A félelem memória fázisának aktív átmenete a konszolidációtól a kihalásig az ERK által közvetített újrakonszolidáció megelőzésen keresztül

Kapcsolatfelvétel: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

A visszaszerzésefélelemmemóriakét ellentétes memóriafolyamatot indukál, azaz az újrakonszolidációt és az extinkciót. A rövid visszakeresés újrakonszolidációt indukál a félelem fenntartása vagy fokozása érdekébenmemória, míg a hosszan tartó visszakeresés kioltja ezt az emléket. Bár az újrakonszolidáció és a kihalás mechanizmusait vizsgálták, továbbra sem ismert, hogy a félelem memóriafázisai hogyan váltanak át az újrakonszolidációból a kihalásba az emlékezés során. Itt bemutatjuk, hogy egy extracelluláris szignál-szabályozott kináz (ERK) függő memóriaátmeneti folyamat a visszakeresés után szabályozza a memóriafázisok átállását az újrakonszolidációból a kihalásba azáltal, hogy megakadályozza a rekonszolidáció indukcióját egy gátló elkerülési (IA) feladatban hím egerekben. Először is, a rekonszolidációt követően, de az extinkciós fázisok előtt azonosították az átmeneti memória fázist, amely megszünteti a rekonszolidáció indukcióját, de nem elegendő az extinkció megszerzéséhez. Másodszor, az újrakonszolidáció, az átmenet és a kihalás fázisamemória előhíváscAMP-reszponzív elemkötő fehérje (CREB) és ERK foszforiláció révén eltérő molekuláris és sejtes aláírásokat mutatott az amygdalában, a hippocampusban és a mediális prefrontális kéregben (mPFC). A rekonszolidációs fázis megnövekedett CREB foszforilációt mutatott, míg az extinkciós fázis több idegi populációt mutatott ki a CREB és/vagy ERK foszforiláció különböző kombinációival ezekben az agyi régiókban. Érdekes módon a három memóriafázis, beleértve az átmeneti fázist is, tranziens ERK aktiválást mutatott közvetlenül a visszakeresés után. A legfontosabb, hogy az ERK blokádja az amygdalában, a hippocampusban vagy az mPFC-ben az átmeneti memória fázisban gátolta az IA memória rekonszolidáció által kiváltott növekedését. Ezek a megfigyelések arra utalnak, hogy az ERK-jelátviteli útvonal aktívan szabályozza a memóriafázis átmenetét az újrakonszolidációból a kihalásba, és ez a folyamat kapcsolóként működik, amely megszünteti a félelem újrakonszolidációját.memória.

Kulcsszavak: ERK; kihalás; félelem memória; újrakonszolidáció; átmenet

1 Biotudományi Tanszék, Élettudományi Kar, Tokiói Mezőgazdasági Egyetem, Tokió 156-8502, Japán és

2 Graduate School of Agriculture and Life Sciences, University of Tokyo, Tokió 113-8657, Japán

Jelentőségi nyilatkozat

A félelem emlékének előhívásakét ellentétes memóriafolyamatot indukál; újrakonszolidáció és kihalás. Az újrakonszolidáció fenntartja/növelifélelem emlék, míg a kihalás gyengíti a félelemmemóriát. Továbbra is ismeretlen, hogy a memóriafázisok hogyan váltanak át az újrakonszolidációból a kihalásba a visszakeresés során. Itt egy aktív memóriaátmeneti folyamatot azonosítottunk, amely kapcsolóként működik, amely gátolja az újrakonszolidációt. Ez a memória átmeneti fázis az extracelluláris szignál-szabályozott kináz (ERK) foszforilációjának átmeneti növekedését mutatta az amygdalában, a hippocampusban és a mediális prefrontális kéregben (mPFC). Érdekes módon az ERK gátlása ezekben a régiókban az átmeneti fázisban gátolta a gátló elkerülő (IA) memória rekonszolidáció által közvetített fokozását. Ezek az eredmények azt sugallják, hogy az átmeneti memória folyamat aktívan szabályozza a félelememlékezet félelemmemória fázisainak átváltását azáltal, hogy megakadályozza a rekonszolidáció indukálását az ERK-jelátviteli útvonal aktiválása révén.

Bevezetés

memóriaA visszakeresés nem passzív folyamat, hanem inkább egy dinamikus folyamat, amely lehetővé teszi egy eredeti memória fenntartását, megerősítését, gyengítését vagy megváltoztatását/frissítését (Misanin et al., 1968; Schneider és Sherman, 1968; Lewis, 1979; Mactutus et al. ., 1979; Gordon, 1981; Nader és mtsai, 2000; Nader és Hardt, 2009; Dudai, 2012; Fukushima és mtsai, 2014). Fontos, hogy a kondicionált ingernek (CS) való rövid ismételt expozícióval előhívott kondicionált félelememlékezet labilissá válik, és génexpressziótól függő újrakonszolidációt igényel a fenntartása vagy fokozása érdekében (Nader és mtsai, 2000; Dudai, 2002; Kida et al., 2002; Suzuki és mtsai, 2004; Tronel és mtsai, 2005; Fukushima és mtsai, 2014). Ezzel szemben a CS-nek való folyamatos vagy ismételt expozíció a memória kihalását idézi elő, ami gyengíti a félelem memóriáját (Pavlov, 1927; Rescorla, 2001; Myers és Davis, 2002). Így a félelemmemória előhívása két ellentétes memóriafolyamatot indukál, azaz az újrakonszolidációt és az extinkciót, bár mindkét folyamatot egy azonos CS-nek való ismételt expozíció indukálja, de különböznek a CS-nek való ismételt expozíció időtartamától függően.

