1. rész Az akteozid elnyomja a RANKL által közvetített oszteoklasztogenezist azáltal, hogy gátolja a C-Fos indukciót és az NF-kB útvonalat, valamint gyengíti a ROS termelést

1. rész Hogyan segítik az akteozidok a csontnövekedést?

További információ:ali.ma@wecistanche.com

Seung-Youp Lee1,2., Keun-Soo Lee3.¤, Sea Hyun Yi2., Sung-Ho Kook2, Jeong-Chae Lee2,3* 1 Chonbuk Nemzeti Egyetem Klinikai Orvostudományi Kutatóintézete, Chonbuk Nemzeti Egyetem Orvosbiológiai Kutatóintézete Kórház, Jeonju, Chonbuk, Dél-Korea, 2 Fogszabályozási Osztály, Oral Biosciences Intézet és Fogorvosi Iskola, Chonbuk National University, Jeonju, Chonbuk, Dél-Korea, 3 Department of Bioactive Material Sciences, Research Center of Bioactive Materials, Chonbuk National University, Jeonju, Chonbuk, Dél-Korea

Absztrakt

Számos tanulmány beszámolt arról, hogy a gyulladásos citokinek fontos közvetítői az oszteoklasztogenezisnek, ezáltal túlzott csontreszorpciót és csontritkulást okoznak.ActeozidA Rehmannia glutinosa fő hatóanyaga, amelyet a hagyományos keleti gyógyászatban széles körben használnak, gyulladáscsökkentő és antioxidáns potenciállal rendelkezik. Ebben a tanulmányban azt találtuk, hogy a CTE oldal jelentősen gátolta az oszteoklasztok differenciálódását és a csontvelői makrofágokból (BMM) és a nukleáris faktor-kappaB (NF-kB) ligandum (RANKL) receptor aktivátora által stimulált RAW264.7 makrofágokból való képződést. Az akteozidos előkezelés dózisfüggő módon megakadályozta az érett oszteoklasztok csontreszorpcióját is. Az akteozid (10 mM) gyengítette a p38 kináz, az extracelluláris szignál által szabályozott kinázok és a c-Jun N-terminális kináz RANKL-stimulált aktiválását, valamint elnyomta az NF-kB aktivációt a p65 alegység és a kBa inhibitor foszforilációjának gátlásával. Ezenkívül a RANKL által közvetített fokozódik a c-Fos expressziója és az aktivált T-sejtek nukleáris faktora, a citoplazmatikus 1 (NFATc1), valamint a tumor nekrózis faktor-a, az interleukin (IL)-1b termelődése. , és IL-6 láthatóan gátolta az akteozidos előkezelést. Ezenkívül az orális akteozid kontroll szintre csökkentette az ovariectomia által kiváltott csontvesztést és a gyulladásos citokintermelést. Adataink arra utalnakakteozidgátolja az oszteoklasztok differenciálódását és érését az oszteoklasztikus prekurzorokból azáltal, hogy elnyomja a mitogén által aktivált protein kinázok és transzkripciós faktorok RANKL által kiváltott aktiválását, mint például az NF-kB, c-Fos és NFATc1. Ezek az eredmények együttesen arra utalnak, hogyakteozidfelszívódást gátló szerként hathat a csontvesztés csökkentésére az oszteoklaszt aktiváció blokkolásával.

