük.

2,14|Statisztikai analízis

A kísérleti és a kontrollcsoportok összehasonlítására Dunnett-tesztet használtunk, és a 0,05-nél kisebb értékeket statisztikailag szignifikáns különbségeknek tekintettük. Három vagy több csoport összehasonlítására Student-féle t-próbát használtunk, és a Bonferroni-korrigált p-értéket alkalmaztuk. Minden statisztikai elemzést a JMP Pro ver13.2.1 (SAS) segítségével végeztünk. Feltételeztük, hogy az értékek normális eloszlású populációból származnak, és átlag ± standard deviáció (SD) formájában vannak feltüntetve.

mi az a cistanche

3|EREDMÉNYEK

3.1|Oxigén gradiens képződés a hipoperfúziós modellben

A fedőlemez elhelyezéssel kiváltott hipoperfúziós modellben az oxigén feszültség közvetlen, foszforeszcencia segítségével történő értékelésével igazoltuk az oxigéngradiens létezését. A foszforeszcencia intenzitás mérése megjósolhatja az oxigénnyomás hozzávetőleges tendenciáját (Hirakawa et al., 2015; Yoshihara et al., 2015). Megfigyeltük a BTPDM1-gyel kezelt HK-2 sejtek fedőlemez-modelljének foszforeszcencia intenzitását. A foszforeszcencia intenzitásáról készült képek hipoxiát mutattak a fedőlemezen belüli területek nagy részén, de nem hipoxiát a széle közelében, ez a megfigyelés arra utal, hogy a fedőlemez széle körül oxigéngradiens létezik a HK-2 sejtekben, amelyeket fedőlemez borított. fedőlemez (1a. ábra). Mivel a foszforeszcencia intenzitása a szonda koncentrációjától és a gerjesztési időtől függ, a foszforeszcencia élettartam (PL) mérése hasznos az oxigénnyomás kvantitatív elemzéséhez (Yoshihara et al., 2015). Így a tenyésztett sejtek oxigénfeszültségének kvantitatív mérésére egy fedőlemez széle körül PLIM képeket kaptunk a HK-2 sejtekről, amelyeket fedőlemezzel fedett 30 percig (1b. ábra). A PL a fedőlemez szélétől való távolság növekedésével nőtt. Megerősítettük, hogy a kalibrációs vonallal számított oxigénfeszültség (S3 ábra) a fedőlemez szélétől való távolság növekedésével csökkent, ami bizonyítékot szolgáltat a fedőlemez széle körüli oxigéngradiens létezésére (1c. ábra). A foszforeszcencia intenzitás időbeli profiljának vizsgálata azt mutatta, hogy az oxigéngradiens a fedőlemez felhelyezése után 10 perccel kezdett kialakulni

(1d. ábra).

3.2|Egyedi HIF-1 eloszlás a hipoperfúziós modellben "HIF gyűrű"

Megvizsgáltuk a HIF{0}} eloszlását a hipoperfúziós modellben oxigéngradienssel. A HIF-1 ICC-je a HK-2 sejtekben fánk alakú kiemelkedést mutatott a pimonidazol-pozitív terület szélén, amelyet "HIF gyűrűnek" neveztünk (2a. ábra). A HIF-1 jel intenzitása szignifikánsan magasabb volt a HIF gyűrűn, mint annak belső vagy külső területén (2b. ábra). Ezt a jelenséget egy másik HIF{8}} antitesttel (S4a ábra) vagy más tubuláris sejtvonalakkal (S4b, c ábra) végzett ICC segítségével igazoltuk. Más típusú tenyésztett sejtekben, például a HeLa méhnyakráksejtekben is elvégeztük a HIF{11}} ICC elemzését. Bár ezeknek a sejteknek a fedőlemezhez való gyenge adhéziója megnehezítette a HIF-1 eloszlásának részletes értékelését, a HIF-1 fánk alakú fokozódását figyeltük meg a HeLa sejtekben (S4d ábra).

A HIF gyűrű és a pimonidazol-pozitív terület több órával a fedőlemez felhelyezése után kezdett kialakulni, és a HIF gyűrű 3 órával statikusnak tűnt (2c. ábra). A HIF-1 leütés a HIF-1 jel eltűnését eredményezte, beleértve a HIF gyűrűt is (2d. ábra, S4e ábra), jelezve, hogy a HIF gyűrű a HIF-1-tól függ.