A rekonszolidáció és az extinkció közös és kritikus biokémiai jellemzője a cAMP-reszponzív elemkötő fehérje (CREB) által közvetített génexpresszió követelménye (Mamiya et al., 2009). Érdekes módon ellentmondó molekuláris, anatómiai és viselkedési szignatúrákat mutattunk ki a kontextuális félelememlékezet rekonszolidációs és kihalási fázisai között (Suzuki és mtsai, 2004; Mamiya és mtsai, 2009). A fehérjeszintézis blokkolása a rekonszolidációs szakaszban megzavarja az eredeti félelmetmemória, míg a fehérjeszintézis blokkolása az extinkciós szakaszban nem teszi ezt meg, bár a kontextuális félelememlékezet újra aktiválódott. A CREB által közvetített génexpresszió aktiválását mutató agyi régiók követelménye eltér a rekonszolidáció és az extinkció között; A rekonszolidáció az amygdalától és a hippocampustól függ, míg a kihalás az amygdalától és a mediális prefrontális kéregtől (mPFC) függ. Az amygdaloid CREB aktiválásának időbeli lefutása azonban eltér a rekonszolidációs és az extinkciós memória fázisai között. Ezek a megfigyelések azt sugallták, hogy a rekonszolidációs és az extinkciós fázis nem független, hanem inkább kölcsönhatásba lép egymással. Érdekes módon a legújabb tanulmányok olyan időablakot (átmeneti fázist) azonosítottak, amely nem mutat extracelluláris szignál-szabályozott kináz (ERK) aktivációt az amygdalában a rekonszolidáció után, hanem a hallási félelem memória előhívását követő kihalási fázis előtt (Merlo et al., 2018). ). Összességében ezek az eredmények azt sugallják, hogy a memóriafázisok a félelemmemória előhívása során az újrakonszolidációról a kihalásra váltanak át. Más szavakkal, lehetséges, hogy a memória átmenet folyamata aktívan szabályozza ezt a kapcsolót.

A gátlás elkerülése (IA) feladat során az egerek elektromos lábrázást kapnak, miután egy világos részből sötét rekeszbe lépnek, és kialakulnak.memóriahogy elkerülje a sötét rekeszt. Korábban ezzel a feladattal megmutattuk, hogy a rekonszolidációs és kihalási fázisok megkülönböztethetők abban az időpontban, amikor az egér az újraexponálás során egy világos részből sötét rekeszbe lép (Fukushima et al., 2014). Ezért ez a feladat lehetővé teszi számunkra, hogy jellemezzük a rekonszolidációs és kihalási fázisok perspektivikus molekuláris aláírásait, ellentétben a klasszikus kontextuális félelem-kondicionáló paradigmával, amelyben a kondicionált félelem-emlékezet újraaktiválása a CS-nek való ismételt expozíció révén újrakonszolidációt és kihalást is elindít; A kondicionált kontextusnak való rövid (3 perces) ismételt expozíció újrakonszolidációt indukál, míg a hosszú (30 perces) vagy ismételt kitettség ennek a kontextusnak a kihalást indukálja (Eisenberg és mtsai, 2003; Pedreira és Maldonado, 2003; Suzuki et al., 2004; Lee és mtsai, 2008; Mamiya és mtsai, 2009). Továbbá azt találtuk, hogy a lekért IA memóriát a memória újrakonszolidációja javítja ebben a feladatban (Fukushima et al., 2014).

Megérteni a félelem visszanyerése során az újrakonszolidációból a kihalásba való átmenet mechanizmusátmemória, arra törekedtünk, hogy azonosítsuk és jellemezzük az IA memória rekonszolidációs, átmeneti és kihalási fázisának molekuláris, sejtes és viselkedési szignatúráját. Elemeztük a CREB és az ERK aktiválódását az amygdalában, a hippocampusban és az mPFC-ben a rekonszolidációs, átmeneti és extinkciós fázisban, és megvizsgáltuk az ERK aktiváció szerepét ezekben a memóriafolyamatokban.

Anyagok és metódusok

Egerek Minden kísérletet a Laboratóriumi állatok gondozására és használatára vonatkozó útmutató (Japan Neuroscience Society és Tokyo University of Agriculture) szerint végeztünk. Az ebben a vizsgálatban végzett összes állatkísérletet jóváhagyta a Tokiói Mezőgazdasági Egyetem Állatgondozási és Felhasználási Bizottsága (280037 számú engedély). Minden sebészeti beavatkozást Nembutal érzéstelenítésben végeztek, és mindent megtettek a szenvedés minimalizálása érdekében. A hím C57BL/6N egereket a Charles River-től szereztük be. Az egereket öt-hat fős ketrecekben tartottuk, 12/12 órás fény/sötét ciklusban tartottuk őket, és ad libitum biztosítottuk a táplálékhoz és a vízhez való hozzáférést. Az egerek legalább nyolc hetesek voltak a teszteléskor. A tesztelést a ciklus világos fázisában végeztük. Minden kísérletet vakon végeztünk az egerek kezelési állapotára.

IA teszt Az átlépő IA készülék (OHARA Pharmaceutical) egy dobozból állt, külön világos és sötét rekesszel (mindkettő 15,5 12,5 11,5 cm). A világítóteret fluoreszkáló fénnyel világították meg (2500 lux; Fukushima et al., 2008, 2014; Zhang és mtsai, 2011; Ishikawa és mtsai, 2016). Az IA tréning megkezdése előtt az egereket egy héten keresztül naponta 2 percig egyenként kezeltük. Az edzések során minden egeret hagytak 30 másodpercig hozzászokni a világos rekeszhez, és a guillotine ajtaját megemelték, hogy hozzáférjenek a sötét rekeszhez. A sötét rekeszbe való belépés késleltetését tekintették a megszerzés mértékének. Amint az egér belépett a sötét rekeszbe, a guillotine ajtaja becsukódott. 5 másodperc elteltével láblökést (0,2 mA) adtak le összesen 2 másodpercig (edzés). Az edzés után 24 órával az egeret visszahelyeztük a világos rekeszbe, amíg be nem került a sötét rekeszbe (átlagosan 459 6 15,49 s). Közvetlenül azután, hogy az egér belépett a sötét rekeszbe, a guillotine ajtaja bezárult, és az egér változó ideig (0, 1 vagy 10 percig) a sötét rekeszben maradt lábrázkódás nélkül (újraaktiválás). A memóriát 48 órával később [reaktiválás utáni hosszú távú memória (PR-LTM) teszt] értékelték, mint az egér átfutási késleltetését, amikor a sötét rekeszbe lép, amikor visszahelyezték a világos rekeszbe, mint az újraaktiváláskor.

