Az MRNS vakcina STING-függő daganatellenes immunválaszt vált ki
Dec 07, 2023
Absztrakt
A lipid formájú RNS vakcinákat széles körben alkalmazzák betegségek megelőzésére és kezelésére, de hatásmechanizmusuk és az ilyen hatásokhoz hozzájáruló egyes összetevők még körülhatárolásra várnak. Itt megmutatjuk, hogy egy protamin/mRNS magból és lipidhéjból álló terápiás rákvakcina rendkívül hatékony a citotoxikus CD8þ T-sejt válaszok elősegítésében és a daganatellenes immunitás közvetítésében. Mechanikailag mind az mRNS magra, mind a lipidhéjra szükség van az I. típusú interferonok és a gyulladásos citokinek expressziójának teljes stimulálásához dendritikus sejtekben. Az interferon-b expressziójának stimulálása kizárólag a STING-től függ, és az mRNS-vakcinából származó daganatellenes aktivitás jelentősen csökken hibás Sting-génnel rendelkező egerekben. Így az mRNS vakcina STING-függő daganatellenes immunitást vált ki.
A cistanche előnyei a férfiak számára – erősítik az immunrendszert
1. Bemutatkozás
Az mRNS-vakcinák gyors fejlesztése és világszerte történő alkalmazása a SARS-CoV-2 fertőzés megelőzésére bebizonyította az mRNS-alapú gyógyszerek erejét az egészségügyben1,2. Nagy molekulatömegük és negatív töltésük miatt az mRNS-molekulákat szállító hordozókba kell csomagolni, hogy hatékonyan bejussanak az emlőssejtekbe. A nanométer méretű szállító hordozókba való csomagolás azzal az előnnyel is jár, hogy megvédi az mRNS-molekulákat az enzimatikus lebomlással szemben. A célnak megfelelően többféle bejuttatási platformot fejlesztettek ki, például lipid nanorészecskét, lipopoliplexet (LPP)5, liposzóma-protamin-RNS (LPR)6, RNS lipoplexet (RNA-LPX)7 és vírusszerű vakcina részecske (VLVP) )8. Bár minden platformnak megvan a maga egyedi szerkezete és összetétele, a legtöbb hordozó tartalmaz egy ionos lipidmolekulát, amely megkönnyíti az mRNS-csomagolást és az mRNS-molekulák kijutását az endoszómákból. A profilaktikus vakcinák sikerével általános felismerés alakult ki, hogy az mRNS-terápiák talán a legtöbb, ha nem az összes betegségtípus kezelésére használhatók9e12. Valójában az mRNS-alapú terápiás rákvakcinákat sok éven át tanulmányozták13,14. A klinikai vizsgálatokban elért közelmúltban elért eredmények azt is igazolták, hogy bizonyos rákos betegeknél alkalmazhatók15e17. Ellentétben az adjuváns molekulákkal18e20 előállított peptid rák elleni vakcinákkal, az mRNS vakcina részecskék önadjuvánsként is szolgálhatnak21.
Például egy kétkomponensű mRNS-alapú rákvakcina, amely szabad és protamin-komplexet tartalmazó mRNS-t tartalmaz, szintén képes aktiválni a toll-like receptor 7 (TLR7) jelátvitelt22. Azonban a csupasz mRNS akut veleszületett immuntoxicitása miatti növekvő aggodalom miatt a legtöbb kutató és vállalat módosított RNS-t használ, hogy elkerülje a TLR-ek veleszületett felismerését23. Következésképpen a lipid komponensek fontos szerepet játszanak az adjuváns aktivitás fokozásában az mRNS vakcina részecskében, elsősorban a nem-TLR jelátvitel aktiválásával. Az 1,2- di-oktadecenil-3-trimetil-ammónium (DOTMA, egy kationos lipid)/dioleoil-foszfatidil-etanol-amin (DOPE, segítő lipid) liposzómából álló lipid-formulált, negatív töltésű RNS-LPX-ről nemrég készült tanulmány kimutatta. az interleukin 1 (IL1)-interleukin 1 receptor antagonista (IL-1 ra) tengely aktiválása a proinflammatorikus citokinek szekréciójának szabályozásában, valamint a monocitákban a kétlépcsős gyulladásos folyamat aktiválásának alapvető szerepe24. Érdekes módon egy újabb vizsgálat az LNP-alapú BNT162b2-vel kapcsolatban, amelyet ALC-0315 (ionizált lipid), 1,2-disztearoil-sn-glicero-3-foszfokolin (DSPC, segítő lipid) készítettek. , a polietilénglikol-2000-N, N-ditetradecil-acetamid (PEG2000-DTA) és a koleszterin kulcsszerepet mutatott az I. típusú interferon-függő MDA5 jelátvitel aktiválásában, de nem a TLR-ek vagy a gyulladásos folyamatok stimulálásában. a COVID-19 vakcina veleszületett és adaptív immunitása25. Ezek a tanulmányok arra a lehetőségre mutatnak rá, hogy a variábilis lipidmolekulákból álló szállítóplatformok különböző jelátviteli útvonalakra támaszkodhatnak a vakcina aktivitása szempontjából. Ezért fontos a kulcsmolekulák és kombinációik funkciójának teljes körű vizsgálata az mRNS-terápia további javítása érdekében.
A jelenlegi tanulmányban kísérleteket állítottunk fel az egyes komponensek funkcionális szerepének feltárására egy terápiás rákvakcinában. Az mRNS vakcina részecske (MVP) egy protamin/mRNS magból áll, amely egy kationos lipidből, egy segítő lipidből, egy pegilált lipidből és koleszterinből álló lipidhéjba van kapszulázva (1A. ábra). Kimutatták, hogy a töltött lipidek bevonása elősegítheti a célzott RNS szállítását26, és a dioleoil-etil-foszfatidil-kolin (EDOPC) és a dioleoil-3--trimetil-ammónium-propán (DOTAP) a két kationos lipid, amelyeket erre a célra teszteltek5,27. Megvizsgáltuk az interferon-b (IFN-b), az IL-1b és a tumor nekrózis faktor-a (TNF-a) expressziójának stimulálását az mRNS mag, az mRNS-mentes hordozó és a teljes MVP által. Az ilyen aktivitásokat korrelálta a TLR7-tel, a mitokondriális antivirális jelátvitellel (MAVS, más néven IPS-1), az IFN gének stimulátorával (STING) és a TIR-domént tartalmazó adapterrel, amely IFN-b (TRIF) jelátvitelt indukál. Ezt követően a magban lévő protamin és a héjban lévő kationos lipid szerepét vizsgáltuk az IFN-b és TNF-a expresszió stimulálásában. Végül összehasonlítottuk az MVP-ből származó tumorellenes immunválaszokat vad típusú és génkiütött egerekben.
