CAR-neutrofil közvetített tumor mikrokörnyezetre reagáló nanogyógyszerek beadása glioblasztóma kemoimmunoterápiához

A glioblasztóma (GBM) az egyik legagresszívebb és leghalálosabb emberi daganat. Míg a hatékony terápiás szereket, például a kiméra antigénreceptor (CAR)-T-sejteket és a kemoterápiás szereket különféle rákos megbetegedések kezelésére fejlesztették ki, hatékonyságukat a GBM kezelésében nagymértékben hátráltatja a vér-agy gát és a vér-agy-tumor gát. A humán neutrofilek hatékonyan átlépik a fiziológiai korlátokat, és effektor immunitást mutatnak a kórokozókkal szemben, de az elsődleges neutrofilek rövid élettartama és genomszerkesztéssel szembeni rezisztenciája korlátozza széles körű alkalmazásukat az immunterápiában. Itt humán pluripotens őssejteket génmanipuláltunk CRISPR/Cas9- közvetített gén knock-in segítségével, hogy különböző anti-GBM CAR konstrukciókat expresszáljanak T-specifikus CD3ζ-vel vagy neutrofil-specifikus jelátviteli doménekkel. A legjobb daganatellenes aktivitással rendelkező CAR-neutrofileket állítják elő, hogy specifikusan és nem invazív módon a tumor mikrokörnyezetére reagáló nano-gyógyszereket szállítsák be és engedjék fel a GBM megcélzására anélkül, hogy további gyulladást kellene kiváltani a tumor helyén. Ez a kombinált kemo-immunterápia kiváló és specifikus anti-GBM aktivitást mutat, csökkenti a nem célzott gyógyszerleadást, és meghosszabbítja az élettartamot a nőstény daganatos egerekben. Ez a biomimetikus CAR-neutrofil gyógyszeradagoló rendszer együtt biztonságos, hatékony és sokoldalú platform a GBM és esetleg más pusztító betegségek kezelésére.

A cistanche tubulosa-Antitumor előnyei

A glioblasztómát (GBM) magas halálozási arány, rövid élettartam és rossz prognózis jellemzi, valamint nagy a kiújulási hajlam1,2. Mind a műtét, mind a kemogyógyszerek terápiás hatékonyságát elsősorban a finom agyszerkezet és a fiziológiás vér-agy gát (BBB) ​​vagy vér-agy-tumor gát (BBTB) akadályozza3–5. Különösen nagy kihívást jelent az agydaganatok kezelésére szolgáló gyógyszerek központi idegrendszerbe (CNS) történő eljuttatása:<1% of administered nanoparticle dose is found to be delivered to a solid tumor based on 376 published datasets6, and 0.8% delivered to brain cancer7. Due to their native capacity to migrate towards inflamed sites, traverse BBB/BBTB, and infiltrate solid tumors, mouse neutrophil-mediated delivery of nanoparticulated chemo drugs has been investigated to enhance targeted drug delivery to the brain tumors for improved therapeutic efficacy8–10. However, an invasive surgical resection of the tumor or tumor microenvironment priming is needed to induce additional inflammation for neutrophil recruitment before neutrophil/chemotherapeutic administration, leading to limited neutrophil recruitment in tumor sites beyond the inflamed surgical margin11. Furthermore, neutrophil-delivered chemotherapeutics were primarily enriched in the spleen, but not in the targeted brain of tumor-bearing mice. While necrosis was not observed in the major organs of experimental mice, there are still concerns regarding off-target tissue toxicity or even systemic toxicity in patients12. Previous studies also focused on mouse neutrophils. The feasibility and safety of using human neutrophils in drug delivery remain elusive since neutrophils have a short lifespan and are prone to apoptosis ex vivo. In addition, massive neutrophil extraction from pre-surgical patients for drug loading may lead to neutropenia or other risks. Thus, a safe and effective human neutrophil-mediated biomimetic drug delivery system that utilizes the natural chemo-attractive GBM microenvironment is urgently needed.

A neutrofilek veleszületett immunitása és plaszticitása a különféle rákos megbetegedésekkel szemben12–16, beleértve a GBM-et is, kevésbé vizsgálták, mint sejthordozóként való alkalmazásukat a gyógyszerszállításban8–10. A vérben keringő neutrofilek a hipoxiás tumor mikrokörnyezetének (TME) otthont adnak, ahol heterogén tumor-asszociált neutrofilekké (TAN) válnak, amelyek az immunszuppresszív TME lényeges összetevője, amely hozzájárul a rák progressziójához és a terápiás rezisztenciához12,17. A makrofágokhoz hasonlóan a TAN-ok tumorellenes N1 és pro-tumor N2 fenotípusait találták a hipoxiás TME18–21-ben. Különféle terápiás stratégiákat dolgoztak ki a neutrofilek közvetlen megcélzására, a neutrofilek kimerülésére vagy gátlására összpontosítva12,22, ami számos klinikai vizsgálathoz vezetett (pl. CCR5 inhibitor Maraviroc az NCT03274804-ben). Így a kezeletlen neutrofilek nanohordozóként való közvetlen alkalmazása további kockázatot jelenthet a rákos betegek számára, amelyekben a kábítószer-kereskedő neutrofilek átprogramozhatók az immunszuppresszív pro-tumor N2 fenotípusra a TME-n belül, miután a tumor helyére kerültek13, 23. Ezen túlmenően fel kell tárni a naiv neutrofilek belső daganatellenes hatását, és fokozni kell az optimalizált terápiás hatékonyság elérése érdekében, ha gyógyszerhordozóként alkalmazzák kemoterápiás szerekkel kombinálva.

A cistanche tubulosa előnyei- erősíti az immunrendszert

A kiméra antigénreceptor (CAR) módosítása jelentősen megnövelte az immun T vagy a természetes gyilkos (NK) sejtek daganatellenes aktivitását24–27. Hatékonyságuk szolid tumorokban azonban még mindig korlátozott, részben viszonylag alacsony forgalom és tumorpenetrációs képességük miatt. A fiziológiás BBB és BBTB jelenléte tovább gátolja ezeknek a feltörekvő terápiáknak a GBM elleni hatását az agyban. Feltételeztük, hogy a CAR-technológia és az erősen mozgékony neutrofilek kombinációja fenntarthatja a tumorellenes N1 fenotípust, és kiváló terápiás hatékonyságot eredményezhet a GBM kezelésében. Az elsődleges neutrofilek rövid életűek és rezisztensek a genomszerkesztéssel szemben28, ami korlátozza alkalmazásukat a CAR-irányított immunterápiában. A humán pluripotens őssejtek (hPSC-k), amelyek könnyebben hozzáférhetők a génszerkesztés számára, és képesek nagymértékben neutrofilekké differenciálódni, korlátlan forrást jelenthetnek a kiváló minőségű CAR-neutrofilek számára a célzott immunterápiához kémiailag meghatározott, xenomentes körülmények között29. A neutrofilek előszeretettel fagocitizálják a durva vagy hosszú felületű mikrobiális kórokozókat is, mint például a S. aureus és az E. coli30, amelyeket figyelembe kell venni a nanorészecskék tervezésénél a neutrofilek által közvetített gyógyszerbejuttatás során. Valóban, Safari et al. nemrégiben beszámolt az intravénásan beadott megnyúlt részecskék előnyös fagocitózisáról, bonyolult felületmódosítás nélkül, keringő neutrofilek által30. A gyógyszerrel töltött nanorészecskék ilyen egyszerű és biológiailag inspirált kialakítása maximalizálhatja a neutrofilek gyógyszerterhelését, és lehetővé teszi a gyógyszer terápiás szintjét a célzott helyeken.

In this work, we design and screen four anti-GBM chlorotoxin (CLTX)-CAR constructs with T or neutrophil-specific signaling domains by knocking them into the AAVS1 safe harbor locus of hPSCs via CRISPR/Cas9-mediated homologous recombination and identified an optimized CAR, composed of a 36-amino acid GBM-targeting CLTX peptide27, a CD4 transmembrane domain and a CD3ζ intracellular domain, for neutrophil-mediated tumor-killing. The resulting stable CAR-expressing hPSCs are then differentiated into CAR-neutrophils, which sustain an anti-tumor N1 phenotype and exhibit enhanced anti GBM activities under the hypoxic tumor microenvironment. A biode gradable mesoporous organic silica nanoparticle with a rough surface (R-SiO2) is synthesized and employed to load hypoxia-activated prodrug tirapazamine (TPZ) or clinical chemo-drug temozolomide (TMZ) and JNJ-64619187 (a potent PRMT5 inhibitor under clinical trial NCT03573310) into hPSC-derived CAR-neutrophils, which are unharmed by the nanoparticulated cargo and retain the inherent physiological properties of naïve neutrophils. CAR-neutrophils loaded with drug-containing SiO2 nanoparticles display superior anti-tumor activities against GBM, possibly due to a combination of CAR-enhanced direct cytolysis and chemotherapeutic-mediated tumor killing via cellular uptake and glutathione (GSH)-induced degradation of nanoparticles within the targeted tumor cells. In an in situ GBM xenograft model, hPSC-derived CAR-neutrophils precisely and effectively deliver TPZ-loaded SiO2 nanoparticles to the brain tumors without invasive surgical resection for amplified inflammation, significantly inhibiting tumor growth, and prolonging animal survival, representing a targeted and efficacious combinatory chemoimmunotherapy. Notably, Si content measurement suggests that>A beadott nanodrugok 20%-át CAR-neutrofilek juttatják az agydaganatba, szemben a szabad nanodrugok 1%-ával. Összefoglalva, biomimetikus CAR-neutrofil gyógyszeradagoló rendszerünk biztonságos, hatékony és sokoldalú platform a GBM és más pusztító betegségek kezelésére.

