A Cinnamomum Osmophloeum Kanehira leveleiből származó új természetes antioxidáns bioanyag elnyomja a melanogenezist és véd a DNS-károsodástól

Kapcsolatfelvétel: ali.ma@wecistanche.com

Yung-Shu Ho 1, Jane-Yii Wu 1,* és Chi-Yue Chang 2

Absztrakt:A Cinnamomoum ​​osmophloeum Kanehira (COK) egy őshonos fafaj Tajvanon. Kémiai összetételek,antioxidánstevékenység, gombatirozinázVizsgálták a COK levelekből származó hidroszol gátlását, a melaninszintézis visszaszorítását és a DNS-károsodás elleni védelmet gőzdesztillációval. 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil gyökfogó, fémion-kelátképző, redukálóerő és Trolox-ekvivalens antioxidáns kapacitás (TEAC) vizsgálatot végeztünk, és meghatároztuk az összfenoltartalom és az antioxidáns aktivitás közötti összefüggéseket. Az eredmények azt mutatták, hogy a COK-hidroszol antioxidáns tulajdonságai szorosan összefüggenek fenoltartalmukkal. Ezenkívül a hidroszol fő összetevői, azaz a fahéjaldehid és a benzaldehid dózisfüggő anti-tirozináz hatást fejtettek ki mind a monofenoláz, mind a difenoláz aktivitással szemben. A GC-MS analízis kimutatta, hogy a hidroszol fő bioaktív komponensei a transz-fahéjaldehid (87,7 százalék), benzaldehid (7.{11}} százalék) és fahéj-acetát (5,3 százalék). Ezenkívül azt találtuk, hogy a benzaldehid jelenlétében lévő hidroszol erősebb, mint a tiszta fahéjaldehid, és fokozza atirozináza hidroszol gátló aktivitása. A kinetikai elemzések során a Lineweaver–Burk diagramok és újratervezések kimutatták, hogy a COK-hidroszol egy vegyes típusú inhibitor. Ezenkívül azt találtuk, hogy a COK-hidroszol nagyon kis dózisai elnyomták a mikroftalmiával összefüggő transzkripciós faktor -melanocita-stimuláló hormon által kiváltott szintézisét, ami csökkent melaninszintézishez vezetett a B16-F10 melanoma sejtekben. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a hidroszol előállítása COK levelekből gőzdesztillációval biztonságos és hatékony forrást jelenthetbőr-fehérítésszerek kozmetikai és gyógyszerészeti alkalmazásokhozantioxidáns, anti-tirozináz, anti-melanogenezis és DNS-védő aktivitások.

Kulcsszavak: antioxidánstevékenység; Cinnamomoum ​​osmophloeum; hidroszol;tirozinázgátló aktivitás;fehérítés; DNS-károsodást védő hatások

Kattintson ideCistancheszár és termék a bőr fehérítésére

1. Bemutatkozás

Az emberi bőrbetegségek, mint például a lentigo, az öregségi foltok, a melasma és a rosszindulatú melanómák összefüggésbe hozhatók a melanin képződésével és felhalmozódásával [1]. A tirozinázok és a melanogenezis gátlása javíthatja a bőrgyógyászati ​​rendellenességeket és a hiperpigmentációs szindrómát. Ezenkívül a bőrfehérítő szerek és kozmetikai termékek globális piaca a közelmúltban bővült, mivel sok sötétebb bőrű egyén a világosabb bőrszínt részesíti előnyben [2]. Ezért hatékony és biztonságostirozinázés a melaninszintézis-gátlókat fontosnak tartják a pigmentációs betegségek és más, melaninnal összefüggő emberi egészségügyi problémák megelőzésében [3,4]. Ezenkívül a környezeti toxikus anyagok különféle oxidatív stresszt okoznak az emberben, és reaktív nitrogénfajokat vagy reaktív oxigénfajtákat (ROS) termelhetnek [5]. A túlzott szabad gyökök és a ROS gyulladásos jelátviteli útvonalakkal járnak, amelyek végül sejtkárosodáshoz, öregedéshez, idegrendszeri rendellenességekhez, cukorbetegséghez, érelmeszesedéshez, gyulladásokhoz, szív- és érrendszeri betegségekhez, rákhoz és melanogenezishez vezetnek [6,7]. Több tanulmány is azt sugalljaantioxidánsokképes gátolni az oxidatív nyomás okozta károsodásokat azáltal, hogy szabad gyökfogóként vagy ROS-fogóként működnek [7,8]. Ezenkívül mind a ROS-képződés gátlói, mind a ROS megkötők csökkenthetik a melaninpigmentek termelését [9]. Kimondottan,tirozinázkulcsfontosságú enzim, amely a melaninszintézis folyamatának első két lépésében sebességkorlátozó lépést katalizál [10], és a tirozináz leszabályozása kritikus cél a bőrbetegségek megelőzésében és a bőrbetegségek termelésében.bőrfehérítésszerek [11]. Ezért elengedhetetlen a tirozinázokat hatékonyan gátló természetes antioxidánsok kifejlesztése a nemkívánatos bőrhiperpigmentáció megelőzésére vagy kezelésére, valamint a DNS-károsodás elleni védelemre.