Annak vizsgálatára, hogy a HIF gyűrű kialakulása oxigénfüggő-e, megvizsgáltuk a HIF-1 eloszlását a fedőlemez-modellben különböző oxigénfeszültségekkel végzett inkubáció mellett. A fedőlemez-modell elkészítése után azonnal különböző oxigénfeszültségű hipoxiás kamrákba helyeztük az edényt. A hipoxiás inkubáció során megfigyeltük, hogy mind a HIF-gyűrű, mind a pimonidazol-pozitív terület kifelé tágul (3a. ábra). Megmértük az egyes HIF gyűrűk és pimonidazol-pozitív területek távolságát a fedőlemez szélétől normoxia, 4 százalék O2 és 1 százalék O2 inkubáció mellett. Mind a HIF gyűrű, mind a pimonidazol-pozitív terület kifelé terjeszkedett, ahogy a környező oxigénfeszültség csökkent (3b. ábra). Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a HIF gyűrű függ a HIF{10}} és az oxigénfeszültségtől.

Annak igazolására, hogy a fánk alakú felhalmozódás a HIF sajátos jelensége, ICC-t végeztünk a takarító génekkel a fedőlemez modellben. A GAPDH és az aktin jelek a fedőlemez teljes területén fennmaradtak, és összehasonlíthatók voltak a HIF gyűrű régiója és a többi régió között (S5a, b ábra).

3,3|A HIF gyűrű oxigénnyomás-tartományának mérése

Megerősítettük a HIF-1 felhalmozódásának gyűrű alakú fokozását fedőlemezzel letakart tenyésztett sejtekben, amely jelenség az oxigénfeszültségtől függ. Az érintett oxigénfeszültség tartományának meghatározásához a HIF gyűrű oxigénnyomását elemeztük foszforeszcencia élettartam technikával. A fedőlemez-modellről PLIM képeket kaptunk 30 perces inkubálás után 21 százalékos O2-ben vagy 4 százalékos O2-ben (4a. ábra). A HIF ICC-ben a pimonidazol kör szélén alakult ki a HIF gyűrű (3b. ábra). A PLIM-képen azt a helyet azonosítottuk, amely egyenértékű volt a HIF ICC-jében található pimonidazol-pozitív területtel, majd azonosítottuk a HIF-gyűrűnek megfelelő helyet (4b. ábra), a HIF-gyűrűtől és a pimonidazol-pozitív terület (3b. ábra). Megmértük a HIF gyűrű PL értékeinek tartományát is, majd kalibrációs vonallal (S3 ábra) kiszámítottuk a HIF gyűrű oxigénnyomását 21 százalékos O2-ban (4,20 [3,46–4,97] ~35,9 [28,5–44,9] Hgmm). , és 4 százalék O2 (2,19 [0,21–4,32] ~20,4 [17,1–24,1] Hgmm) (4c. ábra).

3.4|HIF-1 felhalmozódása homogén oxigénfeszültség mellett

Míg a fedőlemez-modellben a HIF gyűrűn kívüli gyenge HIF-1 jelek az elégtelen hipoxiának tulajdoníthatók, a gyűrűn belülieknek, ahol a HIF-1-nak erősebben kellett volna aktiválódnia az alacsonyabb oxigénfeszültség miatt, kötelező oxigéntől független jelenség szabályozza. A csak a hipoperfúziós modellben előforduló, az anoxikus területen a HIF-1 maximális felhalmozódásának hiányát okozó jelenségek vizsgálatához megvizsgáltuk, hogy van-e fordított összefüggés az oxigénfeszültség és az inkubáció alatti HIF-1 felhalmozódás között. homogén oxigénfeszültséggel. A sejtlizátumok Western blot analízise különböző homogén oxigénfeszültségek mellett a HIF-1 felhalmozódásának növekedését mutatta az anoxikus inkubáció során (5a. ábra). A HRE-luciferáz riporter vizsgálat azt is jelezte, hogy a HIF-1 felhalmozódása alacsonyabb oxigénfeszültség mellett nőtt homogén oxigénfeszültség mellett (5b. ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a HIF-1 felhalmozódása oxigénfeszültség-függő volt, és a maximális felhalmozódást az anoxikus tartományban figyelték meg. A HIF{12}} jellemzőinek változniuk kell a hipoperfúziós modell és a homogén oxigénfeszültségű modell között. Feltételeztük, hogy a HIF-1 felhalmozódásának egyedülálló jelenségét ebben a hipoperfúziós modellben az oxigénfeszültségen kívül más tényező is meghatározhatja.

3,5|A HIF gyűrű kialakulása független volt a PhD-től

Megvizsgáltuk, hogy a HIF{0}} lebomlása, a HIF-gyűrű képződésének egyik lehetséges mechanizmusa, szabályozott-e a HIF gyűrűn belül. Ez az elképzelés érvénytelennek tűnt, mivel a Ph.D. által végzett hidroxilezés, amely a HIF lebontásának sebességkorlátozó folyamata, oxigént igényel szubsztrátként. A kobalt-kloridot széles körben használják kémiai HIF stabilizátorként. Kobalt-kloriddal kezelt HK-2 sejtek fedőlemez-modelljét szerkesztettük, és elvégeztük a HIF ICC analízisét. A HIF-1 jel nem növekedett a HIF gyűrűn belül, ami a gyűrűn kívüli HIF-1 megnövekedett jele miatt vált homályossá (6c. ábra). Hasonló eredményeket produkált a HK-2 sejtek ICC-je a PHD2-vel, amelyről úgy gondolják, hogy az elsődleges HIF prolil-hidroxiláz a sejttenyésztési kísérletekben (Strowitzki és mtsai, 2019) (S6. ábra). Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a HIF lebomlásának PHD-VHL tengelye nincs kapcsolatban a HIF gyűrű képződésével.