A cistanche tubulosa-Antitumor előnyei

Eredmények

A neutrofil-specifikus CAR-struktúrák szűrése a fokozott tumorellenes aktivitás érdekében

To engineer CAR-neutrophils for targeted drug delivery to brain tumors (Fig. 1a–b), we first designed and tested 4 different CAR structures optimized for anti-tumor activities of hPSC-neutrophils. All CAR structures shared the same extracellular granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor (GM-CSFR) signal peptide (SP), glioblastoma-targeting domain CLTX27, and IgG4 hinge29 (Fig. 2a). CAR #1 is a first-generation T cell-specific CAR that uses the CD4 transmembrane (TM) domain and CD3ζ intracellular signaling domain. CAR #2, CAR #3, and CAR #4 differ from CAR #1 in using a transmembrane domain from neutrophil-specific CD32a (or FcγRIIA), a single-chain transmembrane receptor that is highly expressed in neutrophils (30,000 to 60,000 molecules/cell31) and critical for neutrophil activation31–34. CAR #3 and CAR #4 also include an Fc domain γ-chain of CD32a, which relies on a highly conserved immunoreceptor tyrosine based activation motif (ITAM) to express and signal in neutrophils. Notably, CAR #3 contains a combo signaling domain by fusing CD32aITAM to the CD3ζ intracellular domain. Since primary neutrophils are short-lived and resistant to genome editing, we engineered human pluripotent stem cells (hPSCs) with these different CARs to achieve stable and universal immune receptor expression on differentiated neutrophils by knocking CAR constructs into the AAVS1 safe harbor locus via CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair (Fig. 2b). After nucleofection, single cell-derived hPSC clones were isolated and screened with puromycin for about two weeks. Genotyping identified successfully targeted hPSCs with an average CAR knock-in efficiency of >90%-a, és a megcélzott klónok többsége heterozigóta (kiegészítő 1a–d ábra). A módosított hPSC-ken a CAR-expressziót tovább erősítették a CLTX-IgG4 RT-PCR-rel és áramlási citometriás elemzésével (kiegészítő 1e–g ábra). Ahogy az várható volt, a CAR-t expresszáló hPSC-k megtartották a pluripotens markerek, köztük az OCT4, SSEA4 és SOX2 magas expressziós szintjét (1f. kiegészítő ábra).

A de novo CAR-neutrofilek előállításához a CAR-t expresszáló hPSC-ket először multipotens hematopoietikus, majd mieloid progenitorokká differenciálták stádium-specifikus citokinkezeléssel35 (2c. ábra). A G-CSF és az AM580 retinsav agonista ezt követő alkalmazása elősegítette az erőteljes neutrofil termelést36. A perifériás vérben (PB) származó társaikhoz hasonlóan a hPSC-eredetű CLTX-CAR neutrofilek tipikus neutrofil morfológiát és CD16, CD11b, MPO, CD15, CD66b és CD18 felszíni markereket mutattak (2. kiegészítő ábra). Ezt követően meghatároztuk a CAR expressziójának a hPSC-eredetű neutrofilek tumorellenes citotoxicitására gyakorolt ​​hatását glioblasztóma (GBM) U87MG sejtekkel való együttes tenyésztéssel in vitro. Ahogy az várható volt, a hPSC-eredetű CLTX-CAR neutrofilek jobb tumorölő képességet mutattak a PB neutrofilekhez képest (2d. ábra), összhangban a CLTX CAR-T sejtekben végzett korábbi megfigyelésekkel27. A különböző CAR-ok közül a CAR #1 közvetítette a hPSC-neutrofilek kiváló tumorölő aktivitását. Nevezetesen, a -lánc alapú CAR #4 a legkevésbé hatékony a neutrofilek által közvetített tumorölés kiváltásában, ami annak tudható be, hogy az ITAM kópiája alacsonyabb a ζ-alegységben, és a sejtfelszínen a CAR-ok alacsonyabb expressziója28. A neutrofilek citotoxikus reaktív oxigénfajtákat (ROS) és tumor nekrózis faktort (TNF-) szabadítanak fel, hogy elpusztítsák a célsejteket. A különböző neutrofilekből származó ROS és TNF- (2e, f ábra) termelődése jól egybeesett azok fokozott citolízisével. Ahogy az várható volt, a normál SVG p12 gliasejtekkel történő együtttenyésztést követően a ROS és a TNF-termelés különböző neutrofilekből ugyanolyan alacsony maradt, mint a negatív kontrollcsoportban (3a, b kiegészítő ábra). Ezenkívül a CAR-neutrofilek fokozott tumorellenes citotoxicitását csak GBM-sejtekkel, köztük az U87MG-vel, az elsődleges felnőtt GBM43-as és a gyermekkori SJ-GBM2-sejtekkel való együttes inkubáció során figyelték meg (3c. kiegészítő ábra), ami bizonyítja CLTX-ünk nagy specificitását. -AUTÓ. Nevezetesen, a CAR neutrofilek nagy biokompatibilitást mutattak a normál SVG p12 gliasejtekkel, hPSC-kkel és hPSC-eredetű sejtekkel (kiegészítő 3d. ábra), összhangban egy korábbi megfigyeléssel, miszerint az inaktivált primer neutrofilek nem pusztítják el az egészséges sejteket16. Összességében a hPSC-eredetű CAR-neutrofilek, különösen a CD3ζ-t hordozó CAR-neutrofilek fokozott tumorellenes citotoxicitást mutattak, és több ROS-t és TNF-et termeltek in vitro, kiemelve a célzott immunterápiában rejlő potenciáljukat.

1. ábra|A megnövelt anti-glioblasztóma hatékonyság vázlata a CAR-neutrofilek és a tumor mikrokörnyezetre reagáló nano-gyógyszerek kombinált immunterápiájával. A humán pluripotens őssejteket CAR-okkal módosították, és CAR-neutrofilekké differenciálták, amelyeket durva szilícium-dioxid nanorészecskékkel (SiO2 NP-k) töltöttek fel, amelyek hipoxia-célzó tirapazamint (TPZ) vagy más gyógyszereket tartalmaztak, kettős immunkemoterápiaként. b A szisztémásan beadott CAR-neutrofil@R-SiO2- TPZ NP-k először immunológiai szinapszisok kialakításával támadják meg a külső normoxikus tumorsejteket, és fagocitózison keresztül elpusztítják a tumorsejteket. Apoptózis után a CAR-neutrofilek R-SiO2-TPZ NP-ket szabadíthatnak fel, amelyeket a tumorsejtek utolérnek. Ezt követően a nano-prodrugok reagálnak a hipoxiás tumor mikrokörnyezetére, és hatékonyan elpusztítják a daganatsejteket. TEOS-tetraetil-ortoszilikát, BTES-bisz[3-(trietoxiszilil)propil]-tetraszulfid, TPZ tirapazamin, BTZ-benzotriazinil.

A CAR-neutrofilek kiváló daganatellenes aktivitást mutattak immunszuppresszív tumor mikrokörnyezetben

A makrofágokhoz hasonlóan a tumorhoz kapcsolódó neutrofilek tumorellenes N1 és pro-tumor N2 fenotípusait találták az immunszuppresszív tumor mikrokörnyezetében17. A pro-tumor N2 neutrofilek kritikus szerepet játszanak a tumor angiogenezisében, a metasztázisban és az immunszuppresszióban, de ennek a sejttípusnak a terápiás célzása kihívást jelent.

A szisztémás kimerülési stratégia helyett22 itt értékeltük a CAR-mérnöki lehetőségeket a neutrofilek daganatellenes fenotípusának fenntartásában. A CAR hPSC-eredetű és PB neutrofileket hipoxiával (3% O2) és TGF-fel kezelték, amelyek hozzájárulnak a tumor mikrokörnyezetének immunszuppressziójához37, 38, hogy értékeljék tartós tumorölő aktivitásukat. Míg a PB neutrofilek szignifikánsan csökkent citolízist mutattak a GBM sejtekkel szemben immunszuppresszív körülmények között, a CAR-neutrofilek magas tumorölő aktivitást mutattak (4a. kiegészítő ábra). Hasonló megfigyeléseket végeztünk a PB vagy CAR-neutrofilekből immunszuppresszív és normál körülmények között a TNF-felszabadulás és a ROS-generáció tekintetében is (4b, c kiegészítő ábra). A neutrofil fenotípus további igazolására hipoxiás és TGF körülmények között áramlási citometriával mértük az N1--specifikus iNOS és N2- N2--specifikus argináz expresszióját az izolált neutrofileken (kiegészítő ábra). 4d–f). A normoxiával összehasonlítva az immunszuppresszív hypoxia és a TGF szignifikánsan csökkentette az iNOS expressziós szintjét és növelte az argináz szintjét PB neutrofilekben, míg a CAR neutrofilek megtartották az iNOS magas expressziós szintjét. Korábbi tanulmányok azt mutatják, hogy a Syk-Erk jelátviteli útvonal aktiválása ROS-termeléshez vezet39–42. Ezért kimutattuk és összehasonlítottuk a Syk-Erk aktivációt módosítatlan neutrofilekben és CAR-neutrofilekben, és eredményeink a Syk-Erk útvonal szignifikánsan magasabb aktiválódására utaltak hipoxiás CAR-neutrofilekben (kiegészítő 5a–d ábra), amely fenntarthatja a CAR-neutrofilek változatlan ROS-termelése hipoxia alatt. Összességében a CAR-neutrofilek fenntartották a tumorellenes fenotípust, és magas tumorellenes aktivitást tartottak fenn tumor mikrokörnyezet utánzó körülmények között in vitro, kiemelve potenciáljukat a célzott immunterápiában.