A Cinnamomum osmophloeum Kanehira (COK) egy tajvani őshonos fahéjfaj, amelyet számos kínai gyógynövényként használnak. A COK illóolajok aktív vegyületei kiváló farmakológiai antibakteriális hatást mutatnak [12]. Bár a COK levelek alkoholos kivonatainak korábbi tanulmányai tirozináz-ellenes aktivitást mutattak ki, ezeknek a vizsgálatoknak szinte mindegyike a COK-ból származó etanol-kivonatokra vagy illóolajokra összpontosított. Ezenkívül nem számoltak be kvantitatív és szisztematikus tanulmányokrólantioxidánstulajdonságok,tirozinázgátló hatások és a melanin szintézis visszaszorítása a COK levelek vízkivonatai (hidroszol) által. Ezért ezt a vizsgálatot a COK-hidroszolnak az oxidatív stresszre és a melanogenezisre gyakorolt ​​hatásának vizsgálatára végezték el B16F10 melanomasejtekben, és megvédik a DNS-károsodástól. Ez a tanulmány az első részletes jelentés a kémiai összetételről ésantioxidáns, tirozináz gátlás, melanogenezis visszaszorító és DNS-károsodást védő hatások a hidroszol COK levelekből.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Vegyszerek és antitestek

Gombatirozináz, butilezett hidroxitoluol (BHT), -tokoferol, 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilkromán-2-karbonsav (Trolox), triklór-ecetsav (TCA), gallusz sav, kálium-ferricianid, vas(III)-klorid, vas(II)-klorid, ferrozin, 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH),2,20-azino-bisz-3-etilbenztiazolin{{14} } szulfonsavat (ABTS), Folin-Ciocalteu reagenst, L-tirozint és L-3,4-dihidroxi-fenilalanint (L-DOPA) a Merck Co.-tól (Darmstadt, Németország) szereztük be. Az összes vegyszert és a vizsgálatban használt oldószerek analitikai minőségűek vagy nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás oldószerek voltak. A mikroftalmiával összefüggő transzkripciós faktor (MITF) és -aktin elleni antitesteket a Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA) és a Sigma Chemical Co. (St. Louis, USA) cégtől szereztük be.

2.2. Hidroszol előállítása: Kivonás COK levelekből gőzdesztillációval

Egy 13-éves COK fa leveleit Tajvanon (No.186, Yongping Road, Zhongliao Township, Nantou County, Tajvan) levegőn szárították. Rozsdamentes acél daráló segítségével a leveleket finom porrá őröltük (kevesebb, mint 10 mesh), majd szobahőmérsékleten tároltuk. Ezután 3,5 kg szárított COK levélport 4 órán keresztül vízgőz-desztillációval extraháltunk. Ezt a folyamatot négyszer megismételték. Az extraktumot vákuum alkalmazásával leszűrjük, majd rotációs bepárló segítségével a száraz extraktumot kapjuk (1. ábra). Az extraktumot végül bepároljuk, hogy megkapjuk a végső tömeget.

2.3. A hidroszol gázkromatográfiás/tömegspektrometriás (GC/MS) elemzése

Thermo-GC/MS műszer THERMO WaxMS térhálósítású 5% fenil- 95% metil-polisziloxán kapilláris oszloppal (60 m × 0.25 mm id, filmvastagság {{1) 0}},25 µm) héliumot használtunk vivőgázként 1,0 ml/perc állandó áramlási sebességgel. Az oszlopot az injektálás után 5 percig 200 °C-on tartottuk, majd 5 °C/perc sebességgel 260 °C-ra melegítettük. Tiszta illóolajat (1,0 ml) fecskendeztünk be 1:100 arányban. Az injektor, az átviteli vezeték és az ionforrás hőmérséklete 250 ◦C, 250 ◦C és 200 ◦C volt. Az MS detektálást elektron ütközési módban végeztük 70 eVionizációs energián és 60 µA ionizációs áram mellett; a műszer teljes letapogatású felvételi módban működött 50-350 amu tartományban. A vegyületeket úgy azonosítottuk, hogy a kromatográfiás csúcsok retenciós idejét és mutatóit összehasonlították az azonos körülmények között injektált hiteles referencia standardokéval. Az MS fragmentációs mintázatait a tiszta vegyületekével hasonlították össze, és a tömegspektrum adatbázist a National Institute of Standards and Technology (NIST) MSspectral adatbázisával [13] keresték.

2.4.Összes fenoltartalom

A kivonatok teljes fenoltartalmát (TPC) a korábban leírt Folin–Ciocalteu assay-vel [14] határoztuk meg. Röviden, a hidroszolmintákat (100 µL) összekeverjük 100 µl Folin–Ciocalteu reagens (10--szeres hígítás) és 10 µl nátrium-karbonát aliquot részekkel (10 tömegszázalék). 30 perces tárolás után a az abszorbanciát 735 nm-en mértük. A TPC-ket galluszsav-ekvivalensben (GAE) fejezzük ki, mg/100 g friss anyagra vonatkoztatva.