A cistanche tubulosa-Antitumor előnyei
2. Anyagok és módszerek
2.1. Anyagok
1,2-Dioleoil-sn-glicero-3-etil-foszfokolin (EDOPC) (890704), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-foszfatidil-etanol-amin (DOPE) (850725) ), 1,2-disztearoil-sn-glicero-3-foszfoetanol-amin-N-[amino(polietilénglikol)-2000 (DSPE-PEG2k) (880128), 1,2- A dioleoil-3-trimetil-ammónium-propánt (DOTAP) (890890), az 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-foszfokolint (DOPC) (850375) az Avanti Polar Lipids, Inc.-től vásárolták ( Birmingham, AL, USA). A koleszterint (C8667) a Sigma-Aldrich-től (Saint Louis, MO, USA) szereztük be. A reagenseket etanolban oldottuk fel DSPE-PEG2k esetében 2 mg/ml, koleszterin és DOPC esetében 10 mg/ml, EDOPC, DOPE és DOTAP esetében 20 mg/ml koncentrációban. A protamin-szulfátot (P4020) a Sigma Aldrich cégtől szereztük be. Az ovalbumint (OVA-mRNS) (L-7210), eGFP-t (eGFP mRNS) (L-7201) és luciferázt (Luc-mRNS) (L-7204) kódoló mRNS-molekulákat a TriLink Biotechnologies (San Diego, CA, USA). Az RNáz-mentes vizet (W0805-010) a GeneDEPOT-tól (Baker, TX, USA) szereztük be. A TLR7 agonista imikimod (tlrimq) és Sting agonista 20 30 - cGAMP (tlrl-nacga23) az Invivogen (San Diego, CA, USA) termékei voltak. A Lipofectamine 2000 (11668019) és a Quant-iT™ RiboGreen™ RNS vizsgálati készlet (R11490) a Thermo Fisher Scientific-től (Waltham, MA, USA) vásárolt. A rekombináns egér GM-CSF-et (554586) a BD Biosciences-től (San Diego, CA, USA) vásároltuk. Az 500-as protein transzporter inhibitor koktél (00-4980-93) az Invitrogen terméke volt. A Cytofix/Cytoperm készletet (AB_2869010) a BD Biosciences-től vásároltuk. Az EasySep™ Mouse T Cell Isolation Kit (19851) a STEMCELL Technologies, Inc.-től (Vancouver, BC, CAN) szerezhető be. A következő antitesteket a BioLegendtől (San Diego, CA, USA) szereztük be: anti-CD80-PE-Cy7 (104734), anti-CD86-FITC (105006), anti-CD11b-APC- Cy7 (101226), anti-CD8-BV510 (100752), anti-CD44-APC (103012), anti-CD69-APC (104514) és anti-H{{89 }}Kb (SIINFEKL)-PE (141604), anti-CD64- PE-Cy7 (139314), anti-B220-APC (103212), anti-MHCII-BV711 (107643), és anti-CD{105}}PE (121406). Az anti-CD{108}}FITC (553723), az anti-LY6C-AF700 (557979) és az anti-IFN-g-PE (554412) a BD Biosciences cégtől származott. Az OVA257e{120}}MHCI dextramerPE-t (JD2163) az ImmuDextől (Fairfax, VA, USA) vásároltuk. Az IL-1b (EM2IL1B) és a TNF-a (BMS607-3) ELISA készleteit az Invitrogentől, a CCL5 (DY478) és IFN-b (DY8234) ELISA kiteket pedig az R&D Systemstől szereztük be. , Inc. (Minneapolis, MN, USA). Antitestek Western blot analízishez, beleértve az anti-MAVS (4983), anti-STING (13647), anti-TBK1 (3504), anti-foszfo-TBK1 (5483), anti-b-aktin (4970) és anti-GAPDH (5174) a Cell Signaling Technology, Inc.-től (Danvers, MA, USA) vásároltuk.
1. ábra Az mRNS-részecskék előállítása és jellemzése. (A) A vakcinarészecskék elkészítésének sematikus képe. (B) Az agarózgél-elektroforézis azt mutatja, hogy az mRNS-molekulák megmaradtak a mintabetöltő üregben az 1:1 és 1:2 közötti mRNS/protaminnal készített mintákban. (CeF) Az mRNS vakcina részecskék (MVP-k) jellemzése a kapszulázottság százaléka, a polidiszperzitási index, a zéta potenciál és a méret alapján. (G) MVP2 részecskék reprezentatív TEM-képei, léptéksáv Z 50 nm. (H) Az eGFP expresszió százalékos aránya, miután a DC2.4 sejteket eGFP-MVP-kkel 16 órán át kezeltük. (I) eGFP-t expresszáló DC2.4 sejtek fluoreszcens képalkotása, léptéksáv Z 400 mm. (J) Kvantitatív elemzés a biolumineszcenciáról 16 órán keresztül luciferázt kódoló mRNS-sel kapszulázott MVP-kkel kezelt BMDC-kben. (K) Változások a PBS-sel, mRNS-mentes hordozóval, mRNS/protamin maggal vagy mRNS-be kapszulázott MVP2-vel kezelt BMDC-k életképességében. A kezelési koncentrációk mRNS-ekvivalensek voltak. Az adatokat átlagos SEM-ként adjuk meg (n Z 3). *P < 0,05; **P < 0,01.
2.2. Sejtvonalak és sejtkultúra
A DC2.4 egér dendrites sejtvonalat az ATCC-től (Manassas, VA, USA) szereztük be, és 10% borjúmagzati szérumot (FBS) és 1% penicillin-sztreptomicint tartalmazó RPMI-ben{2}} tenyésztettük. A B16-OVA rágcsáló melanoma sejtvonalat Dr. Kenneth Rocktól szereztük be, a Dana-Farber Cancer Institute-tól (Boston, MA, USA). A B16-OVA sejteket 10% FBS-sel és 1% penicillin-sztreptomicinnel kiegészített DMEM-ben tenyésztettük. Az MC38 egér vastagbél-adenokarcinóma sejtvonalat az ATCC-től vásároltuk. A sejteket OVA-expresszióval módosítottuk, és 10% FBS-t és 1% penicillin-sztreptomicint tartalmazó DMEM-ben tenyésztettük. A sejttenyészetet 37 °C-on tartottuk 5% CO2 mellett.
cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert
2.3. mRNS vakcina részecske készítés
Az összes mRNS vakcina részecskét a Precision Nanosystems, Inc. (Vancouver, BC, CAN) NanoAssemblr Benchtop mikrofluidikus műszerével állítottuk elő a szerves fázis és a vizes fázis összekeverésével. A szerves fázis elkészítéséhez EDOPC-t (20 mg/ml), DOPE-t (20 mg/ml), koleszterint (10 mg/ml) és bisz-DSPE-PEG2k-t (2 mg/ml) etanolban oldunk, és 34 °C-on összekeverjük. :30:35:1 M arány 9 ml/perc áramlási sebességgel. A vizes fázisú mRNS mag előállításához az mRNS-t protamin-szulfáttal 1:1 (tömeg/tömeg) arányban kevertük össze a mikrofluid műszerben 9 ml/perc áramlási sebesség mellett. 20 perces 20 °C-on végzett inkubálás után a vizes fázis mRNS magját összekevertük a szerves fázissal, hogy mRNS vakcina részecskéket hozzunk létre. 20 perc elteltével a vakcina részecskeszuszpenziót Amicon ultracentrifugális szűrőbe (MWCO 30 kDa) vittük át, és 9-térfogatú molekuláris minőségű vizet adtunk hozzá, hogy az etanol koncentrációját 25%-ról 2,5%-ra hígítsuk. A részecskeszuszpenziót ezután 2000 g-vel (Multifuge X4, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 4 °C-on végzett centrifugálással betöményítettük. A koncentrált termékhez azonos térfogatú 2 ul PBS-t adtunk az ozmotikus nyomás beállítására.
2.4. Gél retardációs vizsgálat
Az mRNS/protamin magot először gél retardációval elemeztük. Röviden: 0,5 mg mRNS-t tartalmazó mRNS/protamin magot töltöttünk 1%-os agarózgél 1 TBE-oldatban lévő üregébe, és elektroforézist hajtottunk végre 120 V-on 30 percig (PowerPac™, BioRad Co., Ltd., Hercules, CA). Az RNS-sávokat Gelred-del (Biotium, Hayward, CA) festettük, és GelDoc rendszerrel (Gel Doc XRþ, BioRad Co., Ltd.) detektáltuk.
2.5. Az mRNS vakcina részecskék jellemzése
A méreteloszlást és a zéta potenciált dinamikus fényszórású Zetasizerrel (Zetasizer Nano, Malvern Pananalytical, Inc., Westborough, MA, USA) mértük. A kapszulázási sebességet Quant-iT™ RiboGreen™ RNS vizsgálati kittel határoztuk meg. Röviden, egy 0,5 mg mRNS-t tartalmazó vakcina részecskemintát TriseEDTA pufferrel (10 mmol/L TriseHCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,5) hígítottunk 2% Triton-X100-zal vagy anélkül egy { {10}}kúttányér. 10 perces, 37 C-on végzett inkubálás után RiboGreen-t adtunk minden egyes lyukba, és megmértük a fluoreszcens intenzitást. A kapszulázási hatékonyságot az egyenlet szerint számítottuk ki. (1): A vakcinarészecskék transzmissziós elektronmikroszkópiáját (TEM) egy korábban leírt eljárás szerint végeztük9.
