Egy új homozigóta KLHL3 mutáció az autoszomális recesszív pszeudohipoaldoszteronizmus okaként, amelyet későn diagnosztizáltak II.
Nov 02, 2023
Absztrakt bevezetés:
A II-es típusú pszeudohipoaldoszteronizmus (PHA II) egy mendeli rendellenesség, amely hiperkalémiás acidózissal és alacsony plazma reninszinttel jár, amely jellemzően magas vérnyomással társul. A WNK1, WNK4, CUL3 és KLHL3 mutációi PHA II-t okoznak, a WNK1, WNK4 és CUL3 domináns mutációival, a KLHL3-ban pedig domináns vagy recesszív mutációk. Tizennégy recesszív KLHL3 mutációval rendelkező családról számoltak be, 3 hónapos és 56 éves kor között diagnosztizálták, jellemzően normális veseműködésű egyéneknél.
Módszerek: Klinikai és genetikai vizsgálatokat végeztünk hyperkalaemiás magas vérnyomásban szenvedő betegen, és molekuláris dinamikai szimulációkat, heterológ expressziót COS7 sejtekben és Western blottingot alkalmaztunk a KLHL3 jelölt betegségmutáció WNK4 fehérje expresszióra gyakorolt hatásának vizsgálatára.
KATTINTSON IDE A CISTANCHE NÖVÉNYI KÉSZÍTMÉNYÉNEK SZEREZÉSÉHEZ
Eredmények: A beteg, egy 58-éves, rokon családból származó nő magas vérnyomást, súlyos izomfájdalommal járó tartós hyperkalaemiás acidózist, nephrolithiasist, krónikus vesebetegséget (CKD) és koszorúér-betegséget mutatott. A hidroklorotiazidos terápia korrigálta a hyperkalaemiát, a magas vérnyomást és az izomfájdalmat. A genetikai elemzés homozigóta p.Arg431Trp mutációt mutatott ki egy erősen konzervált KLHL3 pozícióban. A szimulációk a mutáns fehérje csökkent stabilitására utaltak, amit Western blot igazolt. A vad típusú KLHL3-hoz képest a p.Arg- 431Trp KLHL3 kotranszfekciója megnövekedett WNK4 fehérjeszinthez vezetett, ami arra következtethető, hogy a tiazid-érzékeny hordozón és a PHA II-n keresztül fokozott NaCl reabszorpciót okoz.
Következtetések: Még a késői életkorban jelentkező és CKD jelenléte esetén is PHA II-re kell gyanakodni, ha alacsony a reninszint, és a hyperkalaemiás acidózis és a magas vérnyomás nem megfelelő a CKD stádiumához, különösen gyanús családi anamnézis esetén.
Bevezetés
A szisztémás artériás hipertónia több mint 1,1 milliárd felnőttet érint világszerte [1], és világszerte a legjelentősebb módosítható kockázati tényezőnek tekintik a minden okból kifolyólag megbetegedést és mortalitást [2]. A felnőtt betegek hozzávetőleg 90%-a úgynevezett primer vagy esszenciális hipertóniában szenved multifaktoriális génkörnyezeti etiológiával [2], míg a többieknél a hypertonia kiváltó oka azonosítható. A másodlagos magas vérnyomás gyakori okai az elsődleges aldoszteronizmus, az obstruktív alvási apnoe, a parenchymás vesebetegség és a veseartéria szűkület [3]. Ritka esetekben a magas vérnyomás monogén tulajdonságként öröklődik. Az érintett betegek jellemzően alacsony plazma reninszinttel rendelkeznek, míg az aldoszteron- és elektrolitszintek a mögöttes etiológiától függően változnak [4]. A magas vérnyomás mendeli formái gyakran gyermek- vagy fiatalkorban jelentkeznek. Felnőtteknél ritkán vizsgálják a monogén eredetű magas vérnyomást; így elterjedtsége az általános populációban továbbra is ismeretlen. Egy kiválasztott kohorszban (az alábbi kritériumok közül legalább az egyik: életkor kezdetben 35 évnél kisebb vagy egyenlő, rezisztens magas vérnyomás, magas vérnyomás elektrolit-rendellenességgel, hormonális rendellenességek, kóros képalkotó eredmények vagy szuggesztív klinikai tünetek) 37 jelölt gént szűrtek, és 1179 esetből 33-ban (2,8%) azonosítottak patogén vagy valószínű patogén variánsokat [5].