2.5. DPPH szabadgyökfogó vizsgálatok

Amint azt korábban leírtuk, DPPH assay segítségével meghatároztuk a hidroszol gyökfogó aktivitását [15], módosításokkal. Röviden, a hidroszolminták különböző hígításait (75 µl három párhuzamosban) adtuk 150 µl-es DPPH aliquot részekhez (0,02 g/100 ml), és az abszorbanciát 517 nm-en mértük 30 perc elteltével. BHT-t használtunk pozitív kontrollként (0,5 mg/ml etanol). A gyökfogó aktivitást gátlási arányként (százalék) fejeztük ki a következő egyenlet segítségével:

A gátlási arány ( százalék )=[1 − (A/B)] × 100 százalék

ahol A a hidroszol minta abszorbanciája és B a vakpróba abszorbanciája.

2.6. Frakcionált gátló koncentrációk

A frakcionált gátló koncentrációk (FIC) vizsgálatát a korábban leírtak szerint [16] végeztük, módosításokkal. Röviden, FeSO4-et (20 µL; 2 mM) kevertünk össze különböző hígítású hidroszolmintákkal (200 µL). Ferrozin (40 µl; 5 mM) hozzáadása után a reakciót 10 percig hagytuk lejátszódni, majd az abszorbanciát 562 nm-en mértük. Továbbá 0,5 mg/ml etilén-diamin-tetraecetsavat (EDTA) használtunk pozitív kontrollként. A ferrozin-Fe2 plusz komplexképződés százalékos gátlását a következő képlettel számítottuk ki:

Fémkelátképző hatás ( százalék )=[1 − (A/B)] × 100 százalék

ahol A a hidroszol minta abszorbanciája és B a vakpróba abszorbanciája.

2.7. A teljesítmény csökkentése

A COK-hidroszol redukáló erejét a Fe3 plusz Fe2 plusz redukciójának követésével határoztuk meg a korábban leírtak szerint [17], módosításokkal. Röviden, a hidroszol 50 µl-es hígítására 50-µl-es foszfátpuffer (pH 6,6, 200 mM) és 50-µl kálium-ferricianid (1 százalék, w/v) aliquot része volt. tette hozzá. 50 °C-on 20 percig végzett inkubálás után 50 µl TCA-t (10 tömeg/térfogat%) adtunk hozzá; és az elegyet 9, 000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk 3 percig. Végül 50 µl felülúszót összekevertünk 50 µl desztillált vízzel és 50 µl vas(III)-klorid vizes oldatával (0,1 %, w/v), és 10 perc reakcióidő után mértük az abszorbanciát 700 nm-en a vakpróbával szemben. Pozitív kontrollként butilezett hidroxitoluolt (BHT) és -tokoferolt használtunk.

2.8. Trolox egyenértékű antioxidáns kapacitás (TEAC) vizsgálat

AntioxidánsA COK hidroszol aktivitását egy korábban leírt módszer szerint [15,18], módosításokkal értékeltük. Röviden, a koncentrált ABTS gyökkation (ABTS• plus ) oldatot foszfáttal pufferolt sóoldattal (pH 7,4) hígítottuk 0,80 ± 0,05 végső abszorbanciára 734 nm-en. Miután (0,02 ml) mintát összekevertünk 1 ml ABTS plusz oldattal, az abszorbancia csökkenést mutatott 734 nm-en 5 perc elteltével. Troloxot használtunk standardként, és a hidroszol aktivitást TEAC-ként fejeztük ki Troloxkalibrációs görbék ábrázolásával. A hidroszol minták moláris ekvivalens TEAC értékeit a Trolox oldat abszorbanciájának csökkenése alapján számítottuk ki. Pozitív kontrollként BHT-t és -tokoferolt használtunk.

2.9. A hidroszol hatása a gomba tirozináz gátlására

GombatirozinázAz aktivitást spektrofotometriás analízissel mértük, a korábban leírtak szerint, módosításokkal [19]. Röviden, 20 µL L-tirozint vagy 20 µL L-DOPA-t PBS-ben (pH 6,8; 80 µL) és 80 µL PBS-t teszthidroszollal vagy anélkül adtunk a 96-lyukú mikrolemezekre, majd 20 µl gomba-tirozinázt (100 U/). ml) adtunk hozzá. Keverés és 37 ◦C-on 20 perces inkubálás után a reakcióelegyben a dopakrómtermelést (vagy fogyasztást) 475 nm abszorbancián határoztuk meg. Pozitív kontrollként a tirozinázt gátoló kojsavat használtuk. A tirozináz százalékos gátlását a következőképpen számítottuk ki:

Gátlás ( százalék ) ≡ {[(A − B) − (C − D)]/(A − B)} × 100 százalék

ahol A az enzimmel való abszorbanciát jelöli hidroszolminta hiányában, B az abszorbanciát enzim vagy hidroszolminta nélkül, C az enzimmel való abszorbanciát, és a hidroszolt és az abszorbanciát jelöli az enzim nélkül, de hidroszollal. 50 százalékkal is számoltunktirozináza minták gátló koncentrációi (IC50), mint azok, amelyek 50 százalékkal gátolják a tirozináz aktivitást.