2.6. Állatok
Az összes állatműveletet jóváhagyta a Houston Methodist Hospital Állatgondozási és Felhasználási Bizottsága (protokollszám: AUP06200042). Az egereket olyan környezetben helyezték el, amely teljes mértékben megfelelt a Nemzeti Egészségügyi Intézet és az Amerikai Laboratóriumi Állatgondozási Szövetség szabványainak. A vad típusú C57BL/6J egereket és a genetikailag módosított egereket, köztük a Tlr7/, Sting/, Mavs/ és Trif/ egereket a Jackson Laboratory-tól vásároltuk.
2.7. Az egér csontvelőből származó dendritikus sejtek (BMDC-k) létrehozása
A csontvelősejteket a combcsontból és a sípcsontból komplett RPMI 1640-nel öblítettük ki. A vörösvérsejteket ACK lízispufferrel lizáltuk, és az éretlen csontvelősejteket 20 ng/ml rekombináns egér GM-CSF-fel kiegészített RPMI 1640-ben tenyésztettük 10 percig. napon 37 C-on 5% CO2-val. A sejttenyésztő tápközeget a 3., 6. és 8. napon frissítettük, a nem tapadó dendrites sejteket pedig a 10. napon gyűjtöttük össze.
2.8. Citokinek és kemokinek mérése
A BMDC-ket egy 24-lyuk lemezre oltottuk 5 105 sejt/lyuk sűrűséggel. 1 óra letelepedés után a sejteket 1 mg/ml imikimod, 20 mg/ml 20 30 -cGAMP, (1 mg/ml mRNS ekvivalens) vakcina részecskékkel vagy kontrollokkal kezeltük. A sejttenyésztő tápközeget 24 órával később összegyűjtöttük, és a TNF-a, CCL5, IFN-b és IL-1b szintjét mértük enzim-linked immunosorbent assay (ELISA) kittel, a gyártó által javasolt eljárásokat követve.
cistanche növény-növelő immunrendszer
2.9. Elemzések az egyenáramú transzfekcióról, az egyenáramú érésről és a stimulációról
A DC transzfekció hatékonyságának in vitro elemzéséhez DC2.4 sejteket oltottunk 25 105 sejt/lyuk értékben egy 24-lyukú lemezre. A sejteket eGFP-t vagy luciferázt kódoló mRNS-be zárt részecskékkel kezeltük 1 mg mRNS/ml végső koncentrációban. A sejteket 24 órával később összegyűjtöttük, 2%-os PBS-oldattal mostuk, majd ugyanabban az oldatban újraszuszpendáltuk, mielőtt BD LSR II áramlási citométerrel (LSR II, BD Biosciences, San Jose, CA) alkalmaztuk volna áramlási citometriás analízishez. . A DC-érés és az antigénprezentáció in vitro mérésére BMDC-ket oltottunk 25 105 sejt/lyuk arányban egy 24-lyukú lemezre, és 1 mg/ml OVA-MVP-vel kezeltük 24 órán keresztül. A BMDC-ket 30 percig festették CD11c-re, MHC I-re, MHC II-re, CD40-re, CD80-ra és CD86-ra specifikus antitestekkel a DC-érés érdekében, és anti-H-2Kb-vel (SIINFEKL) az antigénprezentációhoz. A stimuláló hatás in vivo meghatározásához a C57BL/6J egereket egyszer vakcináztuk 10 mg OVA-MVP-vel egérenként a lábpárnában, és a 24, 48-as popliteális LN-eket begyűjtöttük, és a következő sejtfelszíni markereket: CD11c, MHC I, CD11b, B220 , LY6C, CD64, CD8, CD103, CD86.
2.10. Áramlási citometriai elemzések a T-sejtek aktiválásáról és proliferációjáról
A T-sejt-aktiváció in vivo mérésére az egereket egyszer vakcináztuk 10 mg OVA-MVP-vel, és a popliteális LN-ket 24 vagy 48 óra elteltével izoláltuk. A T-sejteket a következő antitestekkel festettük: CD45, CD3, CD4, CD8 és CD69. Az antigén-specifikus T-sejtek kimutatására a tumorokat, a lépet és a popliteális nyirokcsomókat 5 nappal a második vakcinázás után gyűjtöttük be. A szöveteket feldolgozva egysejtes szuszpenziókat állítottunk elő, és a sejteket T-sejt-specifikus antitestekkel és OVA257e264-MHCI dextramerrel festettük a gyártó utasításait követve. Az intracelluláris IFN-g szintjének mérésére 2 106 lépsejteket vagy poplitealis LN-ből és daganatokból izolált sejteket 10 mg/ml OVA257e264 peptiddel stimuláltunk komplett RPMI 1640 tápközegben, kiegészítve 55 mmol/L b-merkaptoetanollal és 1 fehérje transzporter inhibitorral. koktél 18 óráig. A sejteket összegyűjtöttük, és T-sejt-specifikus antitestekkel megfestettük. A Cytofix/Cytoperm kittel történő rögzítést és permeabilizálást követően a sejteket anti-IFN-g antitesttel megfestettük, és BD LSR II áramlási citométeren (BD Biosciences) analizáltuk. A T-sejt-proliferáció mérésére T-sejteket izoláltunk OT-I transzgenikus egerek lépéből egér T-sejt-izolációs kit segítségével. 1 mmol/l CFSE-vel festettük őket 200 mg/ml BSA-t tartalmazó RPMI 1640-ben, 10 percig 37 C-on. A CFSE-vel jelölt T-sejteket kétszer mostuk 5 térfogat hideg teljes RPMI 1640-nel. Időközben az érett BMDC-ket kezeltük 2 mg/ml OVA mRNS-be kapszulázott MVP 24 órával a T-sejtek izolálása előtt. Miután a T-sejtek készen álltak, a BMDC-ket és a T-sejteket együtt tenyésztjük 1:5 (DC:T) arányban 72 órán át. A sejteket összegyűjtöttük és felületi antitestekkel festettük T-sejtekre, a proliferációt BD LSR II áramlási citométerrel (BD Biosciences) teszteltük és elemeztük. Az összes áramlási citometriai eredményt a FlowJo v10 szoftverrel (Ashland, OH, USA) elemeztük.
2.11. A fehérje expresszió követése élő egerekben
A BALB/c egereket 10 mg Luc mRNS-be kapszulázott MVP-vel kezeltük a lábfejen belüli injekcióval. Intraperitoneálisan egerenként 30 mg RediJect D-luciferint fecskendeztek be 6, 12, 24 vagy 48 órával később, és a biolumineszcenciát a Xenogen IVIS{9}} képalkotó rendszerrel (Caliper Life Sciences, Inc., Hopkinton, MA, USA).
2.12. ELISpot vizsgálat
Az IP szűrőlemezeket előöblítettük 50 ml 35%-os etanollal, és háromszor alaposan mostuk PBS-sel, mielőtt az etanol elpárologna. A lemezeket ezt követően bevontuk anti-IFN-g befogó antitestekkel 4 °C-on egy éjszakán át. A lemezeket 55 mmol/l b-merkaptoetanolt tartalmazó RPMI 1640 komplett tápközeggel blokkoltuk 2 órán át 37 C-on. Sejteket (1 105 lépsejteket, 1 105 sejteket a popliteális LN-ből) beoltottunk minden egyes lyukba, és 36 órán át 10 mg/ml OVA257e264 peptiddel stimuláltuk. A tápközeget eldobtuk, és a sejteket négyszer mostuk PBST-vel (0,05% Tween 20-at tartalmazó PBS), majd kétszer mostuk PBS-sel. Az utolsó mosás után anti-IFN-g detektáló antitestet adtunk hozzá, és 2 órán át szobahőmérsékleten, sötétben inkubáltuk. A lemezeket négyszer mostuk PBST-vel és kétszer PBS-sel, majd avidin-HRP-t adtunk hozzá, és további 45 percig szobahőmérsékleten, sötétben inkubáltuk. Végül a lemezeket újra mostuk PBST-vel és PBS-sel a fent leírtak szerint, és 50 ml AEC szubsztrátot vittünk fel, és figyeltük a foltreakciót. Amikor foltok váltak láthatóvá, a reakciót leállítottuk az AEC szubsztrát eldobásával és kétszeres desztillált vízzel ötszöri átöblítésével. Egy éjszakán át tartó levegőn történő szárítás után a lemezeket letapogattuk és a CTL ImmunoSpot SeriesS5 Versa ELISpot Analyzer (S5Versa{32}}, CTL Inc., Cleveland, OH, USA) segítségével elemeztük.
