Veleszületett kórokozó-érzékelési stratégia, amely magában foglalja a bakteriális felszíni fehérjék ubiquitinációját 2. rész

VITA

A metazoánok az ubiquitinációt sokoldalú mechanizmusként használják a citoszolos homeosztázis fenntartására, megakadályozva a sérült fehérjék/organellumok felhalmozódását és védekezve a behatoló kórokozók ellen (40, 41). Tekintettel a kórokozók sokféleségére és a károsodott fehérjék változatos készleteire, a szubsztrátfelismerés és az azt követő ubikvitináció közös motívumainak azonosítása intelligens stratégiát jelent az erőforrás-optimalizáláshoz. Az eukarióta sejtekben lévő, proteolízisre szánt fehérjéket jellemzően egy háromoldalú degron motívum azonosítja (24).

Az immunitás a szervezet azon képessége, hogy leküzdje a betegséget, beleértve a baktériumokra, vírusokra és más káros anyagokra adott válaszokat. Ha a szervezet immunrendszere sérül, nem lesz elég erős ahhoz, hogy megbirkózzon a betegségek támadásával. Tanulmányok kimutatták, hogy az alultápláltság hatással van az immunrendszer működésére, így a szervezet fogékonyabbá válik a fertőzésekre és betegségekre. A fehérje az egyik fontos anyag az immunitás fenntartásához.

A fehérjék aminosavakból állnak, amelyek egy részét esszenciális aminosavaknak nevezik, mivel ezeket a táplálékkal kell biztosítani, és a szervezet nem tudja szintetizálni. Ezek az esszenciális aminosavak: triptofán, leucin, fenilalanin, lizin, izoleucin, metionin, valin és hisztidin. Ha a szervezet nem jut be elegendő esszenciális aminosavat, az a fehérje anyagcsere károsodásához vezethet, ami befolyásolhatja az immunrendszer működését.

Ezenkívül a jó minőségű fehérjebevitel segít fenntartani az immunrendszer és a szervezet normál működését. Ha a szervezetben hiányzik a fehérje, az immunrendszer gyengüléséhez vezethet, és a szervezet fogékonyabb lesz a betegségekre. Ha az emberi szervezetben huzamosabb ideig hiányzik a fehérje, az hosszú távon károsíthatja az immunrendszert, és fogékonyabbá teheti az embereket különféle betegségekre.

Ezért a kiegyensúlyozott étrend és a megfelelő testmozgás a kulcsa a fehérjebevitel fenntartásának. Az emberek úgy tudják kielégíteni szervezetük fehérjeszükségletét, ha több fehérjében gazdag élelmiszert fogyasztanak, mint például hús, baromfi, hal, bab, tojás, tejtermékek, gabonafélék, diófélék és magvak. Emellett a mérsékelt testmozgás növelheti a szervezet fehérjeigényét és a felszívódás hatékonyságát is. A kiegyensúlyozott és változatos étrend és az egészséges életmód a kulcsa az immunitás megőrzésének, a szervezet egészséges és stabil megőrzésének, valamint a betegségek inváziójával szembeni ellenállásnak. Ebből a szempontból erősítenünk kell immunitásunkat. A Cistanche jelentősen javíthatja az immunitást, mivel a húsban lévő poliszacharidok szabályozhatják az emberi immunrendszer immunválaszát, javítják az immunsejtek stressz-képességét, és fokozzák az immunsejtek immunitását. Baktericid hatás.

Kattintson a cistanche deserticola kiegészítésre

Ez arra késztetett bennünket, hogy megvizsgáljuk, megtalálhatóak-e hasonló motívumok a kórokozók felületén, ahol ezek a szubsztrát felismerés proxyjaként működhetnek. Itt bemutatjuk, hogy a gazdaszervezet ubiquitin ligázai hasonló molekuláris aláírásokat használnak a filogenetikailag eltérő kórokozók érzékelésére. A kórokozó felismerése közös molekuláris mintákon/motívumokon (PAMP) keresztül a veleszületett immunitás jól jellemzett jellemzője (42). Eredményeink arra utalnak, hogy a bakteriális felszíni fehérjékben a degronszerű szekvenciák a PAMP-okkal egyenértékű módon működnek, és intracelluláris patogén megfigyelést biztosítanak. Ezt a modus operandust a gazdaszervezet tovább használhatja mikrobiális fehérje antigének bemutatására az I. fő hisztokompatibilitási komplexen, hogy intracelluláris patogének ellen irányuló erős CD8 választ indukáljon.