2.10. A gomba tirozináz gátlásának kinetikai elemzése

A reakcióelegyek 20 µL L-tirozint vagy L-DOPA-t (0,25 mg/ml) tartalmaztak szubsztrátként, 100 µL gomba tirozinázt (20 egység/ml) 0,2 M nátrium-foszfát pufferben ( pH 6,8) és 80 µl minden hidroszolmintából 200 µl össztérfogatban. A vizsgálatot 25 ◦C-on végeztük, és minden egyes hidroszol minta gátló kinetikájáttirozinázLineweaver–Burk parcellák segítségével elemeztük. A reciprok egyenletet a vegyes típusú nem kompetitív gátlásból származó gyors egyensúly megteremtésére használták, amint azt az (1) egyenlet is kifejezi [20]. A hidroszolminták Ki-értékeit lejtős átrajzolással becsülték meg (2. egyenlet). A hidroszolra vonatkozó Ki értékeket az 1/v tengely metszésponti átrajzolásából számítottuk (3. egyenlet),

ahol Vmax a maximális sebességetirozinázaktivitás, Ks a szubsztrát disszociációs állandója (S) az enzim-szubsztrát komplexből (ES), Ki az inhibitor disszociációs állandója[I] az enzim-inhibitor komplexből és Ki az inhibitor disszociációs állandója az enzim-szubsztrátból -inhibitor komplex (ESI).

2.11. Sejtkultúra és sejtéletképességi vizsgálatok

A B16-F10 melanomasejteket (BCRC60031) a tajvani Bioresource Collection and ResearchCentertől (BCRC) szereztük be. A B16-F10 sejteket 10% FBS-t tartalmazó Dulbecco módosított Eagle-tápközegben (Gibco, California, USA) tenyésztettük 37 ◦C-on 5% CO2-ban. Tripszinezéssel a sejteket összegyűjtöttük. A sejtek életképességét 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazoliumbromid (MTT) vizsgálattal mértük, Lee [15] leírása szerint. ].

2.12. A celluláris melanin tartalma

A melanintartalmat a Lee által leírt módszerrel mértük. [15]. Röviden: B16-F10 sejteket tenyésztettünk 6-lyukú lemezeken 0,8 × 105 sejt/lyuk sűrűséggel, majd 24 órán keresztül inkubáltuk. A sejteket ezután 100-nM -melanocita-stimuláló hormonnal (-MSH), kojsavval (pozitív kontroll) és hidroszollal kezelték különböző koncentrációkban 24 órán keresztül. Miután kétszer mostuk PBS-sel, a sejteket 100 mM nátrium-foszfátot (pH 6,8), 1% Triton X-100-t és 0,1 mM fenil-metánszulfonil-fluoridot tartalmazó pufferben lizáltuk, és -80 ◦C-on 30 percig tároltuk. A sejtek összegyűjtése után a sejtüledéket 10% DMSO-t tartalmazó 1 N NaOH-ban oldottuk 65 °C-on 1 órán át. Ezt követően az abszorbanciát 405 nm-en mértük.

2.13. Western Blot

A sejteket a 2.11. szakaszban leírtak szerint lizáltuk, és Western-blot-vizsgálatnak vetettük alá MITF fehérje kimutatására, anti-MITF antitestet használva.

2.14. DNS-védelmi vizsgálatok

Az oxidatív DNS-károsodást úgy határoztuk meg, hogy a cirkuláris szuperspirálos pCI neoplazmid DNS-t bevágott cirkuláris vagy tovább degradált formákká alakítottuk, egy korábban leírt módszerrel [21,22], kis módosításokkal. A 20 µl-es reakcióelegyek 2,5 µl szupertekercses pCI neo-t (150 ng/µL), 10 µl Fenton reakcióoldatot tartalmaztak, amely 30 mM hidrogén-peroxidot, 100-µM vas-kloridot és 100 µl-t tartalmazott. µM aszkorbinsav 20 mM Tris-HCl pufferben (pH 7,6), és 5 µL hidroszol (0,3325–5,32 mg/ml) vagy kvercetin (pozitív kontroll; 250 µg/ml). A reakcióelegyeket 37 °C-on 30 percig inkubáltuk, majd a plazmid DNS-formákat 0,7%-os agarózgélen választottuk el, és SafeView™ (Applied Biological Materials (ABM) Inc., Richmond, Kanada) segítségével megfestettük.