2.13. Western blot analízis
A vad típusú, Mavs KO vagy Sting KO egerekből származó BMDC-ket összegyűjtöttük, és a sejteket proteáz és foszfatáz inhibitorokkal kiegészített RIPA sejtlízis pufferben lizáltuk. A sejtlizátum fehérjekoncentrációját BCA fehérje vizsgálati kittel mértük. A fehérjemintákat nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézissel (SDS-PAGE) választottuk el, és polivinilidén-difluorid (PVDF) membránra vittük át. MAVS és STING expressziót detektáltunk, miután a membránt anti-MAVS vagy anti-STING antitesttel 1:2000 hígításban inkubáltuk, majd immundetektáltuk SuperSignal West Pico és Femto kemilumineszcens szubsztráttal. Az STING útvonal aktivációjának mérésére a vad típusú egerekből származó BMDC-ket vivőanyaggal vagy OVA mRNS-be kapszulázott MVP-vel kezeltük a jelzett koncentrációban 2 órán át. A sejteket lizáltuk, és Western blot analízist végeztünk anti-TBK1 és anti-foszfo-TBK1 antitestekkel 1:2000 hígításban.
2.14. Daganatellenes vizsgálat
Az egérdaganat modelleket úgy állítottuk elő, hogy egérenként 2 105 sejt B16-OVA melanoma sejteket vagy 5 105 MC38-OVA sejteket szubkután beoltottak a 6–{{5} bal szélébe. }hetes nőstény C57BL/6J egerek. Az egereket véletlenszerűen beosztottuk a kezelési csoportokba, és kétszer, 7 nap elteltével kezeltük 10 mg OVA MVP-vel vagy kontrollokkal a lábpárnában. A daganat növekedését 2 naponta ellenőriztük. A tumor térfogatát az Eq. (2):
Az egereket 5 nappal a második vakcinázás után elaltattuk, és feljegyeztük a tumorszövetek tömegét.
2.15. Statisztikai analízis
Az összes eredményt átlagos SEM-ként adjuk meg. A statisztikákat egyutas ANOVA-teszttel értékelték ki, Tukey-korrekciót alkalmazva a többcsoportos összehasonlításhoz, és egy páratlan, kétoldali t-próbával a kétcsoportos összehasonlításhoz. Az adatok elemzése a GraphPad Prism v8.{6}}.2 szoftverrel történt. P < 0.{{10}}5-öt tekintettük statisztikailag szignifikánsnak (*P < 0.05; **P < 0,01; ***P < 0,005; ****P < 0,001).
3. Eredmények
3.1. Az MVP erőteljes mRNS expressziót közvetít dendritikus sejtekben (DC)
Mag-héj vakcinarészecskéket készítettünk kétlépéses mikrofluidikus megközelítésben (1A ábra), és szisztematikusan értékeltük a nanorészecskék egyes komponenseit, hogy olyan vakcinarészecskéket állítsunk össze, amelyek nagy stabilitású, magas sejtfelvétellel és magas expressziós potenciállal rendelkeznek a DC-kben. A gélelektroforézis kimutatta, hogy stabil mRNS mag képződhet, ha az mRNS-protamin arány 1 vagy az alatt van (1B. ábra). Az eGFP-t kódoló mRNS-t helyettesítő markerként használva azt találtuk, hogy a 34% EDOPC/30% DOPE/35% koleszterin/1% DSPEPEG2k moláris arányú lipidösszetétel ideális kapszulázási arányt és a legjobb expressziós hatékonyságot biztosítja (1. Támogató információk S1AeS1D ábra). A töltésarány megváltoztatása nem változtatta meg szignifikánsan a részecskék kapszulázási sebességét, polidiszperzitási indexét vagy felületi töltését (2. táblázat, 1. ábra CeE); azonban a kapott részecskék mérete 70 és 80 nm közötti átmérőjű volt, amikor az arány 12 és 16 között volt, szemben a 120-130 nm-es átmérővel, amikor az arány a tartományon kívülre esett (1F és G ábra). A legjobb expressziót az MVP2-vel kezelt DC2.4 sejtekben mutattuk ki, amelyek töltési aránya 12 (1H és I. ábra). Hasonló mintát figyeltünk meg, amikor a részecskéket luciferázt kódoló mRNS-sel állítottuk elő, és dózisfüggő expressziót detektáltunk (1J. ábra). Az mRNS-be kapszulázott részecskék kívánatos stabilitást mutattak, mivel nem veszítették el aktivitásukat liofilizálás vagy fagyasztás-olvasztás után (S1E és S1F ábra). Ezenkívül nem volt citotoxicitás, miután a csontvelőből származó dendritikus sejteket (BMDC-ket) csak az mRNS maggal, egy mRNS-molekulák nélkül előállított hordozórészecskével vagy mRNS-t tartalmazó MVP2-vel kezeltük (1K. ábra). Így az MVP2 mutatta a legjobb expressziós potenciált. A tanulmány minden további kísérletében ezt használták, és a szöveg többi részében MVP-ként jelölték. Az MVP-részecskék hatékonyan tudtak mRNS-molekulákat szállítani in vivo, és nem volt kimutatható toxicitás az mRNS-be zárt MVP-ből a testtömeg-változások alapján (S1GeS1I ábra).
3.2. Az MVP hatékonyan indukálja az antigénprezentációt és a T-sejt aktiválást in vitro és in vivo
Elkészítettük az mRNS magot, az mRNS-mentes hordozót és az OVA mRNS-sel kapszulázott MVP-t, és ezeket alkalmaztuk a DC érésének és antigénprezentációjának tesztelésére (2A. ábra). Az MVP-vel kezelt BMDC-k a DC érési markerek, köztük a CD40, CD80 és CD{5}} dózisfüggő túlzott expresszióját mutatták (2BeD ábra). Az mRNS-mentes hordozóval vagy az mRNS-be zárt MVP-vel végzett kezelés MHC I túlzott expressziót váltott ki (2E. ábra), jelezve, hogy a hatás a vivőanyaggal, nem pedig az mRNS-komplexszel volt összefüggésben. Ezenkívül az MVP kezelés az OVA257e264 antigén epitóp-MHC I komplex (SIINFEKL-MHC I) sejtfelszíni megjelenítését eredményezte, amelyet egy anti-SIINFEKL-MHCI antitesttel mutattak ki (2F ábra), ami hatékony antigénfeldolgozást és BMDC-k általi prezentációt mutatott be. . Továbbá MVP-kezelt BMDC-k együttes inkubálása B3Z-vel, egy CD8þ T-sejtvonallal, amely specifikusan felismerte az OVA257e264 epitópot, vagy egy OT-I egér lépéből izolált T-sejtekkel, amelyek OVA257e264-specifikus T-sejtet expresszáltak. receptor, IL-2 szekréciót váltott ki, ez az eredmény nem figyelhető meg a csak hordozóval vagy csak az mRNS/protamin maggal kezelt DC-kkel együtt inkubált T-sejtekben (2G. ábra). Az áramlási citometriás analízis 32,5%-ban proliferatív CD8þ T-sejteket mutatott ki MVP-vel való együttes inkubáció után (2H. és I. ábra). OVA mRNS-be kapszulázott MVP részecskéket is alkalmaztunk egerek kezelésére intradermális injekcióval. Az elvezető nyirokcsomókban lévő sejtek vizsgálata a CD86 expresszió folyamatos növekedését mutatta ki mind a klasszikus DC-k (CD8þ DC, CD11bþ DC, CD103þ DC), mind a plazmacitoid DC-k (pDC) között az első 48 óra során, ami a DC stimulációját jelzi. érlelés (2J. ábra). A kezelés a CD8þ T-sejtek feldúsulását is elősegítette a nyirokcsomókban, a CD69þCD8þ T-sejtek populációjának jelentős növekedésével (2K és L ábra), ami a kezelés általi T-sejt-aktivációt jelzi. A T-sejt-aktiváció meghatározásához sejteket gyűjtöttünk az elvezető nyirokcsomókban az MVP-kezelés után 3, 5 vagy 7 nappal, és ELISpot-elemzést végeztünk, miután a sejteket OVA257e264 antigénpeptiddel fertőztük (S2. ábra). Az MVP-kezelés nagy ugrást váltott ki az IFN-g-t kiválasztó sejtekben az idő alatt, a csúcsaktivitás az 5. napon (2M. ábra). Ezek az eredmények erőteljes DC-stimulációt, antigénprezentációt és T-sejt aktiválást mutattak az MVP-kezelés után.