További információért forduljon:ali.ma@wecistanche.com

Kattintson a Cistanche effektus termékekhez

Bevezetés

A csontot folyamatosan átalakítja a kiegyensúlyozott oszteoklaszt és oszteoblaszt aktivitás [1]. Az oszteoklasztok a monocita/makrofág vonal hematopoietikus prekurzor sejtjeiből, míg az oszteoblasztok a mezenchimális vonalból származnak [2]. Az abnormális oszteoklasztok aktivációja vagy a csökkent osteoblastogenezis megzavarhatja a csont homeosztázisát, és végül olyan betegségeket okozhat, mint a csontritkulás, az ízületi gyulladás és a csontrák [3,4]. Az oszteoporózis egy gyakori csontbetegség, amely a csonttörések fokozott kockázatához vezet. A csontritkulás leggyakoribb formáját az ösztrogénhiány okozza a menopauzás nőknél. Az olyan gyógyszerek, mint a kortikoszteroidok és az epilepszia elleni szerek, szintén egyensúlyhiányt okozhatnak a csontreszorpció és a csontképződés között, ami csontritkuláshoz vezethet [5]. Számos anti-reszorptív inhibitort, köztük biszfoszfonátokat, kalcitonint, ösztrogént és szelektív ösztrogénreceptor-modulátorokat alkalmaztak az oszteoporózis kezelésére. Ezek az inhibitorok fenntartják a csonttömeget az oszteoklasztok működésének gátlásával [6]. Az ösztrogénpótló terápia a legnépszerűbb kezelés a posztmenopauzás csontritkulás megelőzésére és kezelésére. A hosszú távú ösztrogénpótló terápia azonban növelheti az endometrium- és mellrák kockázatát. Ezért sok kutató olyan új, felszívódást gátló szer kifejlesztésére összpontosította erőfeszítéseit, amelynek nincs mellékhatása [7–10]. Mivel az oszteoklasztok a csontreszorpcióban működnek, számos tanulmányban az oszteoklasztok specifikus gátlását tekintették a fő célnak. Az oszteoklasztok többmagvú óriássejtek, amelyeket a monocita/makrofág család mononukleáris progenitorai képeznek a vérképző prekurzor sejtek szekvenciális proliferációja, differenciálódása és fúziója révén [11]. A makrofágkolónia-stimuláló faktor (M-CSF) és a nukleáris faktor (NF)-kB (RANK) ligandum receptor aktivátora (RANKL) az oszteoklasztok differenciálódásának alapvető faktorai[12]. Ezenkívül számos gyulladásos citokin, mint például a tumor nekrózis faktor (TNF) és az interleukin (IL)-1b, hozzájárul az oszteoklasztogenezishez a RANKL, az oszteoprotegerin és az M-CSF indukciójának modulálásával [7,13]. A RANKL sejtfelszíni RANK receptorhoz való kötődése RANKL/RANK/TNFR asszociált faktorok (TRAF) komplexeket eredményez, amelyek szekvenciálisan aktiválják az NF-kB-t és a mitogén által aktivált protein kinázokat (MAPK), beleértve a c-Jun N-terminális kinázt (JNK), p38 kináz és extracelluláris szignál-kapcsolódó kináz (ERK) [14]. Ez az aktiválás kulcsszerepet játszik az oszteoklasztok differenciálódásának, aktivációjának és túlélésének közvetítésében. A RANKL olyan transzkripciós faktorok expresszióját is aktiválja, mint az aktivált T-sejtek nukleáris faktora, a citoplazmatikus 1 (NFATc1) és a Fos, amelyek nélkülözhetetlenek az oszteoklasztok fejlődéséhez. 7,9]. Ezért a RANKL jelátvitelt tekintik az oszteoklasztok aktivációját és a csontvesztést elnyomó anti-reszorpciós szerek fő célpontjának.

Acteozida Rehmannia glutinosa fő hatóanyaga, amelyet széles körben használnak a hagyományos keleti gyógyászatban [15,16]. Az akteozid erős antioxidáns, és antihepatotoxikus, gyulladásgátló és antinociceptív hatással rendelkezik [17–20]. Korábban ezt találtukakteozidcsökkenti a tirozináz aktivitást és a melanin bioszintézist az ERK jelátvitel szabályozásával [21], véd a reaktív oxigénfajták (ROS) által közvetített ínykárosodástól[22], és elnyomja a mikotoxinok által közvetített sejtkárosodást [23]. Ezek a hatások szorosan összefüggenekakteozidokképes eltávolítani a ROS-t és szabályozni a MAPK által közvetített jelzéseket. Különösen a ROS-t javasolják a RANKL által kiváltott jelátviteli útvonalak és a sejtes események közvetítésére az oszteoklasztokban. Az antioxidánsokkal végzett előkezelés gátolta az NF-kB, ERK és IkBa RANKL-indukálta aktivációját, ezáltal elnyomva az oszteoklasztogenezist [24]. Ezek az eredmények határozottan azt sugallják, hogy a gyulladáscsökkentő hatás mellett az antioxidáns aktivitás is kulcsfontosságú a felszívódásgátló szer számára, ígyakteozidelnyomhatja a RANKL által kiváltott osteoclastogenezist.

Jelen tanulmányunkban azt vizsgáltuk, hogyakteozidterápiás hatása van a csontvesztésre. Megvizsgáltuk a hatásátakteozidaz oszteoklasztok differenciálódásáról és csontreszorpciójáról, valamint a kapcsolódó sejtmechanizmusokról in vitro és in vivo kísérleti rendszerek alkalmazásával.

Anyagok és metódusok

Etikai nyilatkozat

Az állatok gondozására és felhasználására vonatkozó gyakorlatokat a Chonbuk Nemzeti Egyetem Laboratóriumi Állatok Gondozása és Felhasználása Etikai Bizottsága hagyta jóvá (engedély száma: CBU 2010-0007). Ebben a tanulmányban minden kísérletet az Egyetem Állatgondozási és Felhasználási Bizottságának irányelvei szerint végeztünk.