Ez a tanulmány a II-es típusú pszeudohipoaldoszteronizmusra (PHA II), a mendeli hipertónia egy olyan formájára összpontosít, amely hyperkalaemiás acidózissal és alacsony plazma reninszinttel jár [6]. A PHA II-t családi hyperkalaemiás magas vérnyomásnak is nevezik. Először 1964-ben Paver és Pauline írták le egy fiatal férfiban, aki súlyos magas vérnyomásban és hyperkalaemiában szenvedett az egyébként normális vesefunkció ellenére [7], akit Stokes és munkatársai [8], valamint Arnold és Healy [9] is jellemeztek, és kimutatták, hogy alacsony. plazma renin. Gordon és munkatársai 1970-ben egy alacsony termetű, magas vérnyomású, súlyos hyperkalaemiás, enyhe acidémiás, időszakos bénulásos és szuppresszált renin-szintű lányról szóló 10-éves kislányról szóló beszámolót követően. [10], a szindrómát időnként Gordon-szindrómának is nevezik.
2001-ben a nem-lizin (WNK) szerin-treonin kináz gén WNK1 és WNK4 mutációit azonosították a PHA II okozójaként [11], és további mutációkat a KLHL3-ban (kelch-like 3-at kódoló) és CUL3-ban (kódoló). cullin 3) géneket 2012-ben írták le [12, 13]. A WNK1, WNK4 és CUL3 mutációi által okozott PHA II alformák autoszomális domináns rendellenességek, míg a KLHL3 mutációk autoszomális domináns vagy autoszomális-recesszív módon öröklődnek [12]. A KLHL3 egy N-terminális BTB domént, majd egy BACK domént és egy C-terminális hatlapátú propeller szerkezetet tartalmaz, amely úgynevezett kelch-szerű ismétlődésekből áll (az 1d, 2a ábrákon látható). A domináns KLHL3 mutációk a propeller lapátjaiban vagy azok között csoportosulnak, míg a recesszív mutációk a fehérjében eloszlanak [12]. A recesszív esetek kevésbé gyakoriak, mint a domináns esetek; összesen 14 recesszív KLHL3 mutációval rendelkező családból 21 beteget publikáltak [12–15] (1. táblázat).