1. táblázat Az eGFP-t kódoló mRNS-sel kapszulázott nanorészecskék összetétele.
2. táblázatAz MVP lipidösszetétele és töltési arányarészecskék.
3.3. Az MVP erős daganatellenes immunitást vált ki kolorektális tumor és melanoma egérmodellekben
Az MVP-t MC38 vastagbélrákban és B16 melanomában szenvedő egerek kezelésére alkalmazták. Mindkét modellben az OVA mRNS-sel kapszulázott MVP-vel végzett kezelés kétszer teljesen blokkolta a tumor növekedését szubkután; ehhez képest az eGFP mRNS-sel kapszulázott MVP-vel vagy önmagában hordozóval végzett kezelésnek nem volt kimutatható gátló hatása a tumornövekedésre (3AeD ábra, alátámasztó információ S3 ábra). A nyirokcsomók CD4-ről CD8-ra történő eltolódásának mintájával összhangban (2. ábra) megfigyeltük a CD8þ/CD4þ T-sejt-arány növekedését OVA mRNS-sel kapszulázott MVP-vel kezelt egerekből származó daganatokban (3E. ábra). Ezenkívül emelkedett IFN-gþCD8þ T-sejtek szintjét észleltük OVA mRNS-be zárt MVP-vel kezelt egerekben a lépekben, a nyirokcsomókban és a daganatokban, de nem önmagában hordozóval vagy GFP mRNS-kapszulázott MVP-vel (3FeH ábra, támogató információ). S4 ábra). Ezenkívül szignifikánsan megnőtt az OVA257e264-MHCI dextramer-pozitív CD8þ T-sejtek száma az OVA mRNS-be kapszulázott MVP-kezelési csoportból származó daganatokban, ami az antigén-specifikus CD8þ T-sejtek proliferációját jelzi (3I. ábra). A lépből és a nyirokcsomókból izolált sejtekkel végzett ELISpot vizsgálat további támogatást nyújtott a T-sejt aktiváláshoz (3JeM. ábra).
3.4. Az MVP stimulálja a veleszületett immunválaszokat azáltal, hogy aktiválja a STING-függő jelátvitelt
A BMDC-k kezelésére mRNS magot, mRNS-mentes hordozót és mRNS-be zárt MVP-t alkalmaztunk, hogy azonosítsuk az I-es típusú IFN stimulációjáért és a gyulladásos citokin expresszióért felelős kulcstényezőket és útvonalakat. Érdekes módon az MVP ugyanolyan hatásos volt az IFN-b szekréció kiváltásában, mint a Tlr7 agonista imikimod, és a vivőanyag önmagában is aktivitást mutatott az IFN-b szekréció elősegítésében, bár hatékonysága nem volt olyan magas, mint az MVP; azonban az mRNS mag önmagában nem volt hatékony az IFN-b szekréció stimulálásában (4A. ábra). Az eredmény azt sugallta, hogy az IFN-b expresszió maximalizálásához mind az mRNS-re, mind a hordozóban lévő komponensekre volt szükség. Időközben az imikimod és a vivőanyag hasonló aktivitást mutatott a TNF-a és IL{8}}b expressziójának elősegítésében, míg az MVP sokkal hatásosabb volt, mint bármelyikük (4B és C ábra). A CCL5, az NF-kB és az IFN szabályozó faktorokkal gyakran összefüggő citokin expressziója egyformán stimulálódott imikimoddal, csak vivőanyaggal vagy MVP-vel kezelt sejtekben (4D. ábra). A TLR7, a MAVS, a STING és a TRIF kulcsfontosságú tényezők a fő jelátviteli útvonalakban, amelyek közvetítik a vírus RNS-re és a sérült DNS28e30-ra adott sejtválaszokat. BMDC-ket állítottunk elő egerekből Tlr7, Mavs, Sting vagy Trif gén knockout (KO), és a sejteket mRNS maggal, mRNS-mentes hordozóval vagy mRNS-be zárt MVP-vel kezeltük, hogy megvizsgáljuk az IFN-b és TNF-a expressziót.
2. ábra Immunválaszok stimulálása MVP-vel. (A) Az mRNS/protamin mag, az mRNS-mentes hordozó és a teljes MVP sematikus képe. (BeD) A BMDC-k érése 24 órás OVA-MVP kezelés után. (E és F) MHC I expresszió és OVA257e264 antigén epitóp-MHC I komplex BMDC-ben 24 órás OVA-MVP kezelés után. (G) B3Z vagy OT-I T-sejtekkel együtt inkubált kezelt BMDC-kből származó IL-2 szintje. (H és I) Proliferatív T-sejtek áramlási citometriás analízise. A T-sejtek reprezentatív kromatogramjait mutatjuk be. (J) DC érés MVP kezelés után in vivo. A C57BL/6J egereket OVA-MVP-vel kezeltük, és a popliteális nyirokcsomókban lévő DC-ket elemeztük. (K és L) T-sejt populáció elemzés. A C57BL/6J egereket vivőanyaggal vagy OVA-MVP-vel kezeltük, és a poplitealis nyirokcsomókban lévő T-sejteket áramlási citometriával elemeztük. (M) ELISpot vizsgálat. A C57BL/6J egereket OVA-MVP-vel kezeltük, és a nyirokcsomókat összegyűjtöttük a jelzett időpontokban. Izolált sejteket alkalmaztunk az IFN-g-t expresszáló sejtek mérésére. Az adatokat átlagos SEM-ként adjuk meg (n Z 3). *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0,005; ****P < 0,001; ns, nem jelentős.
3. ábra MVP tumorellenes aktivitása. (A) Az MC38-OVA daganat növekedésének gátlása. A nőstény C57BL/6J egereket szubkután oltottuk be 5 105 MC38-OVA tumorsejtekkel/egérrel a 0. napon, majd PBS kontrollal, hordozó kontrollal, GFP-MVP-vel vagy OVA-MVP-vel kezeltük. 3. és 1. nap0. (B) A B16-OVA daganat növekedésének gátlása. Nőstény C57BL/6J egereket szubkután oltottunk be 2 105 B16-OVA tumorsejtekkel/egérrel a 0. napon, és kezeltük PBS kontrollal, hordozó kontrollal, GFP-MVP-vel vagy OVA-MVP-vel. a 3. és 1. napon0. (C és D) B16-OVA daganatok képe és súlya a 17. napon. (E) T-sejt-populáció kezelés utáni egerek daganataiban. (FeH) IFN-gþCD8þ T-sejtek a kezelés utáni egerek lépében, nyirokcsomóiban (LN) és daganataiban. (I) OVA-specifikus CD8þ T-sejtek kezelés utáni egerek daganataiban. (JeM) A kezelés utáni egerekből származó lép- és LN-sejtek ELISpot-vizsgálatának képei és kvantitatív elemzése. Az adatokat átlagos SEM-ként adjuk meg (n Z 5). *P < 0.05; **P < 0,01; ***P < 0,005; ****P < 0,001.