Az első kísérletben a fehérjeszintézis gátlásának hatását vizsgáltuk újraaktiválás után (újbóli expozíció a sötét térben 0, 1 vagy 10 percig; 1. ábra). A fehérjeszintézist gátló anizomicint (ANI; Wako) sóoldatban oldottuk (pH-t NaOH-val 7.{12}}–7,4-re állítottuk be). Az egereket a fent leírtak szerint képezték ki, és 24 órával később vivőanyagot (VEH) vagy ANI-t (150 mg/kg, ip) kaptak közvetlenül azután, hogy újra kitették őket a sötét térnek 0, 1 vagy 10 percre lábrázkódás nélkül. (újraaktiválás). Ennél a dózisnál az ANI 0,90 százalékban gátolja a fehérjeszintézist az agyban az első 2 órában (Flood et al., 1973). Az újraaktiválás után 48 órával az egyes egereket ismét a fényrekeszbe helyeztük, és megvizsgáltuk a keresztezési késleltetést.

A második kísérlethez [foszforilált CREB (pCREB) és foszforilált ERK (pERK) immunhisztokémia; ábra 2–5], megvizsgáltuk azokat az agyi régiókat, amelyek aktiválódtak a fénynek való újbóli expozíció után (amíg az egerek be nem léptek a sötét részbe, újra exponáltak a sötét részbe 0 percig) vagy a sötét részbe (újra 1 vagy 1 0 percig a sötét térben). Az egereket négy részre osztották Fukushima et al. · Transition of Fear Memory Phases after Retrieval J. Neurosci., 2021. február 10., • 41(6):1288–1300 • 1289groups. A kiképzés után 24 órával az egyes egereket újra kitettük a világos rekeszbe, majd a sötét rekeszben maradtak, miután beléptek a sötét részből [reaktiválás: 0 perc a sötét rekeszben, rekonszolidációs (Recon) csoport; 1 perc, átmeneti (Tran) csoport; 10 perc, extinkciós (Ext) csoport]. Az egerek másik csoportja nem került vissza a világos/sötét részbe [nem reaktivált (NR) csoport]. Az egereket ezután Nembutal (750 mg/kg, ip) érzéstelenítettük az újraaktiválás után 5, 15 vagy 30 perccel.

A harmadik kísérletben (U0126 mikroinfúziója; 6., 7. ábra) megvizsgáltuk az ERK-gátlás hatását az amygdalában, a hippocampusban vagy az mPFC-ben.memóriaújrakonszolidáció/feljavítás, átmenet és kihalás. Az U0126 (Sigma-Aldrich) MEK-inhibitort három csepp Tween 80-t (Sigma) tartalmazó mesterséges agy-gerincvelői folyadékban oldottuk fel 2,5 ml 7,5%-os dimetil-szulfoxidban (Wako) és pH-értékre állítottuk. 7,4 NaOH-val. Az egereket a fent leírtak szerint képeztük ki, és 24 órával később visszahelyeztük őket a fényrekeszbe (reaktiválás). Az egereket U0126-tal (1 mg) vagy VEH-vel mikroinfundáltuk a különböző agyi régiókba közvetlenül ezt követően (6A, C, E–H, 7A–C ábra), vagy 30 perccel azután. (6B. ábra, D) újraaktiválás. Az újraaktiválás után 48 órával az egyes egereket ismét a fényrekeszbe helyeztük, és megvizsgáltuk a keresztezési késleltetést (PR LTM). A mikroinfúziókat a hippokampuszba és az mPFC-t (0,5 ml) 0,25 ml/perc sebességgel végeztük. Az amygdalába (0,2 ml) mikroinfúziót végeztünk 0,1 ml/perc sebességgel. Az injekciós kanült a mikroinfúzió után 2 percig a helyén hagytuk, majd az egereket visszahelyeztük otthoni ketrecükbe. Az SL327 MEK inhibitort (Santa Cruz Biotechnology) dimetil-szulfoxidban oldottuk és sóoldattal hígítottuk. Az egereket a fent leírtak szerint képeztük ki, és 24 órával később az egyes egereket visszahelyeztük a fényrekeszbe (reaktiválás). Az egereket szisztémásan injektáltuk SL327-tel (10 vagy 20 mg/kg) vagy VEH-vel közvetlenül az újraaktiválás után (7D–F. ábra). Az újraaktiválás után 48 órával az egyes egereket ismét a fényrekeszbe helyeztük, és megvizsgáltuk a keresztezési késleltetést (PR-LTM).

Az immunhisztokémiát a korábban leírtak szerint végeztük (Mamiya és mtsai, 2009; Suzuki és mtsai, 2011; Zhang és mtsai, 2011; Fukushima és mtsai, 2014; Ishikawa et al., 2016; Hasegawa et al., 2019). Érzéstelenítés után az összes egeret 4 százalékos paraformaldehiddel perfundáltuk. Az agyakat eltávolítottuk, egy éjszakán át fixáltuk, 30 százalékos szacharózba helyeztük, és 4 °C-on tároltuk. Koronális metszeteket (30 mm) vágtunk ki kriosztátban.