2. ábra|A neutrofil-specifikus kiméra antigénreceptor (CAR) struktúrák szűrése fokozott neutrofil-mediált daganatellenes hatással. a különböző CAR struktúrák vázlata. b A CAR #1 konstrukció vázlata és a humán pluripotens őssejtek (hPSC) AAVS1 biztonságos kikötőhelyén a célzott knock-in stratégia vázlata. A függőleges nyíl az sgRNS-t célzó AAVS1-et jelzi. A piros és kék vízszintes nyilak a célzási hatékonyság és a homozigótaság vizsgálatához szükséges primereket jelzik. HDR: homológ rekombináció javítás. c A hPSC-ktől való optimalizált neutrofil differenciálódás vázlata kémiailag meghatározott körülmények között. d Az U87MG glioblasztóma sejtek elleni citotoxicitási vizsgálatokat a neutrofil-tumor célpont különböző arányaiban végeztük, a jelzett neutrofilek felhasználásával. Az adatokat öt független biológiai ismétlés átlag ± SD-jeként adjuk meg, kétirányú Student-féle t-teszttel. Meghatároztuk a reaktív oxigénfajták (ROS) képződését (e) és a TNF-felszabadulás ELISA-analízisét (f) különböző neutrofilekből U87MG sejtekkel történő együtttenyésztés után. n=5 biológiailag független minta. Az adatokat átlag ± SD, kétirányú Student-féle t-próba formájában adjuk meg. A forrásadatok forrásadatfájlként vannak megadva.

Tirapazamint (TPZ) tartalmú SiO2 nanorészecskékkel töltött hPSC CAR-neutrofilek előállítása és jellemzése

A PB neutrofileket sejthordozóként használták képalkotó és terápiás gyógyszerek agydaganatba juttatására8–10, bár a célzott neutrofil infiltráció műtéti vagy fényindukált gyulladást igényel, és a célon kívüli gyógyszerszállítás aggodalomra ad okot11. A CAR-neutrofilek daganatellenes aktivitásának továbbfejlesztése érdekében durva vagy sima felületű szilícium-dioxid nanorészecskéket (SiO2-NP) állítottunk elő, hogy kemoterápiás vagy sugárterápiás gyógyszereket töltsünk be a neutrofilekbe. A transzmissziós elektronmikroszkópos (TEM) felvételek azt mutatták, hogy mindkét SiO2 nanorészecske jól diszpergált, és gömb alakú morfológiát mutatott, egyenletes méretű (3a. ábra, 6a. kiegészítő ábra). Az energiadiszperz röntgenspektroszkópiával (EDS) végzett pásztázó TEM (STEM) összetétel-eloszlás elemzése azt mutatta, hogy a kén (S) elem egyenletesen oszlik el a teljes durva SiO2 nanorészecskékben (R-SiO2) (3b. ábra). Nitrogén (N2) adszorpciós-deszorpciós izotermák és a megfelelő pórusméret-eloszlás analízis segítségével az R- és SSiO2 NP-k pórusméretét 25 nm-ben, illetve 35 nm-ben mértük (3c. ábra, 6b. kiegészítő ábra). Tekintettel a nagy felületre és a nagy pórusméretre, a terápiás gyógyszerek hatékonyan betölthetők mind az R-, mind az S-SiO2 NP-kbe, erre példa a hipoxiára reagáló pro-drog tirapazamin (TPZ) (3d. ábra, 6c. kiegészítő ábra). . A TPZ betöltés után nem figyeltek meg jelentős változásokat az R-SiO2-TPZ diszperzitásában, morfológiájában és méretében TEM és dinamikus fényszórási analízis alkalmazásával (kiegészítő 6d, e ábra). Az R-SiO2 NP-kbe beépült tetra-szulfid kötések érzékenyek a reduktív környezetre, és a tumorsejtekben jelenlévő nagy mennyiségű glutation (GSH) miatt gyorsan lebonthatók43. Ezt követően meghatároztuk az R-SiO2–TPZ NP-k GSH-re reagáló lebonthatóságát 10 mM, 1 mM és 10 μM GSH jelenlétében, amelyek megegyeztek a rákos sejtek intracelluláris állapotával, a normál sejtek és az extracelluláris környezettel43. 10 mM GSH-kezelés hatására az R-SiO2-TPZ NP-k kezdeti gömbszerkezete 24 óra elteltével súlyosan tönkrement (kiegészítő 6f, g ábra). A nanorészecskék 48 óra elteltével teljesen szétestek apró törmelékké, aminek eredményeként a TPZ GSH-re reagáló módon szabadult fel (3e. ábra). Az R-SiO2 NP-k törmeléke nem okozott jelentős citotoxicitást a vizsgált sejtekben in vitro (kiegészítő 6h ábra), ami az R-SiO2 NP-k viszonylagos biztonságosságát jelzi.

cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert

Kattintson ide a Cistanche Enhance Immunity termékek megtekintéséhez

【Kérjen többet】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Ezt követően értékeltük a SiO2–TPZ NP-k alkalmazásának megvalósíthatóságát a terápiás gyógyszerek CAR-neutrofilekbe történő betöltésére, mint kombinált kemoimmunoterápia, a megnövelt terápiás hatékonyság elérése érdekében. Centrifugálás után fluoreszcens mikroszkóppal és áramlási citometriás analízissel mértük a neutrofilek SiO2–TPZ NP-k sejtfelvételét (3f. ábra, g), és az R-SiO2–TPZ NP-k jelentősebb sejtfelvételét mutattuk ki, mint az S-SiO2– TPZ NP-k neutrofilek által. Induktív csatolású plazma tömegspektrometriával (ICP-MS) a neutrofilek sejtes Si-tartalmát 11,3 és 19,1 ng SiO2 NPs@TPZ fehérjeként mértük (3h. ábra). Tekintettel a neutrofilek nagy terhelhetőségére, az R-SiO2–TPZ NP-ket alkalmaztuk a további kísérletekhez. Ezután az R-SiO2–TPZ NP-k betöltése után igyekeztünk tesztelni a CAR neutrofilek élettani funkcióit. A CAR-neutrofilek sejtéletképességében (3i. ábra, 6i. kiegészítő ábra), transzwell-migrációs képességében (3j. ábra), kemotaxisában és megfelelő sebességében (3k. ábra, l) nem figyeltek meg változást az R-SiO2 töltése előtt vagy után. – TPZ NP-k, bizonyítva magas biokompatibilitásukat. Időfüggő nano-drog terhelési analízist is végeztünk, és a maximális terhelési tartalmat a sejt-NP inkubáció után 1 órával érték el (kiegészítő 7a ábra). A CAR-neutrofilek több mint 95%-át sikeresen feltöltötték R-SiO2–TPZ NP-kkel (kiegészítő 7b. ábra). A CD11b, a gyulladásos molekula stimulációja során adhéziót és migrációs funkciót közvetítő neutrofil felszíni fehérje expressziós szintje nem változott az R-SiO2-TPZ terhelés nélküli vagy anélküli CAR-neutrofileken (kiegészítő 7c, d ábra). Az aktív neutrofilekből szuperoxid vagy reaktív oxigénfajok (ROS) szabadulnak fel, hogy elpusztítsák a mikrobákat és a tumorsejteket44. Ahogy az várható volt, a CAR-neutrofilek ROS-termelése szignifikánsan megnövekedett az N-Formilmetionin-leucil-fenilalanin (fMLP) kezelés után, és nem figyeltek meg szignifikáns különbségeket a CAR-neutrofilek ROS-termelésében az R-SiO betöltése előtt és után2- TPZ (3m. ábra). Összességében adataink azt mutatták, hogy az R-SiO2-TPZ-vel terhelt CAR-neutrofilek fenntartják a vad típusú neutrofilek fiziológiai aktivitását, és aktívan vándorolnak a gyulladásos ingerek felé, kiemelve potenciáljukat a rák célzott kemoimmunoterápiájában.

Az R-SiO2-TPZ nanorészecskékkel feltöltött CAR-neutrofilek hatékonyan elpusztítják a glioblasztóma sejteket

Ezt követően értékeltük az R-SiO2-TPZ hatását a CAR-neutrofilek tumorölő képességére. Az intim effektor-cél kölcsönhatás előfeltétele volt a neutrofilek által közvetített citolízisnek. Ahogy az várható volt, a CAR-neutrophils@R-SiO2-TPZ 2 órán belül immunszinapszisokat hozott létre a tumorsejtekkel, és hasonló effektor-cél interakciós számokat mutatott, mint a gyógyszermentes CAR-neutrofilek (4a. ábra, 8. kiegészítő ábra) . Nevezetesen, nem találtak megfigyelhető kölcsönhatásokat a CAR-neutrofilek@RSiO2-TPZ és a nem rákos szomatikus sejtek között (8. kiegészítő ábra), ami rávilágít a CLTX-CAR agydaganatokkal szembeni specifikusságára. Ezenkívül R-SiO2–TPZ NP-k szabadultak fel a neutrofilekből a táptalajba (kiegészítő 9a, b ábra) 12 órával az együtttenyésztés után, és bejutottak a fennmaradó tumorsejtekbe (4a. ábra). Huszonnégy órával a SiO2–TPZ NP-vel feltöltött CAR-neutrofilek tumorsejtekkel való együttes inkubációja után a tumorsejtek akár 95%-a tartalmazott R-SiO2–TPZ NP-ket (4a. ábra, 9c. kiegészítő ábra), ami sikeres volt. transzport kaszkád olyan hordozó neutrofilekkel, amelyek effektor sejt funkciójukat fejtik ki és apoptózison mennek keresztül, ezáltal passzívan szabadítják fel az R-SiO2–TPZ NP-ket a céltumorsejteknek45. A TPZ-ből származó gyökök elektronparamágneses rezonancia (EPR) spektroszkópiás analízisével (kiegészítő 9d. ábra) és a TOPRO-3 áramlási citometriás analízisével a tumorsejteken belül is validáltuk a pro-drog TPZ hipoxiás reagáló funkcióját és citotoxicitását a tumorsejteken belül. sejtek (kiegészítő 9e. ábra) hipoxia és normoxia alatt. Az R-SiO2-TPZ NP-vel töltött CAR neutrofilek citolízisének meghatározására in vitro normoxia-hypoxia tumor-újra kihívást jelentő modellt alkalmaztunk (4b. ábra). Huszonnégy órával a normoxikus együtttenyésztés után az R-SiO2-TPZ NP-kkel feltöltött vagy nem hasonló CAR-neutrofilek hasonló tumorellenes citotoxicitást mutattak (4c. ábra), és mindkettő magasabb volt, mint az R-vel feltöltött PB-neutrofileknél -SiO2-TPZ NP-k vagy nem, és R-SiO2- TPZ NP-k egyedül. A fokozott citotoxicitás főként a neutrofilek megnövekedett tumor-célzó képességének köszönhető a CAR-sebészet után. További 12 és 24-órás hipoxiás együtttenyésztést követően tumorsejtekkel az R-SiO2-TPZ NP-vel töltött CAR-neutrofilek jobb tumorellenes képességet mutattak a többi csoporthoz képest (4d. ábra, e). Ezenkívül az R-SiO2-TPZ NP-kkel feltöltött CAR-neutrofilek kiváló citolízist mutattak az újra beoltott friss tumorsejtekkel szemben (4f. ábra), ami jelzi a felszabaduló R-SiO2-TPZ daganatellenes képességét. nanorészecskék a neutrofil apoptózis után.