3,6|A pH hatása a HIF-1 felhalmozódására

Egy korábbi jelentés olyan szívizomsejtek fedőlemez-modelljének használatát írta le, amelyek pH-ja csökkent a fedőlemezen belül (Pitts & Toombs, 2004). Vizsgáltuk a fedőlemez alatti pH-t és annak hatását a HIF gyűrűképződésre. A HK-2 sejteket intracelluláris pH indikátorral kezeltük, melynek fluoreszcencia intenzitása lehetővé teszi a sejtek pH-értékének értékelését. Az élő képalkotás azt mutatta, hogy a pH a belső terület nagy részén csökkent, de nem a fedőlemez széle közelében, ami arra utal, hogy a fedőlemez modellben pH-gradiens van a széle körül (6a ábra). A fluoreszcencia intenzitása és a fedőlemez szélétől való távolság közötti összefüggés kvantitatív elemzése azt mutatta, hogy az előbbi a távolság növekedésével emelkedett, ez a megfigyelés alátámasztotta a pH- és oxigéngradiensek létezését a fedőlemez széle körül (6b. ábra). A sejtlizátumok Western blot analízise homogén oxigénkoncentráció mellett azt találta, hogy a pH 5,0-s tápközeggel való inkubálás elnyomta a HIF-1 felhalmozódását hipoxiás körülmények között (S7a–d ábra). Azt is megerősítettük, hogy a HIF-1 felhalmozódása hipoxia esetén különböző pH-körülmények között pH 6,0 alá csökkent (S8a–c ábra).

Egy jelentés hangsúlyozta az enyhén savas körülmények fontosságát 6 körüli pH-értéken.0. E tanulmány szerint a hipoxia utáni reoxigénezés megsavanyította a tápközeget, ami a VHL nukleoláris megkötését okozta. A HIF lebomlását viszont megakadályozták a C2C12 myotubusokban, PC12 neuronokban és 786-0 veserák sejtekben (Mekhail et al., 2004). Vizsgálatunkban nem változott a VHL-eloszlás a tubuláris sejtekben a HIF-1-felhalmozódást és az elnyomott régiók között, egy 5.0 és 7,4 közötti pH-értékű fedőlemez-modellben. (S9a–c ábra). A tubuláris sejtek sokféle pH-körülménynek vannak kitéve (Burke és mtsai, 1999; Pavuluri és mtsai, 2019; Raghunand és mtsai, 2003), ezért megvizsgáltuk a HIF gyűrű változását különböző pH-jú közegekben. 5,0 és 8,5 közötti értékek. A HIF gyűrű egyértelműen megfigyelhető volt 8,5 és 7,4 pH-jú tápközegben (6c. ábra). A HIF gyűrű pH 6,5-nél is létezett, de homályos volt (6c. ábra). A HIF-1 jel a fedőlemez teljes területén gyengült pH 5,0-nál. (6c. ábra). További kvantitatív elemzést végeztünk a HIF gyűrű és a pimonidazol-pozitív terület széle közötti helyzeti kapcsolatról (7a. ábra), és felfedeztük, hogy a gyűrű helyzete a pH-tól függően változott. A belső kör hajlamos volt kifelé tágulni pH 6,5-nél a pH 7,4-hez képest, míg a külső kör jelentősen befelé zsugorodott pH 8,5-nél, a pimonidazol-pozitív terület széle alapján (7b, c ábra). Azt is megerősítettük, hogy a háztartási gének aktivitását fedőlemez-modellben tartottuk fenn savas inkubáció mellett (S10. ábra). Ezért úgy tűnik, hogy a pH fontos szerepet játszik a HIF-gyűrű kialakulásának hátterében álló mechanizmusban.

4|VITA

Ebben a vizsgálatban a HIF-1 egyedi eloszlását azonosítottuk a vesetubuláris sejtekben, a fedőlemez elhelyezésével kiváltott hipoperfúziós modellt használva. Megállapítottuk, hogy a HIF gyűrű kialakulását és fenntartását az oxigénnyomás és a pH szabályozta, mindkettő egy fedőlemez modell fedőlemez szélén gradiensben létezett. Ezen eredmények alapján javasolunk egy lehetséges mechanizmust a HIF gyűrű kialakulására, amely magában foglalja a HIF-1 felhalmozódását csökkenő oxigénfeszültség mellett, és a felhalmozódást elnyomja az alacsony pH miatt a fedőlemez szélétől bizonyos távolságon belül (8. ábra). ).