A pCREB és pERK festéshez a szabadon lebegő metszeteket 1 százalék H2O2-vel kezeltük, és egy éjszakán át nyúl poliklonális anti-foszfo-CREB (szerin 133; S133) antitesttel (1:1000; #{{10) inkubáltuk. }}, Millipore) és/vagy nyúl monoklonális anti-foszfo-ERK1/2 (T202/Y204) antitest (1:300; #4370; Cell Signaling Technology) blokkolóoldatban (foszfáttal pufferolt sóoldat plusz 1% kecskeszérum albumin, 1 mg/ml szarvasmarha-szérumalbumin és 0,05% Triton X-100). A metszeteket foszfáttal pufferolt sóoldattal mostuk, és torma-peroxidázzal konjugált szamár anti-nyúl IgG-vel (1:500; Jackson ImmunoResearch) pCREB vagy torma-peroxidázzal konjugált kecske anti-nyúl IgG-vel inkubáltuk pERK-hoz 1 órán át szobahőmérsékleten. A pCREB jeleket biotin tiramiddal amplifikáltuk, és Alexa Fluor-konjugált streptavidin (Invitrogen) segítségével tettük láthatóvá. A pERK jeleket TSA-FCM-mel (Invitrogen) erősítettük. A metszeteket csúszdákra szerelték fel, és egy rögzítő közeggel (Millipore) fedték le.

A számszerűsítést a korábban leírtak szerint végeztük (Frankland és mtsai, 2006; Fukushima et al., 2014; Mamiya és mtsai, 2009; Zhang és mtsai, 2011; Suzuki és mtsai, 2008). A szerkezeteket anatómiailag Franklin és Paxinos atlasza (1997) alapján határozták meg. Az összes immunreaktív idegsejtet megszámolta egy kísérletező, aki nem látta a kezelési állapotot

Eredmények

Az IA feladatban a visszakeresés utáni memóriafázisok jellemzése

Az IA feladat lehetővé teszi számunkra, hogy megkülönböztetjük az újrakonszolidációs és kihalási fázisokat abban az időpontban, amikor az egér a világos részből sötét részbe lép (Fukushima et al., 2014). Annak érdekében, hogy megértsük a memóriafázisok újrakonszolidációból a kihalásba való átváltásának mechanizmusát, az IA-memória újrakonszolidációjához és kihalásához szükséges fehérjeszintézis gátlásának vizsgálatával jellemeztük az IA memória-fázisokat a memória előhívását követően (Fukushima et al., 2014). Az egereket először a világos rekeszbe helyeztük. 5 másodperccel azután, hogy beléptek a sötét fülkébe, egy rövid elektromos lábütést adtak le (kiképzés). Az egereket 24 órával a kiképzés után (újraaktiválási munkamenet; 1A. ábra) újra kitettük a fényrekeszbe, és megvizsgáltuk a sötét részbe való belépéshez szükséges keresztezési késleltetésüket (1B. ábra). Az egereket azonnal visszahelyezték otthoni ketrecükbe, miután a világos rekeszből bejutottak a sötét rekeszbe (0-perc ismételt expozíció a sötét rekeszbe; újrakonszolidációs fázis), vagy a sötét rekeszben maradtak 1, 3, ill. 10 percig lábrázkódás nélkül (kioltási fázis; 1C–E. ábra). Közvetlenül a reaktiválási munkamenet után az egerek szisztémás VEH vagy fehérjeszintézis-gátló ANI injekciót kaptak. 48 órával később a keresztezési késleltetést PR-LTM értékeltük.

Korábbi tanulmányunkkal összhangban (Fukushima et al., 2014), a fényrekesznek való újbóli expozíció (0 perc csoport) az IA-memória újrakonszolidációját és fokozását idézte elő. A kétirányú ANOVA az idő (F(1,24)=10.433, p=0.{{20}}036), a gyógyszer (F(1) ,24)=23.197, p , 0,0001) és a gyógyszerkölcsönhatás ideje (F(1,24)=25.022, p , 0,0001; 1B. ábra). A post hoc Bonferroni-teszt és a páros t-teszt kimutatta, hogy a VEH- és az ANI-csoportok szignifikánsan megnövekedett vagy csökkentett keresztezési késleltetést mutattak a PR-LTM-nél az újraaktiválási munkamenethez képest (ps , 0,05; VEH, t(6) {{28) }} 5.134, p=0.0021, ANI, t(6)=4.804, p=0.003; 1B. ábra). Ezek a megfigyelések azt mutatják, hogy az IA memória-visszakeresés a fényrekeszben javította a memóriát, míg a fehérjeszintézis gátlása megzavarta a visszakeresett memóriát, megerősítve azt a korábbi megfigyelést, hogy az IA memória-visszakeresés fehérjeszintézis-függő módon javítja a memóriát a rekonszolidáció révén.

Ezzel szemben a sötét résznek való ismételt extinkció hosszú távú extinkciót váltott ki [kétirányú ANOVA, idő (1C. ábra, F(1,28)=9.575, p=0). {50}}04; 1D. ábra, F(1,36)=11.699, p=0.0016), gyógyszer (1C. ábra, F(1,28)=4.674, p=0.039; 1D. ábra, F(1,36)=12.285, p {{29 }},0012), gyógyszerkölcsönhatás ideje (1C ábra, F(1,28)=7,916, p=0,009; 1D ábra, F(1,36) {{41 }}.915, p=0.0079)], amint azt korábban megfigyeltük (Fukushima et al., 2014). Azok a VEH-csoportok, amelyek 3 vagy 10 percig a sötét rekeszben maradtak, szignifikánsan csökkent keresztezési késleltetést mutattak PR-LTM-nél az újraaktiválási munkamenethez képest, míg az ANI-csoportok hasonló keresztezési késleltetést mutattak a PR-LTM-nél, mint az újraaktiválási szakaszban és a VEH-csoportok (post hoc Bonferroni-teszt, ps , 0,05; páros t-teszt, 1C ábra, VEH, t(7)=4.976, p=0.0016, ANI, t(7) { {59}}.796, p. 0,05; 1D ábra, VEH, t(9)=10.211, p , 0,0001, ANI, t(9)=1.02, p 0,05 ). Ezek a megfigyelések azt mutatják, hogy a sötét rész 3 vagy 10 perces ismételt expozíciója kioltotta az IA memóriát, és a fehérjeszintézis gátlása megakadályozta a hosszú távú kihalást. Így az IA memória visszakeresése a sötét rekeszben génexpressziótól függő módon kioltja az IA memóriát.

