Akteozid a kínai természetes növényben - Cistanche a vesebetegségek enyhítésére--I. rész

Kapcsolatfelvétel: emily.li@wecistanche.com

Az akteozid természetes terméke a NADPH/oxidáz-TGF-/Smad jelátviteli útvonal szabályozása révén javítja a vesekárosodást cukorbeteg db/db egerekben és HK-2 sejtekben

Qinwen Wang|Xinxin Dai et.al

Ez a tanulmány a védőhatások és mechanizmusok vizsgálatára készültakteozida DKD-n diabéteszes hím db/db egerekben és magas glükóz-indukált HK-2 sejtekben. A cukorbeteg db/db egereket véletlenszerűen modellcsoportra, metformin csoportra, irbezartán csoportra ésakteozidcsoport. Megfigyeltük a természetes terméketakteozidjelentős hatást fejt ki bennevesevédelembiokémiai indikátorok és endogén metabolitok elemzése, kórszövettani megfigyelések és Western blot segítségével. A magas glükózszintnek kitett HK-2 sejteket in vitro kísérletekben használtuk. A molekuláris mechanizmusokat RT-PCR és Western blot módszerrel vizsgáltuk.Acteozidmegakadályozza a magas glükóz-indukált HK-2 sejteket és a cukorbeteg db/db egereket azáltal, hogy gátolja a NADPH/oxidáz-TGF-/Smad jelátviteli útvonalat.Acteozidszabályozta a lipid metabolizmus, a glioxilát és dikarboxilát metabolizmus, valamint az arachidonsav metabolizmus zavart metabolikus útvonalát. Felfedeztük a természetes termékétakteozidjelentős hatást fejt kivesevédelem.Ez a tanulmány megnyitotta az utat a patogenezis további feltárásához, a korai diagnózishoz és a DKD új terápiás szerének kifejlesztéséhez.

KULCSSZAVAK akteozid, cukorbetegvesebetegség, metabolikus profilalkotás, NADPH/oxidáz-TGF- /Smad jelátviteli út, ROS

I. rész

Akteozid a vesebetegség kezelésére

1|BEVEZETÉS

Acteozida fenil-etanol-glikozidok reprezentatív komponense, széles körben elterjedt 79 növénynemzetségben, mint például a Rehmannia glutinosa,Cistanche deserticolaés egyéb gyógynövények.Acteozidjellemzi, hogy a kávésav és a hidroxi-tirozol észter-, illetve glikozidkötéseken keresztül egy glükózrészhez kötődik, a glükózmolekulához pedig egy ramnózegység kapcsolódik (Zhao et al., 2015). A hírek szerintakteozidszéleskörű farmakológiai hatásokkal rendelkezik, mint plvesevédelem (Gan és mtsai, 2018), antioxidáció (He et al., 2011), neuroprotekció (Li, Zhou, Xu, Song és Lu, 2018), májvédelem (Lee et al., 2004), rákellenes (Ohno) , Inoue, Ogihara és Saracoglu, 2002), és így tovább. Azonban a védő hatásokakteozidcukorbetegbenvesekárosodástisztázatlanok.