Ezt követően RNS-szekvenálás (RNS-seq) analízist végeztünk daganatsejteken, hogy megvilágítsuk a neutrofilek CAR expressziója és R-SiO2-TPZ NP-k által fokozott tumorellenes citolízisének hátterében álló potenciális molekuláris mechanizmust. A génexpressziós elemzés kimutatta, hogy a kontrollhoz és az R-SiO2-TPZ NP-ekhez képest az R-SiO2-TPZ NP-vel vagy anélkül töltött CAR-neutrofilek szignifikánsan csökkentették a citoplazma és a membrángének expresszióját a tumorsejtekben ( Kiegészítő 10a. ábra, 4g. ábra), amely tovább támogatja a tumorsejtek fagocitózisát együtt tenyésztéskor. Míg az összes kísérleti csoport növelte a celluláris oxidatív stresszt a tumorsejtekben, az R-SiO2-TPZ-vel terhelt CAR-neutrofilek felülmúlták a többi csoportot az oxidatív stressz jelátvitelében. Ezenkívül az R-SiO2-TPZ-vel töltött CAR-neutrofilek jelentősen elősegítették az apoptózist és csökkentették a tumorsejtek proliferációját. Az R-SiO2-TPZ-vel töltött CAR-neutrofilek fokozott daganatellenes aktivitásának további megértéséhez fagocitózisgátló citokalazin D-t és reaktív oxigénfajták (ROS) megkötő N-acetil-ciszteint (NAC) alkalmaztunk. egy ROS inhibitor GSK2795039 a tumor-neutrofil együtttenyészethez. A tumorsejtek CAR-neutrofilek általi citolízisét szignifikánsan csökkentette 5 μM citokalazin D, 5 mM NAC és 100 nM GSK2795039 (kiegészítő 10b, c ábra), jelezve a fagocitózis és a ROS kiemelkedő szerepét a CAR-közvetített tumorsejtekben. gyilkolás. A fennmaradó 40%-50%-os tumorsejtek lízise neutrofilek és NAC vagy GSK2795039 jelenlétében azt jelzi, hogy a ROS-független mechanizmus szerepet játszik a neutrofilek által közvetített tumorpusztulásban, ami további vizsgálatra érdemes.

3. ábra|Tirapazamint (TPZ) tartalmú SiO2 nanorészecskékkel töltött hPSC CAR-neutrofilek előállítása és jellemzése. a–e Transzmissziós elektronmikroszkóp (TEM) (a) és energiadiszperzív spektroszkópia (EDS) elemtérképezési képei (b) durva SiO2 nanorészecskékről láthatók. c A durva SiO2 nanorészecskék nitrogén adszorpciós-deszorpciós izotermáját a Barrett-JoynerHalenda (BJH) pórusméret eloszlási görbével együtt mutatjuk be. A biológiai három párhuzamos vizsgálatot egymástól függetlenül végeztük. A jelzett időpontban mértük a SiO2 nanorészecskék TPZ terhelési tartalmát (d) és a glutation (GSH)--reszponzív TPZ felszabadulást (e). n=3 biológiailag független minta. Egytényezős varianciaanalízis (ANOVA) az (e) pontra. Sima és durva SiO2-TPZ-vel töltött neutrofilek fluoreszcenciás képei (f) és áramlási citometriai elemzése (g). A biológiai három párhuzamos vizsgálatot egymástól függetlenül végeztük. h A hPSC-eredetű CAR-neutrofilek sejtes SiO2 tartalmát mértük. n=5 biológiailag független minták, kétirányú Student-féle t-próba. Sejtéletképesség (i), n=3 biológiailag független minta, transzmigráció (j), n=5 biológiailag független minta, kemoattrakciós képesség (k, l), n=20 biológiailag független minta, ill. Megmutatták a hPSC-eredetű CAR-neutrofilek ROS-generáló képességét (m), durva SiO2-TPZ-vel vagy anélkül, n=5 biológiailag független mintát, kétirányú Student-féle t-tesztet. PMA: forbol-mirisztát-acetát. Ezen az ábrán az összes adat átlag ± SD. A forrásadatok forrásadatfájlként vannak megadva.

Nano gyógyszerekkel töltött CAR-neutrofilek funkcionális értékelése biomimetikus glioblasztóma modellek segítségével in vitro

Az R-SiO2-TPZ NP-vel töltött CAR-neutrofilek aktivitásának további felmérésére egy transzwell-alapú vér-agy gát (BBB) ​​tumormodellt hajtottunk végre humán agyi mikrovaszkuláris endothelsejtek felhasználásával (5a. ábra, Kiegészítő ábra 11a). Ahogy az várható volt, az R-SiO2-TPZ NP-vel töltött CAR-neutrofilek kiváló transzmigrációs képességet mutattak az in vitro BBB-modellben (5b. ábra), hatékonyan elpusztítva a célzott tumorsejteket transzmigráció után mind normoxikus, mind hipoxiás körülmények között (5c. ábra). , d), és több gyulladásos citokin felszabadítása (5e. ábra), amelyek más effektor sejteket vonzanak a tumorsejtek elpusztítására. Ezenkívül a CAR neutrofilek nem befolyásolták szignifikánsan az endothel sejtek életképességét transzmigráció után (kiegészítő 11b ábra). Az R-SiO2-TPZ NP-vel feltöltött CAR-neutrofilek kiváló transzmigrációs képességgel rendelkeztek a második transzmigrációs kísérlet során (5f. ábra), és jobb tumorellenes képességet mutattak a többi csoporthoz képest (5g. ábra). Ezután háromdimenziós (3D) tumor szferoid modellt alkalmaztunk az R-SiO2-TPZ NP-vel töltött CAR-neutrofilek tumorpenetrációs képességének értékelésére (5.h ábra). A CAR-neutrofilek fokozatosan vándoroltak a tumor szferoid közepe felé, és egyenletesen oszlanak el a szferoidban 8 órás inkubáció után (5i. ábra). A CAR neutrofilek és az R-SiO2-TPZ NP-k nagyfokú kolokalizációját figyelték meg (12a–c kiegészítő ábra), ami azt mutatja, hogy az R-SiO2-TPZ NP-k stabilan kapszulázódtak a CAR-ban -neutrofilek a tumor infiltrációja során a citolízisük előtt. Neutrophil által közvetített bejuttatás nélkül az R-SiO2-TPZ NP-ket csak a tumorszferoidok külső rétegében találták meg. Az R-SiO2-TPZ NP-kkel és CAR-neutrofilekkel összehasonlítva az R-SiO2-TPZ NP-vel töltött CAR neutrofilek jobb tumorellenes citolízist mutattak a 3D tumormodellben (5j. ábra). A CAR-neutrofil@R-SiO2 NP-k más gyógyszerek, köztük a klinikai temozolomid (TMZ) és a JNJ{55}} bejuttatására is használhatók 3D-s tumormodellekbe, és hatékonyan elpusztítják a GBM sejteket (12d–f. kiegészítő ábra). Összességében a kombinált CAR neutrofilek és a nano gyógyszerek kiváló daganatellenes aktivitást mutattak biomimetikus tumor mikrokörnyezet utánzó körülmények között in vitro, kiemelve a kombinált neutrofil alapú kemoimmunoterápia terápiás potenciálját.

cistanche tubulosa – erősíti az immunrendszert

A CAR neutrofilek által szállított R-SiO2-TPZ nanorészecskék in vivo eloszlása

In addition to improving the direct tumor-killing ability, we hypothesize that CAR engineering of hPSC-neutrophils will significantly enhance their targeted delivery of therapeutic drugs without additional surgery- or light-induced inflammation11. To test this hypothesis, we employed a mouse xenograft model of glioblastoma and an in vivo imaging system to determine the trafficking and biodistribution of R-SiO2-TPZ NP-loaded CAR-neutrophils. We fluorescently labeled SiO2 NPs with a near-infrared dye Cyanine 5 (Cy5) and then performed fluorescence imaging 3 h and 24 h after systemic administration (Fig. 6a). Three hours after intravenous injection, R-SiO2-TPZ NPs traveled to the whole body of tumor-bearing mice and emitted strong fluorescence with or without neutrophil-mediated delivery (Fig. 6b). CAR-neutrophil-delivered R-SiO2-TPZ NPs accumulated in the brain tumor site within 24 h, whereas free R-SiO2-TPZ NPs were still evenly distributed across the whole body (Fig. 6b). To further quantify the biodistribution of R-SiO2-TPZ NPs in various organs, inductively coupled plasma-optical emission spectrometry (ICP-OES) analysis of Si content was performed on the harvested organs 24 h post-injection. CAR neutrophil-delivered R-SiO2-TPZ NPs were significantly enriched in the mouse brain (Fig. 6c), although a low-level delivery to the liver and spleen was observed. Si content measurement also demonstrated that >A beadott nanodrugok 20%-át CAR-neutrofilek juttatták agydaganatba, szemben a szabad nanodrogok 1%-ával, ami összhangban van a korábbi jelentésekkel6. Az R-SiO2-TPZ NP-k CAR-neutrofilek által a BBB-n keresztül a gazdaagyba történő célzott szállítását a szövettani elemzés is megerősítette (6d. ábra). Éppen ellenkezőleg, az R-SiO2-TPZ NP-k önmagukban főként a májban és a lépben halmozódtak fel. Adataink összességében azt mutatták, hogy a CAR-neutrofilek fokozott célzott bejuttatását mutatják be az R-SiO2-TPZ NP-ket anélkül, hogy további gyulladást kellett volna kiváltani a daganat helyén, kiemelve a neutrofil alapú kemoimmunoterápia megvalósíthatóságát és biztonságosságát a rákkezelésben.