A Mavs és Sting KO-státuszát a BMDC-ben Western-blot analízissel igazoltuk (S5A ábra). Meglepő módon, a Sting KO megszüntette az IFN-b szekrécióra kifejtett stimuláló aktivitást mind a hordozóból, mind az MVP-ből (4E. ábra), jelezve, hogy az MVP aktiválta az I. típusú IFN expresszióját a STING révén. Az elképzelés alátámasztására kimutattuk a tankkötő kináz 1 (TBK1) foszforilációját (S5B ábra), amely kináz általában a STING aktivitással jár31. Ezenkívül ez az útvonal független volt a TLR7 jelátviteltől, mivel az IFN-b expressziója nem sérült az imikimoddal kezelt sejtekben (4E. ábra). Összehasonlításképpen, a Trif vagy a Mavs KO minimális hatással volt az MVP által elősegített IFN-b expresszióra. Ahogy az várható volt, az imikimod nem volt hatékony az IFN-b szekréció stimulálásában a Tlr7 KO-ból származó BMDC-kben; azonban a Tlr7 KO negatív hatással volt az MVP stimuláló hatására (4E. ábra). Érdekes módon eltérő profilt figyeltek meg az azonos kezelésekből származó TNF-a szekrécióban. A Sting, a Trif vagy a Tlr7 kiütése nem volt minimális hatással az MVP által stimulált citokin expresszióra. A Mavs knockoutja viszont drámaian csökkentette a TNF-a szintet a hordozóval vagy MVP-vel kezelt sejtekben (4F. ábra). Az eredmény azt jelzi, hogy a MAVS a TNF-a expressziójának kulcsfontosságú szabályozója DC-kben MVP-kezelés hatására.
3.5. Az MVP stimulálja a STING és MAVS útvonalakat, hogy elősegítse az IFN-I és a gyulladásos citokinek szekrécióját
A járműben az STING és MAVS jelzések stimulálásáért felelős komponensek azonosítása érdekében járműveket és MVP-ket készítettünk elő a kulcsfontosságú alkatrészek cseréjével vagy elhagyásával, és ezeket alkalmaztuk a BMDC-k kezelésére. A Sting agonista ciklikus GMP-AMP (cGAMP) pozitív kontrollként szolgált az IFN-b szekréció stimulálásában. A vivőanyagban lévő kationos lipid EDOPC helyettesítése egy másik pozitív töltésű lipiddel, a DOTAP-pal, teljesen kiirtotta az IFN-b szekréciót. Összehasonlításképpen, a vivőanyagból és az MVP-ből származó stimuláló hatás protaminnal vagy anélkül megmaradt, és ez a stimuláló aktivitás egy ép Sting-géntől függött (4G. ábra). Érdekes módon a lipidhéj egyes komponenseivel, köztük az EDOPC-vel kezelt BMDC-k nem segítették elő az erős IFN-b szekréciót (S6. ábra). Így az EDOPC elengedhetetlen volt a STING aktiválásához, és aktivitása egy lipid nanorészecske (azaz hordozó vagy MVP) képződésétől függ. EDOPC-vel vagy DOTAP-pal előállított hordozót és MVP-t is alkalmaztunk a vad típusú és Mavs KO egerekből származó BMDCS kezelésére, és meghatároztuk a sejttenyésztő tápközegben a TNF-szinteket. Ahogy az várható volt, az EDOPC DOTAP-ra vagy DOPC-re cserélése megszüntette a stimulációs erőfeszítést a járműből és az MVP-ből. Ezenkívül a TNF-a szint szignifikánsan csökkent a Mavs KO sejtekben a vad típusú sejtekhez képest, de nem csökkent (4H. ábra), ami arra utal, hogy további tényezők is szerepet játszhatnak az MVP-stimulált TNF-a expresszió közvetítésében.
3.6. A STING útvonal elengedhetetlen az MVP által közvetített daganatellenes immunválaszokhoz
Mind a vad típusú, mind a knockout egereket OVA mRNS-sel kapszulázott MVP-vel kezeltük, és megvizsgáltuk a DC érését és a T-sejtek proliferációját. A Sting KO szignifikánsan csökkentette a CD80þ és CD86þ DC sejtek és CD69þ T sejtek százalékos arányát (5AeD ábra). Az ELISpot vizsgálat szignifikánsan csökkent IFN-g-termelő sejteket mutatott a Sting KO egerek lépében és nyirokcsomóiban a vad típusú egerekhez képest, miután azonos dózisú MVP-vel kezelték őket (5EeH. ábra). A Mavs KO hatása minimális volt, mivel nem figyeltek meg különbséget a CD44þCD8þ memória T-sejteken, az OVA257e264-MHCI dextramer-pozitív CD8þ T-sejteken vagy a nyirokcsomókban lévő IFN-g-termelő sejtek számában a vad- típusú egerek (5IeL. ábra). Az eredmény megerősíti azt az elképzelést, hogy a MAVS mellett további faktorok is szerepet játszhatnak az MVP által stimulált gyulladásos citokin expresszióban. Mind a vad típusú, mind a Sting KO egereket alkalmaztuk a B16-OVA daganatok beoltására, az egereket pedig PBS kontrollal vagy OVA mRNS-be zárt MVP-vel kezeltük. A vakcinázott egerekből gyűjtött nyirokcsomó- és daganatmintákon végzett áramlási citometriás elemzés kimutatta, hogy a Sting KO egerekben jelentősen csökkent az IFN-g-termelő CD8þ T-sejtek száma (6A és B ábra). Ennek eredményeként a tumor növekedése teljesen gátolt volt az MVP-vel kezelt vad típusú egerekben, szemben a Sting KO egerekben tapasztalt csak részleges gátlással (6C. ábra).
cistanche növény-növelő immunrendszer
Kattintson ide a Cistanche Enhance Immunity termékek megtekintéséhez
【Kérjen többet】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
4. Megbeszélés
Jelen tanulmányunkban szisztematikusan megvizsgáltuk az egyes komponensek funkcionális szerepét az MVP-ben a tumorellenes immunválasz stimulálásában. Sejtalapú vizsgálatunk egyértelműen bebizonyította, hogy az MVP-ben mind az mRNS-molekulákra, mind az RNS-mentes vivőanyagra szükség van az IFN-b és számos gyulladásos citokin, köztük az IL-1b és a TNF expressziójának elősegítésében. -a dendrites sejtekben. Az ilyen citokinekről kimutatták, hogy alapvető szerepet játszanak a dendrites sejtek aktiválásában és a vakcina által közvetített daganatellenes immunitásban20. Vizsgálatunk azt is feltárta, hogy a citokintermelés stimulálása számos kulcsfontosságú jelátviteli útvonaltól függ, amelyek részt vesznek a veleszületett immunérzékelésben, beleértve azokat, amelyeket a STING és a MAVS közvetít. Míg az STING elengedhetetlen az IFN-b expressziójához, a MAVS főként a TNF-a expresszió szabályozásában vesz részt (6D. ábra). Az STING jelátvitel jelentőségét az MVP által közvetített tumorellenes immunitásban tovább bizonyítja a csökkent T-sejt-aktivitás, és ennek következtében a tumornövekedés gátlása Sting KO egerekben. Ez az eredmény összhangban van más jelentésekkel, amelyek szerint az STING aktiválása meghatározza a citotoxikus T-sejtek által közvetített daganatellenes immunitást32. A MAVS kulcsfontosságú közvetítő a vírusfertőzésre adott válaszként a RIG-I-receptor (RLR) jelátvitelében. Ennek az útvonalnak az aktiválása gyulladásos válaszok kaszkádjához vezet33. Érdekes, hogy a Mavs KO egerekben a T-sejt aktivitás nem sérül, mivel a MAVS jelátvitel egyértelműen nagy szerepet játszik a gyulladásos citokinek, köztük a TNF-a expressziójának szabályozásában. Ennek lehetséges oka az, hogy az ilyen citokinek MVP általi stimulálását több útvonal közvetíti, és a MAVS útvonal