Félig számszerűsíteniantioxidánsA kivonatok aktivitását, a pCI neo szuperspirált és bemetszett formáinak mennyiségét AlphaImager Mini (proteinsimple) műszerrel, az agaróz gélek sávintenzitását pedig Gelpro szoftverrel határoztuk meg. Negatív és pozitív kontrollként a pCI neoplazmidot önmagában, illetve a Fenton reagens keverékkel inkubáltuk. Az adatokat a szuperspirált DNS mennyiségeként fejezzük ki a negatív kontrollok mennyiségéhez viszonyítva (100%). A kivonatok védőaktivitását a szuperspirált és bevágott plazmid DNS mennyiségeiből számítottuk ki a következő egyenletek alkalmazásával [23]:

Supercoiled plazmid védelme (százalék) =supercoiled forma intensitypCI neo DNS sáv intenzitás × 100

A bevágott plazmid védelme ( százalék ) =nick form intensitypCI neo DNS sáv intenzitás × 100

2.15. Statisztikai analízis

Minden adat átlag ± szórás (SD) formában van kifejezve. A kezelések közötti különbségeket Student-féle t-teszttel vagy ANOVA-val, majd Scheffe-teszttel határoztuk meg. A különbségeket akkor tekintettük szignifikánsnak, ha p <>

3. Eredmények és megbeszélés

3.1. Illékony vegyületek azonosítása hidroszolban

A hidroszolok tartalmát GC/MS alkalmazásával elemeztük. A komponenseket a standardok retenciós ideje alapján határoztuk meg, és a mennyiségeket az eluensek csúcsterületei alapján határoztuk meg (2. ábra). Amint az a 2A–D. ábrákon látható, a transz-fahéjaldehid, benzaldehid és fahéj-acetát voltak a COK-hidroszol fő vegyületei, és jelen voltak 87,7 százalék, 70 százalék és 5,3 százalék. Az eugenolt korábban 7,29 százalékban találták a C. verum illóolajaiban [24], de a jelenlegi COK-hidroszolban nem mutatták ki (2. ábra). Az extrakciós eljárások és a vizsgálati módszerek különbségei hozzájárulhatnak a C. cassia illóolajok fahéjaldehid-tartalmának különbségeihez [25].

3.2. A COK levelekből származó hidroszol antioxidáns tulajdonságai

3.2.1. DPPH gyökfogó tevékenység

A 3A. ábrán az 1.06×10-2-től 5,32×10-1 mg/mL-ig terjedő hidroszolok DPPH gyökfogó aktivitása 5.04 között volt. százalék ± 0,96 százalék és 41,76 százalék ± 2,50 százalék. Ezek az adatok a COK hidroszol dózisfüggő gyökfogását jelzik. Összehasonlításképpen, a pozitív kontrollok BHT és -tokoferolok a DPPH-reaktív gyökök 94,32 ± 0,08 százalékát, illetve 93,82 ± 0,13 százalékát nyelték ki 0,5 mg/ml-nél. A COK hidroszol gyökfogó aktivitása nagy valószínűséggel a cinnamaldehidnek köszönhető. ).Számos tanulmány kimutatta, hogy a fenolok és flavonoidok hidrogénatomok adományozásával megakadályozzák a DPPH gyökök képződését. Ezért a Cinnamomum fajok DPPH gyökfogó aktivitása hidrogéndonor hatást is tükrözhet [26,27].

3.2.2. Fémion kelát

A hidroszolok Fe2 plusz kötőképességét 1,06 × 10–3 és 5,32 × 10–1 mg/ml értékeknél értékeltük, a 3A. ábra szerint. A hidroszolkomponensek fémkelátképzése kismértékben nőtt a koncentrációval, de 6 mg/ml-nél az EDTA kelátképző aktivitásának csak 37,3 százaléka volt (3A. ábra).

3.2.3. Teljesítmény csökkentése

Amint a 3A. ábrán látható, a hidroszol komponensek redukálóereje koncentrációfüggő volt, és nagyobb volt, mint a BHT és -tokoferol (0,22 ± 0.01 és {{9) }},33 ± 0,15) 0,5 mg/ml-nél. Korábbi vizsgálatokban a C. osmophloeum gallyakból származó nyers kivonatok redukálóereje a BuOH-frakciókban volt a legmagasabb az összes frakció között, és lineárisan nőtt a koncentrációval [28].antioxidánsA potenciálok különböznek a kivonatokban lévő vegyületek között, a kivonatok általános antioxidáns hatása erősen függ az extrakciós oldószertől. A C. osmophloeum gallyakból származó vízkivonatok redukáló ereje (OD-értéke {0}},7) azonban hasonló volt (OD-értéke=0,66 ± 0,01) a jelenlegi C-éhoz. osmophloeum hidroszolok (3A. ábra), amelyeket gőzdesztillációval állítottak elő. A redukáló hatás általában redukálószerek jelenlétével és antioxidáns aktivitással jár, ami a szabad gyökös láncreakciók leállását tükrözi redukáló hidrogénatomok biztosításával. A C. osmophloeum redukáló ereje valószínűleg a fenolos vegyületekben található hidroxilcsoportoknak köszönhető (2. ábra), amelyek elektrondonorként működhetnek.

3.2.4. TEAC Assays

A jelen hidroszol TEAC-értékei 5,32 × 10-3 mg/ml-nél magasabb koncentrációban növekedtek, és nagyobbak voltak, mint a referenciavegyületek - tokoferol és BHT értékei, amint az a 3A. ábrán látható. Ennek megfelelően a jelen hidroszol összetevők fenilcsoportjai valamivel kevésbé gátoltak, mint a Troloxé.