Egerek, vegyszerek és laboratóriumi cikkek

A négyhetes nőstény ICR egereket az OrientBio Inc.-től (Szöul, Korea) vásároltuk, és 2261 °C-on és 5565 százalékos páratartalom mellett tartották őket 12 órás világos/sötét ciklusban, élelmiszerhez és vízhez való szabad hozzáférés mellett. Az akteozidot (3,4-dihidroxi-b-fenetil-Oa-ramnopiranóz-Syl-(1R3)-4-O-koffeoil-bD-glükopiranozid; C29H36O15) (S1. ábra) a kalászfélék leveleiből izolálták. Rehmannia glutinosa. Az akteozidot felhasználás előtt foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS) oldottuk. A RANKL-t, a TNF-a-t, az IL-1b-t, az IL-6-t és az M-CSF-et a K+F-rendszerektől vásárolták (Minneapolis, MN, USA). A c-Fos, p65, p-p65, p-ERK, ERK, JNK, p-JNK, NFATc1, IkBa, p-IkBa és b-aktin specifikus antitesteket a Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) cégtől szereztük be. ). A p-p38 és p38 ellenanyagokat a Cell Signaling Technology-tól (Danvers, MA, USA) vásároltuk. A szérum biokémiai paramétereinek meghatározásához a CalciumAssay és az Osteocalcin (OC) EIA készleteket a BioAssay Systems-től (Hayward, CA, USA) és a Biomedical Technologies-tól (Stoughton, MA, USA) vásároltuk. Egér tartarát-rezisztens savas foszfatáz (TRAP) vizsgálati készletet (Immunodiagnostic Systems, Scottsdale, AZ, USA) is használtunk a szérum TRAP5b szintjének mérésére. Hacsak másként nem jelezzük, további vegyszereket a Sigma Chemical Co.-tól (St. Louis, MO, USA), a laboratóriumi cikkeket pedig az SPL Life Sciences-től (Pochun, Dél-Korea) szereztük be.

Sejtkultúrák

A csontvelősejteket 6 hetes nőstény ICR egerek sípcsontjából és combcsontjából nyertük ki a korábban leírt módszerek szerint [25]. A csontvelő-szuszpenziót egy100-mm-es tenyésztőedényben inkubáltuk 50 ng/ml M-CSF jelenlétében. 3 nap elteltével a tapadó sejteket csontvelő-makrofágokként (BMM-ek) használták az oszteoklasztikus differenciálódás indukálására. Egyes csontvelősejteket 48 órán át M-CSF nélkül is inkubáltunk, és a tapadó sejteket oszteoblaszt-differenciáló tápközegben tenyésztettük, amint azt máshol leírtuk [25]. A RAW264.7 makrofág sejteket Dulbecco módosított Eagle tápközegében (DMEM) tenyésztettük, amelyet 10% magzati borjúszérummal (FBS), 2 mM L-glutaminnal és antibiotikumokkal egészítettünk ki. Ezeket a sejteket a BMM-ek megfelelő sejtvonalaként használták az akteozid osteoclastogenezisre gyakorolt ​​hatásának feltárására.

Osteoklasztikus differenciálódás és TRAP festés

A BMM-eket 2 órán át különböző koncentrációjú (0–50 mM) akteoziddal előkezeltük, majd 100 ng/ml RANKL-lel stimuláltuk. A tenyésztő tápközeget a 2. és 5. napon friss táptalajra cseréltük. 7 napos inkubálás után a tenyészeteket 4%-os PBS-pufferolt paraformaldehidben fixáltuk, és TRAP-pal festettük sigma Aldrich kit segítségével, a gyártó utasításai szerint. A TRAP-pozitív sejteket optikai mikroszkóppal megszámláltuk, és a 3 vagy több sejtmagot tartalmazó sejteket oszteoklasztoknak tekintettük. A RAW 264.7 sejteket szintén 100 ng/ml RANKL-nek tették ki 2 órás akteozidos előkezelés után, majd 7 napos inkubáció után. a sejteket TRAP festésre dolgoztuk fel.

A sejtek életképességének mérése

A sejtek életképességét vízoldható tetrazólium só (WST)-8 reagenssel határoztuk meg. Röviden, 10% FBS-t és antibiotikumokat tartalmazó tápközegben tenyésztett BMM-eket vagy RAW264.7 sejteket 10 mM akteoziddal vagy fenolos vegyülettel, például kvercetinnel, luteolinnal, apigeninnel vagy epigallocatechin -3-galláttal (EGCG) kezeltük. WST-8 reagenst adtunk a tenyészetekhez 48 órás inkubáció után. További 4 órás inkubálás után a WST{10}}fajlagos abszorbanciáját 450 nm-en mértük mikrolemez-leolvasóval (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL, USA).

Bone Resorption Assay

A BMM-eket (16105 sejt/ml) 50 ng/ml M-CSF-et és 100 ng/ml RANKL-t tartalmazó a-MEM-ben szuszpendáltuk, majd kalcium-foszfát nanokristályokkal (OAAS{{6}) bevont lyukú lemezre osztottuk. Osteoclast Activity Assay Substrate, Oscotec Inc., Choongnam, Dél-Korea) 26104 sejt/cm2 sűrűségben akteoziddal és anélkül. 7 napos inkubálás után a sejteket 5%-os nátrium-hipoklorittal eltávolítottuk a lemezekről, és az információt optikai mikroszkóp alatt figyeltük meg. A felszívódott területet képanalizátorral is megmértük, és a kontrollérték százalékában fejeztük ki.