A PHA II-ben a magas vérnyomás mögött meghúzódó patofiziológia a megnövekedett NaCl-reabszorpció a tiazid-érzékeny hordozón (Na-Cl kotranszporter, NCCT) keresztül a vese disztális kanyargós tubulusában, és a tiazid-terápia korrigálja mind a magas vérnyomást, mind az elektrolit-rendellenességeket PHA II-ben szenvedő betegeknél. [16]. Röviden, a WNK1 és a WNK4 foszforilálja az OSR1-et (oxidatív stresszre reagáló 1. gén) és a SPAK-ot (Ste{8}}rokon prolin-alaninban gazdag kináz), amelyek aztán foszforilálják és aktiválják az NCCT-t [17, 18]. A KLHL3 a CUL3 ubiquitin ligáz szubsztrát adaptere; a KLHL3-CUL3 komplex ubiquitinilezi a WNK kinázokat, és így elősegíti azok lebomlását [19]. Az ubiquitin ligáz funkció elvesztése vagy a WNK kinázokhoz való kötődés csökkenése megnövekedett WNK abundanciát, fokozott NCCT foszforilációt [18] és megnövekedett NaCl abszorpciót okoz a distalis csavart tubulusban. A nefron későbbi szakaszaiban az ENaC-n (epiteliális nátrium-csatorna) keresztül történő NaCl-reabszorpció és a ROMK-n (renalis külső medulláris káliumcsatorna) keresztüli K+-kiválasztás csökken [20, 21]. A KLHL3 knockout egerek a disztális, csavarodott tubulus hipopláziáját, erősen megnövekedett WNK1 és WNK4 szinteket, valamint fokozott OSR1, SPAK és NCC foszforilációt mutatnak a vesében. Továbbá hyperkalaemiát, hyperchloraemiát és metabolikus acidózist mutatnak [22]. Itt beszámolunk egy autoszomális-recesszív PHA II-es betegről, és jellemezzük a mögöttes genetikai mutációt és patofiziológiát
Anyagok és metódusok
DNS-előkészítés és Sanger-szekvenálás A DNS-t perifériás vénás vérmintából állítottuk elő a QIAamp DNA Blood Maxi Kit (Qiagen) segítségével a gyártó utasításai szerint. A genomi DNS standard PCR-jét és direkt kétirányú Sanger-szekvenálását a KLHL3 [13], WNK1 és WNK4 [11], valamint a CUL3_9F (5′-AGGAGACACTTTCTCAAACCG-3′) számára publikált primerek felhasználásával végeztük. és CUL3_9R (5′-TGTTCTTCTCCAAAACAATCTACC-3′) primerek a CUL3 számára. A Sanger szekvenálást az Eurofins Genomicsnál végezték.
Sorozat igazítása
A homológ fehérjeszekvenciákat az NCBI Protein BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) és az eggNOG adatbázis (http://eggnogdb.embl.de) segítségével azonosítottuk. A bemutatott szekvenciák közé tartozik az emberi KLHL3 és ortológjai: Homo sapiens (NP_059111.2), Mus musculus (NP_001349344.2), Gallus gallus (XP_015149442.1), Danio rerio (XP_021328460.1), Ciona intestinalis (XP_009862126.1), Drosophila melanogaster (NP_724095.1) és Caenorhabditis elegans (NP_001254310.1) . Az emberi paralógokat szakirodalmi kutatások azonosították, és a KLHL1-től KLHL42-ig terjednek, amint az az online kiegészítő 1. táblázatban látható (az összes online beszerzési anyagot lásd: www.karger.com/doi/10.1159/000521626) [23]. A szekvenciákat a Jalview 2.10.5-ös verziójával igazítottuk [24]. A tartománystruktúra az UniProt-tól származott (Q9UH77, elérve 2021. április 13-án), és a DOG segítségével vizualizáltuk [25].
Plazmidok és helyspecifikus mutagenezis
A pTRE2hyg WNK4 és pFN21A KLHL3 plazmidok Dr. Shinichi Uchida (Tokiói Orvosi és Fogászati Egyetem) kedves ajándékai voltak. A p.R431W mutáció bevezetéséhez primereket terveztünk a Primer X (https://www.bioinformatics.org/primerx) segítségével: 5′- GATGAACACGCGGTGGAGCAGTGTGG -3′ (KLHL3_ R431W{{10} }F) és 5′- CCACACTGCTCCACCGCGTGTTCATC -3′ (KLHL3_R431W_1R). A mutáns maradékok félkövéren vannak szedve. A helyspecifikus mutagenezist a QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit segítségével hajtottuk végre PfuUltra High-Fidelity DNS polimerázzal (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) a gyártó utasításai szerint. A cDNS-t Sanger-szekvenálták az Eurofins Genomicsnál. A plazmidokat a QIAGEN Plasmid Plus Maxi Kit segítségével állítottuk elő.