3.2.5. A TPC-k és az antioxidáns aktivitások közötti összefüggések

Ahogy a 3B. ábra mutatja, rendkívül szignifikáns korreláció volt a TPC-k és a DPPH szabadgyök-fogó aktivitása között GAE-nél 1,75 ± 0,438 és 100,41 ± 1,581 mg/g között. . A TPC és a DPPH szabadgyök-fogó aktivitás, FIC aktivitás, redukáló teljesítmény és TEAC korrelációs együtthatói 0,980, 0,925, 0,967 és 0,902 voltak (3B. ábra). Ezek az adatok együttesen azt mutatják, hogy aantioxidánsA COK hidroszolok aktivitása szorosan összefügg a fenoltartalommal.

3.3. A COK hidroszol koncentráció hatása a tirozináz aktivitásra

Meghatároztuk a COK hidroszol koncentráció hatását az L-tirozin és L-DOPA gomba általi oxidációjára.tirozinázés összehasonlítást végeztek a kojsav aktivitásával, amely egy jól ismert tirozináz inhibitor (3C, D ábra). A jelen hidroszol erősen és dózisfüggően gátolta a gomba tirozináz L-tirozin és L-DOPA oxidáz aktivitását (3C. ábra), de nagyobb tirozináz gátló aktivitást mutatott L-tirozin szubsztrát jelenlétében (monofenoláz aktivitás), mint az L-DOPA (difenoláz aktivitás). A kojsav monofenoláz és difenoláz aktivitással szembeni IC5{{10}} értéke 4.0 × 10-5 és 7,8 × 10-3 mg/ml (3C. ábra), rendre szignifikánsan több, mint a jelen hidroszolé (7,96 × 10-4 mg/ml, illetve 0,35 mg/ml; 3D ábra). Ezért a 90 százalékos tirozináz gátló aktivitás (monofenoláz aktivitás) eléréséhez 0,52 mg/ml és 4,0 × 10-3 mg/ml hidroszolra és 4,0 × 10–3 mg/ml koncentrációra volt szükség, amikor L-tirozint használtak szubsztrátként (3C, D ábra). ). Bár a tirozináz gátló hatások magasabb koncentrációjú COK-hidroszoltán-kojinsav-koncentrációt igényelnek, ezekben a kísérletekben erős tirozináz-gátló aktivitást mutattak ki.

KülönféletirozinázA preparátumok, az aktivitási vizsgálati módszerek, valamint az inhibitorok tisztasága és komponensei hozzájárulhattak az enzimgátló kinetika különbségeihez [29]. A növényi kivonatok biológiai aktivitásához azonban hozzájárulnak azok bioaktív komponensei, amelyeket a növényfaj, a betakarítási idő, az évszak, a földrajzi eredet, a mezőgazdasági gyakorlat és az extrakciós módszerek befolyásolhatnak. Számos újabb tanulmányban azonosítottak és jellemeztek természetes forrásokból származó inhibitorokat, és a gátló hatások és a természetes összetevők közötti összefüggések jól megalapozottak (1. táblázat). Különösen sok aldehidet és más vegyületet izoláltak és jellemeztek tirozináz-inhibitorként. Ide tartozik a fahéjaldehid, a 2-hidroxi-4-metoxi-benzaldehid, az ánizsaldehid, a köményaldehid, a köménysav, a flavonolok, a flavonok és az izoflavánok [4,19,30–37]. A jelen hidroszol 87,7 százalék fahéjaldehidet és 7,0 százalék benzaldehidet tartalmazott, ami arra utal, hogy a fahéjaldehid, majd a benzaldehid a fő anyag, amely felelős a hidroszol tirozináz gátló aktivitásáért. Az 1. táblázattal összhangban azt találtuk, hogy a benzaldehidet tartalmazó hidroszolban nagyobb a benzaldehid. mint a tiszta fahéjaldehid, és fokozza atirozináza hidroszol gátló aktivitása. Azt is megerősítették, hogy a benzaldehid gátolja mind a difenoláz aktivitást, mind a fungitrozináz monofenoláz aktivitását [38]. A benzaldehid típusú inhibitorok tirozináz gátló mechanizmusa feltehetően abból adódik, hogy az enzimben egy primer aminocsoporttal Schiff-bázist képeznek [33,39]. A benzaldehid para pozíciójában egy elektrondonor csoport hozzáadása növeli a tirozináz gátló aktivitást, valószínűleg stabilizálja a Schiff-bázist.