A cukorbetegség a 21. század egyik leggyorsabban növekvő globális egészségügyi vészhelyzete. 2019-ben a becslések szerint 463 millió ember szenved cukorbetegségben, és ez a szám az előrejelzések szerint 2030-ra eléri az 578 milliót, 2045-re pedig a 700 milliót. A cukorbetegség globális prevalenciája gyorsan növekszik, különösen a fejlődő világban, és a cukorbetegek előfordulásavesebetegség(DKD) és végstádiumbanvesebetegség(ESRD) tovább emelkedik (Hu, 2011). A DKD az egyik legrettegettebb diabéteszes krónikus mikrovaszkuláris szövődmény, és az ESRD fő oka. A DKD-ben szenvedő egyének minden okból bekövetkező mortalitása körülbelül 30-szor magasabb, mint a nephropathiában nem szenvedő cukorbetegeknél. A legújabb tanulmányok azt mutatjákvese-tubuláris epiteliális-mezenchimális átmenet (EMT) és extracitoplazmatikus mátrix (ECM) felhalmozódása avese-Az interstitium kulcsfontosságú tényező a DKD patogenezisében (He et al., 2015; Yao et al., 2014). Egyre több tanulmány számolt be arról, hogy a progresszió avese-A diabéteszes nephropathiában kialakuló fibrózist számos jelátviteli útvonal közvetítette. A TGF- kulcsfontosságú patogén faktorként szerepel a fibrózissal összefüggő CKD legtöbb típusában, beleértve a DKD-t is (Lv & Zhang, 2019). A heteromer jelátviteli komplex, amely a TGF- 1 II-es típusú receptorokhoz, illetve I-es típusú receptorokhoz való kötődésének eredménye, a receptor által szabályozott Smad-okon (Smad2/3) és a közös partner Smad-okon (Smad4) keresztül továbbítja a jeleket. célgének transzkripciós szabályozása (Sierra et al., 2015). A ROS felhalmozódása oxidatív stresszhez vezethet a sejtben, ami a sejtkomponensek, köztük a fehérje és a DNS károsodásához vezethet. Végül az oxidatív stressz vezetvese-fibrózis és csökkenéseveseműködés. A NADPH-oxidázok (NOX) a ROS-képződés fő forrásaiként ismertek diabéteszes nephropathiában és krónikusvesebetegség. A NOX felszabályozása és hiperaktiválása valószínűleg szintén hozzájárul az oxidatív stresszhez a patofiziológiás stádiumokban. Emelkedése avese-A ROS szint a hiperglikémia által közvetített NOX aktiváció révén oxidatív stresszt okoz, ami károsítja avese szövetei, ami DKD-t okoz (Lee, An, Kim és Bae, 2020).

A metabolomika egy új és fontos omika technológia az élő sejtekben, szövetekben és testnedvekben lévő kis molekuláris metabolitok minőségi és kvantitatív elemzésére. Az élő szervezetek általános metabolikus változásainak azonosítására szolgáló új tudományágként a metabolomika új betekintést nyújt a cukorbetegség és a diabéteszes szövődmények vizsgálatába (Lu, Xie, Jia és Jia, 2013).

A tanulmány célja a természetes termék védő hatásának vizsgálata voltakteoziddiabéteszes hím db/db egerek DKD-jén és a magas glükóz in vitro által indukált HK-2 sejteken és annak mechanizmusa. Tehát ebben a tanulmányban db/db egereket alkalmaztunk avese-védő hatásaiakteozid, és a szérumban lévő különböző metabolitok szabályozását elemezték, hogy megvilágítsák a mechanizmusokatakteozid. Ezenkívül a magas glükóz-indukált HK-2 in vitro modell értékeli aakteoziddb/db egereken a NADPH/oxidáz-TGF-/Smad jelátviteli útvonal expressziós szintjének meghatározásával.

2|ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

2.1|Vegyszerek és műszerek

Az UPLC minőségű acetonitrilt a Mercktől (Darmstadt, Németország) vásároltuk; A hangyasavat a Sigma-Aldrich-től (Sigma, St. Louis, Missouri) vásároltuk.Acteozid(Tisztaság 98 százalék vagy annál nagyobb) a National Institutes for Food and Drug Controltól (Peking, Kína) vásárolták. A szerkezet aakteozidábrán látható. Szérum-karbamid-nitrogén (BUN) reagenskészlet, aszpartát aminotranszferáz (GOT) reagenskészlet, alanin aminotranszferáz (GPT) reagenskészlet, összkoleszterin (TCHO) reagenskészlet, triglicerid (TG) reagenskészlet, szérum kreatinin (Scr) reagenskészlet, vizelet mikroalbumin (mALB) reagenskészletet és inzulin (INS) reagenskészletet a Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute-tól (Nanjing, Kína) vásároltuk. A metformin-hidroklorid tablettákat a Sino American Shanghai Squib Pharmaceutical Ltd.-től vásároltuk; Az irbezartánt a Shenzhen Haibin Pharmaceutical Co., Ltd.-től vásárolták. A DMEM-et és az F12-t a GIBCO-tól (Amerika) vásárolták; A NOX1 (katalógusszám: ab121009), a NOX2 (katalógusszám: ab129068), a NOX4 (katalógusszám: ab154244) és a Smad7 (katalógusszám: ab216428) első antitestét az Abcam-től (Cambridge, Egyesült Királyság) vásárolták. -SMA (katalógusszám: 19245), E-cadherin (katalógusszám: 3195), NF-κB p65 (katalógusszám: 8242), TGF- 1 (katalógusszám: 3711), Smad2 (katalógusszám: 5339) , a Smad3 (katalógusszám: 9523), a Smad4 (katalógusszám: 46535) és a PSmad2/3 (katalógusszám: 8828) első antitestet a CST-től vásároltuk. A vizsgálatban használt összes többi vegyszer és reagens analitikai minőségű volt, és Kínában készült.