Szövettenyésztés, átmeneti transzfekció és Western blot
A COS7 sejteket DMEM + L-glutamin, 10% FBS és 1% penicillin/sztreptomicin (mind Gibco, Thermo Fisher) tápközegben tenyésztettük. A transzfekciókhoz a sejteket 6-lyuklemezekre oltottuk 1,9 × 105 sejt/lyuk sűrűségben, és körülbelül 90%-os sűrűségre növesztettük. A sejteket 1 µg pTRE2hyg WNK4-gyel és 2 µg pFN21A-val (üres vektor vagy KLHL3 vad típusú [WT]) vagy KLHL3 R431W cDNS-sel transzfektáltuk Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint. Két független klónt használtunk a transzfekcióhoz. Negyvennyolc órával a transzfekció után a sejteket hideg PBS-ben mostuk, és 10 mM Tris-HCl-ben (pH 7,5), 150 mM NaCl-ban, 1 mM EDTA-ban és 1% NP40-ben, amely teljes proteázinhibitor koktélt (Roche, Merck) tartalmazott, lizáltuk. A lizátumot 20, 000 g-vel centrifugáltuk 30 percig 4 °C-on, és a felülúszót -20 °C-on tároltuk. A fehérjekoncentrációkat két párhuzamosban (standard) vagy három párhuzamosban (minták) határoztuk meg a BCA vizsgálattal (Pierce, Thermo Fisher) a gyártó utasításai szerint. Körülbelül 20 µg teljes fehérjét frakcionáltunk SDSPAGE-val, és PVDF membránra vittük át (1,5 óra, 100 V). A membránokat 2%-os száraz tejben blokkoltuk TBST-ben. A Western-blot poliklonális nyúl anti-HaloTag (Promega #G9281, 1:500, 4 fok, éjszakán át), majd mosás és szamár IgG anti-nyúl IgG (H + L)-HRPO (Jackson ImmunoResearch # {{46) segítségével történt. }}, dianova, 1:20, 000, 1 óra szobahőmérsékleten), mosás és fokozott kemilumineszcens detektálás (Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent, GE Healthcare). A blotokat ROTIFree Stripping Buffer 2.0 (Carl Roth) segítségével eltávolítottuk, 2%-os száraz tejben blokkoltuk TBST-ben egy éjszakán át 4 °C-on, és monoklonális egér anti-FLAG M2-vel inkubáltuk (SigmaAldrich #F1804, Merck, 1:1,{69} }, 1,5 óra szobahőmérsékleten), majd szamár IgG anti-egér IgG (H + L)-HRPO (Jackson ImmunoResearch # 715-035-151, dianova, 1:20,000, 1 óra szobában hőmérséklet), ECL detektálás, sztrippelés és blokkolás a fentiek szerint. A blotokat ezután monoklonális egér anti- -aktinnal (Sigma-Aldrich # A2228, Merck, 1:5000, 1 óra szobahőmérsékleten) és szamár IgG anti-egér IgG-vel inkubáltuk, majd ismét ECL-detektálást végeztünk. A sávokat az Image Lab szoftverrel határoztuk meg ChemiDoc XRS+ (Bio-Rad) készüléken. Az anti-HaloTag antitest és az anti-FLAG M2 antitest által kimutatott sávok intenzitását elosztottuk az anti- - aktin antitestek által kimutatott sávok megfelelő intenzitásával. A KLHL3 expressziós szintjének meghatározásához a sejteket a fentiek szerint transzfektáltuk, azonban 0 µg, 0,5 µg, 1 µg, 2 µg, 4 µg és 8 µg pFN21A KLHL3 WT vagy R431W alkalmazásával. A gélelektroforézist és a blottolást a fentiek szerint végeztük. A cikloheximid chase vizsgálathoz a sejteket a fentiek szerint oltottuk be, és a fentiek szerint transzfektáltuk, azonban 2 µg pFN21A KLHL3 WT-vel vagy 4 µg KLHL3 R431W-vel. Negyvennyolc órával a transzfekció után 100 µM cikloheximidet adtunk hozzá, és a sejteket a jelzett időpontok után lizáltuk. Az elemzés további lépései a fentiek szerint történtek.