3.4. A gomba tirozináz gátlásának kinetikai módjai a COK hidroszollal

Vizsgáltuk a hidroszol kinetikai viselkedését a monofenolázra és a tirozináz difenoláz aktivitására L-tirozint és L-DOPA-t használva szubsztrátként. Aztirozináza hidroszol inhibitorokinetikáját Lineweaver–Burk kettős reciprok diagramok segítségével elemeztük, amint az a 4. ábrán látható. A 4A, B ábrán a négy vonal a nem gátolt enzimet (1. sor) és a gátlást három hidroszolkoncentrációval (2. sor – 4. sor) jelzi, és ezek a vonalak az 1/V tengelytől balra metszik egymást az 1/S tengely felett. Gátlás nélküli kísérleti körülmények között a tirozináz által katalizált L-tirozin és L-DOPA oxidációs reakció maximális sebessége (Vmax) {{10}},055 ∆OD475/min és 0,096 ∆OD475/perc volt, tartalom nélkül. hidroszol (1. sor a 4A, B ábrán), ill. A gomba kinetikai paraméterei Km (Michaelis állandó).tirozinázA Lineweaver–Burk grafikonból származó, L-tirozint és L-DOPA-t szubsztrátként használva azt mutatják, hogy Km 0,534 mg/ml és 0,511 mg/ml volt hidroszol nélkül (vonal) 1. ábra a 4A, B) ábrán.

A nem gátolt enzimből és három különböző koncentrációjú hidroszolból nyert négy vonal az 1/V tengelytől balra metszi egymást az 1/S tengely felett. A megnövekedett hidroszolkoncentráció csökkent Vmax-ot és megnövekedett Km-t eredményezett. Pontosabban, amikor L-tirozint használtak szubsztrátként, a növekvő hidroszolkoncentráció több, különböző meredekségű és metszővonalat eredményezett, amelyek azonban a második kvadránsban metszették egymást (4A ábra 1–4. sora). Hasonló eredményeket kaptunk, amikor L-DOPA-t használtak szubsztrátként (4B. ábra 1–4. sora), alátámasztva azt az állítást, hogy a hidroszol vegyes típusú tirozináz inhibitorokat hordoz. A vegyes típusú gátlásnak megfelelően a hidroszol komponensek valószínűleg megkötik a szabad enzimet és az enzim-szubsztrát komplexet. A vegyes típusú gátlások sokféleképpen jöhetnek létre: a hidroszol gátlása abból adódhat, hogy a reakciómintázatban kölcsönhatásba lépnek a későbbi intermedierrel, de nem a kezdeti enzim-szubsztrát komplexszel [40]. Így meghatároztuk a disszociációs állandókat (Ki és Ki, rendre) a szabad enzimhez (E) és az enzim-szubsztrát komplexhez való kötődésének inhibitora esetében kettős reciprok diagramokat, valamint a lejtőn és a függőleges metszéspont görbéit alkalmazva a hidroszol koncentrációi függvényében L-tirozin (4C, D ábra) vagy L- jelenlétében. DOPA mint szubsztrátum (4E, F ábra). Amint a 4A, B ábrán látható, a Ki-érték, amikor L-tirozint használtak szubsztrátként, körülbelül 1,28-szor alacsonyabb volt, mint az L-DOPA jelenlétében, ami azt jelzi, hogy az L-tirozinnal hatékonyabb gátló enzimkötődéssel, mint az L-DOPA-val. Ezenkívül a Ki értéke 1,71-szer nagyobb volt, mint az L-DOPA oxidációjának Ki értéke, ami azt jelzi, hogy a hidroszol komponensek affinitása a szabad enzimhez erősebb, mint az enzim-szubsztrát komplexé. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a hidroszol befolyásolja az affinitását az L-DOPA enzim, de nem köti meg az aktív helyet. Ráadásul a Ki értéke közel azonos volt az L-tirozin oxidációjának Ki értékével, ami azt jelzi, hogy a kevert inhibitorok a nem kompetitív inhibitorok, amelyek L-t használva azonos egyensúlyi állandóval kötődnek egy szabad enzimhez és egy enzim-szubsztrát komplexhez. szubsztrátként tirozint (4A. ábra). Azonban a szabad enzim és az enzim-szubsztrát komplex egyensúlyi kötési állandója eltérő, ha L-DOPA-t használunk szubsztrátként (4B. ábra), ami azt jelzi, hogy a kevert típusú (kompetitív és nem kompetitív kevert) inhibitor nem csak egy szabad enzim, hanem az enzim-szubsztrát komplexszel is, szubsztrátként L-DOPA-t használva. Korábbi tanulmányok azt is feltárták, hogy a C. cassia illóolaj és a fahéjaldehid kevert típusú inhibitorok [19]. Ezzel szemben a C. cassia kérgéből izolált transz-fahéjaldehid kompetitív gátlást mutatott az L-DOPA gomba általi oxidációjábantirozináz[32], míg a fahéjaldehidet a P gyökeréből izolálták. cernua nem kompetitív gátlás volt [35].