A kórokozók ubiquitin által közvetített kimutatásának potenciális jelentőségét a gazdaszervezet védekezésében tovább emeli a BgaA és PspA egyaránt hiányzó mutáns SPN-ben kimutatott jelentős maradék ubikvitináció. Ez azt jelzi, hogy az ubiquitin gépezet további, azonosítatlan szubsztrátjai is vannak, és az ebből eredő redundancia robusztus kórokozó-elfogást biztosít. Nevezetesen, néhány azonnali kérdés a degron motívummal és a baktériumok számára való fontosságával kapcsolatban (a felismerhető egység kivételével) érdekes evolúciós szöget kínál.

A degron motívum in vivo nélkülözhető, és ha van ilyen, a motívum mutációja vagy törlése javította az intracelluláris perzisztenciát, ami megnövekedett virulenciát eredményezett. Ezt támasztják alá eredményeink, miszerint a degron motívum mutációját a kórokozók felhasználhatják, hogy elkerüljék az ubiquitin által közvetített felismerést, amint az SPN 19F szerotípusnál látható. Azonban a BgaA degron motívumának konzervált természete az SPN szerotípusok többségében arra utalhat, hogy a baktériumok olyan ellenstratégiát alkalmaznak, amely kevésbé halálos a gazdaszervezet számára.

Ez lehetőséget teremthet a kórokozó számára, hogy növelje lakható élőhelyeit. Ezzel egyidejűleg a bakteriális felület vagy a szekretált fehérjék ubiquitinációja a degron motívumnál funkcionálisan modulálhatja azokat, hogy csillapítsa vagy újrahuzalozza a gazdaválaszt az esetleges előnyök érdekében (43). Ezért az eukarióta-szerű funkcionális domének vagy motívumok (például degronok) jelenléte vagy hiánya a patogén réstől függhet, és alkalmas lehet a gazdaszervezet immunválaszának elkerülésére vagy modulálására.

Hasonló, guanilátkötő fehérjéket magában foglaló kórokozó-érzékelő mechanizmus is szerepet játszik a bakteriális kiürülésben; azonban, ellentétben az ubiquitinációval, szerepük a jelentések szerint a Gram-negatív kórokozókra korlátozódik (44–47). Az ubiquitináció a kórokozót célozza meg, Gram-eredettől függetlenül, például dokumentálták, hogy az RNF213 a Listeria spp. függetlenül az LPS hiányától (48). Ezért nem zárjuk ki annak lehetőségét, hogy az SPN ellen is antimikrobiális hatást fejtsen ki.

Egy kórokozó felület több lánctípussal is ubiquitinálható különböző E3 ligázokkal, láncok közötti kölcsönhatásokkal (41). Különösen az Mtb esetében a Smurf1 és Parkin bizonyítottan K48 és K63 lánctípusokat alkot, amelyek szinergikusan működnek a kórokozó lebontásában (12). A K48 ubiquitinációjának és a fertőzési forgatókönyvekben részt vevő E3-ligázok mechanikus szerepének megértése még mindig kevéssé tanulmányozott. Az STm esetében egyetlen E3 ligázt, az ARIH1-et ábrázoltak, amely a citoszolikus STm-et célozza meg K48 ubiquitin láncokkal, aminek eredményeként azok eliminálódnak a rendszerből (15). Saját és mások felfedezései alapján a K48-K{12}}jelölésű kórokozók végül lebomlanak, miközben a proteaszómális gépezethez kapcsolódnak.

Ez a tanulmány azonban specifikus bakteriális felszíni fehérjék K48-Ub-dekorációját mutatja. Egyes kórokozókról ismert, hogy aktívan módosítják felszíni fehérjéit, megvédve őket az ubikvitinációtól és az azt követő pusztulástól, így hangsúlyozva az ubiquitin szubsztrát felszíni lokalizációjának jelentőségét (10). Ezenkívül számos kötelező intracelluláris patogén stratégiát fejlesztett ki önmaguknak vagy a gazdaszervezet szabályozó komponenseinek deubiquitinálására, hogy elkerülje az ubiquitin által közvetített kiürülést (5). Ezek az eredmények együttesen hangsúlyozzák az ubiquitin által közvetített riasztás jelentőségét, mint alapvető intracelluláris kórokozó-érzékelő mechanizmust, amely központi szerepet játszik a gazdaszervezet védekezésében.

Vizsgálatunk továbbá igazolta az SCF E3 ligáz központi szerepét, különösen az FBXW7-tel, a bakteriális ubiquitinációban, amely fokozza a kórokozók lebomlását. Az FBXW7 heterozigóta mutációi, különösen az R505C (kritikus maradék a szubsztrát felismerő zsebben) változatban többszörös karcinómát és limfocita leukémiát váltanak ki emberben (49, 50). Egy közelmúltban végzett kohorsz-alapú tanulmány kimutatta, hogy a krónikus limfocitás leukémiában (CLL) szenvedő betegek csaknem 43 százaléka belehal a bakteriális tüdőgyulladásba és szepszisbe, amit gombás fertőzések követnek (51).