Waters Acquity™ Ultra Performance LC rendszer (Waters) Quattro Micro MS spektrométerrel és Waters Xevo TM G2 QTof MS (Waters MS Technologies, Manchester, New Hampshire) készülékkel. Az ionmentes vizet Milli-Q rendszeren (Millipore, Bedford, Massachusetts) tisztítottuk. Az adatok elemzéséhez Mass Lynx v4.1 munkaállomást alkalmaztak, és ultra-nagy sebességű, alacsony hőmérsékletű centrifugát (Thermo Scientific, Egyesült Királyság) és DMI3000M mikroszkópot (Leica, Németország) használtak.

2.2|Állatkísérleti körülmények

Az ebben a tanulmányban használt összes kísérleti eljárást és protokollt a Nanjing Kínai Orvostudományi Egyetem (Nanjing, Kína) Intézményi Állat-etikai Bizottsága felülvizsgálta és jóváhagyta. A jelen tanulmányban leírt protokollok összhangban voltak a laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó intézményi irányelvekkel. Az egereket a Nanjing Egyetem Állatmodellkutató Központjától vásároltuk (tanúsítvány sz. Su 2015–0001). Valamennyi kísérletet 8-hetes hím db/db egerekkel és korban megegyező, vad típusú db/m alomtárs egerekkel végeztük, 30 40 g kezdeti testtömeggel. A db/db diabéteszes egérmodell a cukorbetegség nemzetközileg elismert állatmodellje. A vizsgálatok kimutatták, hogy a DKD mechanizmusa db/db egerekben hasonló az emberéhez. Az állatokat állandó páratartalmú (kb. 60% ± 2%) és hőmérsékletű (kb. 23 ± 2 °C) ketrecekben tartottuk, 12 órás fény/sötét ciklus mellett. Az állatok 3 hetes adaptációs perióduson mentek keresztül, amely alatt korlátlanul hozzáférhettek az ételhez és a csapvízhez. Az akklimatizációs periódus után a db/db egereket véletlenszerűen négy csoportra osztották, mindegyik csoportban hat-hat volt: modellcsoport (normál sóoldat, M), metformin csoport (250 mg kg^-1 d^-1, EJSG), irbezartán csoport (50 mg kg^-1 d^-1, EBST),akteozidcsoport (70 mg kg^-1 d^-1, MRHTG), naponta egyszer (Gao, Peng, Huo, Liu és Yan, 2015). Ezenkívül ebben a vizsgálatban a metformint és az irbezartánt választották pozitív kontrollként. Beszámoltak arról, hogy az irbezartán csökkentheti a vérnyomást, a vérzsírszintet ésvese lipid.Nincs hatással a vércukorszintre és a máj lipidekre. Javíthatja a funkciót és a kóros elváltozásokatvesedb/db egerek közül. A metformin védő hatása avesea proteinuria csökkenésében tükröződik cukorbeteg patkányokban és 2-es típusú cukorbetegségben szenvedő betegeknél. A metformin és irbezartán állati dózisát a humán napi dózisból extrapolálták a testfelület normalizálási módszerrel. Ezután az egereknek naponta egyszer gyomormosással adták be a megfelelő gyógyszert 6 héten át, majd kontrollcsoportként a db/m egereket használtuk, amelyek ugyanabban az időben kaptak ugyanannyi sóoldatot.

2,3|Mintagyűjtés

A kísérleti időszakban a testtömegeket és az éhomi vércukorszintet (FBG) hetente, az FBG szintet One Touch Ultra II vércukor-monitoring rendszerrel (Life Scan, Milpitas, California) mértük a farokvénából minden hétfőn (reggel 8 órakor). ). 6 hetes beadás után az egereket metabolikus ketrecekben éheztettük, ahol szabadon hozzáfértek a vízhez, hogy 24 órás vizeletet gyűjtsenek. Az összes vizeletmintát azonnal centrifugáltuk 3000 fordulat/perc sebességgel 10 percig az összegyűjtés után, majd a felülúszókat elválasztottuk és -80 fokon tároltuk az elemzésig. A vizsgálat végén az egereket 10 százalékos klorálhidráttal (3 mg/kg) altatásban leöltük, és vért vettünk a biokémiai paraméterek koncentrációjának és a metabolomikai vizsgálatnak a céljából. Ezután a vérmintákat 3000 fordulat/perc sebességgel 10 percig centrifugáltuk, majd a szérummintákat elválasztottuk és -80 fokon tároltuk az elemzésig. A jobb vesét 10%-os semleges pufferolt formalinnal rögzített egy darabbal eltávolítottuk szövettani vizsgálat céljából. Azvese-a kéreget izoláltuk a másik darabból, és folyékony nitrogénben lefagyasztottuk Western-blot-vizsgálathoz.