Western Blot analízis

A teljes fehérje-lizátumokat lízispufferben állítottuk elő a másutt leírtak szerint [26]. A citoszolikus és nukleáris fehérjéket a korábban leírtak szerint állítottuk elő [25]. A fehérjekivonat azonos mennyiségét 12-15 százalékos SDS-PAGE-val választottuk el, és polivinil-difluorid membránokra blottoltuk. A blotokat primer antitestekkel egy éjszakán át 4 °C-on vizsgáltuk, majd blokkoló pufferben 1 órán át inkubáltuk a másodlagos antitesttel. A blotokat fokozott kemilumineszcenciával fejlesztettük ki (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Buckinghamshire, Egyesült Királyság), és röntgenfilmre exponáltuk (Eastman-Kodak Co., Rochester, NY, USA).

MAPK Activity Assay

A sejteket 2 órán keresztül előkezeltük akteoziddal, majd további -30 percig RANKL-lel stimuláltuk. A MAPK aktivitásokat immunometrikus vizsgálati készletekkel határoztuk meg, mint például a p-p38kináz vizsgálati készletet (Assay Designs, Inc., MI, USA), a p-ERK enzimes vizsgálati készletet (Assay Designs) és a p-SAPK/JNK szendvics ELISA készletet ( Cell Signaling Technology, MA, USA). Minden eljárás követte a gyártó utasításait, és az abszorbanciát mikrolemez-leolvasóval mértük.

Elektroforetikus mobilitási eltolási vizsgálat (EMSA)

A DNS-fehérje kötési reakciókat 3 0 percig szobahőmérsékleten végeztük, 10-15 mg fehérjét 20 ml pufferben, amely 1 mg/ml BSA-t, 0,5 mg/ml poli(dI-dC) és 5% glicerint tartalmazott. ,1 mM DTT, 1 mM PMSF, 10 mM Tris-Cl (pH 7,5), 50 mm NaCl, 30, 000 CPM [a-32}P] dCTP-vel jelölt oligonukleotidok és a Klenow-fragmens DNS polimeráz. A mintákat 6 százalékos poliakrilamid gélen választottuk szét, amelyeket megszárítottunk és röntgenfilmre (Eastman Kodak Co.) exponáltunk 12-24 órán keresztül 270 °C-on. Az NF-specifikus oligonukleotid primer szekvenciák a következők voltak: 59-AAG GCC TGT GCT CCG GGA CTT TCC CTGGCC TGG A-39 és 39-GGA CAC GAG GCC CTG AAA GGGACC GGA CCT GGA A{{30} }}.

NF-kB Luciferáz Assay

A 24-lyuklemezeken lévő RAW264.7 makrofágokat 0,8 mg kB-luciferáz riporter vektorral transzfektáltuk 2 ml Lipofectamine2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) felhasználásával a gyártó utasításai szerint. A transzfekció után 24 órával a sejteket RANKL-lel stimuláltuk akteozid jelenlétében és hiányában 24 órán át. A sejteket 100 ml riporter lízispufferben (Promega, Madison, WI, USA) újraszuszpendáltuk. Egyenlő mennyiségű fehérjemintát helyeztünk 96-lyuk mikrolemezekre, és összekevertük luciferáz szubsztráttal. A lumineszcenciát mikrolemezes luminométerrel (MicroLumat Plus LB 964, Berthold Technologies, Bad Wildbad, Németország) mértük. Ebben a kísérletben egy permeábilis NF-B inhibitor peptidet (BIOMOL, Butler Pike, PA, USA) használtunk pozitív kB inhibitorként.

A citokinek mérése

A BMM-eket vagy a RAW264.7 sejteket RANKL-lel stimuláltuk a jelenlétébenakteozid24-kúttenyésztő lemezeken. 48 órás inkubáció után a tenyészet felülúszóit összegyűjtöttük és ELISA-val értékeltük TNF-a-, IL-1b- és IL-6-specifikus OptEIATM kittel a gyártó utasításai szerint.

Valós idejű fordított transzkripciós polimeráz láncreakció (RT-PCR)

Az oszteoklasztikus markerek, például a c-Fos, NFATc1 és TNF-a mRNS expresszióját valós idejű RT-PCR-rel határoztuk meg. Röviden, a makrofágokból a teljes RNS-t Trizolreagenttel extraháltuk a gyártó utasításai szerint (Invitrogen). A cDNS-t 1 mg össz-RNS-sel szintetizáltuk SuperScriptReverse Transcripatase II és primerek (Invitrogen) alkalmazásával. A Power SYBRGreen PCR Master Mixet (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) használták a PCR-termék felhalmozódásának kimutatására ciklus közben az ABI 7500 szekvenciadetektáló rendszerrel (az alkalmazás negyven 3-lépéses denaturációs ciklussal 95 °C-on történt 15 másodpercig, 60 uC-on 1 másodpercig annealing és 72 uC-on 30 mp-ig tartó extenzió Minden PCR-reakciót legalább három párhuzamosban végeztünk, és az expressziós szinteket ugyanabban a reakcióban normalizáltuk a housekeeping génre HPRT. Ebben a vizsgálatban a leírt primer szekvenciákat használtuk máshol [7].