A CAR-neutrofilek és az R-SiO2-TPZ nanorészecskék kombinált kemoimmunterápiája kiváló glioblasztóma-ellenes aktivitást mutatott in vivo

Az R-SiO2-TPZ NP-vel töltött CAR neutrofilek terápiás hatékonyságának meghatározására a glioblasztóma in situ xenograft modelljét állítottuk fel NOD.Cg-RAG1tm1MomIL2rgtm1Wjl/SzJ (NRG) egerekben luciferázt expresszáló U87MG sejtek felhasználásával. A daganatos egereknek intravénásan 5 × 106 neutrofilt adtunk be hetente (7a. ábra), és megmértük és számszerűsítettük a gazdaszervezetben a tumorterhelést (7b., c. ábra). A PBS-sel vagy PB-neutrofil-kezelt egerekkel összehasonlítva a CAR-neutrofilekkel és a CAR-neutrofil@R-SiO2-TPZ NP-kkel végzett kezelés hatékonyan lassította a daganat növekedését. A CAR neutrophils@R-SiO2 – TPZ NP-k sokkal nagyobb tumorellenes citotoxicitást mutattak, mint bármely más kísérleti csoport. Éppen ellenkezőleg, a PB-neutrofilek jelentősen elősegítették a tumor növekedését az agyban, ami a daganatos egerek elpusztulását eredményezte már a 23. napon (7d. ábra), ami arra utal, hogy a nem tervezett neutrofilek további kockázatokat jelenthetnek. Ezután különböző kísérleti egércsoportok plazmájában mértük a humán citokin felszabadulást (7e. ábra). Minden nem PBS kísérleti csoport kimutatható TNF-et és IL-t termelt a plazmában az 5. naptól a 26. napig, ami a humán neutrofilek aktiválódására utal a tumorstimuláció hatására. A megfigyelt magasabb tumornövekedési sebességgel összhangban a módosítatlan neutrofilek fokozatosan több IL-6-ot és TNF-et bocsátanak ki, ami citokinfelszabadulási szindrómához vezethet a betegekben, és alaposabb biztonsági vizsgálatokat igényel az IL-6-blokkolóknál46,47 . Nevezetesen, a CAR-neutrofil@RSiO2-TPZ NP-k csökkent citokintermelő képességet mutattak a későbbi időpontokban (a 19. és a 26. napon), ami arra utal, hogy a CAR-neutrofil alapú kemoimmunterápiával kezelt betegeknél potenciálisan alacsony a citokin felszabadulási szindróma kockázata. A kombinált CAR-neutrofilek és az R-SiO2-TPZ NP-k biokompatibilitását a testtömeg heti mérésével és az egerek főbb szerveinek patológiás elváltozásainak monitorozásával értékelték. Nem figyeltek meg különbséget a testtömegben a CAR-neutrofilek@R-SiO2–TPZ NP-vel kezelt egerek és más kísérleti csoportok között (7f. ábra), ami minimális szisztémás toxicitást és a CAR-neutrofil R-SiO2-TPZ NP-k kiváló biokompatibilitását jelzi a szervezeten belül. 28 napos kezelés. Az egerekből a 30. napon szeletelt főbb szervek szövettani elemzése azt mutatta, hogy a CAR-neutrofil@R-SiO2-TPZ NP-vel kezelt egerek nem okoztak észrevehető rendellenességet vagy szervkárosodást a szívben, a májban, a lépben, a tüdőben és a vesében (kiegészítő ábra). 13), tovább erősítve a kombinált CAR-neutrofilek és az R-SiO2-TPZ NP-k biztonságosságát.

4. ábra|Az R-SiO2-TPZ nanorészecskékkel feltöltött CAR-neutrofilek hatékonyan pusztítják el a glioblasztóma sejteket. Az immunológiai szinapszisok reprezentatív képeit mutatták be, amelyeket a CAR-neutrofilek és a tumorsejtek közötti határfelületen polarizált F-aktin felhalmozódás jelez 6, 12 és 24 óra elteltével. A CAR-neutrofilekből a tumorsejtek fagocitózisa során felszabaduló R-SiO2-TPZ nanorészecskéket a tumorsejtek felvették. Három párhuzamos vizsgálatot végeztünk egymástól függetlenül. b A neutrofilek által közvetített tumorellenes citotoxicitási vizsgálat vázlata. Az U87MG glioblasztóma sejtekkel szembeni citotoxicitást a neutrofil-tumor célpont különböző arányában végeztük, a jelzett neutrofilek felhasználásával 24 óra (c), 36 óra (d), 48 óra (e) és 72 óra (f). n=3 biológiailag független minta. Az adatokat átlag ± SD, egytényezős varianciaanalízis (ANOVA) formájában adjuk meg. g Tömeges RNS szekvenálási analízist végeztünk U87MG sejteken különböző körülmények között. A hőtérkép a kiválasztott citoplazma, membrán, oxidatív stressz, apoptózis és proliferációval kapcsolatos gének expressziós szintjét mutatja a jelzett glioblasztóma sejtekben. n=2 biológiailag független minta. A forrásadatok forrásadatfájlként vannak megadva.

5. ábra|R-SiO2-TPZ nanorészecskékkel feltöltött CAR-neutrofilek funkcionális értékelése biomimetikus glioblasztóma (GBM) modellekkel in vitro. a GBM in vitro tumormodelljének vázlata vér-agy-gáttal (BBB), amely endothel sejtekből áll a sejtinszert membránon és tumorsejtekből ugyanazon transzwell alján. b A neutrofilek transzwell-migrációs analízisét mutatjuk be 12 óra után. A jelzett neutrofilek anti-GBM citotoxicitását 24 óra (c) és 36 óra (d) után mértük és mennyiségileg meghatároztuk. Elvégezték a jelzett neutrofilekből 36 órán belül felszabaduló IL-6 és TNF ELISA elemzését. f Különböző neutrofilek második migrációja 48 óra elteltével látható. g A jelzett neutrofilek anti-GBM citotoxicitását 60 óra elteltével mértük és számszerűsítettük. h–j A neutrofil-infiltrált háromdimenziós (3D) tumormodell in vitro vázlatát a (h) pontban mutattuk be. Az infiltrált neutrofilek reprezentatív fluoreszcens képeit mutatták be a 3D tumormodellekben. A sejtmag festésére DAPI-t, a neutrofilek festésére CD45-öt használtunk. Skála rudak, 200 μm. A biológiai három párhuzamos vizsgálatot egymástól függetlenül végeztük. j A jelzett neutrofilek megfelelő tumorölő képességét citotoxicitási kit segítségével mérték és mennyiségileg meghatároztuk. Az adatokat öt független biológiai ismétlés átlag ± SD-jeként adjuk meg, egyirányú varianciaanalízis (ANOVA). A forrásadatok forrásadatfájlként vannak megadva.

Míg a CAR-neutrofil@R-SiO2-TPZ NP-k szignifikánsan lelassították a daganat növekedését xenograft egerekben, addig a CAR-neutrofilek, SiO2-TPZ NP-k és CAR-neutrofil@R-SiO2-TPZ NP-k kísérleti csoportjaiban az állatok túlélésében mutatkozó különbség jelentéktelen (p > 0,05), ami valószínűleg a rövid életű neutrofilek sejtpreparáció és injektálás során bekövetkezett pusztulásának tudható be. Ezt követően erre a három csoportra összpontosítottunk, és meghatároztuk, hogy a csökkent sejt-előkészítési idő, valamint a CAR-neutrofilek és a nano-gyógyszerek megnövelt dózisa befolyásol-e valamit az állatok túlélésében (7g. ábra). Hat alkalommal szisztémás beadás esetén a CAR-neutrofil@R-SiO2–TPZ NP-k jobb teljesítményt nyújtottak a másik két csoportnál a daganatos egerek élettartamának meghosszabbításában (7h. ábra), míg az állatok túlélésében mutatkozó különbség a CAR-neutrofilek és a SiO2– csoportokban A TPZ NP-k jelentéktelenek maradtak. Míg az R-SiO2- TPZ csoport hasonló túlélési görbéjét figyelték meg e két független állatkísérlet között, az első 4 neutrofil esetében a sejtizoláció és az injekcióra való előkészítés ideje körülbelül 4 óráról 1 órára csökkent. A dózisok a CAR-neutrofil csoportokban az állatok túlélési arányának javulását eredményezték a 32. nap előtt. Adataink együttesen igazolták a neutrofilek előkészítésének és az adagolás optimalizálásának fontosságát a neutrofil terápiák jövőbeni klinikai alkalmazásaiban.