3.5. A hidroszolkoncentrációk koncentrációfüggő hatásai a melanogenezisre

A hidroszolnak a sejtek életképességére és a melanogenezisre gyakorolt ​​hatásának vizsgálatához változó koncentrációknál ({0}},0035–10,64 mg/ml), melanogenezist indukáltunk B16-F10 melanomasejtekben -MSH segítségével, és összehasonlítottuk a kojsav pozitív kontrollként történő alkalmazásával (5. ábra). Ennek a sejtéletképességi vizsgálatnak az eredménye azt mutatta, hogy a hidroszolnak nem volt citotoxicitása 0,0035–1,064 mg/ml koncentrációban a B16F10 melanoma sejtekben (5a. ábra). A melanogenezis-gátlók fejlesztése során számos alkalmazásnál a biztonság és a hatékonyság a legfontosabb szempont. A B16F10 melanoma sejtek hidroszollal történő kezelése azonban a sejtek életképességének jelentős csökkenését eredményezte 5,32-10,64 mg/ml koncentrációban. A biztonságosság és hatásosság vizsgálatának eredményei szerintbőrfehérítéstermékek B16F1{5}} sejttenyészetekben, az 1,064 mg/ml a sejtalapú elsődleges szűrés küszöbkoncentrációja. Ezért 0,1064-1,064 mg/ml koncentrációkat használtunk a B16F10 melanomasejtekben lévő anti-tirozináz mechanizmusának hidroszollal történő vizsgálatára.

A melanogenezis hidroszolos kezelésekkel történő visszaszorítását különböző koncentrációkban a sejtek melanintartalmának aszpercenciaértékeként határoztuk meg (5b. ábra). Elemeztük a MITF expressziós szintjeit is Western blotting segítségével (5c. ábra). Ezekben a kísérletekben a melanintartalmat és a MITF expressziós szinteket dózisfüggően elnyomta a COK hidroszol, ami arra utal, hogy a COK hidroszol csökkenti a sejtek melanintartalmát azáltal, hogy elnyomja a MITF szintézist.

3.6. DNS-védelmi vizsgálatok

A reaktív oxigénfajtákról köztudott, hogy károsítják a DNS-t, és sejtöregedést és rákot okoznak. A DNS-nicking tesztek kényelmes sejtmentes modellrendszert kínálnak a DNS-károsító gyökök képződésének érzékeny meghatározására [41]. Ezekben a kísérletekben a Fenton-reakciók hidroxil gyököket hoztak létre, amelyek a szupertekervényes plazmid DNS-t hasítják, és a DNS bemetszett formájává alakítják, amely csökkenti a delektoforetikus mobilitást. [42,43]. Így a hidroszol DNS-védő aktivitásának értékeléséhez a pCI neo DNS-t a Fenton reaktánsokkal inkubáltuk [44]. Amint az a 6. ábrán látható, a szuperspirált és bevágott plazmidformák egyértelműen megkülönböztethetők az agaróz gélen mutatott relatív elektroforetikus mobilitásuk alapján; A szuperspirált DNS mozgott a leggyorsabban, a bevágott DNS pedig a leglassabban. A hidroszolos kezeléseket követően a DNS-károsodás enyhén csökkent 1,33-5,32 mg/ml hidroszolkoncentrációnál, a szuperspirált forma 28-58 százalékos védelmével (6-8. sáv). 0,3325–0,665 mg/ml hidroszolkoncentrációnál nem figyeltek meg védelmet a negatív kontrollhoz képest (4. és 5. sáv). Ezzel szemben a kvercetin hatékonyan védte a plazmid DNS-t a hidroxilgyököktől. közvetített fragmentáció, amint azt korábban bemutattuk [45]. Ezek az első adatok, amelyek a C-ből származó hidroszol-kivonatok védő hatását mutatják. Az osmophloeum Kanehira a Fenton-reakciók által okozott DNS-károsodást okozza. Ezek a hatások valószínűleg a polifenolvegyületek jelenlétének köszönhetők.

4. Konklúziók

A COK-ot régóta használják gyógynövényként Tajvanon. Tudomásunk szerint azonban ez az első jelentés, amely bizonyítja, hogy a COK levelekből gőzdesztillációval előállított hidroszolok antioxidáns hatással rendelkeznek, amint azt aantioxidánsaktivitás és DNS-károsodás. Azt is kimutattuk, hogy ez a hidroszol elnyomja a melanogenezist. A GC/MS analízisek során a COK-hidroszolban a főbb vegyületek a fahéjaldehid és a benzaldehid voltak, és ezek a szerek erősen gátolják a tirozináz monofenoláz és difenoláz aktivitását. A tirozináz gátlás kinetikájának értékelése során a COK hidroszol vegyes típusú dózisfüggő gátlást mutatott mind az L-tirozin, mind az L-DOPA oxidáz aktivitásában.tirozináz. A jelen hidroszolvegyületek az MITF fehérje expresszióját is elnyomták, ami az -MSH által kiváltott melaninszintézis csökkenéséhez vezetett.

Végül a tirozináz-inhibitorok esetében a biztonság fontos szempont, különösen a kozmetikai és élelmiszeripari termékek esetében, amelyek szabályozott mennyiségben használhatók. A COK már ehető és széles körben használt természetes adalékanyag élelmiszerekben és kozmetikumokban. Ezenkívül a fahéjaldehidet általánosan elismerik emberi fogyasztásra biztonságosnak. A COK hidroszol egy kiváló természetes bioanyag, hatékony és biztonságostirozinázvalamint a melaninszintézist gátló aktivitás és a DNS-károsodás elleni védelem lehetősége. Ezért úgy gondoljuk, hogy a COK hidroszol biztonságos és hatékony depigmentáló szerként használható számos alkalmazáshoz.