Az intracelluláris ROS mérése

29,79-diklór-dihidrofluoreszcein-diacetát (DCFH-DA) (50 mM; Calbiochem, Darmstadt, Németország) törzsoldatot készítettünk DMSO-ban, és 220 °C-on, sötétben tároltuk. Röviden, a BMM-eket (106 sejt/ml 6-lyukú lemezeken) 50 ng/MLM-CSF-fel tenyésztettük 24 órán át, majd különböző koncentrációjú (0-10 mM) akteoziddal kezeltük 2 órával a 100 ul-es stimuláció előtt. ng/ml RANKL. 1 órás együttinkubálás után ezeket a sejteket 25 mM DCFH-DA-val 30 percig inkubáltuk. A 29,79-diklórfluoreszcein (DCF) zöld fluoreszcenciáját 515 nm-en (FL 1) rögzítettük FACS VantageH rendszerrel (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA), és 10,000 eseményt. mintánként számolták

Ovariectomia által kiváltott oszteoporózis előidézése

Ebben a vizsgálatban nőstény ICR egereket (6 hetes) használtunk. Az egereken álműtétet (Sham, n=10) vagy műtéti petefészek-eltávolítást (OVX, n=20) végeztek altatásban. Egy héttel a műtét után az OVX egereket véletlenszerűen 2, egyenként 10 egérből álló csoportra osztották: kétoldali OVX és bilaterális OVX, amelyet 200 ml PBS-sel egészítettek ki, amely orálisan 1 mM akteozidot tartalmazott (AC csoport). Orálisakteozida műtét után 8 héten keresztül 3 naponta egyszer adták be, és ugyanannyi PBS-t adtunk be a Sham és OVX csoportoknak. Az utolsó adagolás után 1 nappal az egereket leöltük, majd a szérum biokémiai paramétereit és a 3-dimenziós csontszerkezetet elemeztük.

A szérum biokémiai paramétereinek meghatározása

A vérmintákat szívpunkcióval, a szérumot centrifugálással vettük. A szérummintákat 280 uC-on tároltuk a biokémiai paraméterek elemzéséhez. Az IL-1b és IL-6 szérumszintjét a fent leírt ELISA kit segítségével becsülték meg, míg az alkalikus foszfatáz (ALP) aktivitást biokémiai kolorimetriás vizsgálattal határozták meg, amely a p mennyiségét méri. -nitro-fenol, amelyet p-nitrofenol-foszfát szubsztrátból állítanak elő, amint azt máshol leírták [27]. A csontképződés és a reszorpció biomarkereinek becsléséhez a szérum OC, kalcium és TRAP5b szinteket is meghatároztuk a gyártó utasításai szerint.

A csontszerkezet és a morfometriai paraméterek elemzése

Az egerek (Sham, OVX és AC csoportok) combcsontját kimetszettük, és fiziológiás sóoldattal megtöltöttük mechanikai tesztelés céljából. A combcsont mechanikai szilárdságát a máshol leírtak szerint mérték [28]. A törési terhelést a newtonban kifejezett csúcserőként rögzítettük azon a ponton, ahol a jobb combcsont középső tengelye eltört. Ezenkívül az egyes állatok világos combcsontját hisztomorfometrikusan elemeztük mikroszámítógépes tomográfia (mikro-CT) rendszerrel (SkyScan 1076 mikrofókuszos röntgenrendszer, Kontich, Belgium). Röviden, a 4 százalékos formaldehid-tárolóban lévő csontokat papírzsebkendőn felületesen megszárították, mielőtt műanyag „ragasztófóliába” vagy parafóliába csomagolták, hogy megakadályozzák a szkennelés közbeni kiszáradást. Mindegyik műanyaggal burkolt csontot műanyag/polisztirolhab csövekbe helyezték, amelyeket függőlegesen vízszintesen szereltek fel az 1076 szkenner mintakamrájába a mikro-CT képalkotáshoz. A szkennelés 100 kV-os forrásfeszültséggel és 140 mA-es forrásárammal történt, 35 mm-es felbontással. A combcsont trabekuláris csontjainak háromdimenziós modelljeit a SkyScan CT Analyzer 1.11-es verziójával rekonstruáltuk. A szerkezeti paraméterek, mint a trabekuláris csont ásványi sűrűsége (BMD, g/cm3), százalékos csonttérfogat (csonttérfogat (BV)/szövettérfogat (TV), százalék), vastagság (Tb.Th, mm), elválasztás (Tb.Sp. , mm), és a számot (Tb.N, 1/mm) mértük meg.