2. ábra: A WT és a p.Arg431Trp (R431W) KLHL3 Kelch domének MD szimulációi. a Kelch-tartomány felülről lefelé nézete (PDBID: 4CH9), -propellerlapátokkal (K1–K6) színezve. A mutációs helyet egy sárga csillag jelzi, és az érdeklődésre számot tartó régió szürke színű (425–465. aminosav), a WNK4 peptid (nem szerepel a szimulációkban) pedig átlátszó és szürke színű. b Különbség a fehérjevázon feltérképezett Kelch-domén MSF-jeiben. A mutációs helyet sárga csillag jelzi. A piros szín a fehérje dinamikusabb (kevésbé stabil) részeit jelzi. c A teljes fehérje RMSD-je (fent), a 425–465. maradékok (középen) és a WNK{15}}kötőzseb (alul) a kristályszerkezetből három független szimulációs replikához (félkövér vonalak, futó átlagok). d A hbonds (balra) és a COM-távolság (középen) hegedűdiagramja a K3 (425-441 maradékok) és a K4 (442-465) - propellerlapátok és kötőzseb elektrosztatika (jobbra) között. e A K3–K4 interfész szerkezeti átfedése az egyes replikák (WT, kék; R431W, szürke) végső keretéből (1,1 μs) a kísérleti/kezdeti modellekkel (fekete). A fehérje gerincét rajzfilmként, a 431-es maradékot pálcikákként jelenítjük meg. MSF, átlagos négyzetes ingadozás.
Molekuláris dinamikai szimuláció
A WT modell a humán Kelch doménnek a WNK4 peptid fragmenssel komplexben lévő röntgenkristályszerkezetén (PDBID: 4CH9) alapult [26]. A hiányzó atomokat és a terminális sapkákat a psfgen segédprogram segítségével adtuk hozzá a vizuális molekuláris dinamika 1.9.3-as verziójában [27]. A mutáns (R431W) KLHL3 modellt a Modeller 9.18-as verziójával állították elő [28]. Az egyes rendszerek végső maradékanyag-tartománya 300–585 volt. A WT és R431W modellek N- és C-terminusait acetilezéssel, illetve N-metilamidációval semlegesítettük. A PROPKA 3.0-s verziójával végzett elemzés szerint minden titrálható maradékhoz alapértelmezett protonálódási állapotot rendeltünk [29]. A WNK4 peptidet eltávolították a termelési szimulációkból a KLHL3-tól való disszociáció miatt a kezdeti egyensúlyi szimulációk után.
Minden szimulációt a GROMACS szoftvercsomag 2021 [30] verziójával végeztünk. A CHARMM36m erőtér paramétereket fehérjeatomokra használtuk [31]. Az ionokat az alapértelmezett CHARMM paraméterekkel írták le, a vizekre pedig a TIP3P modellt [32]. A kezdeti kiegyenlítési lépéshez 1 fs-os integrációs időlépést használtunk, és minden további szimulációhoz 2 fs-t használtunk. Minden hidrogént tartalmazó kötést LINCS segítségével korlátoztunk [33]. A nem kötött Van der Waals kölcsönhatásokat a Lennard-Jones potenciál segítségével számítottuk ki 1,2 nm-es vágási sugárral; Az erők simán kikapcsoltak az 1,2-1,0 nm tartományban. Az összes elektrosztatikát a simított részecskehálós Ewald [34] módszerrel számítottuk ki 1,2 nm-es valós tér vágási távolsággal. Az izokorikus-izotermikus együttesben (NVT) végzett kezdeti szimulációt követően az összes további szimulációt az izobár-izotermikus együttesben (NPT) végeztük 310,15 K hőmérsékleten a sebesség-átskálázó termosztát [35] segítségével, 0,5 ps időállandóval. A termosztátot külön alkalmaztuk a fehérjére és az oldószerre (azaz vízre és ionokra); ugyanezeket a csoportokat használtuk a tömegközéppont (COM) mozgásának eltávolítására. 1 bar nyomást állítottunk be Berendsen [36] vagy Parrinello-Rahman [37] barosztát segítségével izotróp módon, 5 ps időállandóval.