Fontos, hogy a VEH-csoport összehasonlítható keresztezési késleltetést mutatott PR-LTM-nél az újraaktiválási munkamenethez és az ANI-csoporthoz képest, amikor 1 percig a sötétben tartózkodtak [kétirányú ANOVA, idő (F(1,36) {{ 5}}.03, p . 0.05), gyógyszer (F(1,36)=0.019, p . 0.05), gyógyszerkölcsönhatás ideje (F(1,36)=0,011, p . 0,05); post hoc Bonferroni teszt, ps. 0,05; páros t-próba, VEH, t(9)=0.091, p. 0,05, ANI, t(9)=0.328, p. 0,05; 1E ábra]. Ezek a megfigyelések azt mutatják, hogy a VEH-csoport sem az IA-memória növekedését, sem kihalását nem mutatta, az ANI-csoport pedig nem mutatott zavart az IA-memóriában. Ezért a sötét rekesz 1 perces újbóli expozíciója blokkolta az újraaktivált IA-memória javítását és ANI- által kiváltott megszakítását, de a kioltott IA-memóriát nem, ami arra utal, hogy ez a 1-perces ismételt expozíció megszünteti az újrakonszolidáció kiváltását. , de nem elegendő az IA memória kioltásához.

Összefoglalva, ezek az eredmények azt mutatták, hogy a világos résznek való ismételt expozíció a rekonszolidációs fázist indukálja, míg a sötét résznek való hosszabb ismételt expozíció (3 vagy 10 perc) az extinkciós fázist indukálja. Ennél is fontosabb, hogy az 1 perces sötét rekeszben való tartózkodás átmenetet indukál az újrakonszolidációból a kihalásba, ami gátolja a félelememlékezet újrakonszolidációját anélkül, hogy kihalást idézne elő.

Az amygdalában, a hippocampusban és az mPFC-ben a rekonszolidációs, átmeneti és extinkciós fázisok molekuláris aláírásai az IA memória visszakeresése után

A kontextuális félelem-memória újrakonszolidációja és extinkciója a CREB foszforilációjának növekedését mutatja az S133-nál, amely a génexpressziós aktiválás markere, amely a rekonszolidációhoz és a hosszú távú kihaláshoz szükséges, de a CREB foszforilációjának eltérő dinamikáját mutatja (Mamiya et al., 2009). ). Érdekes módon a közelmúltban végzett tanulmányok kimutatták, hogy az ERK, a CREB upstream szabályozója (Impey és mtsai, 1998; Wu és mtsai, 2001) foszforilációja nem fokozódik az amygdala bazolaterális régiójában a rekonszolidációból való átmenet során. a jelzett félelem-emlékezet kihalásához, bár ez a foszforiláció megnövekszik a bazolaterális régióban, amikor a jelzett félelememlékezet újra megszilárdul és kialszik (Merlo et al., 2014, 2018). Egy másik tanulmány kimutatta, hogy a hippocampális ERK csak akkor aktiválódik, ha a kontextuális félelem emléke kialszik, de nem konszolidálódik újra (Tronson et al., 2009). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a rekonszolidációs, átmeneti és kihalási fázisok eltérő molekuláris és sejtes aláírásokat mutatnak. Ezért immunhisztokémiával mértük és hasonlítottuk össze a pCREB és a pERK szintjét a rekonszolidációs, átmeneti és extinkciós fázisban. Az 1B, D, E ábrákhoz hasonló kísérleti ütemterveket hajtottunk végre négy kísérleti csoport felhasználásával. Az egereket a kiképzés után 24 órával újra kitettük a fényrekeszbe, majd a sötét rekeszben maradtak [reaktiválás: 0 perc a sötét rekeszben, rekonszolidációs (Recon) csoport; 1 perc, átmeneti (Tran) csoport; 10 perc, extinkciós (Ext) csoport]. Az egerek másik csoportja nem került vissza a világos/sötét részbe (nem reaktivált, NR csoport). Megszámoltuk a pCREB-pozitív (pCREB1) neuronokat, a pERK-pozitív (pERK1) neuronokat és a kettős pozitív (pCREB1/pERK1) neuronokat az amygdalában, a hippocampusban és az mPFC-ben 30 perccel a reaktivációs ülés után.

Amygdala (oldalsó régió) A CREB az extinkciós és a rekonszolidációs fázisban aktiválódott, míg az ERK csak az extinkciós fázisban (ábra. 2A-C). Az egyirányú ANOVA kimutatta a csoport szignifikáns hatását (2B ábra, F(3,29)=14.85, p , 0.0001). A korábbi eredményekhez hasonlóan (Mamiya et al., 2009) a post hoc Newman–Keuls teszt kimutatta, hogy a Recon és Ext csoportok szignifikánsan több pCREB1 neuront mutattak, mint a többi csoport (p, 0,05). Ezek a megfigyelések azt mutatták, hogy hasonlóan a viselkedési szinteken (1. ábra) végzett megfigyelésekhez, a sötét rész 1 perces expozíciója (átmeneti fázis) megszünteti a CREB foszforiláció "bekapcsolását", amely a rekonszolidációs fázisban fokozódna. Ezzel szemben szignifikánsan több pERK1 neuron volt megfigyelhető az Ext csoportban, mint a többi csoportban, bár sokkal kevesebb pERK1 neuron volt, mint pCREB1 neuron az Ext csoportban (F(3,29)=3.793, p { {23}}.0207; 2C. ábra).