Osteogén differenciálódási és mineralizációs vizsgálat

A 6-lyukú tenyésztőlemezeken tenyésztett csontvelősejteket DAG-val (10 nM dexametazon, 50 mM aszkorbinsav és 20 mM b-glicerofoszfát) kezeltük 10 mM jelenlétében.akteozid. 2 hét differenciálódás után a sejteket jéghideg, 70 térfogatszázalékos etanollal fixáltuk 1 órán át, majd 30 percig szobai helyiségben festettük 0,2 százalékos alizarin red Sin desztillált vízzel. hőfok. Miután a sejteket eltávolítottuk és levegőn szárítottuk, a sejttenyésztő lemezeket fordított mikroszkóppal (Nikon TS100, Japán) fénymikroszkóppal értékeltük ki. A vörös festék mennyiségének meghatározásához a foltot 10%-os acetil-piridinium-kloriddal eluáltuk 20 perces rázatással, és az abszorbanciát 560 nm-en mértük. A sejtrétegekben lerakódott kalcium mennyiségét szintén Calcium Kit (Wako Chemical Inc. Osaka, Japán) segítségével mértük a gyártó utasításai szerint. Ezen túlmenően, a csontspecifikus mRNS-markerek, például a futáshoz kapcsolódó transzkripciós faktor-2(Runx2), az osterix, a csont szialoprotein (BSP) és az OC expresszióját valós idejű RT-PCR-rel határoztuk meg. Ezeknek a markereknek az oligonukleotid primereit 200 bp-nál kisebb termékmérettel tervezték a PrimerExpress Software 3.0 (Applied Biosystems) segítségével, a máshol leírtak szerint[27].

Statisztikai analízis

Hacsak másképp nem jelezzük, az összes adatot 3 vagy több független kísérlet átlagos 6 standard deviációjaként (SD) fejezzük ki. Egyutas ANOVA-t használtunk a többszörös összehasonlításhoz az SPSS 12.0 szoftverrel. A 0,05 p-értéket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük.

Eredmények

Az akteozid dózisfüggő módon gátolja az oszteoklasztok makrofagezin általi képződését

Az akteozid BMM oszteoklasztokká történő differenciálódásra gyakorolt ​​hatásának ellenőrzésére a sejteket különböző koncentrációjú (0–20 mM) akteoziddal tenyésztettük 7 napig 50 ng/ml M-CSF és 100 ng/ml jelenlétében. RANKL. Az akteozid dózisfüggő módon csökkentette az oszteoklasztok számát. Amikor a sejteket 2 órán keresztül 10 mM akteoziddal előkezeltük, az oszteoklasztok száma 43 százalékkal csökkent az M-CSF-el és RANKL-lel kiegészített sejtekhez képest (1A. ábra). Az 1B. ábra a RANKL által közvetített oszteoklasztok differenciálódását és annak gátlását mutatja az akteoziddal kombinált kezeléssel. Ezzel az eredménnyel összhangban az akteozid előkezelés csökkentette a RAW264.7 sejtek RANKL által stimulált differenciálódását és az oszteoklaszt képződést (1C. és D. ábra). Amikor az akteozid oszteoklasztellenes potenciálját a BMM-eken összehasonlították több fenolos vegyület oszteoklasztellenes potenciáljával azonos koncentrációban (10 mM), a luteolin mutatta a legnagyobb aktivitást (2A. ábra). A luteolin, a kvercetin vagy maga az apigenin azonban csökkentette a sejtek életképességét (2B. ábra). Valamennyi vegyület gátolta a RAW264.7 makrofágok oszteoklasztikus differenciálódását a következő relatív aktivitásokkal: luteolin. kvercetin=apigenin .EGCG=akteozid (2C. ábra). A luteolin, a kvercetin vagy maga az apigenin is a sejtek életképességének csökkenését mutatta (2D. ábra). Ezzel szemben a kvercetin kezelés csak a BMM-ek és a RAW264.7 sejtek életképességének szignifikáns csökkenését okozta, ha ezeket a sejteket 2 napig 10 mM vegyülettel kezeltük 50 ng/ml M-CSF-el, 100 ng/ml RANKL-lel, vagy mindkettő (az adatok nem láthatók). Amikor ezeknek a vegyületeknek a koncentrációja szükséges 50 százalékos gátlásához

Az oszteoklaszt képződést a BMM-ekben (IC50) koncentráció-aktivitás görbék segítségével számítottuk ki, az IC50akteozidA kvercetin, a luteolin, az apigenin és az EGCG 5,1, 2,3, 2,6, 4,8 és 6,6 mM volt (2E. ábra). Ez az eredmény hasonló volt a RAW264.7 makrofágok vizsgálatához. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a luteolin és a kvercetin nagyobb anti-klasztogén aktivitással rendelkezik, mint az akteozid. Ezzel szemben a kvercetin IC50-nél enyhe toxikus hatást gyakorolt ​​a sejtekre (az adatokat nem mutatjuk be).