Vita

Az egér neutrofilekről kimutatták, hogy hatékonyan szállítják a nanodrugokat a gyulladt posztoperatív agydaganatokba8,9. Ennek ellenére a humán neutrofilek gyógyszerbejuttatásban való felhasználásának megvalósíthatósága és biztonságossága továbbra is megfoghatatlan. Az ezekben a vizsgálatokban a terápiás hatás elérése érdekében felhasznált nagy mennyiségű egér neutrofil (tízszer nagyobb, mint az egerekben keringő neutrofilek teljes száma11) tovább hátráltathatja klinikai transzformációjukat, mivel nagyszámú neutrofil kinyerése rákos betegekből neutropeniához és pózhoz vezethet. egyéb kockázatok. E kihívások megoldása érdekében az önmegújuló hPSC-k erejét korlátlan számú de novo humán neutrofil előállításában használtuk ki29. Erőteljes, bioinspirált, neutrofilek által közvetített gyógyszeradagoló rendszert fejlesztettünk ki CAR-mérnökséggel29, és mesterségesen előállított humán CAR-neutrofileket használtunk nanohordozóként, feltűnő daganatellenes hatással. A durva SiO2 NP-k jobban működnek, mint a sima SiO2 NP-k CAR-neutrofil hordozókban, összhangban a korábbi megfigyelésekkel, miszerint a neutrofilek elsősorban a durva mikrobiális kórokozókat fagocitizálják30. A neutrofilekről beszámoltak arról, hogy elősegítik a gliómasejtek proliferációját és progresszióját48. Állatkísérleteink során a módosítatlan neutrofilek hasonló tumor-előző hatását figyeltük meg, ami rávilágított a CCAR-mérnöki vagy egyéb módosítások szükségességére a neutrofilekben, hogy biztosítsuk biztonságosságukat a gyógyszerbejuttatásban és más terápiás alkalmazásokban. Nevezetesen, a CAR-neutrofil által közvetített gyógyszerbejuttatásunk kizárólag a GBM natív kemo-attraktáns képességétől függ, de nem a műtét utáni felerősített gyulladásos jelektől, ami arra utal, hogy gyógyszer-bejuttató rendszerünk nagy specifitású és terápiás potenciállal rendelkezik a mélyen infiltrált gliómák felszámolásában. amelyeket műtéttel nem lehet eltávolítani. Mivel a sebészi reszekció és az adjuváns kemoterápia/sugárterápia a GBM12 elsődleges klinikai beavatkozása, a CAR neutrofil nanohordozókkal és a műtéttel/sugárterápiával végzett kombinált kezelés optimális terápiás hatékonyságot érhet el, és érdemes további vizsgálatokat végezni. A T- és NK-sejt-specifikus CAR-konstrukciókat széles körben alkalmazták a T- és NK-sejtek daganatellenes aktivitásának fokozására, de a neutrofilek daganatellenes funkcióit javító neutrofil-specifikus CAR-kat nem írtak le. A CD4ζ és CD4 kiméra immunreceptorokról korábban beszámoltak, hogy in vitro fokozzák a neutrofilek citolízisét a HIVenv-vel transzfektált sejtekkel szemben. Ennek ellenére a lízis hatékonysága csak ~10% volt 10:128 effektor-cél (E:T) arány mellett. Az Fc RIIA (CD32a) egy alacsony affinitású egyláncú transzmembrán receptor a monomer IgG-hez, amely nagymértékben expresszálódik a neutrofilekben (30,000-60,000 molekula/sejt31), és ligálása indukálja az Fc-t. függő funkciók a neutrofilekben, mint például a szemcsetartalom felszabadulása, a Ca2+ mobilizáció, a tumorellenes citotoxicitás és a fagocitózis49. Tekintettel a CD32a kiemelkedő szerepére a neutrofilek aktiválásában és működésében, CD32a-alapú CAR konstrukciókat terveztünk és teszteltünk. Eredményeink azonban azt mutatták, hogy a CD3ζ szignifikánsan jobb citolízist közvetít, mint a CD32a, ha hPSC-eredetű neutrofilekben expresszálódik, ami részben annak tudható be, hogy a CD3ζ-ben magasabb az ITAM-kópiák száma, mint a CD32a-ban: három, illetve egy kópia, valamint magasabb expressziós szint. ζ, mint a neutrofilek sejtfelszínén28. A CD32a-hoz hasonlóan az Fc RIII (CD16b) egy másik alacsony affinitású receptor a monomer IgG számára, és sokkal magasabb szinten expresszálódik, mint a CD32a a neutrofileken31. Míg a CD16b keresztkötése csak Ca2+ mobilizációt és degranulációt indukál, fagocitózist és citolízist nem indukál a neutrofilekben28,50, a jövőbeli vizsgálatokban továbbra is érdekes lesz a CD3ζ- és CD16b képességeinek szisztematikus összehasonlítása. - CAR-ok a neutrofilek daganatellenes funkcióinak kiváltásában és fokozásában.

6. ábra|A CAR neutrofilek által szállított R-SiO2-TPZ nanorészecskék (NP-k) in vivo eloszlása. intravénásan beadott Cy5-jelzett CAR neutrofil@R-SiO2 NP és R-SiO2 NP vázlata in vivo sejtkövetési vizsgálathoz. 5 × 105 luciferázt (Luci) expresszáló U87MG sejtet sztereotaktikusan implantáltunk NRG egerek jobb előagyába. 4 nap elteltével az egereket intravénásán PBS-sel, 5 × 106 Cy{16}} jelölt CAR neutrofil@R-SiO2 NP-vel és R-SiO2 NP-vel kezelték. b A Cy5+ neutrofilek időfüggő biológiai eloszlását az egész testben, az agyban és más szervekben fluoreszcens képalkotással határoztuk meg és mennyiségileg határoztuk meg a jelzett órákban. c A CAR neutrofil@R-SiO2 NP-k és R-SiO2 NP-k biológiai megoszlását egerekben 24 órával az injekció beadása után induktív csatolású plazma-optikai emissziós spektrometriával (ICP-OES) elemeztük Si elem alapján, és az adatokat százalékban fejeztük ki. az injektált dózis szövetgrammonként (%ID/g). n=5 biológiailag független minta. Az adatok átlag ± SD. A forrásadatok forrásadatfájlként vannak megadva. d A tumoros egerekből izolált jelzett glioblasztóma xenograftokban a CD45 és SiO2 reprezentatív fluoreszcens képeit mutattuk be. Skála rudak, 100 μm. A biológiai három párhuzamos vizsgálatot egymástól függetlenül végeztük.

7. ábra|A kombinált CAR-neutrofilek és az R-SiO2-TPZ nanorészecskék (NP-k) in vivo tumorellenes aktivitását intravénás injekcióval értékeltük. az intravénásan beadott PBS, PB-neutrofilek, CAR-neutrofilek és CAR-neutrofil@R-SiO2-TPZ NP-k vázlata in vivo tumorölő vizsgálathoz. 5 × 105 luciferázt (Luci) expresszáló U87MG sejtet sztereotaktikusan implantáltunk NRG egerek jobb előagyába. 4 nap elteltével az egereket intravénásan kezeltük a jelzett neutrofilekkel hetente egy hónapon keresztül. Az időfüggő tumorterhelést a jelzett napokon biolumineszcens képalkotással (BLI) határoztuk meg (b) és számszerűsítettük (c). Az adatok átlag ± SD egerek esetén (b) (n=5), egyirányú varianciaanalízis (ANOVA). d Megjelenítettük a jelzett kísérleti csoportok túlélését (n=5) bemutató Kaplan-Meier görbét. A különböző egércsoportok perifériás vérében (e) és testtömegében (f) mértük a felszabadult humán tumor nekrózis faktor- (TNF ) és IL{22}} mennyiségét a jelzett napokon. Az adatok átlag ± SD, n=5 biológiailag független minta. g, h A CAR-neutrofilek és az RSiO2-TPZ NP-k megnövekedett dózisfrekvenciájának daganatellenes aktivitását értékeltük. g Intravénásan beadott CAR-neutrofilek, R-SiO2-TPZ NP-k és CAR-neutrofil@ R-SiO2-TPZ NP-k vázlata in vivo tumorölő vizsgálathoz. h Megjelenítettük a jelzett kísérleti csoportok túlélését bemutató Kaplan-Meier görbét (n=5). A Kaplan–Meier görbéket log-rank teszttel elemeztük. A forrásadatok forrásadatfájlként vannak megadva.

Bemutattunk itt egy moduláris és sokoldalú hPSC neutrofil gyógyszerbejuttató platformot is, amelyet a jövőben újratervezhetnek és hangolhatnak, hogy támogassák más, más emberi betegségek kezelésére irányuló neutrofil alapú erőfeszítéseket. Először is, a CAR-sebészet jobban hozzáférhető a hPSC-kben, mint az elsődleges immun T-sejtekben és a neutrofilekben. Csak egyszeri genomszerkesztésre van szükség a különböző CAR-ok stabil és homogén expressziójának eléréséhez29. A CLTX CAR-ok mellett stabil hPSC-vonalakat is szerkesztettünk, amelyek univerzális anti-fluoreszceint (FITC)51 vagy anti-PD-L1 CAR52-t expresszálnak, és mindkettő felhasználható univerzális szolid tumort célzó nanohordozó CAR-neutrofilek előállítására. Más genetikai módosítások, mint például az anti-FAP CAR-okat megcélzó fibrózis53, szintén végrehajthatók a neutrofil nanohordozók irányítására a végzetes degeneratív betegségek, köztük az agyi trauma és a szívfibrózis kezelésére. Ezenkívül a CAR-t expresszáló hPSC-k könnyen adaptálhatók CAR-T vagy CAR-NK sejtek előállítására29, és ezeknek az immunterápiáknak a CAR-neutrofil nanohordozókkal való kombinációja optimális terápiás daganatellenes előnyöket érhet el. Végül a bioinspirált tumor-glutation (GSH)-érzékeny nanodrog rendszerünk egy moduláris és sokoldalú platform ígéretes kemoterápiás vagy radioaktív gyógyszerek CAR-neutrofilekbe való betöltésére a célzott gyógyszerbejuttatás érdekében, amint azt a klinikai TMZ, a JNJ64619187 és a pro-drug TPZ példázza. A további nanorészecskék tesztelésével kapcsolatos tanulmányok optimalizált gyógyszerterhelést eredményezhetnek a neutrofilekben, és maximális in vivo terápiás hatékonyságot érhetnek el.