Következetesen szignifikánsan több kettős pozitív neuron (pCREB1/pERK1) volt megfigyelhető az Ext csoportban (F(3,29)=6.698, p=0.00 14. ábra; 2D. ábra), míg szignifikánsan több pCREB1/pERK– (pCREB egyszeri pozitív) neuront figyeltek meg a Recon és Ext csoportokban (F(3,29)=13.689, p , 0 .0001; 2E ábra). Így a rekonszolidációs fázis csak egyetlen pCREB1/pERK– neuron populációt mutatott. Ezzel szemben az extinkciós fázis a pCREB1/pERK– és a pCREB1/pERK1 neuronok két populációját mutatta, ami azt jelzi, hogy az ERK csak a pCREB1 neuronok egy részében aktiválódik. Fontos, hogy hasonló eredményeket figyeltek meg az amygdala bazolaterális régiójában (2G ábra, F(3,29)=13,042, p , 0,0001; 2H ábra, F(3,29) {{32} }.824, p=0.0201; 2I. ábra, F(3,29)=12.633, p , 0,0001; 2J. ábra, F(3,29)=12 .505, p , 0,0001).

Az ERK kétfázisú aktiválása az extinkciós fázisban Az ERK a CREB upstream aktivátora, ezért az ERK aktiválása szükséges a félelememlékezet megszilárdulásához és újrakonszolidációjához (Schafe et al., 200{{31). Duvarci et al., 2005). Azonban következetlen módon nem figyeltek meg ERK-aktivációt az amygdalában, a hippocampusban vagy az mPFC-ben a rekonszolidációs fázisban, amikor a pERK-t 30 perccel az újraaktiválási munkamenet után mérték (2-4. ábra). Ezért megvizsgáltuk az ERK és CREB foszforiláció időbeli lefutását. Hasonló kísérletet hajtottunk végre, mint a(z) 2-4 ábrákon, azzal a különbséggel, hogy a pCREB és a pERK szintet az újraaktiválási munkamenet után 5, 15 és 30 perccel mértük (újbóli expozíció a sötét rekeszbe {{ 66}}, 1 vagy 10 perc; 5A. ábra). A 2-4 ábrákon látható adatokkal összhangban a pCREB1 neuronok számának szignifikáns növekedését figyelték meg a Recon (amygdala, mPFC és hippocampus) és Ext (amygdala és mPFC) reaktivációs munkamenete után 30 perccel, de nem 5 perccel. ).=15.272, p , 0,0001; mPFC, 5 perc, F(3,23)=1,169, p 0,05, 30 perc, F(3,23)=32. 346, p , 0,0001, hippocampus, 5 perc, F(3,23)=0,154, p 0,05, 30 perc, F(3,23)=16,197, p , 0,0001; páratlan t-teszt, amygdala, újrakonszolidáció, 5 vs 30 perc, t(12)=7.807, p , 0,0001, extinkció, 5 vs 30 perc, t(12)=5.405, p { {73}},0002; mPFC, újrakonszolidáció, 5 vs 30 perc, t(12)=5,727, p , 0,0001, extinkció, 5 vs 30 perc, t(12)=4.188 , p=0.0013; hippocampalis CA1 régió, újrakonszolidáció, 5 vs 30 perc, t(12)=2.339, p=0.0374).

Érdekes módon a pERK1 neuronok számának szignifikáns növekedését figyelték meg a Recon, Tran és Ext csoport amygdalájában, mPFC-jében és hippokampuszában 5 perccel az újraaktiválás után, összehasonlítva az NR csoporttal (5F. ábra, amygdala, F(3,23).=10.961, p=0.0001; mPFC, F(3,23)=7.525, p { {13}}.0011; hippocampus, F(3,23)=6.924, p=0.0017). Ezek a megfigyelések azt mutatták, hogy az ERK azonnal aktiválódik az újraaktiválás után minden memóriafázisban. A pERK1 neuronok számának ez a növekedése azonban a reaktivációs munkamenet után 15 perccel visszatért az alapszintre (az NR-csoporthoz hasonló) (5F. ábra, amygdala, F(3,20)=2.676, p 0,05; mPFC, F(3,23)=0,683, p 0,05; hippocampus, F(3,20)=0,74, p 0,05). Továbbá, összhangban a 2-4 ábrákon látható eredményekkel, szignifikánsan több pERK1 neuront figyeltek meg az amygdalában, az mPFC-ben és a hippocampusban 30 perccel az újraaktiválás után csak az Ext csoportban (5F. ábra, amygdala, F(). 3,23)=6.616, p=0.022; mPFC, F(3,23)=8.012, p=0.0008; hippocampus, F( 3,23)=6.206, p=0.003). Így a rekonszolidációs és átmeneti fázisok csak a korai időpontban (5 perc) mutatják az ERK tranziens aktiválását, míg az extinkciós fázis az ERK kétfázisú aktiválását mutatja a reaktiváció utáni korai (5 perc) és késői (30 perc) időpontokban. ülés. Ezek a megfigyelések azt mutatták, hogy az ERK aktiválódás szabályozásának mechanizmusai eltérnek a rekonszolidációs/átmeneti és extinkciós fázisban. Megfigyeléseink együttesen azt mutatták, hogy a rekonszolidációs, átmeneti és extinkciós fázisok eltérő molekuláris jeleket mutatnak.

Az ERK aktiválásának szerepe az IA memória rekonszolidációs és kioltási fázisában

A rekonszolidációs/átmeneti és az extinkciós fázis egyfázisú, illetve kétfázisú ERK aktivációt mutatott. Ezt követően megvizsgáltuk és összehasonlítottuk a korai (5 perc) és a késői (30 perc) ERK aktiváció szerepét az mPFC-ben a rekonszolidációs és extinkciós fázisban az ERK gátlásának vizsgálatával (6. ábra).