A hipoperfúziót a mikrovaszkulatúra megritkulása indukálja CKD-ben (Mimura és Nangaku, 2{{20}}10; Nangaku, 2006). Korábbi munkánkban in vivo képalkotást használtunk az oxigéngradiens jelenlétének kimutatására normál egérvesék vese tubuláris sejtjeiben (Hirakawa et al., 2018). Az oxigénfeszültség várhatóan heterogén is lesz a tubuláris sejtekben CKD-ben. Továbbra sem világos azonban, hogy az oxigéngradienses hipoperfúzió megléte hatással van-e a hipoxia elleni védekezési rendszerre, a HIF-re. Ebben a tanulmányban megvizsgáltuk a HIF eloszlását tenyésztett proximális tubulussejtekben hipoperfúziós modellben, és felfedeztük, hogy a tenyésztett vesetubuláris sejtekben az oxigéngradiens sikeresen modellezett kerek üveg fedőlemez segítségével. A homogén oxigén tenzióval végzett kísérletekből származó bizonyítékok azt mutatták, hogy a HIF-1, amelynek hidroxilációja és későbbi lebomlása főként oxigénfüggő, felhalmozódott. Ez azt jelenti, hogy a HIF-1 mennyisége nő, ahogy az oxigénfeszültség csökken. A mi fedőlemez-modellünkben azonban a HIF-1 elnyomott az anoxikus területen, és a fedőlemez szélétől bizonyos távolságban volt a legnagyobb felhalmozódása. Ezt a fánk alakú HIF-felhalmozódást még soha nem mutatták be. Megmutattuk, hogy a HIF gyűrű kialakulása az inkubációs légkör oxigénfeszültségétől függetlenül megfigyelhető, de elhelyezkedése az oxigénfeszültségtől függ. Az oxigénfeszültség tartományát a HIF gyűrűn körülbelül 4-20 Hgmm között mérték PLIM és BTPDM1 segítségével. A legtöbb korábbi tanulmány, amely homogén oxigénfeszültségű atmoszférában tenyésztett sejtekre összpontosított, azt találta, hogy a HIF-1 fehérje mennyisége a hipoxiás vagy anoxikus tartományban nőtt (Ameri és mtsai, 2002; Carrera et al. , 2014). Így a mi modellünkben a HIF gyűrűképződést az oxigénfeszültségtől eltérő tényezőnek kellett befolyásolnia; független volt a doktori fokozattól, a HIF degradáció sebességkorlátozó folyamata. A HIF gyűrűképződés mechanizmusának felderítésében áttörést jelentett, hogy felfedeztük a pH-gradiens, valamint az oxigéngradiens szerepét a covers-ajak modellben, amely az in vivo hipoperfúzióhoz hasonlóan korlátozta a közeg beáramlását. modell. Ebben a hipoperfúziós modellben az intracelluláris pH csökkent a fedőlemez szélétől való távolság növekedésével, és pH-gradiens volt megfigyelhető a fedőlemez széle körül. Kimutattuk, hogy a HIF-1 felhalmozódása elnyomott alacsony pH-értéken, 5,0 körüli pH mellett, összehasonlítva a semleges pH körüli inkubációval, homogén oxigénfeszültség mellett. A HIF gyűrű külső széle pH 6,5-nél kifelé tágul, a HIF gyűrű belső széle pedig befelé zsugorodott pH 8,5-nél, a pimonidazol-pozitív terület széle alapján. A HIF gyűrűt savas körülmények között kitakarták, és a HIF-1 jel eltűnt pH 5,0-nál. Így tisztáztuk a pH jelentőségét a HIF gyűrű kialakulásában egy fedőlemez modellben. Kimutattuk annak lehetőségét, hogy a HIF gyűrű a HIF-1 felhalmozódásának gátlásával jött létre a gyűrűn belüli alacsony pH miatt.