A WT és R431W modelleket egy 1,2 × 1,2 × 1,2 nm3 kezdeti méretű kockadobozban oldották meg. Mindegyik rendszert 150 mM NaCl-dal semlegesítettük. A kezdeti legmeredekebb ereszkedési energiaminimalizálást követően minden rendszer egyensúlyba került az NVT együttesben 5 ns-ig, az összes fehérjeatom helyzetkorlátozásával. Egy következő kiegyenlítési lépést hajtottak végre az NPT együttesben 5 ns-ig, ugyanazokkal a korlátozásokkal, mint az előző lépésben. Az utolsó 5-ns egyensúlyi szimulációhoz az összes oldalláncról eltávolították a pozíciókorlátokat. A WT és R431W rendszerek független gyártási szimulációihoz az egyensúlyozás végső szakaszából három kezdeti struktúrát hoztak létre, az összes helyzetkorlátozás eltávolításával. Mindegyik termelési ismétlést 1,1 µs-ig szimuláltuk; az első 0,1 µs-t eltávolítottuk az elemzésből.
A szimulációk során a szerkezeti stabilitás felmérésére a teljes fehérje C atomjaira, valamint a K3–K4 határfelületre (425–465. aminosavak) és a kristályszerkezettől számított átlagos négyzetes eltéréseket (RMSD-ket) számítottuk ki. WNK4- kötőzseb (339., 355., 360., 386., 402., 407., 432., 449., 451., 481., 498., 528. és 577. maradék). Kiszámoltuk az RMSD-nyomok futóátlagait, és ráfedtük a nyers adatokra.
A mutáció szerkezeti stabilitásra gyakorolt hatását a fehérje C atomok átlagos négyzetes fluktuációinak különbségének kiszámításával tettük láthatóvá, átlagoltuk a keretekre és replikákra, és leképeztük a WT fehérje szerkezetére. Az összes fehérjevizualizációt ChimeraX segítségével állítottuk elő [38]. Az R431W mutáció hatását a K3 (425–441. aminosav) – K4 (442–465. maradékok) határfelületre a hidrogénkötés (H-kötés) analízissel és a két csoport közötti COM távolsággal jellemeztük. A H-kötéseket minden keretnél a GROMACS tool gmx hbond segítségével értékeltük, 3,5 Å és 30 fokos távolság- és szöglevágásokkal. A COM távolságokat hasonlóan értékelték minden egyes képkockánál – mind a Hbonds, mind a COM távolságok eloszlását hegedűdiagramként jelenítettük meg. Az átlagokat a pályák és a replikák alapján számítottuk ki.
A WNK{0}}kötőzseb elektrosztatikáját g_elpot [39] segítségével számítottuk ki. Az elektrosztatikus potenciál időbeli lefutását a kötőzsebben úgy értékeltük ki, hogy meghatároztunk egy 8 Å sugarú gömb térfogatot, amelynek középpontja a kötőzsebet alkotó maradékok geometriai középpontja. Az elektrosztatika varianciájának értékeléséhez 50-ns blokkátlagokat számítottunk ki. A WT és az R431W mutáns kötőzsebén belüli elektrosztatikus potenciál eloszlását hegedűdiagramként jelenítettük meg, 50-ns blokkokra és pályákra számított átlagokkal.
Wecistanche támogató szolgáltatása – Kína legnagyobb cisztanche exportőre:
E-mail:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel.:+86 15292862950
Vásároljon további specifikációkért:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