megszakítása nem csökkenti a citokin expresszióját elég alacsony szintre ahhoz, hogy jelentős hatást váltson ki. Alternatív megoldásként a MAVS jelátvitel elvesztését a többi útvonal kompenzálja. További vizsgálatokra van szükség ezen utak azonosításához, hogy jobban megértsük az MVP-vakcina hatásmechanizmusát. Bár a TLR7-et hagyományosan az mRNS-terápiákkal társították21, úgy tűnik, hogy a TLR7 jelátvitel nem játszik jelentős szerepet az MVP aktivitás közvetítésében. A teljesen metilált mRNS-molekulák jelen tanulmányban való alkalmazása kevésbé relevánssá tehette a TLR7 jelátvitelt. Jól bebizonyosodott, hogy az RNS-metiláció elnyomja a TLR-ek általi felismerést23. A TRIF a TLR3/7/8 jelátvitel kulcsfontosságú adapterfehérje28. A Trif kiütése sem befolyásolja az MVP aktivitását, megerősítve azt az elképzelést, hogy a fenti TLR-ek, beleértve a TLR7-et, nem játszanak jelentős szerepet az MVP-re adott sejtválaszok közvetítésében. Több Sting-agonistát alkalmaztak a rák elleni vakcina kifejlesztésében, beleértve a ciklikus dinukleotidokat, valamint a kis és nagy molekuláris vegyületeket34e37. Az ilyen szúrás-agonistákat külső adjuvánsként kell hozzáadni az oltóanyag-előállítás során, ami további komplexitást ad a vakcinakészítményhez. Ezenkívül a külsőleg hozzáadott Sting agonista nemkívánatos káros hatásokat okozhat, miután elválik az mRNS komplextől. Összehasonlításképpen, az MVP-nk önadjuvánsként szolgál, és egy rákvakcina kontextusában működik, mivel a vakcina egyetlen összetevője sem, beleértve az EDOPC-t, nem képes elősegíteni a citokin expresszióját. Érdekes módon a kationos foszfolipid EDOPC nem helyettesíthető nem foszfolipid DOTAP-pal, amely szintén pozitív töltésű. Érdekes találgatni a két kationos lipid közötti különbség lehetséges mechanizmusát. Mindazonáltal dokumentálták, hogy a lipidmolekula komponensének egyéb tulajdonságai, például a hidrofóbitás, jelentős hatással lehetnek a nanorészecske általános funkciójára és a nukleinsavak szállítási hatékonyságára38. Ezért gondot kell fordítani a megfelelő molekulák kiválasztására egy teljesen működőképes mRNS vakcina előállításához. Összefoglalva, kifejlesztettünk egy erős mRNS-alapú terápiás rákvakcinát, és az oltóanyagban az egyes komponenseket funkcionalitásukkal együtt rendeltük hozzá. Hatásmechanizmusa merőben különbözik a profilaktikus és terápiás beavatkozásokhoz használt többi mRNS-platformtól. A jelenlegi tanulmányból származó ismeretek minden bizonnyal irányítják a további mRNS-terápiák jövőbeli fejlesztését.
4. ábra Veleszületett immunválaszok elősegítése MVP által. (AeD) BMDC-ket 1 mg/ml imikimoddal, 1 mg/ml mRNS-ekvivalens maggal, vivőanyaggal vagy MVP-vel kezeltek 24 órán keresztül. Az IFN-b, TNF-a, IL-1b és CCL5 szinteket ELISA-val mértük. (E és F) Vad típusú és génkiütéses (KO) egerekből származó BMDC-k IFN-b és TNF-a expressziója. A BMDC-ket 24 órán keresztül kezeltük a jelzett reagensekkel. Az IFN-b-t és a TNF-a-t ELISA-val mértük. (G) IFN-b vad típusú és Sting knockout egerekből származó BMDC-kben. A BMDC-ket 20 mg/ml cGAMP-val, 1 mg/ml mRNS-ekvivalens maggal, vivőanyaggal vagy MVP-vel kezeltük 24 órán keresztül. Jármű (DOTAP): az EDOPC DOTAP-ra cserélésével készült; vivőanyag (protamin nélkül): protamin elhagyásával készül. ND: nem észlelhető. (H) TNF-a vad típusú és Mavs knockout egerekből származó BMDC-kben. A BMDC-ket 1 mg/ml mRNS-ekvivalens maggal, hordozóanyaggal vagy MVP-vel kezeltük 24 órán keresztül. Jármű (DOTAP): az EDOPC DOTAP-ra cserélésével készült; hordozó (DOPC): az EDOPC DOPC-vel való helyettesítésével készült. Az adatokat átlagos SEM-ként adjuk meg (n Z 3). ***P < 0.005; ****P < 0,001; ns, nem jelentős.
5. ábra Daganatellenes immunválaszok Sting és Mavs knockout egerekben. (AeD) Csökkent DC és T sejt aktiváció Sting knockout egerekben. Mind a vad típusú, mind a Sting knockout egereket OVA mRNS-be zárt MVP-vel kezeltük, és a nyirokcsomókat 48 órával később összegyűjtöttük a DC és T sejt méréshez. (EeH) Csökkentett IFN-g-t expresszáló T-sejtek a lépben és a nyirokcsomókban Sting knockout egerekből. Mind a foltok képei, mind a kvantitatív elemzések láthatók. (IeL) Nincs hatással a T-sejt aktivitásra Mavs knockout egerekben. Mind a vad típusú, mind a Mavs knockout egereket PBS kontrollal vagy OVA mRNS-be zárt MVP-vel kezeltük, és 48 órával később nyirokcsomókat gyűjtöttünk a CD44þCD8þ memória T-sejtek (I), OVA257e264-MHCI dextramer-pozitív CD8þ mérése céljából. T-sejtek (J) és az IFN-g-t termelő sejtek száma (K és L). Az adatokat átlagos SEM-ként adjuk meg (n Z 3 vagy 5). *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0,005; ****P < 0,001; ns, nem jelentős.
6. ábra Sting-függő daganatellenes immunitás. (A és B) IFN-g-t expresszáló T-sejtek elemzése nyirokcsomókban és tumorszövetekben, miután B16-OVA tumorokat hordozó vad típusú és Sting-knockout egereket OVA mRNS-be zárt MVP-vel kezeltünk. Az egereket a 3. és az 1. napon kezeltük 0, a nyirokcsomókat és a daganatokat a 15. napon gyűjtöttük össze. Az egyes sejteket áramlási citometriával elemeztük. (C) A tumor növekedésének gátlása vad típusú és Sting knockout egerekben. Az egereket PBS-kontrollal vagy MVP-vel kezeltük a 3. és az 1. napon0. Az adatokat átlagos SEM-ként adjuk meg (n Z 5). *P < 0,05; ****P < 0,001; ns, nem jelentős. (D) Sematikus nézet a jelátviteli utak MVP-stimulációjáról, amely citokintermeléshez vezet DC-kben. Míg az IFN-b expressziójának stimulálását kizárólag az STING közvetíti, számos tényező, köztük a MAVS közvetíti a TNF-a és IL{19}}b expresszióját.
Hivatkozások
1. El Sahly HM, Baden LR, Essink B, Doblecki-Lewis S, Martin JM, Anderson EJ és társai. Az mRNS-1273 SARS-CoV-2 vakcina hatékonysága a vak fázis befejezésekor. N Engl J Med 2021;385:1774e85.
2. Moreira Jr ED, Kitchin N, Xu X, Dychter SS, Lockhart S, Gurtman A, et al. A BNT162b2 Covid-19 vakcina harmadik adagjának biztonságossága és hatékonysága. N Engl J Med 2022;386:1910e21.
. Dowdy SF. A sejtes akadályok leküzdése az RNS-terápiákban. Nat Biotechnol 2017;35:222e9.
4. Cullis PR, Hope MJ. Lipid nanorészecske rendszerek génterápiák lehetővé tételéhez. Mol Ther 2017;25:1467e75.
5. Persano S, Guevara ML, Li Z, Mai J, Ferrari M, Pompa PP stb. A Lipopolyplex fokozza az mRNS-alapú vakcinázás tumorellenes immunitását. Bioanyagok 2017;125:81e9.
6. Wang Y, Su HH, Yang Y, Hu Y, Zhang L, Blancafort P és mások. A herpes simplex vírus 1 timidin-kinázt kódoló módosított mRNS szisztémás bejuttatása célzott rákgénterápiához. Mol Ther 2013;21:358e67.