Miközben bemutattuk a CAR-neutrofilek alkalmazásának terápiás koncepcióját a kemogyógyszerek specifikus és hatékony eljuttatására az agydaganatokban a BBB-n keresztül, ennek a tanulmánynak van néhány korlátozása. Először is, a 4-napos tumorsejt-oltás nem biztos, hogy elégséges a terápiás vizsgálatok klinikai forgatókönyvét utánzó daganatok létrehozásához, és a jövőben a különböző daganatos beoltási periódusokkal végzett munkára van szükség ahhoz, hogy összefoglaljuk a glioblasztóma fejlődésének különböző szakaszait és a terápiás választ különböző esetekben. betegek54,55. Másodszor, az általunk használt immunhiányos egereknek nincs adaptív immunitása, és más, ép immunrendszerű preklinikai modellekre van szükség, mint például a spontán gliomában szenvedő kedvtelésből tartott kutyák56, hogy jobban felmérjük az in vitro termelt CAR-neutrofilek biztonságosságát és hatékonyságát. A rövid élettartam ellenére különösen a CAR-neutrofilek célponttól eltérő toxicitási profiljára van szükség infundált állatokban nano-gyógyszerek hozzáadásával vagy anélkül, beleértve a citokin felszabadulási szindrómát, a neurotoxicitást és a CAR-T sejtekben megfigyelt célponton kívüli daganatos toxicitást57. a neutrofilek. Míg a megvalósítható megközelítések, mint például a hipoimmunogén univerzális donor hPSC-k58–61 tervezése és a humán leukocita antigén (HLA) homozigóta hPSC-könyvtárak62 bankolása, könnyen elérhetők a graft versus-host betegség (GvHD) potenciális kockázatának elkerülésére, a preklinikai állatmodellek ép immunrendszerre még mindig szükség van a neutrofil terápiás szereink transzlációs potenciáljának felméréséhez. Végül a CAR-neutrofil nanodrog terápiák korlátozott daganatellenes citotoxicitását és az állatok élettartamának meghosszabbítását figyelték meg. Ezért a hatékonyabb kemoterápiás gyógyszerek vagy sugárérzékenyítők, valamint a klasszikus CAR-T-vel és sebészi reszekcióval kombinált terápiák jövőbeli feltárása elengedhetetlen a CAR-neutrofil terápiák maximális daganatellenes hatékonyságának eléréséhez. Például egy, a mechanizmuson alapuló tervezésről szóló közelmúltbeli tanulmány egy hatékonyabb gyógyszerhez vezetett, a KL-50, amely legyőzi a szerzett rezisztenciát, amint azt a klinikai TMZ-gyógyszerben63 megfigyelték, és így beépíthető a moduláris CAR-neutrofil nanodrog platformunkba egy potenciálisan jobb terápiás hatékonyság. A neutrofilek eltarthatóságának 5 napra való meghosszabbítása CLON-G (kaszpázok-lizoszómális membránpermeabilizáció-oxidáns-nekroptózis gátlás plusz granulocita telep-stimuláló faktor64) kezelés és/vagy CAR-neutrofilek esetében egy hosszabb távú szabályozott gyógyszerfelszabadulási rendszer alkalmazása is lehetséges. a neutrofil apoptózis után tartós in vivo tumorellenes hatékonyság elérése. Eredményeink együttesen egyértelműen bizonyították, hogy az R-SiO2-TPZ-vel terhelt CAR-neutrofilek képesek fenntartani a tumorellenes N1 fenotípust, és hatékonyan elpusztítani a tumorsejteket különböző tumor-niche-szerű körülmények között in vitro. Funkcionális CAR-neutrofilek nagy mennyiségben előállíthatók mesterséges hPSC-kből is, hogy pontosan a tumor mikrokörnyezetére reagáló nano-gyógyszereket juttathassák el a GBM in vivo célba juttatásához, ami egy kombinált kemoimmunoterápiához vezet, robusztus és specifikus anti-GBM aktivitással és minimális, célon kívüli gyógyszerszállítással. meghosszabbodott élettartam daganatos egerekben.

Hivatkozások

1. Yang F. et al. A glioblasztóma szinergikus immunterápiája az IL-6 és a CD40 kettős célzásával. Nat. Commun. 12, 3424 https://doi.org/ 10.1038/s41467-021-23832-3 (2021).

2. Lim, M., Xia, Y., Bettegowda, C. & Weller, M. Current state of immunotherapy for glioblastoma. Nat. Rev. Clin. Oncol. 15, 422–442 (2018).

3. Agliardi, G. et al. Az intratumorális IL-12 bejuttatás lehetővé teszi a CAR-T sejt immunterápiát a glioblasztóma preklinikai modelljében. Nat. Commun. https://doi.org/10.1038/s41467-020-20599-x (2021).

4. Németh, T., Sperandio, M. & Mócsai, A. Neutrophils as emerging therapy targets. Nat. Rev. Drug Discov. https://doi.org/10.1038/ s41573-019-0054-z (2020).

5. Subhan, MA és Torchilin, VP A neutrofilek mint feltörekvő terápiás célpont és eszköz a rákterápiában. Life Sci. https://doi.org/ 10.1016/j.lfs.2021.119952 (2021).

6. Cheng, YH, He, C., Riviere, JE, Monteiro-Riviere, NA & Lin, Z. Nanorészecskék tumorokba juttatásának metaanalízise fiziológiai alapú farmakokinetikai modellezési és szimulációs megközelítéssel. ACS Nano 14, 3075–3095 (2020).

7. Wilhelm, S. et al. A nanorészecskék daganatokba való bejutásának elemzése. Nat. Rev. Mater. 1, 1–12 (2016).

8. Xue, J. et al. A neutrofilek által közvetített rákellenes gyógyszer beadása a posztoperatív malignus glioma kiújulásának elnyomására. Nat. Nanotechnol. 12, 692–700 (2017).

9. Wu, M. et al. Gyulladásra aktiválható mesterséges neutrofilek MR képalkotó nyomon követése a műtétileg kezelt glióma célzott kezeléséhez. Nat. Commun. 9, 1–13 (2018).

10. Chu, D., Dong, X., Zhao, Q., Gu, J. & Wang, Z. A tumor mikrokörnyezetének fotoszenzitizációs alapozása javítja a nanoterápiás szerek szállítását neutrofil infiltráción keresztül. Adv. Mater. 29, (2017).

11. Osuka, S. & Van Meir, EG Cancer therapy: Neutrophils traffic in cancer nanodrugs. Nat. Nanotechnol. 12, 616–618 (2017).

12. Lin, YJ, Wei, KC, Chen, PY, Lim, M. & Hwang, TL A neutrofilek szerepe gliomában és agyi metasztázisokban. Elülső. Immunol. https://doi.org/10.3389/fimmu.2021.701383 (2021).

13. Fridlender, Z. et al. A tumorhoz kapcsolódó neutrofil fenotípus polarizációja TGF-béta által: "N1" versus "N2" TAN. Ráksejt (2009).

14. Blaisdell, A. et al. A neutrofilek ellenzik a méh epiteliális karcinogenezisét a hipoxiás daganatsejtek eltávolítása révén. Cancer Cell 28, 785–799 (2015).

15. Mahiddine, K. et al. A tumor hypoxia enyhítése felszabadítja a neutrofilek daganatölő képességét. J. Clin. Invest 130, 389–403 (2020).

16. Yan, J. et al. A humán polimorfonukleáris neutrofilek specifikusan felismerik és elpusztítják a rákos sejteket. Oncoimmunology 3, e950163 (2014).

17. Jaillon, S. et al. A neutrofilek sokfélesége és plaszticitása a tumor progressziójában és terápiájában. Nat. Rev. Cancer 20, 485–503 (2020).

18. Li X. et al. Kutatási eredmények a glióma őssejtekkel kapcsolatban a glióma immun mikrokörnyezetében. Elülső. Pharmacol. https://doi.org/10. 3389/fphar.2021.750857 (2021).

19. Gieryng A., Pszczolkowska, D., Walentynowicz, KA, Rajan, WD & Kaminska, B. Immune microenvironment of gliomas. Labor. Investig. https://doi.org/10.1038/labinvest.2017.19 (2017).

20. Jung E. et al. A tumorsejtek plaszticitása, heterogenitása és rezisztenciája a glióma döntő mikrokörnyezeti réseiben. Nat. Commun. https://doi.org/10.1038/s41467-021-21117-3 (2021).

21. Dunn GP et al. Feltörekvő immunterápiák rosszindulatú gliómára: az immunogenomikától a sejtterápiáig. Neuro. Oncol. (2020). https://doi.org/10.1093/neuonc/noaa154

22. Yee PP et al. A neutrofilek által kiváltott ferroptosis elősegíti a tumor nekrózist a glioblasztóma progressziójában. Nat. Commun. 11, (2020).

23. Sagiv, JY et al. Fenotípusos sokféleség és plaszticitás a keringő neutrofil szubpopulációkban rák esetén. Cell Rep. 10, 562–573 (2015).

24. Li, Y., Hermanson, DL, Moriarity, BS & Kaufman, DS A kiméra antigénreceptorokkal módosított humán iPSC-eredetű természetes ölősejtek fokozzák a daganatellenes aktivitást. Cell Stem Cell 23, 181–192.e5 (2018).