Ez megerősíti azt a megfigyelésünket, hogy az FBXW7 mutációt hordozó gazdasejtek nem képesek érzékelni és eliminálni a kórokozókat. Eredményeink ezért váratlan molekuláris magyarázatot adnak a fertőzések fokozott kockázatára a CLL-ben szenvedő betegeknél. Az E3 ligáz gének genetikai polimorfizmusa és a bakteriális fertőzésekre való érzékenység közötti kapcsolatot Parkinson-kórban szenvedő betegek is alátámasztják, akik tífuszra vagy leprára érzékenyek (14), ami arra utal, hogy az E3 ligázok jelentős mértékben hozzájárulnak a gazdaszervezet bakteriális fertőzésekkel szembeni immunitásához és fenntartásához. a celluláris egyensúlyi állapot.

Összefoglalva, megfejtettük a citoszolban lakó kórokozók érzékelésének univerzális nyelvét, amelyet a gazdaszervezet hatékonyan alkalmazhat a mikroorganizmusok felismerésére a későbbi elimináció érdekében. Ezek az eredmények együttesen rávilágítanak a sejtes immunrendszer kezdetleges folyamatainak megértésére, amelyek felhasználhatók az antibakteriális immunitás erősítésére.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Sejttenyésztés

Mindkét humán tüdő alveoláris karcinóma (II-es típusú pneumocita) sejtvonal A549 [American Type Culture Collection (ATCC) no. CCL185)] és a HeLa cervicalis adenokarcinóma sejtvonalat (ATCC sz. CRM-CCL-2) Dulbecco módosított Eagle táptalajban (DMEM; HiMedia) tenyésztettük 10 százalék borjúmagzati szérummal (Gibco) 37 fokon és 5 fokon. százalékos CO2.

Baktériumtörzsek és növekedési feltételek

Az SPN-t (R6, 2-es szerotípus, Tim J. Mitchell ajándéka, Birminghami Egyetem, Egyesült Királyság) 1,5 százalékos élesztőkivonattal kiegészített Todd-Hewitt húslevesben termesztették 37 fokos hőmérsékleten, 5 százalékos CO2-tartalom mellett. Szükség esetén a következő antibiotikumokat használtuk az SPN tenyészetek termesztésére: kanamicint (200 ug/ml), spektinomicint (100 ug/ml) és kloramfenikolt (4,5 ug/ml). Kilencszáz mikroliter 0,4 OD600 (optikai sűrűség 600 nm-en) növesztett SPN tenyészetet összekevertünk 600 ul 80 százalékos steril glicerinnel (32 százalékos végső glicerinkoncentráció), és -80 fokos mélyhűtőben tároltuk. Ezeket a glicerin törzsoldatokat használtuk kiindulási inokulumként minden kísérletben.

Escherichia coli DH5 és STm (ATCC 14028) tenyészeteket Luria-Bertani húslevesben (LB) tenyésztettünk 37 fokos rázatás mellett (200 rpm), és szükség esetén a következő antibiotikumokat használtuk: kanamicint (50 ug/ml), spektinomicin (100 ug/ml), kloramfenikol (20 ug/ml) és ampicillin (100 ug/ml). Minden fertőzési vizsgálathoz a baktériumokat OD600-0,4-ig növesztjük, majd foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS) hasonló sűrűségig szuszpendáljuk a gazdasejtek megfertőzése előtt.

A feltételezett ubiquitin célfehérjék szűrése

Az STm és SPN proteomban jelenlévő összes felszíni fehérjét először a publikált irodalomból azonosították. A felszíni fehérjék teljes fehérjeszekvenciáját az UniProt-tól szereztük be, amelyeket azután a degron motívumok jelenlétének azonosítására használtunk. A publikált irodalomból (24, 52, 53) és az Eukaryotic Linear Motif adatbázisból 29 feltételezett degron motívumból álló készletet gyűjtöttek össze. A Python regex modulját használták az összes ilyen kurált motívum helyének azonosítására a felszíni fehérjeszekvenciákban. Lineáris keresést végeztünk továbbá egy lizin-maradék jelenlétének azonosítására minden azonosított degron-motívum közelében (8-14 aminosav). Feltételezhető, hogy ez a lizinmaradék az ubiquitin-rész kapcsolódási helyeként működik. Végül a szűkített fehérjeszekvenciákat az IUPred-be (54), egy fehérjeszerkezet-előrejelző eszközbe tápláltuk be, hogy meghatározzuk egy rendezetlen régió jelenlétét a degron motívum és a proximális lizin között. Az eredményül kapott fehérjéket (SPN esetén BgaA és PspA, STm esetén RlpA) ubiquitinációs célpontként értékeltük ki, és dekódoltuk a kórokozók eltávolításában betöltött szerepüket.