Vita

Ebben a tanulmányban az IA memória előhívása után a memória átmenetének mechanizmusait vizsgáltuk az újrakonszolidációból a kihalási fázisba. Először jellemeztük az IA memóriafázisok viselkedési aláírásait a visszakeresés után. Korábbi tanulmányunkkal összhangban (Fukushima et al., 2014), az IA memória-visszakeresés által kiváltott újrakonszolidáció és kihalás a fénynek (0 perc a sötétben) és a sötét 3 vagy 10 perc) rekeszbe. Érdekes módon az IA-memória sem nem fokozódott, sem nem szűnt meg, és rezisztenciát mutatott a fehérjeszintézis gátlásával szemben, amikor az egereket csak 1 percre újra kitették a sötét térnek. Ezért ezek a megfigyelések azt sugallják, hogy egy 1-perc ismételt expozíció a sötét résznek megszünteti az újrakonszolidáció indukcióját, de nem elegendő az IA memória kioltásához. Továbbá azt találtuk, hogy az ERK aktiválódott az amygdalában, a hippocampusban és az mPFC-ben egy korai időpontban (5 perc), miután ismételten kitettük a sötét résznek 0, 1 vagy 10 percig. Következetesen az ERK gátlása ezekben az agyi régiókban blokkolta az IA-memória újrakonszolidációját/feljavítását és kihalását. A legfontosabb, hogy az ERK gátlása az amygdalában, a hippocampusban és az mPFC-ben, miután 1-perces ismételt expozíciót kapott a sötét részhez, gátolta az IA memória rekonszolidáció által közvetített javulását, ami arra utal, hogy az ERK aktiválása rövid (1 perces) ismételt expozíciót követően a sötét részhez szükséges az IA memória újrakonszolidáció gátlásához. Ezzel szemben a 1-perces ismételt expozíció a sötét rekesznek nem volt elegendő az IA-memória kioltásához, bár a sötét részre tett hosszabb expozíció (3 vagy 10 perc) kioltotta ezt a memóriát. Eredményeink tehát azt sugallják, hogy a 1-perc ismételt kitettség a sötét térbe olyan memóriaátmeneti folyamatot indukál, amely megszakítja az újrakonszolidációt/feljavítást, de nem indítja el a kioltási tanulást. Összességében azt javasoljuk, hogy az emlékezet-átmeneti folyamat az ERK-közvetített rekonszolidáció megakadályozása révén hozzájárul a memóriafázisok újrakonszolidációból a kihalásba való átváltásához.

Jelenlegi megfigyeléseinkhez hasonlóan egy nemrégiben, hallási félelem-kondicionálást alkalmazó tanulmány kimutatta, hogy az egyszeri (1) vagy hosszan tartó (10) CS-prezentációk a memória újrakonszolidációját, illetve kihalását idézik elő a pERK-szintek növekedésével az amygdala bazolaterális régiójában. Ezzel szemben a köztes (4–7) CS-prezentációk nem változtatják meg a pERK-szinteket az amygdala bazolaterális régiójában. Fontos, hogy az ERK gátlása a közbenső CS prezentációkban nem befolyásolta a félelem memóriáját. Ez a tanulmány azt sugallta, hogy az emlékezet fázisának átmenete van az újrakonszolidációból a kihalásba a félelemre való emlékezés után (Merlo et al., 2018). Jelen tanulmányban kiterjesztettük ezt a megállapítást, és azt javasoltuk, hogy az átmeneti fázis az ERK jelátviteli útvonal aktiválása révén aktívan váltja át a memória fázisait az újrakonszolidációból a kihalásba. A korábbi megállapításokkal ellentétben (Merlo és mtsai, 2018) azt találtuk, hogy az átmeneti fázis magában foglalja az ERK foszforilációját az amygdalában, a hippocampusban és az mPFC-ben. Ezek az eltérések az ERK foszforilációját vizsgáló időpontok különbségéből adódhatnak; az előző vizsgálat a pERK szintet 12 perccel a CS bemutatása után mérte (Merlo és mtsai, 2018), míg a mi vizsgálatunk azt mutatta, hogy a megnövekedett pERK szintek ezen időpont környékén (15 perccel az ismételt expozíció után) visszatértek az alapszintre. Ezenkívül fontos megjegyezni, hogy az IA feladat lehetővé teszi az IA memória javításának megfigyelését az újrakonszolidáció révén, ezáltal arra a következtetésre jutottunk, hogy az ERK gátlása az átmeneti fázisban gátolja az IA memória javítását.

Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy az ERK foszforilációja megnövekszik az amygdala bazolaterális régiójában 20-60 perccel a jelzett félelememlékezet kihalásos megtanulását követően (Herry és mtsai, 2006; Merlo és mtsai, 2014, 2018), míg a hippocampus ezt mutatja. ez az aktiválás 1 órával a kontextuális félelem-memória kihalásának megtanulását követően (Fischer et al., 2007; Tronson és mtsai, 2009). Jelen tanulmányban hasonló megfigyeléseket kaptunk, hogy a pERK 30 perccel az extinkciós fázis reaktiválása után nő. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az ERK-foszforiláció a késői kihalási fázis (20-60 perc) általános molekuláris jele.

Megfigyeltük továbbá, hogy az ERK aktiválása kétfázisúan megy végbe a korai és késői időpontokban (5 és 30 perccel) az extinkciós fázis reaktivációs szakasza után, míg ez az aktiválás monofázisosan, a rekonszolidációs fázis korai időpontjában (5. ábra). . Következetesen az ERK gátlása az agyi régiókban a rekonszolidációs és az extinkciós fázis ezen időpontjaiban blokkolta a rekonszolidációt / fokozódást és a hosszú távú kihalást (6A ábra, C-H). Ezek a megfigyelések arra utalnak, hogy az IA-memória rekonszolidáció által közvetített bővítéséhez, illetve kioltásához egyfázisú, illetve kétfázisú ERK-aktiválásra van szükség. Fontos megjegyezni, hogy az ERK a CREB foszforiláció upstream szabályozójaként működik. Ezért az ERK átmeneti aktiválása a korai memóriafázisban, legalábbis részben, hozzájárulhat a CREB ezen foszforilációjához, amely aktiválja a rekonszolidációhoz és a hosszú távú extinkcióhoz szükséges gének expresszióját.