Több korábbi, fedőlemez módszerrel végzett tanulmány is használt rákos sejteket. A zöld fluoreszcens fehérje (AcGFP1) oxigénfüggő vöröseltolódását kifejező Hep3B humán hepatoma sejtvonalat használó egyik jelentés szerint a téglalap alakú fedőlemezzel borított sejtek élőképe vöröseltolódást mutatott a fedőlemez szélétől való távolság növekedésével (Takahashi & Sato, 2010). A hepatomasejtek emissziós spektruma a zöld fluoreszcens fehérje (GFP) fluoreszcenciájának hullámhosszáról a vörösre tolódott el, ahogy az oxigénfeszültség csökkent. Egy másik vizsgálatban kerek 15-mm fedőlemezzel rendelkező SCC-7 sejtek oxigénfeszültségét mérték foszforeszcencia élettartam technikával. Az oxigénfeszültség 6,9 Hgmm és 166 Hgmm volt, PL-ből számolva, ami 3,89 µs és 893 µs volt, 0-2 mm-rel a fedőlemez szélén belül, illetve 0-1 mm-rel kívül (Yoshihara et al., 2015). A fedőlemezes módszert szívizomsejteknél is alkalmazták, amely rendszer ígéretes in vivo ischaemia-reperfúziós modellként keltette fel a figyelmet. Kelly és munkatársai kimutatták, hogy a fedőlemezzel borított myocyták jelentős morfológiai változásokon mentek keresztül az idő múlásával, amit a mitokondriális membránpotenciál és a plazmamembrán dinamika változásai kísértek, ami végül a myocyta halálához vezetett. Azt is kimutatták, hogy a fedőlemezzel borított myociták intracelluláris pH-ja gyorsan leesik körülbelül pH 4-re a fedőlemez közepén (Pitts & Toombs, 2004). A fedőlemezes modell, amely gátolja az oxigén- vagy tápanyag diffúziót a tenyésztett sejtekbe egy fedőlemez alatt, utánozhatja az ischaemiás, normál és marginális zónák in vivo modelljét a fedőlemez közepén, kívül és szélén. Számos tanulmány alkalmazta ezt a modellt a myocyták ischaemia-reperfúziós modelljeként in vitro (Chun és mtsai, 2015; Pitts és mtsai, 2008; Solhjoo és O'Rourke, 2015; Wang és mtsai, 2012). Legjobb tudomásunk szerint tanulmányunk az első, amely fedőlemezes módszert alkalmaz csősejtekre. A mi rendszerünkben a távolság a fedőlemez szélétől a 10 Hgmm oxigénfeszültségnek megfelelő tartományig, ahol a pimonidazolnak pozitívra kell fordulnia, 1,22 mm volt, és az oxigénfeszültség a fedőlemez szélétől számított 2 mm-es távolságon belül egészen nullára csökkent. . Ez az eredmény összeegyeztethető a korábbi jelentésekkel, amelyek körülbelül 15 mm-es fedőlemezt használnak, bizonyítva, hogy a széltől legalább 2 mm-en belül oxigéngradiens létezik (Akiyama et al., 2018; Yoshihara és mtsai, 2015). Megvizsgáltuk a sejtek apoptózisának sebességét fedőlemezek alatt (S11 ábra), és felfedeztük, hogy a GAPDH és az aktin még a HIF gyűrűn belül is megmaradt, ami azt jelzi, hogy a HIF gyűrűt nem csak a sejt apoptózisa vagy a HIF gyűrűn belüli elhalása okozta.

Számos tanulmány mérte a vesék oxigénfeszültségét különböző módszerekkel. Néhány példa a normál vesék oxigénfeszültségének mérésére a következő volt: 50 Hgmm és 30 Hgmm a kéregben és a velőben mikroelektródákkal; és 49 Hgmm és 41 Hgmm a kéreg tubuláris sejtjeinek S1 és S2 szegmenseiben PLIM segítségével (Hirakawa és mtsai, 2017, 2018; Zhang és mtsai, 2014). A beteg vesék oxigénfeszültsége alacsonyabb lenne. Egy korábbi, oxigén mikroelektródákkal végzett jelentés szerint a cukorbeteg patkányok vese parenchymalis oxigénfeszültsége alacsonyabb volt: 36 Hgmm, illetve 11 Hgmm a kéregben és a velőben (Heyman és mtsai, 2013; Palm és mtsai, 2003). Mivel az oxigén mikroelektródák mérik az átlagos parenchymás oxigénfeszültséget, a beteg vesékben szélesebb tartomány várható. Az intracelluláris oxigénfeszültség nulla Hgmm-re csökkent egy olyan ischaemiás vese modellben, amelynek laterális veseartériája és vénája össze volt szorítva (Hirakawa és mtsai, 2015). Figyelembe véve ezeket a megállapításokat, a HIF-gyűrű oxigénfeszültség-tartománya, körülbelül 4-20 Hgmm, in vivo elfogadhatónak tűnt.