Baktériumtörzs felépítése

Az allélcserét homológ rekombinációval olyan génszegélyező régiók felhasználásával végeztük, amelyek egy beépített antibiotikum-kazettát tartalmaztak mutáns törzsek generálására mind SPN-ben, mind STm-ben (S2 táblázat).

Az SPN esetében a bgaA, pspA és génjeinek 500-bp upstream és downstream régióit és génjeit megfelelő primerekkel (S3 táblázat) amplifikáltuk a genomból, és a pBKS vektorba állítottuk össze. Ezen fragmensek klónozása után egy antibiotikum-rezisztencia kazettát (a zsákhoz spektinomicint, valamint a hysA-hoz pspA-t és kloramfenikolt) illesztettünk ebbe a konstrukcióba. A linearizált rekombináns plazmidokat ezután WT SPN-be transzformáltuk a kompetencia stimuláló peptid 1 (GenPro Biotech) segítségével, a rekombinánsokat a megfelelő antibiotikumok segítségével szelektáltuk, és a géncserét polimeráz láncreakcióval (PCR) és a megfelelő génlókuszok szekvenálásával igazoltuk. Az STm esetében a λ-vörös rekombináz módszert alkalmaztuk a géndeléciós mutánsok előállítására (55).

Röviden, a kötélgén végeivel homológ szekvenciákat csatoltunk a kanamicin rezisztencia-kazetta amplifikálására használt primer szekvenciákhoz. A kazettát ezután a WT STm törzsbe elektroporáltuk, és a homológ rekombináció által generált kiütéseket a kanamicin rezisztencia alapján választottuk ki. A géndeléciót PCR-rel és a génlókusz szekvenálásával igazoltuk. A teljes hosszúságú pspA-t, a hysA-t és a csonkolt bgaA-T-t (1-3168 bp) klónoztuk a P23 promoter alá a pIB166 (56) transzfervektorba, és komplementációra használták.

Ezeket a rekombináns plazmidokat helyirányított mutagenezishez is használták a bgaA-T (bgaA-TK96R, bgaA-TK97R, bgaA-TK96R, K97R és bgaATΔDegron), pspA (pspAK314R, pspAK315RA4 és KSPAK315RA4, p,spron KDA315R45R, p,spron) különböző változatainak előállítására. ), és az ő (hysADegron-BgaA és hysADegron-PspA) megfelelő primerkészletekkel (S3 táblázat), és ΔbgaA és ΔpspA mutánsokká transzformálták. Minden klónt DNS-szekvenálással ellenőriztünk. A BgaA, PspA és HysA különböző variánsainak expresszióját Western blot segítségével igazoltuk megfelelő antitestek felhasználásával.

Antitestek és reagensek

Anti-enoláz és anti-PspA szérum (S. Hammerschmidt, University of Greifswald, Németország); anti-BgaA szérum (S. King, The Ohio State University, USA); és a His6-ra (Invitrogen, MA1-21315), K48-Ub-kötésre (Millipore, 05-1307), K63-Ub-kötésre (Millipore, 14-6077-80) ​​specifikus antitestek ), Ply (Santa Cruz Biotechnology, sc-80500), FBXW7 (Bethyl Laboratories, A301-721A), SKP1 (Invitrogen, MA5-15928), Cullin1 (Invitrogen, {{15} }), glicerinaldehid-foszfát-dehidrogenáz (Millipore, MAB374), GSK3 [Cell Signaling Technology (CST), D5C5Z], foszfotreonin (CST, 9381S), IgA, egér mielómából származó kappa, TEPC-15 klón (igma-AlrichS, M1421) és PSMB7 (Invitrogen, PA5-111404) beszerzésére került sor. A következő másodlagos antitesteket használtuk: torma-peroxidáz (HRP) címkével ellátott anti-nyúl (BioLegend, 406401), HRP-címkével ellátott anti-egér (BioLegend 405306), anti-nyúl Alexa Fluor 488 (Invitrogen, A27206), anti-rabbit Alexa Fluor 555 (Invitrogen, A31572), biotinnal konjugált anti-egér immunglobulin A (Life Technologies, M31115), anti-egér Alexa Fluor (Invitrogen, A31570), anti-egér Alexa Fluor 488 (Invitrogen, A212 Alexa02) Fluor 633 (Invitrogen, A21082) és FM4-64 (Thermo Fisher Scientific, T13320).

Fehérje expressziója és tisztítása

A BgaA-T-t és variánsait pET28-ba klónoztuk Xba I/Not I restrikciós helyek alkalmazásával. A BgaA-T-t N-terminális His-taggal kódoló rekombináns plazmidokat E. coli BL21 (DE3) sejtekbe transzformáltuk fehérjeexpresszió céljából. A frissen transzformált telepeket kanamicint (50 ug/ml) tartalmazó LB-ben tenyésztettük 37 fokon rázóinkubátorban 12 órán át. Az elsődleges tenyészet egy százalékát 1 liter LB táptalajhoz adtuk, és 37 fokon rázóinkubátorban inkubáltuk, amíg az OD600nm el nem érte a 0,6 és 0,8 közötti értéket. A fehérjeexpressziót 100 μM izopropil- -D-tiogalaktopiranozid (IPTG) hozzáadásával és a tenyészet 5-6 órán keresztül 37 fokos hőmérsékleten, 150 fordulat/perc sebességű keverésével indukáltuk.