Az akteozid gátolja a makrofágok csontreszorpcióját

Az akteozid emellett dózisfüggő módon megakadályozta a RANKL által közvetített csontreszorpciót, amint azt egy in vitro modellrendszerrel mértük (3A. ábra). A csontreszorpció szignifikánsan gátolt, ha a BMM-eket 1 mM akteoziddal inkubáltuk (3B. ábra). A 10 mMakteozidA kezelés szinte teljesen gyengítette a BMM-ek által kiváltott RANKL-indukált információkat. Hasonlóképpen, az akteozid csökkentette a csontreszorpciót a RANKL-stimulált RAW264.7 sejtekben (S2A és B ábra). Az akteozid csontreszorpciót gátló képessége a kezelés RANKL stimulációhoz viszonyított időzítésétől függött. A RANKL-stimuláció után 4 nappal hozzáadott akteozid (10 mM) nem csökkentette a BMM-ekben található információkat, viszont csökkentette a képződött oszteoklasztok számát (3C. ábra). Ez az eltérő eredmény részben a 4 napos RANKL stimuláció kialakulása után már kialakult gödörfelületnek köszönhető (3D. ábra).

Az Acteoside Down szabályozza a korai RANKL jelátviteli útvonalakat

A RANKL 3 jól ismert MAPK és NF-kB aktiválását indukálja az oszteoklaszt prekurzorokban, és ez az aktiválás szükséges a korai oszteoklaszt differenciálódáshoz. Annak érdekében, hogy megértsük azokat a lehetséges mechanizmusokat, amelyek révén az akteozid gátolja az oszteoklasztogenezist, megvizsgáltuk aakteozida MAPK-kra és az NF-B aktiválására makrofágokban. A BMM-eket és a RAW264.7 sejteket 10 mM akteoziddal előkezeltük 2 órán át, majd 30 percig 100 ng/ml RANKL-lel stimuláltuk. A MAPK foszforilációját Western blottal és immunometriás analízissel vizsgáltuk. A RANKL indukálta a p38, ERK és JNK foszforilációját BMM-ekben (4A. ábra) és RAW264.7 sejtekben (4B. ábra). Az akteozid megakadályozta a p-p38, p-ERK és p-JNK RANKL-indukálta növekedését. Ezt az eredményt immunometriás analízis is alátámasztotta, amelyet 10 mM előkezeléssel végeztünkakteozidszignifikánsan gátolta a foszforilált MAPK-k szintjét ezekben a makrofágokban (4C. ábra). A RANKL-kezelés növelte az NF-kB DNS-kötődését, míg az akteozid gátolta az NF-kB-DNS-kötés RANKL-indukálta aktiválását (5A. ábra). Ez a gátlás szembetűnőbb volt a BMM-ekben, mint a RAW264.7 sejtekben. Az akteozid emellett csökkentette a RANKL által stimulált p65 és IkBa foszforilációt BMM-ekben és RAW264.7 sejtekben (5B. és C. ábra). 10 mMacteozid hozzáadása majdnem teljesen gátolta mind az IkBa lebomlását, mind aktiválását a BMM-ekben (5B. ábra). Annak további igazolására, hogy az NF kB aktiváció részt vesz az akteozid hatásában, a kB promoter-luciferáz konstrukciókat átmenetileg RAW264.7 sejtekbe transzfektáltuk. A 100 ng/ml RANKL-lel inkubált sejtek 3-szer nagyobb kB promoter aktivitással rendelkeztek, amit 10 mM akteozid szignifikánsan gyengített (5D. ábra).

Az akteozid elnyomja a gyulladásos citokinek termelődését és a TNF-a, c-Fos és NFATc1 expresszióját a RANKL-stimulált makrofágokban

A TNF-a, IL-1b és IL-6 fontosak az oszteoklasztok képződésében és működésében, amelyet az NF-kB jelátvitel közvetít a RANKL-stimulált makrofágokban. A RANKL stimulálta ezeknek a citokineknek a termelését, és ez a termelés jelentősen csökkent 10 mM-relakteozidelőkezelés BMM-ekben (6A. ábra). Hasonlóképpen, az akteozid gyengítette a RANKL által kiváltott citokinek termelését, kivéve az IL-6-t, a RAW264.7 makrofágokban (S3. ábra). Annak érdekében, hogy megértsük az akteozid hatásának molekuláris mechanizmusait az oszteoklasztogenezisben, tovább vizsgáltuk az akteozid hatását a TNF-a, c-Fos és NFATc1 expressziójára. A RANKL fokozta ezen faktorok mRNS expresszióját a BMM-ekben és a RAW264.7 sejtekben (6B. és C. ábra). A 10 mM akteoziddal végzett előkezelés mindkét esetben szignifikánsan gátolta ezeknek a faktoroknak a RANKL-indukálta expresszióját.