Cistanche veseelégtelenség kezelésére

2,4|Sejttenyésztés és kezelés

A HK{{0}} humán RTEC-vonalat a Nanjing Keygen Biotechnology Development Co., Ltd.-től szereztük be. A teljes tápközeg alacsony glükóztartalmú DMEM volt, 10% FBS-sel és 1% penicillin-sztreptomicin oldattal. A HK-2 sejteket 37 fokos hőmérsékleten, 5 százalékos CO2-ban és telített páratartalom mellett tenyésztettük. A sejteket 80 százalékos összefolyás mellett tenyésztettük, amelyet eltávolítottunk az inkubátorból, és az edényben lévő eredeti tápközeget eldobtuk. A sejteket 0,5 ml foszfátpuffer sóoldattal (PBS) öblítettük, és 0,5 ml tripszinnel 1-2 percig 37 °C-on emésztettük. Az emésztést 2 ml-es DMEM tápközeggel leállítottuk, majd a sejtszuszpenziót 450 g-vel centrifugáltuk 5 percig 4 °C-on. A felülúszót elöntöttük, és a sejteket 2 ml megfelelő DMEM tápközegben újraszuszpendáltuk, hogy egysejtes szuszpenziót kapjunk. A sejteket különböző edényekbe/mikrolemezekbe oltottuk különböző sűrűségben a későbbi kísérletekhez, az alábbiak szerint. A HK-2 sejteket 96-lyukas lemezekre és tányérokra szélesztettük, alacsony glükóztartalmú (5 mmol/L) DMEM-mel előkezeltük, 37 °C-on és 5 százalékos CO-n inkubáltuk.₂6 órán keresztül, majd szinkronizálták. A kísérleti csoportokat a következőképpen osztottuk fel: kontroll csoport (C), beavatkozási faktor nélkül; modellcsoport (M), amelyben a sejteket magas glükóz (30 mmol/L) DMEM-oldatban tenyésztették; ozmózisnyomás-szabályozó csoport (DMEM plusz 24,5 mmol/l mannit, GLC); irbezartán csoport (25 mmol/L) ésakteozid(MRHTG) csoport öt dózisban (5, 10, 25, 50 és 100 μmol/L).

2,5|Sejtmorfológia

A HK-2 sejteket kétszer mostuk PBS-sel, és fordított mikroszkóp alatt (OLYMPUS IX51) néztük meg. A sejtek morfológiáját 100 nagyítás mellett figyeltük meg.

2,6|Biokémiai indikátorok mérése

A terápiás hatékonyság aakteoziddb/db egereken értékeltük a mALB vizeletben és az FBG, INS, T-CHO, TG, Scr, GOT, GPT és BUN szintjét a szérumban, amelyeket a kit gyártója által megadott leírás követett.

2,7|Patológiai elemzés

Része avese-kéregvizsgálatot végeztünk hematoxilin-eozin (HE) és periodikus sav-Schiff (PAS) festéshez, hogy megfigyeljük a patológiás változásokatveseszövet, fokú fibrózisos szöveti hiperplázia, glomerulusok és tubulusok szerkezete elektronmikroszkóppal (400). Fényképezéskor próbálja meg kitölteni a teljes látómezőtveseszövethogy minden fényképen azonos háttérfény legyen. Az Image-Pro Plus 6.{2}} szoftverrel ugyanazt a piros-lila színt választották ki, mint az összes fénykép pozitív elbírálásának egységes kritériumát. Az egyes fényképek elemzésével meghatároztuk az alapmembrán pozitív expressziójának kumulált optikai sűrűségét (IOD) és a glomeruláris vascularis plexus pixelterületét (AREA), és kiszámítottuk az átlagos optikai sűrűséget (IOD/AREA).