25. Kim, GB et al. A nagy affinitású mutáns interleukin-13 célzott CAR T-sejtek fokozzák a kattintható, biológiailag lebontható fluoreszcens nanorészecskék glioblasztómába való eljutását. Bioact. Mater. 5, 624–635 (2020).

26. Nguyen, V. et al. Egy új ligandum-bejuttató rendszer az IL13R 2 tumor-korlátozott biomarker nem invazív megjelenítésére és terápiás kiaknázására. Neuro. Oncol. 14, 1239–1253 (2012).

27. Wang D. et al. Klorotoxin által irányított CAR T-sejtek a glioblasztóma specifikus és hatékony célzásáért. Sci. Ford. Med. 12, (2020).

28. Roberts, MR et al. Antigén-specifikus citolízis zéta- vagy gamma-jelátviteli domént hordozó kiméra immunreceptorokat expresszáló neutrofilek és NK-sejtek által. J. Immunol. 161, 375–384 (1998).

29. Chang, Y. et al. Kiméra antigén receptor neutrofilek tervezése humán pluripotens őssejtekből célzott rák immunterápiához. Cell Rep. 40, 111128 (2022).

30. Safari H. et al. A neutrofilek elsősorban a megnyúlt részecskéket fagocitizálják a szelektív célzás lehetőségét akut gyulladásos betegségekben. Sci. Adv. 6, (2020).

31. Wang, Y. & Jönsson, F. A neutrofil Fc receptorok expressziója, szerepe és szabályozása. Elülső. Immunol. https://doi.org/10.3389/fimmu. 2019.01958 (2019).

32. Németh T. et al. Az fc receptor-lánc ITAM tirozinok jelentősége a neutrofil aktivációban és in vivo autoimmun ízületi gyulladásban. Elülső. Immunol. https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.00252 (2019).

33. A neutrofil Fc RIIa (CD32) és Fc RIIIb (CD16) polimorf formáinak szerepe a humán IgG1- és IgG3- opszonizált baktériumok és eritrociták fagocitózisában. Transzfusz. Med. Rev. https://doi.org/10.1016/ s0887-7963(05)80094-x (1995).

34. Tsuboi, N., Asano, K., Lauterbach, M. & Mayadas, TN. A humán neutrofil Fc receptorok speciális, nem redundáns szerepeket indítanak el és játszanak az antitest által közvetített gyulladásos betegségekben. Immunitás. https://doi.org/10.1016/j.immuni.2008.04.013 (2008).

35. Chang, Y. et al. A humán hemogén endotélium és a definitív hematopoietikus progenitor sejtek kémiailag meghatározott generációja. Biomaterials 285, 121569 (2022).

36. Brok-Volchanskaya, VS et al. Funkcionális neutrofilek hatékony és gyors előállítása indukált pluripotens őssejtekből ETV2-módosított mRNS segítségével. Stem Cell Rep. 13, 1099–1110 (2019).

37. Emami Nejad A. et al. A hipoxia szerepe a tumor mikrokörnyezetében és a rákos őssejt fejlődésében: új megközelítés a kezelés fejlesztéséhez. Cancer Cell Int. https://doi.org/ 10.1186/s12935-020-01719-5 (2021).

38. Lequeux A. et al. A hipoxiás tumor mikrokörnyezetének és a tumorsejtek plaszticitásának hatása az immunellenőrző pontok expressziójára. Cancer Lett. (2019). https://doi.org/10.1016/j.canlet.2019.05.{6}}. Takano, T., Sada, K. & Yamamura, H. Role of protein-tyrozin kinase Syk in oxidative stress signaling in B cell. Antioxidánsok Redox jel. https://doi.org/10.1089/15230860260196335 (2002).

40. Zhang J. et al. ROS és ROS által közvetített celluláris jelátvitel. Oxidat. Med. Sejt. Hosszú élet. https://doi.org/10.1155/2016/4350965 (2016).

41. Kawakami Y. et al. A protein-kináz C Syk-foszforilációjától függő Ras-aktivációs útvonal. Proc. Natl. Acad. Sci. EGYESÜLT ÁLLAMOK. https://doi.org/10.1073/pnas.1633695100 (2003).

42. Mócsai, A., Ruland, J. & Tybulewicz, VLJ The SYK tirozin kinase: A crucial player in diverse biological functions. Nat. Rev. Immunol. https://doi.org/10.1038/nri2765 (2010). 43. Liu B. et al. Tumor-mikrokörnyezetre reagáló nanokompozit hidrogén-szulfid gázhoz és trimodálisan továbbfejlesztett enzimdinamikus terápiához. Adv. Mater. https://doi.org/10.1002/adma. 202101223 (2021).

44. Nguyen, GT, Green, ER & Mecsas, J. Neutrophils to the ROScue: Mechanisms of NADPH oxidase activation and bakteriális rezisztencia. Elülső. Sejt. Megfertőzni. Microbiol. https://doi.org/10.3389/fcimb.2017. 00373 (2017).

45. Che J. et al. A neutrofilek lokális és non-invazív liposzómák bejuttatását teszik lehetővé a gyulladt vázizmokba és az ischaemiás szívbe. Adv. Mater. 32, (2020).

46. ​​Le, RQ et al. FDA jóváhagyási összefoglaló: tocilizumab kiméra antigénreceptor T-sejtek által kiváltott súlyos vagy életveszélyes citokin felszabadulási szindróma kezelésére. Oncologist 23, 943–947 (2018).

47. Morris, EC, Neelapu, SS, Giavridis, T. & Sadelain, M. Citokin felszabadulási szindróma és kapcsolódó neurotoxicitás a rák immunterápiájában. Nat. Rev. Immunol. 22, 85–96 (2022).

48. Liang, J. et al. A neutrofilek elősegítik a rosszindulatú glióma fenotípusát az S100A4-en keresztül. Clin. Cancer Res. 20, 187–198 (2014).

49. Nagarajan S. et al. A neutrofil CD32A ligandumkötő funkciójának sejtspecifikus, aktivációfüggő szabályozása. Blood https://doi.org/ 10.1182/blood.v95.3.1069.003k14_1069_1077 (2000).

50. Fanger, MW, Shen, L., Graziano, RF és Guyre, PM Humán Fc-receptorok által közvetített citotoxicitás IgG-re. Immunol. Ma. https:// doi.org/10.1016/0167-5699(89)90234-X (1989).

51. Lee, YG et al. A CAR T sejt által közvetített citokin felszabadulási szindrómaszerű toxicitás szabályozása alacsony molekulatömegű adapterek segítségével. Nat. Commun. 10, 2681 (2019).

52. Kagoya, Y. et al. Egy JAK-STAT jelátviteli domént tartalmazó új kiméra antigén receptor kiváló daganatellenes hatásokat közvetít. Nat. Med. 24, 352–359 (2018).

53. Aghajanian H. et al. A szívfibrózis megcélzása mesterséges T-sejtekkel. Természet. https://doi.org/10.1038/s41586-019-1546-z (2019).

54. Zhang C. et al. ErbB2/HER2-specifikus NK-sejtek a glioblasztóma célzott kezelésére. J. Natl. Cancer Inst. https://doi.org/10.1093/jnci/ djv375 (2016).

55. Akhavan D. et al. CAR T-sejtek agydaganatokhoz: tanulságok és az előttünk álló út. Immunol. Rev. https://doi.org/10.1111/imr.12773 (2019).

56. Omar, NB et al. Biztonsági és időközi túlélési adatok az M032, egy genetikailag módosított onkolitikus HSV-1, amely IL-12-t expresszál, intracranialis beadása után szórványos gliómában szenvedő kedvtelésből tartott kutyáknál. Neurosurg. Focus 50, 1–11 (2021).

57. Larson, RC & Maus, MV A CAR T-sejtek mechanizmusainak és funkcióinak legújabb eredményei és felfedezései. Nat. Rev. Cancer 21, 145–161 (2021).

58. Wang, B. et al. Hipoimmunogén T-sejtek generálása genetikailag módosított allogén humán indukált pluripotens őssejtekből. Nat. Biomed. Eng. 5, 429–440 (2021).

59. Deuse, T. et al. Az indukált pluripotens őssejtek hipoimmunogén származékai elkerülik az immunkilökődést teljesen immunkompetens allogén recipiensekben. Nat. Biotechnol. 37, 252–258 (2019).

60. Han X. et al. Hipoimmunogén humán pluripotens őssejtek előállítása. https://doi.org/10.1073/pnas.1902566116

61. Kwon YW et al. A HLA DR genomszerkesztés TALEN-ekkel humán iPSC-ben immuntoleráns dendritikus sejteket termelt. Stem Cells Int. https://doi.org/10.1155/2021/8873383 (2021).

62. Morizane A. et al. Az MHC-illesztés javítja az iPSC-eredetű neuronok beágyazódását nem humán főemlősökben. Nat. Commun. https://doi. org/10.1038/s{5}} (2017).

63. Lin, K. et al. A gyógyszerrezisztens gliomát szelektíven célzó szerek mechanizmus alapú tervezése. Sci. (80-.) 377, 502–511 (2022).

64. Fan Y. et al. Több sejthalál út megcélzása meghosszabbítja az eltarthatósági időt, és megőrzi az emberi és egér neutrofilek transzfúziós funkcióját. Sci. Ford. Med. 13, (2021).

65. Chang Y. et al. Fluoreszcens indikátorok a humán pluripotens őssejtek sejtciklus-fázisainak folyamatos és vonal-specifikus jelentéséhez. Biotechnol. Bioeng. bit.27352. https://doi.org/10.1002/bit. 27352 (2020).

66. Jung, J. et al. Kémiailag meghatározott humán hematopoietikus ős- és progenitor sejtek generálása. STAR Protoc. 4, 101953 (2023).