7. Kranz LM, Diken M, Haas H, Kreiter S, Loquai C, Reuter KC és mások. A dendritikus sejtek szisztémás RNS-bejuttatása kihasználja a vírusellenes védekezést a rák immunterápiájában. Természet 2016;534:396e401.
8. Meng C, Chen Z, Mai J, Shi Q, Tian S, Hinkle L és munkatársai. Vírusutánzó mRNS vakcina rák kezelésére. Adv Ther 2021;4:2100144.
9. Pardi N, Hogan MJ, Porter FW, Weissman D. mRNS vakcinák új korszaka a vakcinológiában. Nat Rev Drug Discov 2018;17:261e79.
10. Rurik JG, Tombacz I, Yadegari A, Mendez Fernandez PO, Shewale SV, Li L és mások. A CAR T-sejteket in vivo termelik szívsérülések kezelésére. Science 2022;375:91e6.
11. Esteban I, Pastor-Quinones C, Usero L, Plana M, Garcia F, Leal L. Az mRNS vakcinák korszakában van remény a HIV funkcionális gyógyítására? Vírusok 2021;13:501.
12. Krienke C, Kolb L, Diken E, Streuber M, Kirchhoff S, Bukur T és társai. Nem gyulladásos mRNS vakcina kísérleti autoimmun encephalomyelitis kezelésére. Science 2021;371:145e53.
13. Miao L, Zhang Y, Huang L. mRNS vakcina rák immunterápiájához. Mol Rák 2021;20:41.
14. Van Hoecke L, Verbeke R, Dewitte H, Lentacker I, Vermaelen K, Breckpot K és társai. mRNS a rák immunterápiájában: túl az antigénforráson. Mol Rák 2021;20:48.
15. Sahin U, Derhovanessian E, Miller M, Kloke BP, Simon P, Lower M stb. A személyre szabott RNS-mutánom vakcinák polispecifikus terápiás immunitást mozgósítanak a rák ellen. Természet 2017;547:222e6.
16. Sahin U, Oehm P, Derhovanessian E, Jabulowsky RA, Vormehr M, Gold M stb. Az RNS vakcina immunitást biztosít az ellenőrzőpont-gátlóval kezelt melanomában. Nature 2020;585:107e12.
17. Hilf N, Kuttruff-Coqui S, Frenzel K, Bukur V, Stevanovic S, Gouttefangeas C, et al. Aktívan személyre szabott oltási kísérlet újonnan diagnosztizált glioblasztóma ellen. Természet 2019;565:240e5.
18. Carreno BM, Magrini V, Becker-Hapak M, Kaabinejadian S, Hundal J, Petti AA és társai. Rák immunterápia. A dendritesejtes vakcina növeli a melanoma neoantigén-specifikus T-sejtek szélességét és sokféleségét. Tudomány 2015;348:803e8.
19. Keskin DB, Anandappa AJ, Sun J, Tirosh I, Mathewson ND, Li S és mások. A neoantigén vakcina intratumorális T-sejt-válaszokat generál az Ib fázisú glioblasztóma vizsgálatban. Természet 2019;565:234e9.
20. Mai J, Li Z, Xia X, Zhang J, Li J, Liu H és munkatársai. A daganatellenes immunitás szinergikus aktiválása szemcsés terápiás vakcinával. Adv Sci 2021;8:2100166.
21. Kobiyama K, Ishii KJ. Az mRNS vakcina adjuvantitásának veleszületett megértése. Nat Immunol 2022;23:474e6.
22. Fotin-Mleczek M, Duchardt KM, Lorenz C, Pfeiffer R, Ojkic-Zrna S, Probst J et al. A kettős aktivitású hírvivő RNS-alapú vakcinák kiegyensúlyozott TLR{4}}függő adaptív immunválaszokat indukálnak, és daganatellenes aktivitást biztosítanak. J Immunother 2011;34:1e15.
23. Kariko K, Buckstein M, Ni H, Weissman D. Az RNS felismerésének elnyomása Toll-like receptorok által: a nukleozid módosítás hatása és az RNS evolúciós eredete. Immunity 2005;23:165e75.
24. Tahtinen S, Tong AJ, Himmels P, Oh J, Paler-Martinez A, Kim L és társai. Az IL-1 és az IL-1ra az RNS-vakcinákra adott gyulladásos válasz kulcsfontosságú szabályozói. Nat Immunol 2022;23:532e42.
25. Li C, Lee A, Grigoryan L, Arunachalam PS, Scott MKD, Trisal M és mások. A PfizerBioNTech BNT162b2 vakcinával szembeni veleszületett és adaptív immunitás mechanizmusai. Nat Immunol 2022;23:543e55.
26. LoPresti ST, Arral ML, Chaudhary N, Whitehead KA. A segítő lipidek töltött alternatívákkal való helyettesítése a lipid nanorészecskékben megkönnyíti a célzott mRNS szállítást a lépbe és a tüdőbe. J Control Release 2022;345:819e31.
27. Charbe NB, Amnerkar ND, Ramesh B, Tambuwala MM, Bakshi HA, Aljabali AAA és társai. Kis interferáló RNS a rák kezelésére: a szállítási akadályok leküzdése. Acta Pharm Sin B 2020;10:2075e109.
28. Fuertes MB, Woo SR, Burnett B, Fu YX, Gajewski TF. Az I-es típusú interferonválasz és a rák veleszületett immunrendszere. Trends Immunol 2013;34:67e73.
29. Harding SM, Benci JL, Irianto J, Discher DE, Minn AJ, Greenberg RA. A DNS-károsodást követő mitotikus progresszió lehetővé teszi a mintázat felismerését a mikronukleuszokban. Természet 2017;548:466e70.
30. Hartlova A, Erttmann SF, Raffi FA, Schmalz AM, Resch U, Anugula S et al. A DNS-károsodás az I. típusú interferonrendszert a citoszolikus DNS-érzékelővel, a STING-en keresztül aktiválja, hogy elősegítse az antimikrobiális veleszületett immunitást. Immunity 2015;42:332e43.
31. Zhang Z, Yuan B, Bao M, Lu N, Kim T, Liu YJ. A helikáz DDX41 érzékeli az intracelluláris DNS-t, amelyet az STING adapter közvetít dendritikus sejtekben. Nat Immunol 2011;12:959e65.
32. Sivick KE, Desbien AL, Glickman LH, Reiner GL, Corrales L, Surh NH és társai. A terápiás STING aktiváció nagysága meghatározza a CD8þ T-sejt által közvetített tumorellenes immunitást. Cell Rep 2018;25: 3074e3085 e5.
33. Reikine S, Nguyen JB, Modis Y. A RIG-I és az MDA5 mintafelismerési és jelzési mechanizmusai. Front Immunol 2014;5:342.
34. Fu J, Kanne DB, Leong M, Glickman LH, McWhirter SM, Lemmens E és társai. A STING agonista formájú rákvakcinák meggyógyíthatják a PD-1 blokáddal szemben ellenálló, kialakult daganatokat. Sci Transl Med 2015;7: 283ra52.
35. Corrales L, Glickman LH, McWhirter SM, Kanne DB, Sivick KE, Katibah GE és társai. Az STING közvetlen aktiválása a tumor mikrokörnyezetében erős és szisztémás tumorregresszióhoz és immunitáshoz vezet. Cell Rep 2015;11:1018e30.
36. Miao L, Li L, Huang Y, Delcassian D, Chahal J, Han J és társai. Az mRNS vakcinák heterociklusos lipidekkel történő bejuttatása növeli a daganatellenes hatékonyságot az STING által közvetített immunsejtaktiváció révén. Nat Biotechnol 2019;37:1174e85.
37. Luo M, Wang H, Wang Z, Cai H, Lu Z, Li Y és mások. STING aktiváló nanovakcina a rák immunterápiájához. Nat Nanotechnol 2017;12:648e54.
38. Wang L, Koynova R, Parikh H, MacDonald RC. Kationos o-szubsztituált foszfatidil-kolin származékok bináris keverékeinek transzfekciós aktivitása: a hidrofób mag erősen módosítja a fizikai tulajdonságokat és a DNS szállítási hatékonyságát. Biophys J 2006;91:3692e706.