2,8|Western blot

Veseszövetés a sejteket lízispufferrel extraháltuk; a lizátumokat centrifugáltuk. A teljes pirolízis után centrifugáljuk 5 percig 12000 fordulat/perc sebességgel, majd vegyük ki a felülúszót, és a felülúszókat összegyűjtjük. A fehérjekoncentráció meghatározásához bicinkoninsav (BCA) fehérjekoncentrációs készletet használtunk. A mennyiségi meghatározás után a fehérjét 10%-os SDS-PAGE-val feloldottuk, PVDF membránokra vittük, majd TBST-ben 5%-os BSA-ban blokkoltuk, és elsődleges antitestekkel, majd a megfelelő másodlagos antitestekkel inkubáltuk. Az antitest reaktivitását ezután ECL-el detektáltuk, és ImageJ szoftverrel mennyiségileg meghatároztuk.Veseszöveteka mintákat Western blottal elemeztük az -SMA, TGF- 1 (1:1300), Smad2 (1:3000), Smad3 (1:1000), P-Smad2/3 (1:500) expressziós szintjének kimutatására. ), Smad4 (1:1000) és Smad7 (1:1000) fehérje.

2,9|ELISA elemzés

A monocita kemoattraktáns fehérje -1 (MCP-1), az interleukin-1 (IL-1), a tumornekrózis faktor- (TNF-) és az interleukin-6 (IL) szekréciója -6) az egyes sejtek felülúszójában ELISA kittel mértük.

2.10|Valós idejű PCR

Ezenkívül ezeket a sejteket felkészítették a valós idejű PCR-re, hogy megvizsgálják a NOX1, NOX2, NOX4, -SMA, E-cadherin, NF-κB p65, TGF- 1, Smad2, Smad3, Smad4 és Smad7 mRNS. Az egyes csoportok sejtjeit (körülbelül 1 107 sejt) összegyűjtöttük. A teljes RNS-t a Trizol-féle egylépéses módszerrel extraháltuk, meghatároztuk tisztaságát és koncentrációját. A GAPDH belső referenciaként a primer szekvencia a következő volt. TGF- 1, szensz primer: 5-ACACATCAGAGCTCCGAGAA-3, antiszensz primer: 5-GAGGTATC GCCAGGAATTGT-3;E-cadherin, szenzor primer: 5- ACGCATTGCCA CATACACTC-3, antiszensz primer: 5-GGTGAATTCGGGCTTGTTGT-3; NF-κB p65, szensz primer: 5-CTTCCTGCCCTACAGAGGTC-3, antiszensz primer: 5-AGAGCAAGGAAGTCCCAGAC-3;NOX1, szensz primer: 5-CCTAGAAGGGCTCCAAACCA{{33} }, antiszensz primer: 5-GGAAGGCATCCACAAACAGG-3; NOX2, szensz primer: 5-ACCCTTCGCATCCATTCTCA-3, antiszensz primer: 5-TCTGCAAACCACTCAAAGGC-3; NOX4, szensz primer: 5-CAAGCAGGAGAACCAGGAGA-3, antiszensz primer: 5-AGTTGAGGGCATTCACCAGA-3; Smad2, szensz primer: 5-TGAGCACGTGAGGTGAGATT-3, antiszensz primer: 5-CTCCATCACAGTGCACCAAG-3; Smad3, szensz primer: 5-CAGCCGGTTTGGATTACAGG-3, antiszensz primer: 5-GAGTCAAAGTCCCTGCTCCT-3; Smad4, szensz primer: 5-CACTGCCAACTTTCCCAACA-3, antiszensz primer: 5-ATCCATTCTGCTGCTGTCCT-3; Smad7, szensz primer: 5-AAGAGTCAGCTGGTGCAGAA-3, antiszensz primer: 5-GCGGACTTGATGAAGATGGG-3; -SMA, szensz primer: 5-GGTGCTGTCTCTCTATGCCT-3, antiszensz primer: 5-CAGATCCAGACGCATGATGG-3; GAPDH, szensz primer: 5-TGGTATCGTGGAAGGACTCA-3, antiszensz primer: 5-CCAGTAGAGGCAGGGATGAT-3.