Felfedeztük továbbá, hogy a pH befolyásolja a HIF gyűrűképződést, valamint az oxigénfeszültséget. Mivel a vese tubuláris hámsejtjei folyamatosan ki vannak téve a vizeletfolyadéknak, a tubuláris sejtek pH-ját a vizelet pH-értékének kell befolyásolnia. Tekintettel a vizelet pH-értékének széles tartományára, úgy döntöttünk, hogy megvizsgáljuk az 5-ös pH-tartományban inkubált sejteket.{1}}–8,5. Tanulmányokat végeztek a normál vesék pH-tartományára vonatkozóan. Egy tanulmány szerint a kéreg pH-ja 7,39 ± 0.{{10}}8, a velőké pedig 7,20 ± {{2{{39} }}}.09, mikroelektródákkal mérve (Burke et al., 1999). Egy másik, MRI-alapú pH-képalkotást alkalmazó vizsgálat 7,3 ± 0,13 és 7.0 ± 0,29 pH-értéket mutatott (Raghunand et al., 2003). Beszámoltak arról, hogy a vese pH-ja 6,5-ről 6,32-re, súlyos esetben pedig 5,83-ra csökkent az acidózissal járó CKD egérmodelljében (Pavuluri et al., 2019). Ezek a megfigyelések bizonyítékot szolgáltattak a CKD pH-csökkenésére és változásaira. Azonban a pH-nak a krónikus hypoxia által kiváltott HIF-1-ra gyakorolt ​​hatását nem vizsgálták kellőképpen. A jelen vizsgálatban a HIF gyűrű eltolódását figyelték meg pH 6,5 és pH 7,4 között, amely pH-tartomány valószínű CKD esetén. Ez az eredmény alátámasztotta azt a hipotézist, hogy a pH enyhe csökkenése befolyásolja a HIF-1 felhalmozódását CKD-ben. Súlyos krónikus vesebetegség esetén a pH 6,0 alá csökkenésének bizonyítékai alapján alacsonyabb pH-n is fel kell mérni a HIF{40}} élettani állapotát. Bár vannak jelentések arról, hogy a savas környezet még normoxia esetén is stabilizálja a HIF-1-t, a legtöbb ilyen jelentés enyhe savasságú, 6,0 feletti pH-értéket vizsgált (Filatova és mtsai, 2016; Mekhail et al., 2004). . Ebben a munkában kimutattuk a HIF-1 felhalmozódásának gátlását a tubuláris sejtekben pH 5,0-nál, és a HIF-1 jelek gyengülését pH 5,0-n inkubált fedőlemez-modellben. Ezért a vese pH-csökkenése a CKD-ben in vivo összefüggésbe hozható az elégtelen HIF-aktivációval, valamint a hipoxiás vese urémiás toxinjaival, ami súlyosbítja a CKD progresszióját (Tanaka et al., 2013).

Tanulmányunknak számos korlátja van. Először is, a hipoperfúzió területén a táptalajnak tápanyaghiányosnak kell lennie, az oxigénhiány és a csökkent pH mellett. Nehéz azonban körülhatárolni a pH, az oxigénfeszültség és a hipoperfúzió által kiváltott egyéb tényezők hatását. A szervezetben ischaemia, vagyis a vér kóros hipoperfúziója, amelyet az alacsony oxigén- és tápanyagtartalom kombinációja okoz, a szervekben és a sejtekben fordul elő. Fontos megérteni a hipoxia-érzékelés és az ischaemia-érzékelés közötti különbségeket. Annak ellenére, hogy az egyes faktorok biológiai hatását nehéz tisztázni, hipoperfúziós modellünk fiziológiailag elfogadható, utánozza a kóros állapotot in vivo. Másodszor, a fedőlemez-modell készítése szakértelmet és gyakorlatot igényel, mivel a fedőlemez eltávolítása során a cellák többsége esetenként levál, különösen a hagyományos módszerrel (S2a ábra). Ez a probléma a használt sejtvonaltól függött. Például nehéz volt fedőlemez-modellt alkalmazni a HEK 293-as cellákra, mert a fedőlemezhez való tapadásuk viszonylag gyenge volt. Harmadszor, kívánatos volt a fedőlemez alatt tenyésztett sejtek károsodásának minimalizálása. A károsodott sejtek száma nőtt, ahogy a lefedettség időtartama nőtt, amint azt az apoptózis elemzése mutatja. Megállapítottuk, hogy 3 óra volt megfelelő a HIF gyűrű becsléséhez, amikor az statikusnak tűnt, és a sejtek körülbelül 10 százaléka vált apoptotikussá (S11 ábra). A negyedik korlátozás a tenyésztett sejtek fedőlemezhez való egységes rögzítésének nehézsége volt minden mintában (S2b, c ábra). A fedő-ajak modell elkészítésének hagyományos és alternatív módszere közötti rögzítési különbség is befolyásolhatta a vizsgálatot. A HIF gyűrűvel egyenértékű oxigénfeszültség tartományt mértük foszforeszcencia élettartam technikával, melynek során hagyományos módszerrel fedőlemez-modellt hoztunk létre. Mivel az immuncitokémia során a HIF gyűrűt egy alternatív módszerrel vizualizálták, a valódi oxigénfeszültség eltérő lehet. Minimálisra csökkentettük ezeket a hibákat azzal a bizonyítékkal, hogy a pimonidazol pozitív volt 10 Hgmm vagy annál kisebb oxigénfeszültségnél. Az ötödik korlátozás az, hogy az intracelluláris pH nem feltétlenül egyezik meg a táptalaj pH-jával. Számos korábbi jelentés kimutatta, hogy az intracelluláris pH bizonyos mértékig konzisztens a tápközeg pH-jával a tenyésztett sejtekben (Michl et al., 2019), a tápközeg pH-jának változtatásával csak az intracelluláris pH trendjét tudtuk értékelni. In vivo az intracelluláris és extracelluláris régiók, például a vizelet vagy a testfolyadék pH-értéke közötti kapcsolat bonyolultabb, mint a tenyésztett sejtekben. Így a jövőben további vizsgálatokra lesz szükség arról, hogy a pH-eltolódás hogyan szabályozza a HIF-1 fehérje in vivo felhalmozódását.