A sejteket centrifugálással gyűjtöttük be 6 000 ford./perc mellett 10 percig 4 fokon. A sejtüledéket A pufferben [25 mM Trisz (pH 8,0) és 300 mM NaCl] újraszuszpendáltuk, és ultrahanggal lizáltuk. A sejttörmeléket centrifugálással (14, 000 fordulat/perc, 50 perc, 4 fok) elválasztottuk, és a felülúszót Ni-NTA oszlopra vittük, amelyet A pufferrel egyensúlyoztak. Az oszlopot 10 oszloptérfogatnyi pufferrel mostuk. Az A-t és a His-jelölt fehérjéket imidazollal (250 mM) A pufferben eluáltuk. A BgaA-T összes változatát ugyanezzel az eljárással expresszáltuk és tisztítottuk. Az FBXW7-et a pCMV6-Entry-FBXW7 vektorból származó N-terminális glutation-S-transzferáz (GST) címkét tartalmazó pGEX-4 T-1 vektorba szubklónoztuk Eco RI restrikciós enzim segítségével.

A GST-címkézett FBXW7-et E. coli BL21 (DE3) sejtekben expresszálták, miután a fehérje expresszióját 0,1 mM IPTG-vel indukáltuk, és 4 órán át 30 fokon szaporították. Az E. coli nyers kivonatból származó GST-FBXW7-et Glutathione-Sepharose (GE HealthCare) oszlopkromatográfiával tisztítottuk. A tisztított fehérjéket tartalmazó frakciókat összegyűjtöttük, és 0,5 mg/ml-re betöményítettük egy 10- kDa molekulatömeg-leválasztó szűrő (Amicon) segítségével, centrifugálással 4700 rpm-en 4 fokon. A fehérjék tisztaságát SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel (SDS-PAGE) ellenőriztük, majd Coomassie kékkel festettük.

Gazdasejtek transzfekciói

A BgaA-T-t doxiciklinnel indukálható pAK_Tol2_TRE_Blast vektorba (Addgene no. 130261) klónoztuk egy infúziós klónozó készlet (Takara) segítségével. A pozitív klónt Sanger-szekvenálással igazoltuk. Az FBXW7R505C mutációt helyspecifikus mutagenezissel végeztük, templátként pMRX-GFP-FBXW7-et használva, és Sanger-szekvenálással igazoltuk. Minden transzfekciót Lipofectamine 3000 reagenssel (Thermo Fisher Scientific) végeztünk, és a szelekciót blaszticidin-hidroklorid (2 ug/ml; HiMedia) jelenlétében végeztük.

siRNS által irányított génleütés

Specifikus gének RNS-interferencia által közvetített leütéséhez a következő siRNS-eket használták: siFBW7 (Dharmacon ON-TARGET SMARTpool L-004246-00-0005), siCullin1 (Qiagen, 1027423), siSKP1 (Qiagen, SI00301819) és SMARTpool L-003010-00-0005). Röviden, egy 24-lyuklemezen tenyésztett A549 sejteket átmenetileg transzfektáltuk génspecifikus siRNS-ekkel vagy scramble-vel (siControl) (150 pmol) Lipofectamine 3000 használatával a gyártó utasításai szerint. Harminchat órával a transzfekció után a sejteket Western-blot-vizsgálatra és immunfluoreszcens vagy penicillin-gentamicin védelmi vizsgálatokra dolgoztuk fel.

Struktúra előrejelzés és modellezés

Minden struktúrát az AlphaFold (Protein Homology/analogy Recognition Engine V 2.0) (57) (57) jósolt meg, és PyMOL (The PyMOL Molecular Graphics System, 2. verzió) segítségével vizualizáltuk.0 Schrödinger, LLC. A PyMol-ban a struktúrákat színkódoltuk az IUPred (54) pontszámok alapján, a rendezetttől (kék) a rendezetlenig (piros) át a fehérig.