2,11|Statisztikai analízis

Az adatok és a statisztikai elemzés megfelel a farmakológiai kísérletek tervezésére és elemzésére vonatkozó ajánlásoknak. Minden kísérletet véletlenszerűen és vakon végeztünk. Az eredményeket a független kísérletek jelzett számú (n) M ± SD/SEM értékében fejezzük ki. A jelenlegi tanulmányban az adatokat legalább három független kísérletből származó M ± SD/SEM értékben mutatjuk be. A különbségek jelentőségét egyutas ANOVA-val, majd Tukey-teszttel (két csoportnál több) vagy Student-féle t-próbával (két csoport) elemeztük. A post hoc teszteket csak akkor végezzük, ha F elérte a p <.05 értéket,="" és="" nem="" volt="" szignifikáns="" varianciainhomogenitás.="" minden="" teszt="" kétoldalú="" volt,="" és="" p="">< 0,05="" volt="" statisztikailag="" szignifikáns.="" a="" statisztikai="" elemzést="" graphpad="" prism="" 7.0="" szoftverrel="">

Cistanche akteozid a vese javítására

2,12|UPLC-QTOF/MS feltételek és adatelemzés

Az összes szérummintát szobahőmérsékleten felengedtük az előkészítés előtt. A 300 ul acetonitrilt 100 ul szérummintákhoz adtuk a kicsapódott fehérjéhez, és 60 másodpercig erőteljesen kevertük. Az összes mintát 13000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk 10 percig 4 fokon. Végül a felülúszót UPLC-QTOF/MS analízisbe injektáltuk. A metabolitok szétválasztását Waters Acquity™ Ultra Performance LC rendszerrel (Waters) végeztük, amely Waters Xevo™ G2 Q/TOF-MS (Waters MS Technologies) berendezéssel volt felszerelve. A mintaoldat 2 ul-es aliquot részét Acquity UPLC BEH C18-ra (100 mm, 2,1 mm, 1,7 μm, Waters Corporation, Milford, Connecticut) injektáltuk 35 fokos hőmérsékleten, és az áramlási sebesség 0,4 ml/perc volt. Az optimális mozgófázis a víz (A) (amely 0,1% hangyasavat tartalmaz) és acetonitril (B) volt. Az optimalizált UPLC-elúciós feltételek a szérumanalízishez: 0 3 perc, 95% 55% A; 4 13 min, 55 százalék 5 százalék A; 13 14 min, 5 százalék A. Az automatikus mintavevőt 4 fokon tartottuk.

A tömegspektrometriát Xevo™ G2 QTof (Waters MS Technologies), kvadrupól és ortogonális gyorsulási repülési idő tandem tömegtrométerrel végeztük. Leucin-enkefalint használtak zártömegként, ami [M plusz H]^pluszion (m/z 556,2771) és [MH]^-ion (m/z 554,2615) pozitív, illetve negatív módban. A leucin-enkefalin koncentrációja 200 pg/ml, az infúzió áramlási sebessége pedig 100 ul/perc volt, hogy a fecskendős pumpával végzett MS analízis során a pontosság biztosítva legyen. Az adatokat centroid módban gyűjtöttük 100 és 1,000 m/z között. Mind a pozitív, mind a negatív elektrospray módban a kapilláris és a kúpfeszültséget 3,0 kV-ra, illetve 30 V-ra állítottuk be. A deszolvatációs gázt 600 l/órára állítottuk be 350 fokos hőmérsékleten, a kúpos gázt 50 l/órára, a forrás hőmérsékletét pedig 120 fokra. Az adatgyűjtési sebességet 30 ms-ra állítottuk be, 0,02 s interscan késleltetéssel.

Ezenkívül minden csoportból véletlenszerűen 10 szérummintát választottunk ki, és minőség-ellenőrzési (QC) mintákként kevertük össze. A minőségellenőrzési mintát az UPLCQTOF/MS állapotának optimalizálására használtuk, mivel ez tartalmazza a legtöbb információt a teljes mintáról. A minőségellenőrzési mintákat hatszor fecskendeztük be a futtatás elején a rendszer kondicionálása vagy egyensúlyozása érdekében, majd 10 mintánként az analízis stabilitásának további ellenőrzése érdekében. Minden nap, a műszer kalibrálása után a minőségellenőrzési mintát először elemezték, hogy teszteljék a műszer stabilitását, hogy biztosítsák a rendszer egyenletes teljesítményét.