A Cistanche előnye: javít vesefunkció

Egy másik korlátozás az, hogy a pH-nak hatással kell lennie a hipoxia markerre, a pimonidazolra. Összehasonlítottuk a pimonidazol-pozitív terület szélének távolságát a fedőlemez közepétől különböző pH-viszonyok között fedőlemez-modellünkben. A pimonidazol-pozitív terület széle pH 6,5, 7,4 és 8,5 között összehasonlítható volt (S12a, b ábra). Egy korábbi tanulmány azt is kimutatta, hogy a pimonidazol kötődése különböző pH-értékeken is fennmarad (Kleiter et al., 2006). Ezen bizonyítékok alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy a pimonidazol megfelelő hipoxia marker fedőlemezes kísérleteinkhez. A végső korlátozás az, hogy a HIF-gyűrű körülbelül 4 Hgmm és 20 Hgmm (0,52% O2-2,6% O2) közötti oxigénfeszültség tartományban a Pt(II)- és Pd(II)-porfirinek, amelyeket széles körben használnak biológiai anyagként. Az oxigénszondák az Ir(III)-komplexekhez képest lényegesen hosszabb foszforeszcencia-élettartamuk miatt előnyösek nagyon alacsony oxigénkoncentrációk mérésében (Yoshihara et al., 2017). Általában azonban a foszforeszcencián alapuló kvantitatív oxigénmérés, amelyet a Stern–Volmer egyenlet alapján számítanak ki, jobb teljesítményt nyújt alacsony O2 tartományokban (Papkovsky & Zhdanov, 2016). Számos korábbi tanulmány kimutatta, hogy az oxigénfeszültségek Ir(III) komplex alapú mérése körülbelül 10 Hgmm-ig terjed (Akiyama et al., 2018; Yoshihara és mtsai, 2015). Ezért úgy gondoljuk, hogy a HIF gyűrű oxigénfeszültség-tartományának pontos eredménynek kell lennie.

5|KÖVETKEZTETÉSEK

Összefoglalva, azt találtuk, hogy mind az oxigén, mind a pH szerepének megértése elengedhetetlen a HIF-1 fiziológiai állapotának megértéséhez CKD-ben, és ez a tubuláris sejtek hipoperfúziós vizsgálatával érhető el. A fedőlemez-modell a táptalaj beáramlásának korlátaival együtt az in vivo hipoperfúzió jó modellje volt, különösen a CKD tubulusaiban, mivel a peritubuláris kapillárisok ritkulása a CKD fő jellemzője (Mimura és Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). Ez a hipoperfúziós modell in vivo is képes utánozni az oxigén- és pH-gradienseket, például daganatokat és ischaemiás elváltozásokat. A modell ígéretes megközelítést kínál e biológiai mechanizmusok feltárására.

ÉRDEKÜLÉKENYSÉG

Egyetlen szerzőnek sem kell nyilatkoznia összeférhetetlenségről.

A SZERZŐK HOZZÁJÁRULÁSA

Valamennyi szerző hozzájárult az átfogó koncepció kialakításához. TH végezte el az átfogó kísérleteket. TH és YH elemezte az eredményeket és elkészítette a számokat. TH írta az eredeti kéziratot. KM, TY és ST a kísérletet foszforeszcencia élettartam technikával végezte, és megszerkesztette a kézirat részét. YH, TT és MN szerkesztette a teljes kéziratot. Valamennyi szerző elolvasta és jóváhagyta a végleges kéziratot.

REFERENCIA

Akiyama, H., Takahashi, I., Shimoda, Y., Mukai, R., Yoshihara, T. és Tobita, S. (2018). Ir(iii) élő sejtek és szemfenék komplex alapú oxigénes leképezése kapuzott ICCD kamerával. Fotokémiai és Fotobiológiai Tudományok, 17(6), 846–853.

Akizawa, T., Nangaku, M., Yamaguchi, T., Arai, M., Koretomo, R., Maeda, K., Miyazawa, Y. és Hirakata, H. (2019). Enarodustat, konverziós és fenntartó terápia anémiában hemodializált betegeknél: Randomizált, placebo-kontrollos 2b fázisú vizsgálat, amelyet hosszú távú vizsgálat követ. Nephron, 143(2), 77–85.