Western blot

A {{0}},4 OD600 nm-re növesztett SPN-tenyészeteket ultrahanggal lizáltuk, és a nyers kivonatokat centrifugálás után (15, 000 fordulat/perc, 30 perc, 4 fok) összegyűjtöttük. Az A549-ek esetében az egyrétegű rétegeket többször mostuk PBS-sel, és jéghideg radioimmunprecipitációs vizsgálati (RIPA) pufferben lizáltuk [50 mM tris-Cl (pH 7,89), 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,5% nátrium dezoxikolát és 1 százalék SDS], amely proteáz inhibitor koktélt (Promega), nátrium-fluoridot (10 mM) és EDTA-t (5 mM) tartalmaz. A sejtszuszpenziót rövid ideig ultrahanggal kezeltük és centrifugáltuk a sejtlizátumok összegyűjtésére. A bakteriális vagy A549 sejtlizátumokban (10 vagy 20 ug) jelen lévő fehérjéket 12%-os SDS-PAGE gélen választottuk el, és aktivált polivinilidén-difluorid membránra vittük át. Az 5 százalékos fölözött tejben történő blokkolást követően a membránokat megfelelő primer és HRP-címkézett másodlagos antitestekkel vizsgáltuk. A blotokat végül egy fokozott kemilumineszcenciás szubsztrát (Bio-Rad) alkalmazásával fejlesztettük ki.
Penicillin-gentamicin védelmi vizsgálat

Az OD600nm 0,4-ig tenyésztett SPN törzseket Todd-Hewitt táplevesben, amelyet 0,2 százalékos élesztőkivonattal (THY) egészítettünk ki, ülepítettük, majd PBS-ben újraszuszpendáltuk ( pH 7,4), és az A549 egyrétegű rétegek fertőzésének 10-es fertőzési többszörösével (MOI) végzett vizsgálati táptalajjal hígítottuk. 1 órás fertőzés után az egyrétegű rétegeket DMEM-mel mostuk, és penicillint (10 ug/ml) tartalmazó vizsgálati táptalajjal inkubáltuk. ) és gentamicint (400 ug/ml) 2 órán át az extracelluláris SPN elpusztítására. A sejteket ezután 0,025 százalékos Triton X-szel{16}} lizáltuk, és a lizátumot Brain Heart Infusion agarlemezekre szélesztettük az életképes SPN számbavételére. A százalékos inváziót a következőképpen számítottuk ki: [telepképző egység (CFU) a fertőzéshez használt lizátumban/CFU-ban] × 100. Az intracelluláris túlélés értékelésére a fertőzés után 9 órával (a penicillin-gentamicin kezelés kezdetétől) sejtlizátumokat készítettünk a következőképpen: fent említettük, és felsorakoztattuk a szétterjedt lemezes és túlélő baktériumokat. A túlélési hatékonyságot (százalék) a kontrollhoz viszonyított százalékos túlélés többszörös változásaként ábrázoltuk a jelzett időpontban (0 órára normalizálva).

Immunfluoreszcencia

Az immunfluoreszcenciás vizsgálathoz A549 vagy HeLa sejteket növesztettünk üveg fedőlemezeken, és SPN vagy STm törzsekkel fertőztük MOI ~25 értéknél 1 órán át, majd 2 órán át antibiotikumos kezeléssel. A fertőzést követő kívánt időpontokban (9 óra SPN-fertőzés esetén A549-ben és 3 óra STm-fertőzés esetén HeLa-ban) a sejteket DMEM-mel mostuk, és jéghűtött metanollal -20 fokon 10 percig fixáltuk. Ezenkívül a fedőlemezeket 3 százalékos szarvasmarha-szérumalbuminnal (BSA) blokkoltuk PBS-ben 2 órán át szobahőmérsékleten (RT). A sejteket ezután megfelelő primer antitesttel kezeltük 1% BSA-t tartalmazó PBS-ben egy éjszakán át 4 °C-on, mostuk PBS-sel, és inkubáltuk egy megfelelő másodlagos antitesttel 1% BSA-ban PBS-ben 1 órán át szobahőmérsékleten. Végül a fedőlemezeket PBS-sel mostuk, és VECTASHIELD-vel együtt 4′,{17}}diamidino-2-fenil-indollal vagy anélkül (Vector Laboratories) üveglemezekre rögzítettük, hogy lézeres pásztázó konfokális mikroszkóppal (LSM 780, Carl Zeiss) láthatóvá váljanak. ) 40×-es vagy 63×-os olajcélok alatt. A képeket optikai metszéssel készítettük, majd a ZEN lite szoftverrel (5.0-s verzió) dolgoztuk fel. A szuperfelbontású mikroszkópiát hasonlóan végeztük Elyra 7 (Carl Zeiss) használatával SIM módban. A kolokalizációs elemzéshez a baktériumokat ismétlésenként n > 100 baktérium vizuális megszámlálásával értékeltük.