Az összes adatgyűjtést és adatelemzést a Waters MassLynx v4.1 szoftver vezérelte. A többváltozós adatmátrixot az EZinfo szoftver 2.0 (Waters Corp.) elemezte. A fő paraméterek közé tartozik a megőrzési időtartomány: 0 14 perc; tömegarány m/z 100 1,000, tömegtűrési tartomány 0.{{10}}1 Da, csúcsintenzitás-küszöb 50, minőségi ablak 0,05 Da, retenció időablak 0,20 perc, valamint 5 százalékos csúcsmagasság és zaj automatikus érzékelése. Az egyes ionok intenzitását normalizáltuk a teljes ionszámhoz képest, hogy egy adatmátrixot hozzunk létre, amely a retenciós időből, m/z értékből és a normalizált csúcsterületből állt.

Az eredményül kapott adatmátrixokat bevezettük az EZinfo 2.{1}} szoftverbe a főkomponens-elemzés, a részleges legkisebb négyzetek diszkriminanciaelemzés (PLS-DA) és a látens struktúrákra ortogonális vetítés (OPLS-DA) elemzéséhez. Az OPLS-DA alapján különböző metabolitokat lehetett azonosítani, amelyek felelősek a kontrollcsoport és a modellcsoport elválasztásáért, ezért potenciális markereknek tekinthetők. Az érdeklődésre számot tartó potenciális markereket az OPLS-DA-val végzett analízist követően megszerkesztett S-diagramokból vontuk ki, és a csoportok közötti megkülönböztetéshez jelentős mértékben hozzájáruló változókat a molekulaképlet további azonosítására vetettük alá.

A projekciós értékben a változó fontossága (VIP) a PLS súlyok négyzeteinek súlyozott összege, és a VIP > 1 változókat befolyásolónak tekintettük a minták elválasztását az OPLS-DA elemzésből generált pontdiagramokon. Minden kísérletben a konfidenciaszintet 95 százalékra állítottuk, hogy meghatározzuk a különbség szignifikanciáját (p <.{10}}5). ezeket="" a="" változókat="" végül="" potenciális="" biomarkerként="" választották="" ki.="" a="" pls-da="" pontdiagramokat="" az="" r2y="" és="" q2="" kereszt-validációs="" paraméterek="" írták="" le,="" amelyek="" az="" x="" mátrix="" teljes="" magyarázható="" variációját,="" illetve="" a="" modell="" kiszámíthatóságát="" reprezentálják.="" kiváló="" modelleket="" kapunk,="" ha="" az="" r2y="" és="" q2="" kumulatív="" értéke="" 0,8="" felett="" van.="" az="" adagolt="" csoportok="" és="" a="" kontrollcsoport="" közötti="" relatív="" távolságokat="" a="" pls-da="" pontdiagramtól="" számítva="" a="" kontrollcsoport="" összes="" mintájának="" átlagértékét="" (x-tengely="" és="" y-tengely)="" referenciapontként="" számítottuk="">

A kiválasztott potenciális metabolitokat a fenti lehetséges biomarkerek pontos m/z, retenciós ideje, valamint tipikus MS/MS fragmentuma és mintázata alapján azonosítottuk, amelyeket pozitív és negatív ion módban kaptunk. Az anyagcsere-útvonal felépítése a Metabo Analyst segítségével történt, amely egy web-alapú eszköz a metabolomika vizualizálására (https://www.metaboanalyst.ca/), amely adatbázis-forrásokon, köztük a KEGG-n (HTTP://www.genome) alapul. .jp/kegg/) és a HMDB (http://www.hmdb. ca/) adatbázisok a kereséshez. A retenciós idő és a tipikus MS/MS fragmentum és mintázat nagy hasznot hoz a lehetséges molekulák tartományának szűkítésére.

A Cistanche-ban található akteozid javíthatja a veseműködést

3|EREDMÉNYEK

Kattintson ide a cikk II. részével (eredmények) kapcsolatos információkért.

Kivonat innen: ' Természetes termék aakteozidjavítanivese sérülésdiabéteszes db/db egerekben és HK-2 sejtekben a NADPH/oxidáz-TGF-/Smad jelátviteli útvonal szabályozásán keresztül' -----Qinwen Wang|Xinxin Dai et.al

----Fitoterápiás kutatás. 2021;35:5227–5240. wileyonlinelibrary.com/journal/ptr © 2021 John Wiley & Sons Ltd. DOI: 10.1002/ptr.7196