Ameri, K., Burke, B., Lewis, CE és Harris, AL (2002). Egy patkány VL30 elem szabályozása humán emlőráksejtekben hipoxiában és anoxiában: A HIF szerepe-1. British Journal of Cancer, 87(10), 1173–1181.

Asai, H., Hirata, J., Hirano, A., Hirai, K., Seki, S. és Watanabe- Akanuma, M. (2016). Az aril-szénhidrogén-receptor aktiválása közvetíti a hipoxia-indukálható faktor-függő eritropoetin expresszió indoxil-szulfát általi elnyomását. American Journal of Physiology. Cell Physiology, 310(2), C142–C150.

Burke, TJ, Malhotra, D. és Shapiro, JI (1999). A vesén belüli pH-gradienst fenntartó tényezők: az érrendszeri architektúra szerepe. Kidney International, 56(5), 1826–1837.

Carrera, S., Senra, J., Acosta, MI, Althubiti, M., Hammond, EM, de Verdier, PJ és Macip, S. (2014). A HIF-1alfa transzkripciós faktor szerepe a fokozott sejtosztódásban fiziológiás oxigénfeszültség esetén. PLoS One, 9(5), e97938.

Chen, N., Hao, C., Peng, X., Lin, H., Yin, A., Hao, L., Tao, Y., Liang, X., Liu, Z., Xing, C., Chen, J., Luo, L., Zuo, L., Liao, Y., Liu, BC, Leong, R., Wang, C., Liu, C., Neff, T., … Yu, KHP (2019) ).

Roxadustat vérszegénység kezelésére olyan vesebetegségben szenvedő betegeknél, akik nem részesülnek dialízisben. New England Journal of Medicine, 381(11), 1001–1010.

Chen, N., Qian, J., Chen, J., Yu, X., Mei, C., Hao, C., Jiang, G., Lin, H., Zhang, X., Zuo, L., He, Q., Fu, P., Li, X., Ni, D., Hemmerich, S., Liu, C., Szczech, L., Besarab, A., Neff, TB, … Valone, F.

H. (2017). Az orális hipoxia-indukálható faktor prolil-hidroxiláz inhibitor FG-4592 2. fázisú vizsgálata a vérszegénység kezelésére Kínában. Nephrology, Dialysis, Transplantation, 32(8), 1373–1386.

Chiang, CK, Tanaka, T., Inagi, R., Fujita, T. és Nangaku, M. (2011). Az indoxil-szulfát, egy reprezentatív urémiás toxin, HIF-függő módon gátolja az eritropoetin termelést. Laboratory Investigation, 91(11), 1564–1571.

Chun, WJ, Nah, DY, Bae, JH, Chung, JW, Lee, H. és Moon, IS (2015). A glükóz-inzulin-kálium oldat védi az újszülött patkányok kamrai myocitáit in vitro fedőlemez ischaemia/reperfúziós modellben. Korean Circulation Journal, 45(3), 234–241.

Coyne, DW, Goldsmith, D. és Macdougall, IC (2017). Új lehetőségek a krónikus vesebetegség vérszegénységére. Kidney International Supplement, 7(3), 157–163. csók.2017.09.002

Deng, A., Arndt, MA, Satriano, J., Singh, P., Rieg, T., Thomson, S. et al (2010). Vesevédelem krónikus vesebetegségben: hipoxia-indukálható faktoraktiváció vs. angiotenzin II blokád. American Journal of Physiology. Vesefiziológia, 299(6), F1365–F1373.

Filatova, A., Seidel, S., Bogurcu, N., Graf, S., Garvalov, BK és Acker, T. (2016). Az acidózis a HSP90-en keresztül Ph.D./VHL-független módon fejti ki hatását, elősegítve a HIF funkciót és az őssejt fenntartását gliómában. Cancer Research, 76(19), 5845–5856. LEHET-15-2630

Goldfarb, M., Rosenberger, C., Abassi, Z., Shina, A., Zilbersat, F., Eckardt, KU, Rosen, S. és Heyman, SN (2006). Akut-krónikus veseelégtelenség patkányban: funkcionális kompenzáció és hipoxia tolerancia. American Journal of Nephrology, 26(1), 22–33.

Heyman, SN, Rosenberger, C., Rosen, S. és Khamaisi, M. (2013). Miért kockázati tényező a diabetes mellitus a kontraszt-indukálta nephropathia kialakulásában? BioMed Research International, 2013, 123589.

Hirakawa, Y., Mizukami, K., Yoshihara, T., Takahashi, I., Khulan, P., Honda, T., Mimura, I., Tanaka, T., Tobita, S., & Nangaku, M. (2018). A vesekéreg intravitális foszforeszcencia élethosszig tartó képalkotása pontosan méri a vese hipoxiát. Kidney International, 93(6), 1483–1489.

Hirakawa, Y., Tanaka, T. és Nangaku, M. (2017). Vese hipoxia CKD-ben; Kórélettan és kimutatási módszerek. A fiziológia határai, 8, 99.