Transzmissziós elektronmikroszkópia

Az SPN és STm fertőzést követően a sejteket {{0},1 M nátrium-kakodilát pufferrel mostuk, 2,5 százalékos glutáraldehiddel (Sigma-Aldrich) fixáltuk 0,1 M nátrium-kakodilát pufferben ( Sigma-Aldrich) 3 órán át 4 fokon. Rögzítés után a sejteket egy sejtkaparón keresztül összegyűjtöttük, és 2000 ford./perc sebességgel 10 percig ülepítettük. A sejteket ezután 0,1 M nátrium-kakodilát pufferrel mostuk, és 1%-os ozmium-tetroxiddal 0,1 M nátrium-kakodilát pufferben 20 percig 4°C-on utófixáltuk. Az ezt követő kakodilát pufferrel és desztillált vízzel történő mosást követően a sejteket növekvő koncentrációjú etanolban (50, 70, 95 és 100 százalékban) és propilén-oxidban 30 percig dehidratáltuk, és végül epoxigyantába ágyaztuk (Electron Microscopy Sciences, 14300). polimerizáció 75 fokon 45 percig. Ezt követően a kapszulákat 95 fokos sütőbe helyeztük 45 percre. Ultravékony metszeteket (70 nm) vágtunk le gyémántkéssel Leica EM UC7 Ultramicrotome készüléken, és 2% uranil-acetáttal és 1% ólom-citráttal festettük meg, majd transzmissziós elektronmikroszkóppal (Talos L120 C, Thermo Fisher Scientific) 120 KV-n néztük meg.

Ex vivo ubikvitináció

Az A549--t expresszáló BgaA-T-t és variánsait MG132-vel (5 μM), a fehérjeexpressziót pedig doxiciklinnel (100 ug/ml) indukáltuk 24 órán keresztül. A sejteket ezután RIPA pufferben lizáltuk, és a mintákat SDS-PAGE-val elektroforetizáltuk (8%). A BgaA-T és variánsai fehérjeexpressziójának és ubikvitinációjának igazolását Western blot segítségével igazoltuk anti-BgaA és anti-K48-Ub antitestekkel.

In vitro ubikvitináció

Az in vitro ubiquitinációs vizsgálatokhoz a rekombináns fehérjéket a korábban leírtak szerint tisztítottuk (58). Az SCFFBW7 E3 ligáz komplexet rekombináns 0,1 mM E1-gyel (UBE1; Boston Biochem), 0.25 mM E2-vel (cdc34; Boston Biochem) és ubiquitinnel (2,5 ug/ml; Boston) inkubáltuk. Biochem) tisztított BgaA-T és variánsai jelenlétében. Az ubiquitilációs reakciókat vizsgálati pufferben [50 mM tris (pH 8), 5 mM MgCl2, 5 mM adenozin-trifoszfát (ATP), 1 mM -merkaptoetanol és 0,1% Tween 20] 2 órán át 25 fokon végeztük. . A reakciókat 5x Laemmli pufferrel leállítottuk, SDS-PAGE gélen rezolválták, és anti-BgaA antitesttel immunblottal analizáltuk.

In vitro kináz vizsgálat

Az in vitro kináz vizsgálat elvégzéséhez a GSK3 kináz enzimrendszert (Promega) alkalmaztuk a gyártó protokollja szerint, a következő módosításokkal. Röviden, 3 ug rekombináns BgaA-T-t adtunk 0,5 ug aktív GSK3-hoz 400 μM ATP-vel 40 mM trisz (pH 7,5), 20 mM MgCl2 tartalmú reakciópufferben. , BSA (0,1 mg/ml) és 50 μM ditiotreitol. A reakciót 2 órán át 30 °C-on inkubáltuk, majd 1x Laemmli puffer hozzáadásával leállítottuk. A mintákat ezután felforraltuk, és a korábban említett módon Western-blothoz elektroforetizáltuk. A foszforilált BgaA-T-t anti-foszfotreonin antitesttel mutatták ki.

In vivo modell

All animal experiments were performed at the University of Liverpool in strict accordance with U.K. Home Office guidelines, under project license PP2072053, following approval from local animal welfare and ethics committees. For infection studies, 7- to 8-week female CD1 mice were purchased from Charles River Laboratories, United Kingdom, and allowed to acclimatize for 7 days before use. Briefly, mice were placed into a restraint tube, and S. pneumoniae was administered by intravenous injection into the tail vein (1 × 106 CFU in 100 μl of PBS). Mice were periodically scored for clinical signs of disease and culled when they showed signs of advanced pneumococcal disease or else at predetermined times after infection. Severity endpoints were defined as one or more of the following: substantially elevated or reduced respiratory rate, substantial reduction in natural behavior or moderate reduction in provoked behavior, loss of >20 százalékos kiindulási testsúly, és kifejezett orr- vagy szemváladékozás. A vérmintákat szívpunkcióval, terminális érzéstelenítésben vettük, és a lépeket postmortem kivágtuk a baktériumok számbavétele céljából. A szövetmintákat kézi szövethomogenizátorral dolgoztuk fel, és a homogenizátumokat sorozatosan hígítottuk PBS-ben, mielőtt véragar lemezekre vitték volna fel. A lemezeket egy éjszakán át 37 °C-on, 5% CO2-on inkubáltuk, és a következő napon meghatároztuk a baktériumkolónia számát.