BMM-ek és RAW264.7 sejtek. Az akteozidos előkezelés emellett erősen csökkentette a c-Fos és az NFATc1 fehérjeszintjét a RANKL-stimulált BMM-ekben (6D. ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az akteozid leszabályozza a RANKL-t, ami az oszteoklasztképződés mediátorait indukálja gén- és fehérjeszinten.

Az akteozid dózisfüggő módon csökkenti az intracelluláris ROS-generációt BMM-ekben Mivel ismert, hogy az intracelluláris ROS-termelés korrelál a RANKL-stimulált oszteoklasztogenezissel, megvizsgáltuk, hogy az akteozid gátolja-e a ROS-termelést a RANKL által közvetített oszteoklasztok differenciálódása során, sejt-oxidáció-áteresztő képességgel. , DCFH-DA. Az áramlási citometriás analízis azt mutatta, hogy a BMM-ekben a DCF-re specifikus átlagos fluoreszcens jel láthatóan jobbra tolódott a RANKL-lel végzett stimuláció után a kezeletlen kontrollsejtekhez képest (7A. ábra). Ez az eltolódás hasonló volt ahhoz az esethez, amikor RAW264.7 makrofágokat figyeltek meg RANKL stimuláció után (az adatokat nem mutatjuk be). A BMM-ek akteoziddal történő kezelése dózisfüggő módon csökkentette a DCF jelintenzitását. A 10 mM akteoziddal végzett előkezelés csaknem teljesen csökkentette az oszteoklasztok differenciálódása során termelődő intracelluláris ROS szintjét a kezeletlen kontrollszintekre (7B. ábra).

Az orális akteozid beadás gátolja az oszteoporózisos biokémiai markerek változását és a csontvesztést petefészek-eltávolított egerekben

Az akteozid csontvesztésre kifejtett hatásának feltárására ovariectomiával készítettünk egy csontritkulásos állatmodellt. A kísérleti időszak alatt szignifikáns különbség volt a testtömegben az OVX és a Shammice között (az adatokat nem mutatjuk be). A csoportban szignifikánsan magasabb volt az IL{0}}b és IL-6 szérumszintje, mint a Sham csoportban (8. ábra). Az ovariectomia által kiváltott növekedés ezekben a gyulladásos citokinekben az orális akteozid adagolásával (AC csoport) csillapodott. A csontturnover markerek, például az ALP, a kalcium, a TRAP5b és az OC szérumszintje szignifikánsan megemelkedett az OVX csoportban. Ezen oszteoporózisos markerek közül az OVX egerekben a megnövekedett kalcium-, TRAP5b- és OC-szinteket az akteozidos kezelés nyilvánvalóan gátolta, míg az ALP szérumszintjét a kezelés nem változtatta meg. Az átlagos maximális törési terhelés a jobb combcsont közepéig szignifikánsan alacsonyabb volt az OVX csoportban, mint a Sham csoportban (9A. ábra). Az akteozidos kezelés a maximális törési tartalékot a Sham csoport értékére emelte. Amikor a combcsont kérgi csontját kimetszették és optikai mikroszkóppal megfigyelték, az OVX csoportban mutatott oszteoporózisos jellemzők szinte teljesen eltűntek AC egerekben (9B. ábra). Az akteozid OVX által kiváltott csontritkulás modellre gyakorolt ​​hatásának igazolására a könnyű proximális femur trabekuláris BMD és csontmorfológiai paramétereit mikro-CT-vel elemeztük. Amint a 9C. ábrán látható, az OVX egerekben a femorális trabekuláris architektúra megváltozását találták, míg ezt a változást az akteozidos kezelés csökkentette. A mikro-CT analízis eredményei azt mutatták, hogy a csontszilárdságot mérő BMD drámaian csökkent az OVX egerekben (9D. ábra). A Sham csoporthoz képest az OVX egerek is jelentős változásokat mutattak a BV/TV, Tb értékben. Sp és Tb. N, de nem a Tb.Th. Az OVX egerek orális akteozidos kezelése jelentősen megakadályozta a BMD, valamint a BV/TV és a Tb.N változását.

Az akteozid nem befolyásolja az oszteoblasztogenezist a csontvelősejtekben

Az akteozid szerepét az oszteoblasztok differenciálódásában tovább vizsgálták csontvelősejtek felhasználásával. Amint a 10A. ábrán látható, a DAG-kezelés növelte az alizarin-vörösre festett sejtek számát, és ezen a 10 mM akteozidos előkezelés nem változott. A jelenlévő festék mennyisége azt jelzi, hogy a kombinált akteozid- és DAG-kezelés nem változtatta meg a mineralizációt (10B. ábra). Hasonlóképpen, a csontspecifikus markerek, például a Runx2, az osterix, a BSP és az OC intracelluláris kalciumtartalmának (10C. ábra) és mRNS-szintjének (10D. ábra) DAG-indukált növekedését nem befolyásolta az előkezelésakteozid.