Hasonlóan korábbi, kontextuális félelem kondicionálást alkalmazó eredményeinkhoz (Mamiya et al., 2009), a CREB a rekonszolidációs (amygdala/hippocampus/mPFC) és az extinkciós (amygdala/mPFC) memóriafázisban, míg az ERK csak az extinkciós fázisban aktiválódott. 30 perccel az újraaktiválás után. Következetesen csak egyetlen populációt figyeltek meg a pCREB1/pERK– neuronok a rekonszolidációs fázisban, míg a különböző neuronpopulációk az extinkciós fázisban: pCREB1/pERK– és pCREB1/pERK1 neuronok az amygdalában (2. ábra); pCREB– /pERK1 neuronok a hippocampusban (3. ábra); és pCREB1/pERK–, pCREB– /pERK1 és pCREB1/pERK1 neuronok az mPFC-ben (4. ábra). Ezek a megfigyelések, különösen a pCREB–/pERK1 és pCREB1/pERK– neuronok ellentétes megfigyelése arra utalnak, hogy a CREB és az ERK aktiválódása az egyes agyterületeken eltérően szabályozódik, amikor a memória kialszik, és hogy az ERK késői fázisú aktiválódása specifikusan és határozottan játszik szerepet. A félelemmemória kioltásának szerepe más memóriafolyamatokhoz, például a konszolidációhoz és az újrakonszolidációhoz képest, amint azt alább tárgyaljuk. Érdekes módon megfigyeltük, hogy a pERK1 neuronok nagyobb mennyiségben voltak jelen az mPFC-ben, mint a hippocampusban és az amygdalában, mivel az mPFC nagyobb arányban mutatta a pERK1 neuronokat (kihalási fázis) és a pCREB1 neuronokat (rekonszolidációs fázis), mint a hippocampusban és az amygdalában, ami arra utal, hogy az ERK aktiválása az mPFC-ben specifikusabb szerepet játszik a memória kioltásában.

Továbbra is tisztázatlan, hogy a rekonszolidáció, az átmenet és a kihalás memóriafázisában ugyanazok vagy különböző neuronpopulációk aktiválódnak-e. Egy korábbi tanulmány azonosította a "félelem neuronok" és a "kihalási neuronok" aktiválását az amygdalában, amikor a jelzett félelememlékezet újra aktiválódik vagy kialszik (Herry et al., 2008). Ezért lehetséges, hogy az ERK és a CREB aktiválódik a különböző időbeli profillal rendelkező neuronok különböző populációiban (azaz "rekonszolidációs neuronok" és extinkciós neuronok). Amint azt fentebb tárgyaltuk, a pCREB1 neuronok, beleértve a pCREB1/pERK1 neuronokat, szabályozhatják az IA memória rekonszolidációját és hosszú távú kihalását a génexpresszió rekonszolidációs, illetve extinkciós neuronokként történő aktiválásával. Ezzel szemben a pCREB–/pERK1 neuronokban az ERK aktiváció hozzájárulhat a CREB által közvetített transzkripciós aktiváció leállításához, amelyre a rekonszolidációhoz szükség lenne, mivel ez az ERK aktiváció kifejezetten a késői extinkciós fázisban figyelhető meg; Az ERK aktiválódott a rekonszolidációs neuronokban, hogy megszüntesse a génexpresszió aktiválását az extinkciós fázisban. Érdekes módon egy korábbi tanulmány kimutatta, hogy a hippocampalis ERK aktiválása blokkolja a c-fos indukcióját, amikor a kontextuális félelem emléke kialszik (Guedea et al., 2011), ami felveti annak lehetőségét, hogy ez az ERK aktiválás antagonizálja a CREB jelátviteli útvonalat. Fontos azonosítani a rekonszolidációt, átmenetet és extinkciót szabályozó neuronpopulációkat, és megvizsgálni ezen neuronok molekuláris aláírásait és funkcionális jelentőségét. Ezenkívül a tanulmányban azonosított idegi populációk közötti kölcsönhatások továbbra is ismeretlenek. Lehetséges, hogy a "kihalási (átmeneti) neuronok" modulálják a rekonszolidációs neuronok funkcióját, hogy megakadályozzák a rekonszolidációt a köztük lévő kölcsönhatások révén (Eisenberg et al., 2003; Merlo és mtsai, 2014). Ezért is fontos megvizsgálni ezeket a kölcsönhatásokat az amygdalában, az mPFC-ben és a hippocampusban, illetve azok között.

Korábban kimutattuk, hogy a hippokampusz nem mutat változást a CREB foszforilációjában és az Arc expressziójában a kontextuális félelem extinkciós megtanulását követően, és következetesen a fehérjeszintézis gátlása a hippocampusban az extinkciós fázisban nem akadályozza meg a hosszú távú kihalást (Mamiya et al. , 2009). Ezek a megfigyelések felvetették annak lehetőségét, hogy a hippocampusra nincs szükség a hosszú távú kihaláshoz. Megmutattuk azonban, hogy az ERK aktiválódik a hippocampusban az IA memória kihalása után, és következetesen az ERK aktiválásának blokkolása a hippocampusban rontja a hosszú távú extinkciót. Ezért jelenlegi megfigyeléseink azt mutatják, hogy a hippokampusz alapvető szerepet játszik a memória kihalásában. Korábbi eredményeinkkel együtt azt sugalljuk, hogy a hippokampusz szükséges a memória kioltásához, de nem egy konszolidációhoz hasonló folyamathoz, amely a génexpresszió aktiválása révén stabilizálja a "kihalási memóriát".