Statisztikai analízis

A statisztikai elemzéshez a GraphPad Prism 5-ös verzióját használtuk. Az egyes kísérletekhez végzett statisztikai teszteket a megfelelő ábramagyarázat tartalmazza. P < 0,05 statisztikailag szignifikánsnak tekinthető. Az adatokat a normalitás és az egyes vizsgált csoportok varianciájának meghatározása céljából teszteltük. Minden többparaméteres elemzés tartalmazott korrekciókat a többszörös összehasonlításhoz, és az adatokat átlag ± SD formában adjuk meg, hacsak másképp nem jelezzük.

IRODALOM ÉS JEGYZETEK

ME Bianchi, DAMP-ok, PAMP-ok és alarmins: Minden, amit tudnunk kell a veszélyről. J. Leukoc. Biol. 81, 1–5 (2007).

2. TH Mogensen, Kórokozó felismerés és gyulladásos jelátvitel a veleszületett immunvédelemben. Clin. Microbiol. Rev. 22, 240–273 (2009).

3. K. Ray, B. Marteyn, PJ Sansonetti, CM Tang, Élet a belsejében: A citoszolikus baktériumok intracelluláris életmódja. Nat. Rev. Microbiol. 7, 333–340 (2009).

4. X. Jiang, ZJ Chen, Az ubiquitiláció szerepe az immunvédelemben és a kórokozók elkerülésében. Nat. Rev. Immunol. 12, 35–48 (2011).

5. V. Vozandychova, P. Stojkova, K. Hercik, P. Rehulka, J. Stulik, The ubikvitinációs rendszer a bakteriális gazda-patogén kölcsönhatásokon belül. Microorganisms 9, 638 (2021).

6. E. Fiskin, T. Bionda, I. Dikic, C. Behrends: A gazdaszervezet és a bakteriális ubiquitinom globális elemzése salmonella typhimurium fertőzésre adott válaszban. Mol. Cell 62, 967–981 (2016).

7. Q. Chai, X. Wang, L. Qiang, Y. Zhang, P. Ge, Z. Lu, Y. Zhong, B. Li, J. Wang, L. Zhang, D. Zhou, W. Li, W. Dong, Y. Pang, GF Gao, CH Liu, A mycobacterium tuberculosis felszíni fehérje toborozza az ubiquitint, hogy kiváltsa a gazda xenofagiáját. Nat. Commun. 10, 1973 (2019).

8. EG Otten, E. Werner, A. Crespillo-Casado, KB Boyle, V. Dharamdasani, C. Pathe, B. Santhanam, F. Randow, Ubiquitylation of lipopolysaccharide by RNF213 during bakteriális fertőzés. Nature 594, 111–116 (2021).

9. A. Yamada, M. Hikichi, T. Nozawa, I. Nakagawa, FBXO2/SCF ubiquitin ligáz komplex irányítja a xenofagiát a bakteriális felszíni glikán felismerésén keresztül. EMBO Rep. 22, e52584 (2021).

10. P. Engstrom, TP Burke, CJ Tran, AT Iavarone, MD Welch, A lizin metiláció megvéd egy intracelluláris kórokozót az ubiquitilációtól és az autofágiától. Sci. Adv. 7, eabg2517 (2021).

11. J. Celli, LRSAM1, egy E3 ubiquitin ligáz, amely érzékeli a baktériumokat. Cell Host Microbe 12, 735–736 (2012).

12. LH Franco, VR Nair, CR Scharn, RJ Xavier, JR Torrealba, MU Shiloh, B. Levine, The ubiquitin liase Smurf1 functions in selective autophagi of mycobacterium tuberculosis and anti-tuberculous host protection. Cell Host Microbe 21, 59–72 (2017).

13. J. Noad, A. von der Malsburg, C. Pathe, MA Michel, D. Komander, F. Randow, LUBAC A szintetizált lineáris ubiquitin láncok korlátozzák a citoszolba behatoló baktériumokat az autofágia és az NF-κB aktiválásával. Nat. Microbiol. 2, 17063 (2017).

14. PS Manzanillo, JS Ayres, RO Watson, AC Collins, G. Souza, CS Rae, DS Schneider, K. Nakamura, MU Shiloh, JS Cox, Az ubiquitin ligáz parkin közvetíti az intracelluláris kórokozókkal szembeni rezisztenciát. Nature 501, 512–516 (2013).

15. M. Polajnar, MS Dietz, M. Heilemann, C. Behrends, Expanding the host cell ubiquitilation machinery targeting cytosolic Salmonella. EMBO Rep. 18, 1572–1585 (2017).

For more information:1950477648nn@gmail.com